JPS6036755B2 - 生体液中の成分の測定方法 - Google Patents
生体液中の成分の測定方法Info
- Publication number
- JPS6036755B2 JPS6036755B2 JP14325782A JP14325782A JPS6036755B2 JP S6036755 B2 JPS6036755 B2 JP S6036755B2 JP 14325782 A JP14325782 A JP 14325782A JP 14325782 A JP14325782 A JP 14325782A JP S6036755 B2 JPS6036755 B2 JP S6036755B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ascorbic acid
- biological fluids
- reaction
- pms
- measuring components
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- Expired
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は生体液中のァスコルビン酸の干渉を受けること
なく生体液中の成分を容易かつ正確に測定するためのア
スコルビン酸の除去に関する。 生体液中の成分を測定するために脱水素酵素あるいは酸
化酵素による酸化還元反応を用いる比色定量法が診断試
薬の分野では従来から広く行なわれてきた。しかしいず
れの酵素反応にもとずく発色系も生体液中の物質により
干渉を受けることが多く、中でもアスコルビン酸をはじ
めとする還元性物質によるものが重要視されてきた。す
なわち、これら還元性物質が存在するときは、脱水素酵
素を用いたホルマザン発色反応においては正誤差を、酸
化酵素を用いた酸化縮合反応においては負の誤差を与え
る。したがって、例えばアスコルビン酸が生体液中に存
在するときは成分の測定に先立ってアスコルビン酸を除
去し、その干渉作用を消去しなければ正確な成分の値を
測定することはできない。従来このようなアスコルビソ
酸の千渉作用を除くためにはアスコルビン酸オキシター
ゼのような酵素を用いる方法が一般であるが、酵素を用
いることは試薬の安定性、経済性の点から望ましいこと
はできない。本発明者等はこれらの欠点を改善するため
種々研究した結果、フェナジンメトサルフェートあるい
はその誘導体の特性を利用し生体液中のアスコルビン酸
を除去する方法を開発し本発明を完成した。 本発明に従って、生体液中の成分を脱水素酵素あるいは
酸イ携酵素による酸化還元反応を用いて測定する方法に
おいて、当該反応に干渉作用を有する生体液中のアスコ
ルビン酸を発色性電子受容体の存在しない状態でフェナ
ジンメトサルフェートあるいはその誘導体およびカタラ
ーゼまたはベルオキシダーゼと作用させ、その還元性を
消失せしめることを特徴とする生体液中の成分の測定方
法が提供される。 本発明の方法において次の模式で示す過程を経てアスコ
ルビン酸の除去が行なわれる。 生体液中の成分の測定に先立って前処理として本発明方
法を行なうと、上記の榛式に従いアスコルビソ酸は速や
かに酸化されその干渉作用は消失する。 ここでＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）は触媒として働らき、元に
戻るため変化はない。従って、事後の成分の測定反応に
何ら影響を及ぼすことはない。生体液中の成分の測定に
脱水素酵素を用いる場合に本発明方法を前処理として適
用すれば、事後の酸化還元反応を次の反応式に従って新
たに加えるテトラゾリウム塩の存在下にホルマザンの発
色に導き比色定量することができる。ＮＡＤ（Ｐ）日十
日十十ＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）→ＮＡＤ＋（Ｐ）＋ＰＭＳ
＆（ｍ一ＰＭＳＨ２）ＰＭＳ比（ｍ−ＰＭＳＨ２）十テ
