JP2804079B2 - Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 - Google Patents
Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法Info
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- JP2804079B2 JP2804079B2 JP1123050A JP12305089A JP2804079B2 JP 2804079 B2 JP2804079 B2 JP 2804079B2 JP 1123050 A JP1123050 A JP 1123050A JP 12305089 A JP12305089 A JP 12305089A JP 2804079 B2 JP2804079 B2 JP 2804079B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（リン酸）〔NAD（Ｐ）Ｈ〕の定量法に関する。
ド（リン酸）〔NAD（Ｐ）Ｈ〕の定量法に関する。
さらに詳しくは、乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸オキ
シダーゼを用いてNAD（Ｐ）Ｈの量に対応する過酸化水
素を生成させ、これを定量する方法に関する。
シダーゼを用いてNAD（Ｐ）Ｈの量に対応する過酸化水
素を生成させ、これを定量する方法に関する。
本発明は、酵素反応によってNAD（Ｐ）Ｈを生成する
反応に係る反応物あるいは酵素活性の定量に適用でき
る。
反応に係る反応物あるいは酵素活性の定量に適用でき
る。
従来技術及び問題点 従来NAD（Ｐ）Ｈの紫外部における吸収を直接測定
する方法、NAD（Ｐ）Ｈを電子伝達体を介して蛍光物
質に導き、その蛍光を測定する方法、NAD（Ｐ）Ｈを
電子伝達体を介してテトラゾリウム塩からホルマザンに
導き、これを比色定量する方法、NAD（Ｐ）Ｈに電子
伝達体を作用させ、スーパーオキシドジスムターゼ（SO
D）の存在下、あるいは非存在下に生成する過酸化水素
を定量する方法〔臨床化学・第15巻・第１号（1986）20
〜27,特開昭59−210899,特開昭62−19100〕、ペルオ
キシダーゼ及びダイアホラーゼの存在下、特殊なロイコ
型化合物を発色させ、これを比色定量する方法（特開昭
60−80600）、ピリジン酵素と酸化酵素を組み合わせ
てNAD（Ｐ）Ｈを一旦還元型基質に変化させ、しかる後
に過酸化水素に導き、これを定量する方法（特開昭62−
138200号公報）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び
グルタミン酸オキシダーゼを用いて生成する過酸化水素
を定量する方法（特開昭60−43398号公報）等が知られ
ている。
する方法、NAD（Ｐ）Ｈを電子伝達体を介して蛍光物
質に導き、その蛍光を測定する方法、NAD（Ｐ）Ｈを
電子伝達体を介してテトラゾリウム塩からホルマザンに
導き、これを比色定量する方法、NAD（Ｐ）Ｈに電子
伝達体を作用させ、スーパーオキシドジスムターゼ（SO
D）の存在下、あるいは非存在下に生成する過酸化水素
を定量する方法〔臨床化学・第15巻・第１号（1986）20
〜27,特開昭59−210899,特開昭62−19100〕、ペルオ
キシダーゼ及びダイアホラーゼの存在下、特殊なロイコ
型化合物を発色させ、これを比色定量する方法（特開昭
60−80600）、ピリジン酵素と酸化酵素を組み合わせ
てNAD（Ｐ）Ｈを一旦還元型基質に変化させ、しかる後
に過酸化水素に導き、これを定量する方法（特開昭62−
138200号公報）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び
グルタミン酸オキシダーゼを用いて生成する過酸化水素
を定量する方法（特開昭60−43398号公報）等が知られ
ている。
これらの方法は、感度が低い、生体試料中の他の成分
の影響を受け易い、連続分析への適用が困難である、あ
るいは検体ブランクテストが必要である等の欠点があ
る。
の影響を受け易い、連続分析への適用が困難である、あ
るいは検体ブランクテストが必要である等の欠点があ
る。
特に、生体試料中の影響を受け易い他の比較的多量に
含まれる成分として生体試料例えば血清中には乳酸が存
在し、さらに乳酸デヒドロゲナーゼも存在していて目的
成分に由来するNADHの定量に際して、試料にNADを加え
るか、NADが生成すると乳酸が乳酸デヒドロゲナーゼの
作用を受けてNADHが生成する。目的とする成分に由来す
るNADHにこの乳酸に由来するNADHが加わるための検体ブ
ランクテストを行わなければならない。
含まれる成分として生体試料例えば血清中には乳酸が存
在し、さらに乳酸デヒドロゲナーゼも存在していて目的
成分に由来するNADHの定量に際して、試料にNADを加え
るか、NADが生成すると乳酸が乳酸デヒドロゲナーゼの
作用を受けてNADHが生成する。目的とする成分に由来す
るNADHにこの乳酸に由来するNADHが加わるための検体ブ
ランクテストを行わなければならない。
