JPH01187099A - 基質試薬液の安定化方法 - Google Patents
基質試薬液の安定化方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素又はその擬似酵素の酸化反応を利用した生
体成分の測定に有用な基質試薬液の安定化方法に関する
。
体成分の測定に有用な基質試薬液の安定化方法に関する
。
臨床検査、診断分野においては、各種生体内物質の定性
、定量を行うに当り、酵素反応を利用する測定法が広く
用いられている。
、定量を行うに当り、酵素反応を利用する測定法が広く
用いられている。
例えば抗原抗体反応を利用する酵素免疫測定法において
は、標識体として酵素を用いる事により、その活性量又
は活性量の変化を指標として試料中の解析物質の測定が
行われる。標識として用いられる酵素としては経済性、
感度の面から過酸化酵素（ベルオキシグーゼ）が最も広
く使用されている。また、ある種の生体成分、例えばコ
レステロール、グルコース、モノアミン等の測定は対応
する酸化酵素であるコレステロールオキシダーゼ、グル
コースオキシグーゼ、モノアミンオキシグーゼ等を作用
させる事により生成する過酸化水素量を過酸化酵素を用
いて定量する事により行われる。
は、標識体として酵素を用いる事により、その活性量又
は活性量の変化を指標として試料中の解析物質の測定が
行われる。標識として用いられる酵素としては経済性、
感度の面から過酸化酵素（ベルオキシグーゼ）が最も広
く使用されている。また、ある種の生体成分、例えばコ
レステロール、グルコース、モノアミン等の測定は対応
する酸化酵素であるコレステロールオキシダーゼ、グル
コースオキシグーゼ、モノアミンオキシグーゼ等を作用
させる事により生成する過酸化水素量を過酸化酵素を用
いて定量する事により行われる。
過酸化酵素の活性測定、過酸化水素の定量には、過酸化
酵素、過酸化水素等の過酸化物質及び基質からなる検出
系に於てその酵素反応が利用される。
酵素、過酸化水素等の過酸化物質及び基質からなる検出
系に於てその酵素反応が利用される。
酵素反応は一般に基質を溶解した水系溶液（基質試薬液
）中で行われ、過酸化酵素や過酸化物質の量に応じ基質
が酸化されその結果生じた可溶性物質を検知解析するこ
とによって測定が行なわれる。
）中で行われ、過酸化酵素や過酸化物質の量に応じ基質
が酸化されその結果生じた可溶性物質を検知解析するこ
とによって測定が行なわれる。
使用される基質は過酸化酵素による酸化作用により検知
で能な可溶性物質を与える化合物であり、通常、呈色色
素を生成する芳香族アミン化合物やフェノール系化合物
などが知られている。芳香族アミン化合物、例えば。−
フェニレンノアミンは高い感度を得る事ができ、最も広
く用いられる。
で能な可溶性物質を与える化合物であり、通常、呈色色
素を生成する芳香族アミン化合物やフェノール系化合物
などが知られている。芳香族アミン化合物、例えば。−
フェニレンノアミンは高い感度を得る事ができ、最も広
く用いられる。
しかしながら、ｏ−７ヱニレンジアミンを含め、一般に
基質は安定性が十分でない場合が多く、特に溶液中では
、光、酸素等により非酵素的に酸化を受け、検出系にお
いて高いバックグランド濃度を生じたり、経時的に検出
値が大きい方へ振れるなど、この不安定性が実際の測定
における測定誤差の要因となっていた。それ故、暗所に
おける取扱いや基質試薬液Ｗ４！！後がら使用までの時
間制限等が課され、管理上不便が多く基質試薬液の安定
化方法が強く要望されていた。
基質は安定性が十分でない場合が多く、特に溶液中では
、光、酸素等により非酵素的に酸化を受け、検出系にお
いて高いバックグランド濃度を生じたり、経時的に検出
値が大きい方へ振れるなど、この不安定性が実際の測定
における測定誤差の要因となっていた。それ故、暗所に
おける取扱いや基質試薬液Ｗ４！！後がら使用までの時
間制限等が課され、管理上不便が多く基質試薬液の安定
化方法が強く要望されていた。
前記の情況に照し、本発明の目的は非酵素的酸化が抑え
られた安定な基質試薬液を与えるための安定化方法の提
供にある。
られた安定な基質試薬液を与えるための安定化方法の提
供にある。
前記した本発明の目的は、酸化作用を有する酵素または
その擬似酵素に酸化されることにより検知可能な可溶性
物質を生ずる基質を含む基質試薬液に２個の燐オキソ酸
単位からなる縮合燐オキソ酸誘導体を含有させる事によ
って達成される。
その擬似酵素に酸化されることにより検知可能な可溶性
物質を生ずる基質を含む基質試薬液に２個の燐オキソ酸
単位からなる縮合燐オキソ酸誘導体を含有させる事によ
って達成される。
尚前記本発明の基質試薬液の安定化方法の態様に於て、
前記酵素またはその擬似酵素は過酸化酵素またはその擬
似過酸化酵素であることが好ましい。
前記酵素またはその擬似酵素は過酸化酵素またはその擬