トラゾリウム塩→ＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）十ホルマザン発
色注 ＮＡＤ十（Ｐ）：ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドまたは、ニコチンアミドアデニンジヌク レオチドリン酸 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：同上の還元型 この場合、発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩が
存在するのでホルマザン発色が優先して起り正確な測定
値が得られると共に測定試薬の１成分であるＰＭＳ（ｍ
−ＰＭＳ）がそのまま利用でき、かつ本発明方法実施後
つまり前処理後、その量に変化がないことは従釆のアス
コルビン酸オキシターゼのような酵素を別に必要とする
方法に較べ操作上もまた経済的にも非常に有利である。 また、酸化酵素を用いる場合には、本発明方法による前
処理後、酸化還元反応により生成する過酸化水素をベル
オキシダーゼ存在下に適当な電子供与体を新たに添加す
ることにより、つぎの酸化縮合反応により比色定量がで
きる。比０２十電子供与体 →発色性酸化縮合物 ベルオキシタ−ゼ この場合、生成する過酸化水素はアスコルビン酸が除去
されているのでアスコルビン酸による消費はなく正確な
成分の量を示す酸化縮合物の発色を与える。 本発明方法は、上述のように脱水素酵素あるいは酸イ控
酵素による酸化還元反応による生体液中の成分の測定に
広く適用可能である。 例えば、Ｑ−アミラーゼ活性測定法、トリグリセライド
測定法やトランスアミラーゼ活性測定法などがある。以
下に実験例を示す。実験例 アスコルビン酸の酸化反応
： 試薬 （１｝ 公山Ｍ ｍ−ＰＭＳ ＩＯＯＯ小／１ ベルオキシターゼ を含む０．１Ｍリン酸バッファー Ｐ｝１７．５操作法
試薬‘１｝２．５の‘を３７０、５分間保温後、１００
の９／ｄ‘のアスコルビン酸溶液１叫〃を加え、２６籾
ｍでの吸光度の変化を求める。 第１図にはアスコルビン酸の還元型と、反応生成物の酸
化型との吸収スペクトルを示した。 第２図にはアスコルビン酸の酸化反応の経時変化を示し
た。本条件の場合には、反応開始約３分間でアスコルビ
ン酸は完全に酸化される。 次に実施例により本発明をさらに詳しく説明する。 実施例 Ｉ Ｑ−アミラーゼ活性測定法 試薬 ‘１｝ ＆Ｍ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）０．４ｍ
ＭＮＡＤＰ３０山Ｍ ｍ一ＰＭＳ ２■ＭＭやｌ２ １０００仇／〆 カタラーゼ ６０Ｗ／〆 へキソキナーゼ ５０ル／そ グリコース６リン酸デヒドロゲナーゼ４８
０仇ノク グリコアミラーゼ ０．１％ 牛アルプミン を含む０．１Ｍコハク酸ナトリウムバッファーＰＨ８．
２‘２｝ 欄Ｍ ニトロテトラゾリウムブル−１％
トリトン Ｘ−１００７．鶴ノク ソデイウムカルボキ
シ スターチを含む０．０』Ｍコハク酸ナトリウムバッ
ファーＰＨ６．４
なく生体液中の成分を容易かつ正確に測定するためのア
スコルビン酸の除去に関する。 生体液中の成分を測定するために脱水素酵素あるいは酸
化酵素による酸化還元反応を用いる比色定量法が診断試
薬の分野では従来から広く行なわれてきた。しかしいず
れの酵素反応にもとずく発色系も生体液中の物質により
干渉を受けることが多く、中でもアスコルビン酸をはじ
めとする還元性物質によるものが重要視されてきた。す
なわち、これら還元性物質が存在するときは、脱水素酵
素を用いたホルマザン発色反応においては正誤差を、酸
化酵素を用いた酸化縮合反応においては負の誤差を与え
る。したがって、例えばアスコルビン酸が生体液中に存
在するときは成分の測定に先立ってアスコルビン酸を除
去し、その干渉作用を消去しなければ正確な成分の値を
測定することはできない。従来このようなアスコルビソ