課題を解決するための手段 本発明によれば試料中のNAD（Ｐ）Ｈにピルビン酸の
存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を作用させて、N
AD（Ｐ）及び乳酸を生成させ、該乳酸に酵素の存在下乳
酸オキシダーゼ（LOX）を作用させて、ピルビン酸と過
酸化水素（H2O2）を生成させ該過酸化水素を定量するこ
とによってNAD（Ｐ）Ｈを定量できる（以下発明１とい
う）。
存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を作用させて、N
AD（Ｐ）及び乳酸を生成させ、該乳酸に酵素の存在下乳
酸オキシダーゼ（LOX）を作用させて、ピルビン酸と過
酸化水素（H2O2）を生成させ該過酸化水素を定量するこ
とによってNAD（Ｐ）Ｈを定量できる（以下発明１とい
う）。
この酵素反応の反応式が示される。
本発明の実施に際しては、各反応を順次行わせて目的
を達成できるが、試料にピルビン酸もしくはその塩,LD
H,LOX及び要すればH2O2定量用試薬を一度に加え、H2O2
を定量することによってNAD（Ｐ）Ｈを定量できる。
を達成できるが、試料にピルビン酸もしくはその塩,LD
H,LOX及び要すればH2O2定量用試薬を一度に加え、H2O2
を定量することによってNAD（Ｐ）Ｈを定量できる。
定量すべきNAD（Ｐ）Ｈが他の酵素反応によって生成
する場合該反応に必要な酵素，基質等とNAD（Ｐ）Ｈ定
量反応用試薬とを一緒に試料に加えることができる。
する場合該反応に必要な酵素，基質等とNAD（Ｐ）Ｈ定
量反応用試薬とを一緒に試料に加えることができる。
次の発明によれば、試料中の乳酸に乳酸オキシダーゼ
を作用させて、ピルビン酸と過酸化水素に分解し、該過
酸化水素を消去した後、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下
ピルビン酸もしくはその塩と試料中のNAD（Ｐ）Ｈとを
反応させて乳酸を生成させ、次いで生成した乳酸に乳酸
オキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を定量す
ることによりNAD（Ｐ）Ｈを正確に定量できる（以下発
明２という）。
を作用させて、ピルビン酸と過酸化水素に分解し、該過
酸化水素を消去した後、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下
ピルビン酸もしくはその塩と試料中のNAD（Ｐ）Ｈとを
反応させて乳酸を生成させ、次いで生成した乳酸に乳酸
オキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を定量す
ることによりNAD（Ｐ）Ｈを正確に定量できる（以下発
明２という）。
この酵素反応の反応式が示される。
この方法は、検体ブランクテストを必要としない優れ
た且つ簡便な方法である。
た且つ簡便な方法である。
発明２を実施するに際して反応を順次行わせても目的
を達成できるが、第１試薬としてLOX及びH2O2消去剤
（第1A試薬）を調製し、試料に第1A試薬を加えて反応
後、H2O2消去能力を失活させ、次いでLDH,ピルビン酸も
しくはその塩及び要すればH2O2定量用試薬からなる第２
試薬（第2A試薬）を加えてH2O2を定量することにより、
正確にNAD（Ｐ）Ｈを定量できる。
を達成できるが、第１試薬としてLOX及びH2O2消去剤
（第1A試薬）を調製し、試料に第1A試薬を加えて反応
後、H2O2消去能力を失活させ、次いでLDH,ピルビン酸も
しくはその塩及び要すればH2O2定量用試薬からなる第２
試薬（第2A試薬）を加えてH2O2を定量することにより、
正確にNAD（Ｐ）Ｈを定量できる。
LOXの反応はLDHの反応に比べ著しく早いので、第１試
薬にLOX,LDH,H2O2消去剤，ピルビン酸もしくはその塩
（第1A′試薬），第２試薬にH2O2定量用試薬（第2A′試
薬）を配してもNAD（Ｐ）Ｈを正確に定量できる。
薬にLOX,LDH,H2O2消去剤，ピルビン酸もしくはその塩
（第1A′試薬），第２試薬にH2O2定量用試薬（第2A′試
薬）を配してもNAD（Ｐ）Ｈを正確に定量できる。
試料中にNAD（Ｐ）Ｈが存在せず、酵素反応によってN
AD（Ｐ）Ｈが生成し、これを定量する場合、第１試薬と
して第1A′試薬を用い第２試薬として目的成分の分解に
必要な成分（酵素，基質等）及びH2O2定量用試薬からな
る試薬（第2A″試薬）を調製し前記と同様にして生成す
るH2O2を定量すればよい。
AD（Ｐ）Ｈが生成し、これを定量する場合、第１試薬と
して第1A′試薬を用い第２試薬として目的成分の分解に
必要な成分（酵素，基質等）及びH2O2定量用試薬からな
る試薬（第2A″試薬）を調製し前記と同様にして生成す
るH2O2を定量すればよい。
NAD（Ｐ）Ｈ生成反応に必要な試料の中、試料中の乳
酸消去反応を阻害せず且つ定量の目的に反応しない成分
は第１試薬に加えてもよい。
酸消去反応を阻害せず且つ定量の目的に反応しない成分
は第１試薬に加えてもよい。
H2O2消去剤としては、カタラーゼが好ましく、その失
活にはアジ化ナトリウムが用いられる。
活にはアジ化ナトリウムが用いられる。
又、H2O2と反応してH2O2を分解し、反応を阻害しない