似過酸化酵素であることが好ましい。
ここで擬似酵素とは先記する酵素に着目する作用効果が
同一と看做される物質を謂う。また前記基質は呈色色素
、発光物質または蛍光物質を与えるものが好ましく、芳
香族アミン化合物、就中。−フェニレンノアミン、０−
ノアニシジンま件は３．３’。
同一と看做される物質を謂う。また前記基質は呈色色素
、発光物質または蛍光物質を与えるものが好ましく、芳
香族アミン化合物、就中。−フェニレンノアミン、０−
ノアニシジンま件は３．３’。
５．５′−テトラメチルベンツジンであることが好まし
い。
い。
また前記の縮合燐オキソ酸誘導体は酸化数５の燐オキソ
酸である燐酸単位からなるものが好ましく、また、縮合
燐オキソ酸又は縮合燐オキソ酸の一部もしくは全部が塩
となった化合物が好ましく、更に二燐酸又は二燐酸アル
カリ金属塩が好ましい。
酸である燐酸単位からなるものが好ましく、また、縮合
燐オキソ酸又は縮合燐オキソ酸の一部もしくは全部が塩
となった化合物が好ましく、更に二燐酸又は二燐酸アル
カリ金属塩が好ましい。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明に係る縮合燐オキソ酸誘導体は２個の燐オキソ酸
単位から成るものであれば良く、また、各々の単位燐オ
キソ酸は酸化数２〜５のいずれの燐オキソ酸でも良いが
すべての単位燐オキソ酸が酸化数５の燐酸である場合が
好ましい。
単位から成るものであれば良く、また、各々の単位燐オ
キソ酸は酸化数２〜５のいずれの燐オキソ酸でも良いが
すべての単位燐オキソ酸が酸化数５の燐酸である場合が
好ましい。
前記誘導体の例としては縮合燐オキソ酸又は縮合燐オキ
ソ酸無機塩たとえばナトリウム、カリウム、リチウム等
のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアル
カリ土類金属塩、７ンモニウム塩、又は縮合燐オキソ酸
有機塩たとえばピリジウム塩等が挙げられ、また、縮合
燐オキソ酸エステル、縮合燐オキソ酸アミド、燐に直接
有機置換基が結合したもの等の有機燐オキソ酸化合物が
挙げられる。−分子中にフリーの酸単位や塩を作った単
位や有機置換基が結合した単位が混在していても良い。
ソ酸無機塩たとえばナトリウム、カリウム、リチウム等
のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアル
カリ土類金属塩、７ンモニウム塩、又は縮合燐オキソ酸
有機塩たとえばピリジウム塩等が挙げられ、また、縮合
燐オキソ酸エステル、縮合燐オキソ酸アミド、燐に直接
有機置換基が結合したもの等の有機燐オキソ酸化合物が
挙げられる。−分子中にフリーの酸単位や塩を作った単
位や有機置換基が結合した単位が混在していても良い。
更に本発明に於ては２種以上の縮合燐オキソ酸誘導体が
混合して用いられてもよい。
混合して用いられてもよい。
次に本発明に係る縮合燐オキソ酸誘導体の具体例を例示
するがこれらに限定されるものではない。
するがこれらに限定されるものではない。
尚アルキル置換体に於ては炭素原子数１〜８個のアルキ
ル基が好ましい。
ル基が好ましい。
二燐酸
〃 二水素二ナトリウム
〃 四ナトリウム
〃 二水素二カリウム
〃 四カリウム
〃 二水素二アンモニウム
〃 四アンモニウム
〃 ニカルシウム
二亜燐酸
〃 ニナトリウム
〃 三ナトリウム
二燐Ｉｌ＆ （１，Ｖ）三ナトリウム
次燐酸
〃 二水素二ナトリウム
〃 四ナトリウム
モノアルキル 二燐酸
〃 二燐酸玉ナトリウム
ノアルキル 二燐酸
〃 二燐酸二ナトリウム
本発明に係る基質は、酸化されることにより検知可能な
可溶性物質、例えば呈色色素、発光物質或は蛍光物質を
生成する化合物であれば良く、−般に過酸化酵素、過酸
化水素の酵素反応を利用する検出系に用いられる基質が
含まれる。代表的なものとしては芳香族アミン化合物や
フェノール系化合物などが挙げられる。
可溶性物質、例えば呈色色素、発光物質或は蛍光物質を
生成する化合物であれば良く、−般に過酸化酵素、過酸
化水素の酵素反応を利用する検出系に用いられる基質が
含まれる。代表的なものとしては芳香族アミン化合物や
フェノール系化合物などが挙げられる。
具体例としては、ｏ−フェニレンジアミンｌｌｌ−７！
ニレンノアミン＊９−７ｘニレンジ７ミン、ベンツジン
、０−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３．３’、５゜５
′−テトラメチルベンジジン、ノアミノベンジジン、ジ
カルボキシジン、２．２’−アノノービス （３−ニチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、３−７ミ／−
９−エチルカルバゾール、４−クロル−１−す７トール
、ピロガロール、４−７ミノーアンチピリン、４−７ミ