酸の千渉作用を除くためにはアスコルビン酸オキシター
ゼのような酵素を用いる方法が一般であるが、酵素を用
いることは試薬の安定性、経済性の点から望ましいこと
はできない。本発明者等はこれらの欠点を改善するため
種々研究した結果、フェナジンメトサルフェートあるい
はその誘導体の特性を利用し生体液中のアスコルビン酸
を除去する方法を開発し本発明を完成した。 本発明に従って、生体液中の成分を脱水素酵素あるいは
酸イ携酵素による酸化還元反応を用いて測定する方法に
おいて、当該反応に干渉作用を有する生体液中のアスコ
ルビン酸を発色性電子受容体の存在しない状態でフェナ
ジンメトサルフェートあるいはその誘導体およびカタラ
ーゼまたはベルオキシダーゼと作用させ、その還元性を
消失せしめることを特徴とする生体液中の成分の測定方
法が提供される。 本発明の方法において次の模式で示す過程を経てアスコ
ルビン酸の除去が行なわれる。 生体液中の成分の測定に先立って前処理として本発明方
法を行なうと、上記の榛式に従いアスコルビソ酸は速や
かに酸化されその干渉作用は消失する。 ここでＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）は触媒として働らき、元に
戻るため変化はない。従って、事後の成分の測定反応に
何ら影響を及ぼすことはない。生体液中の成分の測定に
脱水素酵素を用いる場合に本発明方法を前処理として適
用すれば、事後の酸化還元反応を次の反応式に従って新
たに加えるテトラゾリウム塩の存在下にホルマザンの発
色に導き比色定量することができる。ＮＡＤ（Ｐ）日十
日十十ＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）→ＮＡＤ＋（Ｐ）＋ＰＭＳ
＆（ｍ一ＰＭＳＨ２）ＰＭＳ比（ｍ−ＰＭＳＨ２）十テ
トラゾリウム塩→ＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）十ホルマザン発
色注 ＮＡＤ十（Ｐ）：ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドまたは、ニコチンアミドアデニンジヌク レオチドリン酸 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：同上の還元型 この場合、発色性電子受容体であるテトラゾリウム塩が
存在するのでホルマザン発色が優先して起り正確な測定
値が得られると共に測定試薬の１成分であるＰＭＳ（ｍ
−ＰＭＳ）がそのまま利用でき、かつ本発明方法実施後
つまり前処理後、その量に変化がないことは従釆のアス
コルビン酸オキシターゼのような酵素を別に必要とする
方法に較べ操作上もまた経済的にも非常に有利である。 また、酸化酵素を用いる場合には、本発明方法による前
処理後、酸化還元反応により生成する過酸化水素をベル
オキシダーゼ存在下に適当な電子供与体を新たに添加す
ることにより、つぎの酸化縮合反応により比色定量がで
きる。比０２十電子供与体 →発色性酸化縮合物 ベルオキシタ−ゼ この場合、生成する過酸化水素はアスコルビン酸が除去
されているのでアスコルビン酸による消費はなく正確な
成分の量を示す酸化縮合物の発色を与える。 本発明方法は、上述のように脱水素酵素あるいは酸イ控
酵素による酸化還元反応による生体液中の成分の測定に
広く適用可能である。 例えば、Ｑ−アミラーゼ活性測定法、トリグリセライド
測定法やトランスアミラーゼ活性測定法などがある。以
下に実験例を示す。実験例 アスコルビン酸の酸化反応
： 試薬 （１｝ 公山Ｍ ｍ−ＰＭＳ ＩＯＯＯ小／１ ベルオキシターゼ を含む０．１Ｍリン酸バッファー Ｐ｝１７．５操作法
試薬‘１｝２．５の‘を３７０、５分間保温後、１００
の９／ｄ‘のアスコルビン酸溶液１叫〃を加え、２６籾
ｍでの吸光度の変化を求める。 第１図にはアスコルビン酸の還元型と、反応生成物の酸
化型との吸収スペクトルを示した。 第２図にはアスコルビン酸の酸化反応の経時変化を示し