化合物であればいずれも用いうる。かかる化合物の例と
して、ペルオキシダーゼの存在下H2O2と反応して色素を
生成しない化合物が知られている。フェノール誘導体，
アニリン誘導体，ナフトール誘導体がかかる化合物とし
て例示され、特にペルオキシダーゼの存在下H2O2と２種
の化合物からなるカップリング剤と反応して色素を生成
するが、カップリング剤の一方を用いるとH2O2は分解さ
れるが色素を生成しない化合物は後のH2O2定量反応の色
源体として該カップリング剤の他方の化合物を加えるこ
とにより目的成分に由来するH2O2を定量することができ
るので便利である（特公昭62−21517,同61−23998）。
化合物であればいずれも用いうる。かかる化合物の例と
して、ペルオキシダーゼの存在下H2O2と反応して色素を
生成しない化合物が知られている。フェノール誘導体，
アニリン誘導体，ナフトール誘導体がかかる化合物とし
て例示され、特にペルオキシダーゼの存在下H2O2と２種
の化合物からなるカップリング剤と反応して色素を生成
するが、カップリング剤の一方を用いるとH2O2は分解さ
れるが色素を生成しない化合物は後のH2O2定量反応の色
源体として該カップリング剤の他方の化合物を加えるこ
とにより目的成分に由来するH2O2を定量することができ
るので便利である（特公昭62−21517,同61−23998）。
上記いずれの方法においてもH2O2の定量法としてペル
オキシダーゼの存在下H2O2と色源体とを反応させて生成
する色素によって着色した反応液の吸光度を測定する場
合、ペルオキシダーゼと色源体を別々に保存して、ある
いはキットとして構成させ、使用時に同時に加えるか、
ペルオキシダーゼを第１試薬に加える（第1B試薬）方が
好ましい。この場合、第２試薬は目的成分の分解に必要
な成分及び色源体（第2B試薬）からなる。
オキシダーゼの存在下H2O2と色源体とを反応させて生成
する色素によって着色した反応液の吸光度を測定する場
合、ペルオキシダーゼと色源体を別々に保存して、ある
いはキットとして構成させ、使用時に同時に加えるか、
ペルオキシダーゼを第１試薬に加える（第1B試薬）方が
好ましい。この場合、第２試薬は目的成分の分解に必要
な成分及び色源体（第2B試薬）からなる。
発明２において酸性の緩衝剤を用いると の方向の反応が進行するので、試料中の乳酸及びNADか
らNADHが生成せず、又検体試料中にLDH反応系以外に他
の成分からのNADH生成反応系が存在していて、第１試薬
の添加によりNADH生成反応が進行しても生成したNADH
は、上記LDHの作用でNAD及び乳酸が生成し、乳酸はLOX
によって分解され生成するH2O2はカタラーゼによって分
解される。次いでカタラーゼ阻害剤を加えてこれを分解
し、第２試薬を加えて反応させ生成するH2O2を適当な手
段で定量すればよい。
らNADHが生成せず、又検体試料中にLDH反応系以外に他
の成分からのNADH生成反応系が存在していて、第１試薬
の添加によりNADH生成反応が進行しても生成したNADH
は、上記LDHの作用でNAD及び乳酸が生成し、乳酸はLOX
によって分解され生成するH2O2はカタラーゼによって分
解される。次いでカタラーゼ阻害剤を加えてこれを分解
し、第２試薬を加えて反応させ生成するH2O2を適当な手
段で定量すればよい。
第１試薬の添加により、H2O2が生成すると試料中の還
元性物質例えばビリルビン，グルタチオン等も分解され
るので、目的成分に由来するNAD（Ｐ）Ｈの定量への悪
影響がなく、極めて優れた方法である。
元性物質例えばビリルビン，グルタチオン等も分解され
るので、目的成分に由来するNAD（Ｐ）Ｈの定量への悪
影響がなく、極めて優れた方法である。
本発明を実施する際には一般にpH2〜11の緩衝剤、例
えばリン酸塩，トリス−塩酸塩，コハク酸塩，ビス（２
−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチ
ル）メタン（ビス−トリス）,N−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HETES），
酢酸塩,Good等の0.005〜2mol/中で、酵素の至適作用
温度付近、通常５〜50℃好ましくは25〜40℃で行われ
る。
えばリン酸塩，トリス−塩酸塩，コハク酸塩，ビス（２
−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチ
ル）メタン（ビス−トリス）,N−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HETES），
酢酸塩,Good等の0.005〜2mol/中で、酵素の至適作用
温度付近、通常５〜50℃好ましくは25〜40℃で行われ
る。
反応液中の各成分の濃度が示される。
LDH: 0.1〜1000 IU/ml LDX: 0.1〜1000 IU/ml ピルビン酸もしくはその塩 0.1〜100 mM/ ペルオキシダーゼ 0.1〜1000 IU/ml 色源体 定量すべきNAD（Ｐ）の等モル以上好ましくは1
0〜1000倍モル 反応後の反応液による吸収を生成色素の極大吸収波長
で試薬ブランクを対照として測定し、予め既知量につい