ノーＮ、Ｎ−ジメチルアニリン、４−７ミノアンチピリ
ンとジメチルアニリン混合物。
ニレンノアミン＊９−７ｘニレンジ７ミン、ベンツジン
、０−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３．３’、５゜５
′−テトラメチルベンジジン、ノアミノベンジジン、ジ
カルボキシジン、２．２’−アノノービス （３−ニチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、３−７ミ／−
９−エチルカルバゾール、４−クロル−１−す７トール
、ピロガロール、４−７ミノーアンチピリン、４−７ミ
ノーＮ、Ｎ−ジメチルアニリン、４−７ミノアンチピリ
ンとジメチルアニリン混合物。
４−７ミノアンチピリンとフェノールの混合物。
ピロガロールとｐ−フェニレンジアミンのｆｎ 合物ｔ
４−クロル−１−す７トールとＮ−エチル−Ｎ′−ヒド
ロキシルエチル−３−メチル−４−７ミノ７ニリンの混
合物、５−７ミノサリチル酸、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンとジメチル７ニリンの混合物、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸、ルミノール等が挙げられ、また
これらの酸の塩も有用である。これらのうち芳香族アミ
ン化合物が好ましく、０−フェニレンジアミン、０−ジ
アニシジン＊３Ｂ３’１５．５′−テトラメチルベンジ
ノンが特に好ましい。
４−クロル−１−す７トールとＮ−エチル−Ｎ′−ヒド
ロキシルエチル−３−メチル−４−７ミノ７ニリンの混
合物、５−７ミノサリチル酸、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンとジメチル７ニリンの混合物、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸、ルミノール等が挙げられ、また
これらの酸の塩も有用である。これらのうち芳香族アミ
ン化合物が好ましく、０−フェニレンジアミン、０−ジ
アニシジン＊３Ｂ３’１５．５′−テトラメチルベンジ
ノンが特に好ましい。
本発明に係る酵素又は擬似酵素としては、基質を酸化し
検知可能な可溶性物質を与える反応を触媒するものであ
れば特に限定されないが、過酸化酵素又はそ・の擬似過
酸化酵素が好ましい、過酸化酵素又は擬似過酸化酵素に
よる酸化反応には過酸化物質が必要とされる。過酸化物
質としてはいずれの過酸化物質たとえば有機過酸化物質
であっても良いが、過酸化水素が好ましい。
検知可能な可溶性物質を与える反応を触媒するものであ
れば特に限定されないが、過酸化酵素又はそ・の擬似過
酸化酵素が好ましい、過酸化酵素又は擬似過酸化酵素に
よる酸化反応には過酸化物質が必要とされる。過酸化物
質としてはいずれの過酸化物質たとえば有機過酸化物質
であっても良いが、過酸化水素が好ましい。
過酸化酵素としては例えばホースラデイツシュペルオキ
シダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシ
ダーゼ、グルタチオンベルオキシグーゼ、チトクローム
Ｃペルオキシダーゼ等が使用可能であり、また擬似過酸
化酵素としては、例えばヘモグロビン、鉄、金、銀等の
金属及び金属化合物が使用可能である。
シダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシ
ダーゼ、グルタチオンベルオキシグーゼ、チトクローム
Ｃペルオキシダーゼ等が使用可能であり、また擬似過酸
化酵素としては、例えばヘモグロビン、鉄、金、銀等の
金属及び金属化合物が使用可能である。
本発明に係る基質試薬液は少くとも、酸化されることに
より検知可能な可溶性物質を生じる基質及び基質、検知
可能物質を溶解する溶媒より成り、場合によっては過酸
化水素等の過酸化物質又は過酸化酵素が含まれる。さら
に、必要に応じてその他の物質例えば他の安定化剤が含
まれていても良１１１゜ 基質試薬液に過酸化物質及び／又は過酸化酵素が含有さ
れる事により酵素反応が開始進行し、基質の酸化の結果
上じる物質を検知し、解析することにより測定が行なわ
れる。
より検知可能な可溶性物質を生じる基質及び基質、検知
可能物質を溶解する溶媒より成り、場合によっては過酸
化水素等の過酸化物質又は過酸化酵素が含まれる。さら
に、必要に応じてその他の物質例えば他の安定化剤が含
まれていても良１１１゜ 基質試薬液に過酸化物質及び／又は過酸化酵素が含有さ
れる事により酵素反応が開始進行し、基質の酸化の結果
上じる物質を検知し、解析することにより測定が行なわ
れる。
基質試薬液の溶媒としては、基質及び検知可能物質の溶
解が可能であり、かつ酵素的酸化反応を極端に阻害する
事のない溶媒が用いられ、一般には水系溶媒、場合によ
っては有機溶媒又は水と混和性を有する有機溶媒たとえ