ての試験から求めた検量線を利用して試料中のNAD
（Ｐ）Ｈを定量する。
0〜1000倍モル 反応後の反応液による吸収を生成色素の極大吸収波長
で試薬ブランクを対照として測定し、予め既知量につい
ての試験から求めた検量線を利用して試料中のNAD
（Ｐ）Ｈを定量する。
反応液中のNAD（Ｐ）Ｈは一般に0.00001〜1mg/mlとな
るように試薬液又は蒸留水で調製される。
るように試薬液又は蒸留水で調製される。
反応系には必要に応じてポリエチレングリコール−モ
ル−ｐ−iso−オクチルフェニルエーテル（商品名Trito
n X−100）等の界面活性剤が用いられる。
ル−ｐ−iso−オクチルフェニルエーテル（商品名Trito
n X−100）等の界面活性剤が用いられる。
少量のフェノールをペルオキシダーゼの活性化あるい
は色素形成反応促進のために反応系に加えることができ
る。
は色素形成反応促進のために反応系に加えることができ
る。
その他NAD（Ｐ）Ｈ生成反応に用いられる酵素の活性
化剤例えば塩化マグネシウムやその安定化剤、例えばア
ルブミンが0.01〜20mg/mlで用いられる。
化剤例えば塩化マグネシウムやその安定化剤、例えばア
ルブミンが0.01〜20mg/mlで用いられる。
過酸化水素の定量法としてはペルオキシダーゼを用い
る以外に公知の手法がいずれも適用できる。
る以外に公知の手法がいずれも適用できる。
過酸化水素の生成量もしくは速度の測定法としては、
化学発光分析法，電気化学的分析法，けい光分析法，分
光学的分析法などが知られている（たとえば、有機合成
化学協会誌，第39巻，第７号,p659〜666（1981）参
照）。本発明においては、そのいずれもが適用可能であ
るが、本発明の目的から迅速かつ高感度に過酸化水素を
検出するシステムを採用することが好ましい。
化学発光分析法，電気化学的分析法，けい光分析法，分
光学的分析法などが知られている（たとえば、有機合成
化学協会誌，第39巻，第７号,p659〜666（1981）参
照）。本発明においては、そのいずれもが適用可能であ
るが、本発明の目的から迅速かつ高感度に過酸化水素を
検出するシステムを採用することが好ましい。
代表的な過酸化水素の測定法をいくつか列挙すれば下
記のとおりである。
記のとおりである。
まず、化学発光分析法としては、ルミノールを赤血塩
の存在下で過酸化水素と反応させ、酸化に伴う発光量を
測定する方法を挙げられる。ルミノールの代わりにイソ
ルミノール，ピロガロール，ビス（2,4,6−トリクロロ
フェニル）オキザレートを、赤血塩の代わりにペルオキ
シダーゼ，ヘマチン，ヘミン，塩化コバルトを使用する
方法も知られている。
の存在下で過酸化水素と反応させ、酸化に伴う発光量を
測定する方法を挙げられる。ルミノールの代わりにイソ
ルミノール，ピロガロール，ビス（2,4,6−トリクロロ
フェニル）オキザレートを、赤血塩の代わりにペルオキ
シダーゼ，ヘマチン，ヘミン，塩化コバルトを使用する
方法も知られている。
電気化学的分析法としては、クラーク型過酸化水素電
極を用いる方法が一般的である。過酸化水素をペルオキ
シダーゼもしくはモリブデン酸塩などの触媒存在下でヨ
ウ素イオンと反応させてヨウ素イオン電極で測定する方
法も使用できる。
極を用いる方法が一般的である。過酸化水素をペルオキ
シダーゼもしくはモリブデン酸塩などの触媒存在下でヨ
ウ素イオンと反応させてヨウ素イオン電極で測定する方
法も使用できる。
けい光分析法としては、ホモバニリン酸をパーオキシ
ダーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する2,
2′−ジヒドロキシ−3,3′−ジメトキシビフェニル−5,
5′−ジ酢酸のけい光強度を測定する方法が挙げられ
る。ホモバニリン酸の代わりにｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸，ジアセチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン，ジアセチルジクロロフルオレスシンな
ど）などを用いてることもできる。
ダーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する2,
2′−ジヒドロキシ−3,3′−ジメトキシビフェニル−5,
5′−ジ酢酸のけい光強度を測定する方法が挙げられ
る。ホモバニリン酸の代わりにｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸，ジアセチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン，ジアセチルジクロロフルオレスシンな
ど）などを用いてることもできる。
分光学的分析法としては、ペルオキシダーゼ法，カタ
ラーゼ法などが一般的である。ペルオキシダーゼ法は、
色源体をペルオキシダーゼ（POD）の存在下で過酸化水
素と反応させ、生成する色素を比色定量する方法であ
る。色源体としては、たとえばｏ−ジアニシジン,4−メ
トキシ−１−ナフトール,2,2′−アジノ−ビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ABTS）など
の単独試薬、４−アミノアンチピリン（4AA）とフェノ
ール系化合物（たとえば、フェノール,p−クロロフェノ
ール,2,4,6−トリブロモフェノールなど）、アニリン系
化合物（たとえば、N,N−ジメチルアニリン（DMA）,N,N
−ジエチルアニリンなど）またはトルイジン系化合物
（たとえば、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジンなど）と
の組み合わせ試薬、３−メチル−２−ベンソチアゾリノ
ヒドラゾンとN,N−ジメチルアニリンとの組み合わせ試
薬などを使用することができる。カタラーゼ法として
は、過酸化水素をカタラーゼの存在下でアルコール（メ
タノールなど）と反応させ、生成するアルデヒドを発色
系に導いて色素の吸光度測定を行う方法などが挙げられ
る。
ラーゼ法などが一般的である。ペルオキシダーゼ法は、
色源体をペルオキシダーゼ（POD）の存在下で過酸化水
素と反応させ、生成する色素を比色定量する方法であ
る。色源体としては、たとえばｏ−ジアニシジン,4−メ
トキシ−１−ナフトール,2,2′−アジノ−ビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ABTS）など
の単独試薬、４−アミノアンチピリン（4AA）とフェノ
ール系化合物（たとえば、フェノール,p−クロロフェノ
ール,2,4,6−トリブロモフェノールなど）、アニリン系
化合物（たとえば、N,N−ジメチルアニリン（DMA）,N,N
−ジエチルアニリンなど）またはトルイジン系化合物
（たとえば、N,N−ジエチル−ｍ−トルイジンなど）と
の組み合わせ試薬、３−メチル−２−ベンソチアゾリノ
ヒドラゾンとN,N−ジメチルアニリンとの組み合わせ試
薬などを使用することができる。カタラーゼ法として
は、過酸化水素をカタラーゼの存在下でアルコール（メ
タノールなど）と反応させ、生成するアルデヒドを発色
系に導いて色素の吸光度測定を行う方法などが挙げられ
る。
これらの過酸化水素の検出系はいずれも公知の方法で
あり、その実施にあたってはそれぞれ公知の操作、条件
を参照すればよい。
あり、その実施にあたってはそれぞれ公知の操作、条件
を参照すればよい。
本発明を実施する際の最も好ましい方法は、ペルオキ
シダーゼの存在下H2O2と色源体とを反応させて生成する
色素による着色を比色定量する方法である。
シダーゼの存在下H2O2と色源体とを反応させて生成する
色素による着色を比色定量する方法である。
この方法を実施するに際しては、発明１においてはペ
ルオキシダーゼ及び色源体も試薬に加えられる。発明２
においては第１試薬にペルオキシダーゼが、第２試薬に
色源体が加えられる。色素の生成量もしくは生成速度
は、例えば色素の吸収極大値における吸光度を測定する
ことによって求めることができる。
ルオキシダーゼ及び色源体も試薬に加えられる。発明２
においては第１試薬にペルオキシダーゼが、第２試薬に
色源体が加えられる。色素の生成量もしくは生成速度
は、例えば色素の吸収極大値における吸光度を測定する
ことによって求めることができる。
本発明において、H2O2をペルオキシダーゼ及び色源体
を用いて定量する際、色源体としてカタラーゼ及びNAD
（Ｐ）Ｈの影響の小さいものが好ましく、又生体試料に
はヘモグロビン，ビリルビン等の極大吸収波長と離れた
極大吸収波長、特にλmaxが600〜750nmの色源体が好ま
しい。かかる色原体として、特開昭57−29297号公報，
特開昭59−74713号公報に記載の化合物、あるいは一般
式（１） 〔式中R1,R2は水素，炭素数１〜６のアルキル例えば、
メチル，エチル，プロピル，ブチル等を示し、R3,R4は
スルホアルキル（アルキルはR1と同義を示す）を示す〕
で表される化合物が好ましい。
を用いて定量する際、色源体としてカタラーゼ及びNAD
（Ｐ）Ｈの影響の小さいものが好ましく、又生体試料に
はヘモグロビン，ビリルビン等の極大吸収波長と離れた
極大吸収波長、特にλmaxが600〜750nmの色源体が好ま
しい。かかる色原体として、特開昭57−29297号公報，
特開昭59−74713号公報に記載の化合物、あるいは一般
式（１） 〔式中R1,R2は水素，炭素数１〜６のアルキル例えば、
メチル，エチル，プロピル，ブチル等を示し、R3,R4は
スルホアルキル（アルキルはR1と同義を示す）を示す〕
で表される化合物が好ましい。
本発明で用いられる代表的な色源体が第１表，第２
表，第３表に例示される。
表，第３表に例示される。
第１表中の化合物は、特開昭57−29297号公報に記載
されている化合物であり、表中の記号は下記定義を有す
る。
されている化合物であり、表中の記号は下記定義を有す
る。
第２表中の化合物は、特開昭59−74713号公報に記載
されている化合物であり、表中の記号は下記定義を有す
る。
されている化合物であり、表中の記号は下記定義を有す
る。
第３表中の記号は一般式（Ｉ）において下記定義を有
する。
する。
これらのものは次の原料１と２から10倍モルの原料２
を下位条件下で反応させることにより得る。
を下位条件下で反応させることにより得る。
これらの色源体を用いる場合の極大吸収波長（λma
x）、及び感度、下記NAD（Ｐ）Ｈ定量法に用いた場合の