ば、メタノール、エタノール、Ｎ、Ｎ−ツメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン
、ジオキサンと水系溶媒の混合溶媒が用いられる。基質
試薬液は酵素的酸化反応に適当なｐＨ値にある事が望ま
しく、通常用いられる緩衝剤により調整する事が好まし
い。過酸化酵素を用いる場合はｐＨ３〜９が好ましい。
解が可能であり、かつ酵素的酸化反応を極端に阻害する
事のない溶媒が用いられ、一般には水系溶媒、場合によ
っては有機溶媒又は水と混和性を有する有機溶媒たとえ
ば、メタノール、エタノール、Ｎ、Ｎ−ツメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン
、ジオキサンと水系溶媒の混合溶媒が用いられる。基質
試薬液は酵素的酸化反応に適当なｐＨ値にある事が望ま
しく、通常用いられる緩衝剤により調整する事が好まし
い。過酸化酵素を用いる場合はｐＨ３〜９が好ましい。
本発明の安定化方法において含有される縮合燐オキソ酸
誘導体の濃度は酵素的酸化反応における阻害の程度と非
酵素的酸化の抑制度を考慮し決定され、その１’ＪｒＨ
によって多少異なるが、通常０．０１−１００Ｏｎ＋Ｍ
テア’）、好＊ Ｌ ＜ ｌ；ｋ ０．１−５００ｍ
Ｍテｈ Ｚｌ。
誘導体の濃度は酵素的酸化反応における阻害の程度と非
酵素的酸化の抑制度を考慮し決定され、その１’ＪｒＨ
によって多少異なるが、通常０．０１−１００Ｏｎ＋Ｍ
テア’）、好＊ Ｌ ＜ ｌ；ｋ ０．１−５００ｍ
Ｍテｈ Ｚｌ。
縮合燐オキソ酸誘導体を基質試薬液に含有させるには、
基質を溶解した溶媒に添加しても良く、溶媒に最初に溶
解後基質を添加しても良く、また、基質と縮合燐オキソ
酸誘導体の混合物もしくは凍結乾燥物を、同時に溶媒に
添加、溶解しても良い。
基質を溶解した溶媒に添加しても良く、溶媒に最初に溶
解後基質を添加しても良く、また、基質と縮合燐オキソ
酸誘導体の混合物もしくは凍結乾燥物を、同時に溶媒に
添加、溶解しても良い。
また、基質を含む溶液と縮合燐オキソ酸誘導体を含む溶
液を混合しても良い。
液を混合しても良い。
また本発明に係る縮合燐オキソ酸誘導体は緩衝能を有し
ており、適当な酸、塩基を加え任意のｐｉに調整する事
により基質試薬液の緩衝剤としても使用可能である。基
質の濃度は０．１〜１００ａ＋Ｎが適当である。
ており、適当な酸、塩基を加え任意のｐｉに調整する事
により基質試薬液の緩衝剤としても使用可能である。基
質の濃度は０．１〜１００ａ＋Ｎが適当である。
本発明の安定化方法が特に有効な検出系は、過酸化物質
及び過酸化酵素及び酸化されることにより光学的に検知
可能な可溶性物質を生成する基質から成る検出系であり
、本発明により過酸化水素量もしくは過酸化酵素活性が
安定な正確な測定が可能となる。
及び過酸化酵素及び酸化されることにより光学的に検知
可能な可溶性物質を生成する基質から成る検出系であり
、本発明により過酸化水素量もしくは過酸化酵素活性が
安定な正確な測定が可能となる。
例えば検出系は以下のごとく行なわれる。即ち０．１〜
１００ｍＭの濃度の基質及び安定化剤として０．０１〜
１０００ ＋ｏ Ｍ、好ましくは０．１〜５００−Ｈの
濃度の縮合燐オキソ酸誘導体を含有させたｐＨ３〜９の
範囲の任意のｐｌ＋の緩衝液を調製する。過酸化酵素活
性を測定する場合はさらに８酸化水素を、過酸化水素量
を測定する場合はさらに過酸化酵素を一定量含有せしめ
、基質試薬液を調製する。基質試薬液と試料とを混合し
、２〜５０℃の温度で酵素反応を行わせ一定時間後、硫
酸等の酸、弗素化合物、７ジ化ソーダなどを加え反応を
停止する。試料中の過酸化酵素活性又は過酸化水素量に
応じて基質が酸化され、その結果生成した可溶化状態の
物質を光学的に検出する。
１００ｍＭの濃度の基質及び安定化剤として０．０１〜
１０００ ＋ｏ Ｍ、好ましくは０．１〜５００−Ｈの
濃度の縮合燐オキソ酸誘導体を含有させたｐＨ３〜９の
範囲の任意のｐｌ＋の緩衝液を調製する。過酸化酵素活
性を測定する場合はさらに８酸化水素を、過酸化水素量
を測定する場合はさらに過酸化酵素を一定量含有せしめ
、基質試薬液を調製する。基質試薬液と試料とを混合し
、２〜５０℃の温度で酵素反応を行わせ一定時間後、硫
酸等の酸、弗素化合物、７ジ化ソーダなどを加え反応を
停止する。試料中の過酸化酵素活性又は過酸化水素量に
応じて基質が酸化され、その結果生成した可溶化状態の
物質を光学的に検出する。
生成物質がたとえば呈色色素であれば最大吸収波長にお
ける吸光度を測定し、既知量の過酸化酵素又は過酸化水
素について同様な操作を行なって作成した検量線との対
比を行うことにより定量測定が可能となる。
ける吸光度を測定し、既知量の過酸化酵素又は過酸化水
素について同様な操作を行なって作成した検量線との対
比を行うことにより定量測定が可能となる。