血清中の成分の影響、生成した色素の水への溶解性の度
合いが第４表に示される。
x）、及び感度、下記NAD（Ｐ）Ｈ定量法に用いた場合の
血清中の成分の影響、生成した色素の水への溶解性の度
合いが第４表に示される。
感度の測定は以下の方法で行われた。20U/mlのペルオ
キシダーゼ,8U/mlの乳酸デヒドロゲナーゼ,5U/mlの乳酸
オキシダーゼ,0.5mg/mlのピルビン酸ソーダ,5mg/mlのト
リトンＸ−100,0.01mg/mlのフェノール，および第１表
中の化合物0.1mg/mlあるいは第２表中の化合物0.1mg/m
l,あるいは４−アミノアンチピリン0.1mg/mlと第３表中
の化合物0.1mg/mlを含有する100mMのビス（２−ヒドロ
キシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン
（Goodの緩衝液の一種）のpH6.25の緩衝液を調整し、こ
の3mlに、50μの300μmol/のNADH溶液を加える。37
℃で５分間反応させ、反応液のλmaxにおけるODを測定
する。
キシダーゼ,8U/mlの乳酸デヒドロゲナーゼ,5U/mlの乳酸
オキシダーゼ,0.5mg/mlのピルビン酸ソーダ,5mg/mlのト
リトンＸ−100,0.01mg/mlのフェノール，および第１表
中の化合物0.1mg/mlあるいは第２表中の化合物0.1mg/m
l,あるいは４−アミノアンチピリン0.1mg/mlと第３表中
の化合物0.1mg/mlを含有する100mMのビス（２−ヒドロ
キシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン
（Goodの緩衝液の一種）のpH6.25の緩衝液を調整し、こ
の3mlに、50μの300μmol/のNADH溶液を加える。37
℃で５分間反応させ、反応液のλmaxにおけるODを測定
する。
色源体としてニトロテトラゾリウムブルーを用いた場
合のODを100として相対値を３表に示す。なおニトロテ
トラゾリウムブルーの場合、上記緩衝液から、ペルオキ
シダーゼ，乳酸デヒドロゲナーゼ，乳酸オキシダーゼ，
ピルビン酸ソーダ，フェノールを除去し、20U/mlのジア
ホラーゼを加えてpH7.0とした緩衝液を使用して実験を
行った。
合のODを100として相対値を３表に示す。なおニトロテ
トラゾリウムブルーの場合、上記緩衝液から、ペルオキ
シダーゼ，乳酸デヒドロゲナーゼ，乳酸オキシダーゼ，
ピルビン酸ソーダ，フェノールを除去し、20U/mlのジア
ホラーゼを加えてpH7.0とした緩衝液を使用して実験を
行った。
血清中の成分の影響は、ビリルビン10μg/ml,もしく
はシステイン10μg/3ml,あるいは尿酸10μg/3mlが存在
する時、５〜10％の影響を±、10〜20％を＋,5％以下を
−として示す。
はシステイン10μg/3ml,あるいは尿酸10μg/3mlが存在
する時、５〜10％の影響を±、10〜20％を＋,5％以下を
−として示す。
生成した色素の水への溶解性の度合いは、ニトロテト
ラゾリウムブルーと比較した場合の評価である。AAはニ
トロテトラゾリウムブルーに比べ水への溶解性が著しく
良いもの、Ａは水への溶解性が良いもの、Ｂはニトロテ
トラゾリウムブルーと同程度しか水に溶けないものであ
ることを意味する。
ラゾリウムブルーと比較した場合の評価である。AAはニ
トロテトラゾリウムブルーに比べ水への溶解性が著しく
良いもの、Ａは水への溶解性が良いもの、Ｂはニトロテ
トラゾリウムブルーと同程度しか水に溶けないものであ
ることを意味する。
λmaxが高く、感度が高く、生体成分の影響を受け
ず、水に溶けやすいものほど、微量生体成分の定量に適
している。
ず、水に溶けやすいものほど、微量生体成分の定量に適
している。
本発明方法は、反応によってNAD（Ｐ）Ｈを化学量論
的に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性
の測定に適用できる。かかる反応系はNAD及びデヒドロ
ゲナーゼを用いる多くの反応系が知られている。かかる
物質としてグルコース，ガラクトース，アルコール，リ
ンゴ酸，アルデヒド，キサンチン，コレステロール，胆
汁酸，ホスフォヘキソースイソメラーゼ（PHI）活性，
中性脂肪等があげられる。
的に生成する反応系における反応物質あるいは酵素活性
の測定に適用できる。かかる反応系はNAD及びデヒドロ
ゲナーゼを用いる多くの反応系が知られている。かかる
物質としてグルコース，ガラクトース，アルコール，リ
ンゴ酸，アルデヒド，キサンチン，コレステロール，胆
汁酸，ホスフォヘキソースイソメラーゼ（PHI）活性，
中性脂肪等があげられる。
これらの反応系が図式的に次に示され、反応系におけ
る基質、酵素活性が測定できる。
る基質、酵素活性が測定できる。
これらのNADHを生成する反応の脱水素酵素もしくはそ
の基質が試料に含まれていて、これを定量するに際して
は、NAD（Ｐ）Ｈを生成するに必要な酵素もしくは基質
を試料に加え、次いで、本発明方法に従って生成したNA
D（Ｐ）Ｈを定量することによって目的成分を定量でき
る。
の基質が試料に含まれていて、これを定量するに際して
は、NAD（Ｐ）Ｈを生成するに必要な酵素もしくは基質
を試料に加え、次いで、本発明方法に従って生成したNA
D（Ｐ）Ｈを定量することによって目的成分を定量でき
る。
NAD（Ｐ）Ｈ生成反応とNAD（Ｐ）Ｈ定量反応が阻害し
ないときは、両反応に必要な成分を一緒に加え、あるい
は発明２においてはNAD（Ｐ）Ｈ生成反応に必要な試薬
を第２試薬に加えて分析を行えばよい。
ないときは、両反応に必要な成分を一緒に加え、あるい
は発明２においてはNAD（Ｐ）Ｈ生成反応に必要な試薬
を第２試薬に加えて分析を行えばよい。
一般に定量すべき成分が基質の場合はH2O2の総生成量
もしくは生成速度が、成分が酵素の活性であるときはH2
O2の生成速度が測定される。
もしくは生成速度が、成分が酵素の活性であるときはH2
O2の生成速度が測定される。
以下に本発明の態様示す実施例を示す。
実施例1.（NADHの定量） 50mM Goodの緩衝液（pH6.25）100mlにペルオキシダー
ゼ1000単位，乳酸デヒドロゲナーゼ800単位，乳酸オキ
シダーゼ500単位，ピルビン酸ソーダ50mg,トリトンＸ−
100を500mg,フェノール5mgおよび化合物No.1を10mg,
化合物No.20を10mg,化合物No.21を10mg,化合物N
o.22を10mg,化合物No.24を10mg,化合物No.26を10m
g,化合物No.45を10mg,化合物No.53を10mg,４−ア
ミノアンチピリン10mgと化合物No.56を10mg,４−アミ
ノアンチピリン10mgと化合物No.57を10mg,４−アミノ
アンチピリン10mgと化合物No.60を10mg,４−アミノア
ンチピリン10mgと化合物No.65を10mgをそれぞれ溶解
し、試薬液とする。
ゼ1000単位，乳酸デヒドロゲナーゼ800単位，乳酸オキ
シダーゼ500単位，ピルビン酸ソーダ50mg,トリトンＸ−
100を500mg,フェノール5mgおよび化合物No.1を10mg,
化合物No.20を10mg,化合物No.21を10mg,化合物N
o.22を10mg,化合物No.24を10mg,化合物No.26を10m
g,化合物No.45を10mg,化合物No.53を10mg,４−ア
ミノアンチピリン10mgと化合物No.56を10mg,４−アミ
ノアンチピリン10mgと化合物No.57を10mg,４−アミノ
アンチピリン10mgと化合物No.60を10mg,４−アミノア
ンチピリン10mgと化合物No.65を10mgをそれぞれ溶解
し、試薬液とする。
別に100,200,300,500,1000μmol/のNADH溶液を調製
し、試験管に各50mlずつを分取し、上記試薬液を各々3m
l加え、37℃に５分間放置した後、各λmaxにおける吸光
度を試験盲検を対照として測定する。
し、試験管に各50mlずつを分取し、上記試薬液を各々3m
l加え、37℃に５分間放置した後、各λmaxにおける吸光
度を試験盲検を対照として測定する。
結果を第５表に示す。表中の値は吸光度である。
実施例2.〔PHI（ホスフォヘキソースイソメラーゼ）活
性の測定〕 （試薬組成） （操作法） 2.25ml試薬液１を37℃に保温し、PHI（シグマ製）
の50U/溶液，100U/，200U/，400U/を5
0μ添加撹拌し、５分後に試料液２を0.75ml加えて均
一にした後、595nmにおける10分後の吸光度を測定し
た。第１図に得られた検量線を示す。
性の測定〕 （試薬組成） （操作法） 2.25ml試薬液１を37℃に保温し、PHI（シグマ製）
の50U/溶液，100U/，200U/，400U/を5
0μ添加撹拌し、５分後に試料液２を0.75ml加えて均
一にした後、595nmにおける10分後の吸光度を測定し
た。第１図に得られた検量線を示す。
実施例3.（総胆汁酸の定量） （試薬組成） 試薬液２にA:化合物番号１を0.1mg/ml,B:化合物番号2
0を0.1mg/ml,C:化合物番号21を0.1mg/ml,D:化合物番号2
6を0.1mg/ml,E:化合物番号27を0.1mg/mlをそれぞれ溶解
したものを試薬液２−A,2−B,2−C,2−D,2−Ｅとする。
0を0.1mg/ml,C:化合物番号21を0.1mg/ml,D:化合物番号2
6を0.1mg/ml,E:化合物番号27を0.1mg/mlをそれぞれ溶解
したものを試薬液２−A,2−B,2−C,2−D,2−Ｅとする。
試薬液１の2.25mlを37℃に保温し、生血清50μを添
加撹拌する。５分後に５種類の各試薬２を0.75ml加えて
均一にした後、さらに37℃にて５分間放置する。各色源
体のλmaxにおける吸光度を試薬盲検を対照として測定
し、予め既知の濃度で作成した検量線より血清中の総胆
汁酸濃度を算出する。結果を高速液体クロマトグラフィ
ー法（HPLC法）を用いて測定した数値と対比して第６表
に併記する。
加撹拌する。５分後に５種類の各試薬２を0.75ml加えて
均一にした後、さらに37℃にて５分間放置する。各色源
体のλmaxにおける吸光度を試薬盲検を対照として測定
し、予め既知の濃度で作成した検量線より血清中の総胆
汁酸濃度を算出する。結果を高速液体クロマトグラフィ
ー法（HPLC法）を用いて測定した数値と対比して第６表
に併記する。
血清試料１〜５には乳酸がそれぞれ9.8,12.3,5.6,14.