本発明は任意の酵素免疫測定法、たとえば均−系測定法
又は不均一系測定法、−抗体法又は二抗体法等いプれの
一般的な測定法にも適用可能である。
又は不均一系測定法、−抗体法又は二抗体法等いプれの
一般的な測定法にも適用可能である。
本発明の方法により基質試薬液の非酵素的酸化が抑制さ
れ経時安定性が向上し、また、この方法を適用した基質
試薬液を用いる検出系においては、酵素反応が阻害され
る事なく基質の非酵素的酸化反応が抑制され安定化され
る。また、酵素反応停止後の非酵素的酸化反応による生
成物質の増加も抑制され、正確な値が保持される。
れ経時安定性が向上し、また、この方法を適用した基質
試薬液を用いる検出系においては、酵素反応が阻害され
る事なく基質の非酵素的酸化反応が抑制され安定化され
る。また、酵素反応停止後の非酵素的酸化反応による生
成物質の増加も抑制され、正確な値が保持される。
本発明により、酵素活性又は過酸化水素量さらにはこれ
らに対応する解析対象物質量の測定を極めて精度の高い
ものとする事が可能となった。
らに対応する解析対象物質量の測定を極めて精度の高い
ものとする事が可能となった。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例１
ｏ−７ｘニレンノアミンを３−ｇ／ｍｌの濃度で含む５
Ｇ＋ａＮ （えん＠ −１００＋ａ）４燐ｍａｔ衝液（
ａｌ１４．９）に二燐酸四ナトリウムを添加したもの及
Ｖ無添加のものを調製し、さらに過酸化水素を０．０２
％となる様に加え、ｐＨがシフトしたものについては塩
酸または水酸化す） ＋７ウムでＩＩＨを４．９に調製
し基質試薬試液とした。基ＩＩｌ試薬試液を０．５ｍＺ
宛２本ずつに分注し、一方には０．５μｇ／１１１１の
濃度のホースラディッシュベルオキシグーゼ結合ヤギ抗
マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製）１０μｌ
を添加し、他方には添加しなかった。それぞれを３７℃
の暗所にて３０分間反応させ、次いでこの混合物にＩＮ
＋１２ＳＯ−２１１ｊ！を加え反応を停止させ、４９２
ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示す
。尚酵素活性値は酵素結合抗体添加の場合の値と無添表
１は二燐酸四ナトリウムの添加が基質試薬液の非酵素的
酸化反応を顕著に抑制する事及び酵素反応をほとんど阻
害せず、検出系を安定化する事を示す。
Ｇ＋ａＮ （えん＠ −１００＋ａ）４燐ｍａｔ衝液（
ａｌ１４．９）に二燐酸四ナトリウムを添加したもの及
Ｖ無添加のものを調製し、さらに過酸化水素を０．０２
％となる様に加え、ｐＨがシフトしたものについては塩
酸または水酸化す） ＋７ウムでＩＩＨを４．９に調製
し基質試薬試液とした。基ＩＩｌ試薬試液を０．５ｍＺ
宛２本ずつに分注し、一方には０．５μｇ／１１１１の
濃度のホースラディッシュベルオキシグーゼ結合ヤギ抗
マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製）１０μｌ
を添加し、他方には添加しなかった。それぞれを３７℃
の暗所にて３０分間反応させ、次いでこの混合物にＩＮ
＋１２ＳＯ−２１１ｊ！を加え反応を停止させ、４９２
ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示す
。尚酵素活性値は酵素結合抗体添加の場合の値と無添表
１は二燐酸四ナトリウムの添加が基質試薬液の非酵素的
酸化反応を顕著に抑制する事及び酵素反応をほとんど阻
害せず、検出系を安定化する事を示す。
実施例２
添加する縮合燐オキシ酸誘導体として二燐酸四ナトリウ
ムの代りに二燐酸西カリウムを用いたほかは実施例１と
同様に行なった。結果を表２に示す。
ムの代りに二燐酸西カリウムを用いたほかは実施例１と
同様に行なった。結果を表２に示す。
表２は二燐酸四カリウムを用いた場合も実施例１と同様
の効果が現れる事を示す。
の効果が現れる事を示す。
実施例３
添加する縮合燐オキソ酸誘導体として二燐酸四ナトリウ
ムの代りに二燐酸を用いたほかは実施例１と同様に行な
った。
ムの代りに二燐酸を用いたほかは実施例１と同様に行な
った。
表３は、二燐酸を用いた場合も実施例１と同様の効果が
現れる事を示す。
現れる事を示す。
実施例４
基質試薬液として３醜ｇ／ａｌのオルトフェニレンジア
ミン、０．０２％の過酸化水素、１０ｍＭの各種縮合燐
オキソ酸誘導体を含むｐＨ４，９の５０ｍＭ ＜えン酸
−１００ｍＭ燐酸緩衝液を調製した。０．５ｍｆｆ１ず
つ分注し各種条件下にて放置後Ｉ Ｎ Ｈ２ＳＯ，２ｐ
ａｌを加え４９２ｎｍの吸光度を測定した。比較例とし
て縮合燐オキソａ誘導体を含まない基質試薬液を用−ま
た。
ミン、０．０２％の過酸化水素、１０ｍＭの各種縮合燐
オキソ酸誘導体を含むｐＨ４，９の５０ｍＭ ＜えン酸