1及び8.2mg/dl含まれていたが、その影響は認められな
かった。
1及び8.2mg/dl含まれていたが、その影響は認められな
かった。
結果はHPLC法に対し、良く相関した測定値を示してい
る。
る。
実験例4.（PHI活性の定量） 実施例２において用いた試薬液１の2.25mlを37℃に保
温し、生血清50μを添加撹拌する。５分後に実験例２
において用いた試薬液２を0.75ml加えて均一にした後、
さらに37℃にて10分間放置する。色源体のλmax,595nm
における吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め既
知の活性で作成した検量線より血清中PHI活性を算出す
る。結果を、NADHの生成を紫外吸収により定量する方法
（UV法）と対比して第７表に併記する。またこの血清中
の乳酸値を「デタミナーLA」のキット（協和メデックス
社製）によって定量した。結果にみるように、乳酸の影
響を受けずUV法と良い相関を示している。
温し、生血清50μを添加撹拌する。５分後に実験例２
において用いた試薬液２を0.75ml加えて均一にした後、
さらに37℃にて10分間放置する。色源体のλmax,595nm
における吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め既
知の活性で作成した検量線より血清中PHI活性を算出す
る。結果を、NADHの生成を紫外吸収により定量する方法
（UV法）と対比して第７表に併記する。またこの血清中
の乳酸値を「デタミナーLA」のキット（協和メデックス
社製）によって定量した。結果にみるように、乳酸の影
響を受けずUV法と良い相関を示している。
第１図は、ホスフォヘキソースイソメラーゼの検量線を
示す。
示す。
Claims (2)
- 【請求項１】試料中のNAD（Ｐ）Ｈにピルビン酸もしく
はその塩の存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させて
NAD（Ｐ）及び乳酸を生成させ、該乳酸に酸素の存在下
乳酸オキシダーゼを作用させてピルビン酸と過酸化水素
を生成させ、該過酸化水素を定量することを特徴とする
NAD（Ｐ）Ｈの定量法。 - 【請求項２】試料中の乳酸に乳酸オキシダーゼを作用さ
せてピルビン酸と過酸化水素に分解し、該過酸化水素を
消去した後、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下、ピルビン
酸と試料中のNAD（Ｐ）Ｈとを反応させて乳酸を生成さ
せ、次いで生成した乳酸に乳酸オキシダーゼを作用させ
て生成する過酸化水素を定量することを特徴とするNAD
（Ｐ）Ｈの定量法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12145888 | 1988-05-18 | ||
| JP63-121458 | 1988-05-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0249600A JPH0249600A (ja) | 1990-02-19 |
| JP2804079B2 true JP2804079B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=14811634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1123050A Expired - Lifetime JP2804079B2 (ja) | 1988-05-18 | 1989-05-17 | Ｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0342984A3 (ja) |
| JP (1) | JP2804079B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100274552B1 (ko) * | 1993-06-25 | 2000-12-15 | 더블유. 브루스 위톤 | 피루브산의 제조 방법 |
| JP2005304483A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | アルカリフォスファターゼ測定法 |
| CN108828215B (zh) * | 2018-08-30 | 2019-05-14 | 中拓生物有限公司 | 一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN109928940B (zh) * | 2019-03-25 | 2022-12-27 | 浙江师范大学 | 基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备 |
| CN110467582B (zh) * | 2019-08-27 | 2023-03-21 | 浙江师范大学 | 一种用于铜离子检测的点亮型近红外荧光探针及制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4242446A (en) * | 1978-07-26 | 1980-12-30 | Coulter Electronics, Inc. | Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method |
| US4467811A (en) * | 1979-08-02 | 1984-08-28 | Children's Hospital Medical Center | Method of polarographic analysis of lactic acid and lactate |
| JPS6033479B2 (ja) * | 1980-07-30 | 1985-08-02 | 協和醗酵工業株式会社 | 過酸化水素の定量方法 |
| JPS59182361A (ja) * | 1983-03-31 | 1984-10-17 | Kyowa Medetsukusu Kk | 過酸化水素の定量方法 |
| JPS6043398A (ja) * | 1983-08-20 | 1985-03-07 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Νａｄ（ｐ）ｈの定量法 |
-
1989
- 1989-05-17 JP JP1123050A patent/JP2804079B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-18 EP EP19890305054 patent/EP0342984A3/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0249600A (ja) | 1990-02-19 |
| EP0342984A2 (en) | 1989-11-23 |
| EP0342984A3 (en) | 1992-03-11 |
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