−１００ｍＭ燐酸緩衝液を調製した。０．５ｍｆｆ１ず
つ分注し各種条件下にて放置後Ｉ Ｎ Ｈ２ＳＯ，２ｐ
ａｌを加え４９２ｎｍの吸光度を測定した。比較例とし
て縮合燐オキソａ誘導体を含まない基質試薬液を用−ま
た。
結果を表４に示す。
表４より、二燐酸口ナトリウム、二燐酸口カリウム、二
燐酸等、二個の燐オキソ酸単位からなる縮合燐オキソ酸
誘導体を含有する事により基質の非酵素的酸化反応が抑
制され基質試薬液の経時安定性が向上している事が明ら
かである。
燐酸等、二個の燐オキソ酸単位からなる縮合燐オキソ酸
誘導体を含有する事により基質の非酵素的酸化反応が抑
制され基質試薬液の経時安定性が向上している事が明ら
かである。
実施例５
実施例４と同様に基質試薬試液を調整し、４℃暗所にて
２４時間放置した後０．５μｇ／論１の濃度のホースラ
デイツシュ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カ
ッペル社製）１０μｌを加え３７℃にて３０分間反応さ
せた。ＩＮ Ｈ２ＳＯ−２ｍｌを加え反応を停止させ、
４９２ｎｍにおける吸収度を測定し、縮合燐酸誘導体無
添加の場合を対照とし、相対酵素活性を求めた。
２４時間放置した後０．５μｇ／論１の濃度のホースラ
デイツシュ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カ
ッペル社製）１０μｌを加え３７℃にて３０分間反応さ
せた。ＩＮ Ｈ２ＳＯ−２ｍｌを加え反応を停止させ、
４９２ｎｍにおける吸収度を測定し、縮合燐酸誘導体無
添加の場合を対照とし、相対酵素活性を求めた。
さらに実施例１〜３にて、硫酸を加え反応を停止した基
質試薬液について、室温暗所にて２４時間放置した後４
９２ｎ−の吸光度を測定し停止直後の場合を対照として
相対値を求めた。
質試薬液について、室温暗所にて２４時間放置した後４
９２ｎ−の吸光度を測定し停止直後の場合を対照として
相対値を求めた。
これらの結果を表５に示す。
表５より二個の燐オキソ酸単位より成る縮合燐オキソ酸
誘導体を含有する事により、基質試薬液が経時的な保存
においても失活する事なく安定であり、また、酵素反応
停止後の基質試薬液の呈色安定性が向上する事が明らか
である。
誘導体を含有する事により、基質試薬液が経時的な保存
においても失活する事なく安定であり、また、酵素反応
停止後の基質試薬液の呈色安定性が向上する事が明らか
である。
実施例６
ｏ−フェニレンジアミ２３輪ｇ／ｌａｌの濃度で含む１
００ｍＭ燐酸緩衝ｗＬ（ｐＨ５，０） ｌ： １０ｍＭ
各種縮合燐酸誘導体を含有したもの及び含有しないもの
を調製し、さらに過酸化水素を０．０１％となる様に加
え基質試薬液とした。基質試薬液を０．５ｍｆ宛２本ず
つ分注し、一方には０．１μｇ／論ｌの濃度のホースラ
デイツシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体（カッペル社製）２０μｌを添加し、他方
には添加しなかった。それぞれを３７℃にて３０分間反
応させ、次いでアジ化ナトリウムを加え反応を停止した
。 ４１０ｎｍを励起波長とし、５５０ｎｍの蛍光強度
を測定した。その結果を表６に示す。
００ｍＭ燐酸緩衝ｗＬ（ｐＨ５，０） ｌ： １０ｍＭ
各種縮合燐酸誘導体を含有したもの及び含有しないもの
を調製し、さらに過酸化水素を０．０１％となる様に加
え基質試薬液とした。基質試薬液を０．５ｍｆ宛２本ず
つ分注し、一方には０．１μｇ／論ｌの濃度のホースラ
デイツシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体（カッペル社製）２０μｌを添加し、他方
には添加しなかった。それぞれを３７℃にて３０分間反
応させ、次いでアジ化ナトリウムを加え反応を停止した
。 ４１０ｎｍを励起波長とし、５５０ｎｍの蛍光強度
を測定した。その結果を表６に示す。
表６より、蛍光にて酵素活性を測定する検出系において
も、本発明により、酵素反応がほとんど阻害される事な
く非酵素的酸化反応が抑制される事が明らかである。
も、本発明により、酵素反応がほとんど阻害される事な
く非酵素的酸化反応が抑制される事が明らかである。
実施例７
０−ジアニシジンを５Ｂ／ｍ１の濃度で含むツメチルス
ル７オキシド３論ｌに各Ｓ濃度の二燐酸口ナトリウムを
含んだ５０ｍＭ ＜えん１ｌｌ−１００ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ４，９） １２論ｌを加え、さらに過酸化水素を
０．０２％となる様に加え、基質試薬液とした。基質試
薬液を２ｍｆ宛５本ずつに分注した後、１本には０．５
μｇ／ｌａｎの濃度のホースラディッシュベルオキシグ
ーゼ総合ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル
社製）１００μｌを添加し、他の１本と共に３７℃暗所
にて１時間反応させ、４９６ｎｍにおける吸収度の差を
酵素活性とした。なお、酵素結合抗体を添加しないもの
はすべて吸光度は０であった。残りの３本については室
温、明所にて２４時間放置後、１本はそのまま吸収度を
測定し、残りの２本を用いて前記同様に酵素活性の測定
を行なった。二燐酸四ナトリウム無添加の場合を対照と
し相対酵素活性を求めた。その結果を表７に示す。
ル７オキシド３論ｌに各Ｓ濃度の二燐酸口ナトリウムを
含んだ５０ｍＭ ＜えん１ｌｌ−１００ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ４，９） １２論ｌを加え、さらに過酸化水素を
０．０２％となる様に加え、基質試薬液とした。基質試
薬液を２ｍｆ宛５本ずつに分注した後、１本には０．５
μｇ／ｌａｎの濃度のホースラディッシュベルオキシグ
ーゼ総合ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル
社製）１００μｌを添加し、他の１本と共に３７℃暗所
にて１時間反応させ、４９６ｎｍにおける吸収度の差を
酵素活性とした。なお、酵素結合抗体を添加しないもの
はすべて吸光度は０であった。残りの３本については室
温、明所にて２４時間放置後、１本はそのまま吸収度を
測定し、残りの２本を用いて前記同様に酵素活性の測定
を行なった。二燐酸四ナトリウム無添加の場合を対照と
し相対酵素活性を求めた。その結果を表７に示す。
表７より、基質として０−ツアニシジンを用いた場合に
おいても、本発明の方法により、酵素反応がほとんど阻
害される事なく基質の非酵素的酸化反応が顕著に抑制さ
れ、基質試薬液の保存安定性が向上する事が明らかであ
る。
おいても、本発明の方法により、酵素反応がほとんど阻
害される事なく基質の非酵素的酸化反応が顕著に抑制さ
れ、基質試薬液の保存安定性が向上する事が明らかであ
る。
実施例８
３．３ ’、５．５ ’−テトラメチルベンツジンを６
ｍｇ／論ｌの濃度で含むＮ−メチル・ピロリドン０．５
論ｌに各種濃度の二燐酸四カリウムを含む５０ｍＭ ＜
えん酸−１００ｍＮｇ４Ｎ１！衝液（ｐＨ４，９） ３
．５ｍｉ’を加え、さらに過酸化水素を０．０２％とな
る様に加え、基質試薬液とした。基質試薬液を０．５ｍ
ｊ！宛５本ずつに分注した後、１本には０．５μｇ／論
ｌの濃度のホースラデイツシュペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗マウスイム／グロブリン抗体（カッペル社製）１０
μｌを添加し、他の１本と共に３７℃暗所にて３０分間
反応させた。
ｍｇ／論ｌの濃度で含むＮ−メチル・ピロリドン０．５
論ｌに各種濃度の二燐酸四カリウムを含む５０ｍＭ ＜
えん酸−１００ｍＮｇ４Ｎ１！衝液（ｐＨ４，９） ３
．５ｍｉ’を加え、さらに過酸化水素を０．０２％とな
る様に加え、基質試薬液とした。基質試薬液を０．５ｍ
ｊ！宛５本ずつに分注した後、１本には０．５μｇ／論
ｌの濃度のホースラデイツシュペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗マウスイム／グロブリン抗体（カッペル社製）１０
μｌを添加し、他の１本と共に３７℃暗所にて３０分間
反応させた。
Ｉ Ｎ Ｈ２ＳＯ−２ｍｌを７加え、４５０ｎＩ１１に
おける吸光度の差を酵素活性とした。なお、酵素結合抗
体を添加しないもの、はすべて吸光度は０であった。残
りの３本については室温、明所にて２４時間放置後、１
本はそのまま吸光度を測定し、残りの２本を用いて前記
同様に酵素活性の測定を行なった。二燐酸四カリウム無
添加の場合を対照として相対酵素活性８ 表８より、基質として３．３ ’、５．５ ’−テトラ
メチルベンツジンを用いた場合においても、本発明の方
法により、実施例７と同様の効果が現れる事−が明らか
である。
おける吸光度の差を酵素活性とした。なお、酵素結合抗
体を添加しないもの、はすべて吸光度は０であった。残
りの３本については室温、明所にて２４時間放置後、１
本はそのまま吸光度を測定し、残りの２本を用いて前記
同様に酵素活性の測定を行なった。二燐酸四カリウム無
添加の場合を対照として相対酵素活性８ 表８より、基質として３．３ ’、５．５ ’−テトラ
メチルベンツジンを用いた場合においても、本発明の方
法により、実施例７と同様の効果が現れる事−が明らか
である。
Claims (10)
- （１）酸化作用を有する酵素またはその擬似酵素に酸化
される事により検知可能な可溶性物質を生じる基質を含
む基質試薬液に２個の燐オキソ酸単位からなる縮合燐オ
キソ酸誘導体を含有せしめる事を特徴とする基質試薬液
の安定化方法。 - （２）前記酵素またはその擬似酵素が過酸化酵素または
その擬似過酸化酵素である請求項１に記載の基質試薬液
の安定化方法。 - （３）前記基質が呈色色素、発光物質または蛍光物質を
与える基質である請求項１または２に記載の基質試薬液
の安定化方法。 - （４）前記基質が芳香族アミン化合物である請求項１〜
３のいづれかに記載の基質試薬液の安定化方法。 - （５）前記基質がｏ−フェニレンジアミンである請求項
１〜４のいづれかに記載の基質試薬液の安定化方法。 - （６）前記基質がｏ−ジアニシジンである請求項１〜４
のいづれかに記載の基質試薬液の安定化方法。 - （７）前記基質が３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジンである請求項１〜４のいづれかに記載の基質試
薬液の安定化方法。 - （８）前記縮合燐オキソ酸誘導体が２個の酸化数５の燐
オキソ酸である燐酸単位からなる縮合燐オキソ酸誘導体
である請求項１〜７のいづれかに記載の基質試薬液の安
定化方法。 - （９）前記縮合燐オキソ酸誘導体が縮合燐オキソ酸又は
縮合燐オキソ酸の一部もしくは全部が塩となった化合物
である請求項１〜８のいづれかに記載の基質試薬液の安
定化方法。 - （１０）前記縮合燐オキソ酸誘導体が二燐酸又は二燐酸
アルカリ金属塩である請求項１〜９のいづれかに記載の
基質試薬液の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1173588A JP2573009B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 基質試薬液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1173588A JP2573009B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 基質試薬液の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01187099A true JPH01187099A (ja) | 1989-07-26 |
| JP2573009B2 JP2573009B2 (ja) | 1997-01-16 |
Family
ID=11786291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1173588A Expired - Lifetime JP2573009B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 基質試薬液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2573009B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01317399A (ja) * | 1988-06-15 | 1989-12-22 | Konica Corp | 検出系の反応停止方法 |
| WO1999004261A1 (en) * | 1997-07-15 | 1999-01-28 | Kem-En-Tec A/S | Pre-stained 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrates for the detection of enzyme activity |
-
1988
- 1988-01-20 JP JP1173588A patent/JP2573009B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01317399A (ja) * | 1988-06-15 | 1989-12-22 | Konica Corp | 検出系の反応停止方法 |
| WO1999004261A1 (en) * | 1997-07-15 | 1999-01-28 | Kem-En-Tec A/S | Pre-stained 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrates for the detection of enzyme activity |
| US6221624B1 (en) | 1997-07-15 | 2001-04-24 | Kem-En-Tec A/S | Pre-stained 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrates for the detection of enzyme activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2573009B2 (ja) | 1997-01-16 |
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