た。本条件の場合には、反応開始約３分間でアスコルビ
ン酸は完全に酸化される。 次に実施例により本発明をさらに詳しく説明する。 実施例 Ｉ Ｑ−アミラーゼ活性測定法 試薬 ‘１｝ ＆Ｍ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）０．４ｍ
ＭＮＡＤＰ３０山Ｍ ｍ一ＰＭＳ ２■ＭＭやｌ２ １０００仇／〆 カタラーゼ ６０Ｗ／〆 へキソキナーゼ ５０ル／そ グリコース６リン酸デヒドロゲナーゼ４８
０仇ノク グリコアミラーゼ ０．１％ 牛アルプミン を含む０．１Ｍコハク酸ナトリウムバッファーＰＨ８．
２‘２｝ 欄Ｍ ニトロテトラゾリウムブル−１％
トリトン Ｘ−１００７．鶴ノク ソデイウムカルボキ
シ スターチを含む０．０』Ｍコハク酸ナトリウムバッ
ファーＰＨ６．４
【３１０．３３％ トリトン Ｘ−１
００を含む０．州ＨＣＩ溶液 。 作法試薬【１ー２Ｍに検体２岬そ１を加え、３７０５分
間保温後、試薬■ｌｗ‘加え、さらに３７０５分間保温
後に試薬‘３’１の‘を加えて反応を棒止した後、波長
６０仇血で吸光度を測定する。 別に、Ｑーァミラーゼ活性既知の検体上記と同様に操作
し、検量線をつくり、この検量線より検体のＱ−アミラ
ーゼ活性を求める。試験例 Ｉ Ｑ−アミラーゼ活性測
定法におけるアスコルビン酸の影響：検体に予じめ、ア
スコルビン酸を１２．５，２５，５０双９／ｄ‘の濃度
で添加した検体について実施例１により吸光度を測定し
た。 結果を第３図に示した。本条件下にアスコルビン酸８０
の９／ｄ‘相当までは完全に消去され影響を受けないこ
とは明らかである。実施例 ２ トリグリセライド測定
法 試薬 ‘・｝ ２坪Ｍ ｍ一ＰＭＳ ＩＯＯＯＷ／〆 ベルオキシターゼ 】．６×１『ｖ／そ ＩＪパーゼ を含む０．０２Ｍ Ｎ，Ｎ′ービス（２ーハイドロキシ
ェチル）−２一アミノェタンスルホン酸バツフア−（Ｂ
ＥＳ）ＰＨ７．７ ‘２｝ ８仇／ク グリセロキナーゼ ２４０び／〆 グリセロール３リン酸オキシターゼ５
山Ｍ フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）１
．秋Ｍ Ａｍ１５ｍＭ ＭｇＣ１２ ０．１ｍＭ ４ーアミノアンチピリン ０．５ｍＭ Ｎ−エチル一Ｎースルホプロピルーｍ
ートルイジンを含む０．０２ＭＢＥＳバッファーｐＨ７
．７操作法試薬ｍ０．５の‘に検体２叫〆を加え３７℃
１ひげ間保温後、試薬■２．５の【を加え、されに３７
０１５分間保温し、波長５５仇皿で吸光度を測定する。 ８Ｕに濃度既知の検体を上記と同様に操作し検量線を作
りこの検量線より検体のトリグリセライド含量を求める
。 試験例 ２ トリグリセラィド測定法におけるアスコル
ビン酸の影響：検体に予じめ、アスコルビン酸を１０，
１７．５，２５３５ｍｐ／のの濃度で添加した検体につ
いて実施例２により吸光度を測定した。 結果を第４図に示した。酸イは酵素を用いた場合にも本
条件下にアスコルビン酸３０桝ノの相当までは完全に影
響を除くこが可能である。 以上述べたように、本発明方法は簡単な方法で検体中の
アスコルビン酸の干渉作用を除去し、試薬の無駄な使用
もなく正確な測定を可能にした点で有用なものである。 図面の簡単な説明第１図はアスコルビン酸の吸収スペク
トルを、第２図はアスコルビン酸量の酸化反応における
隆時変化を示す。 第３図はＱ−アミラーゼ活性測定法におけるアスコルビ
ン酸濃度の影響を示す。第４図はトリグリセラィド測定
法におけるアスコルビン酸の濃度の影響を示す。第３図 第４図 第１図 第２図
００を含む０．州ＨＣＩ溶液 。 作法試薬【１ー２Ｍに検体２岬そ１を加え、３７０５分
間保温後、試薬■ｌｗ‘加え、さらに３７０５分間保温
後に試薬‘３’１の‘を加えて反応を棒止した後、波長
６０仇血で吸光度を測定する。 別に、Ｑーァミラーゼ活性既知の検体上記と同様に操作
し、検量線をつくり、この検量線より検体のＱ−アミラ
ーゼ活性を求める。試験例 Ｉ Ｑ−アミラーゼ活性測
定法におけるアスコルビン酸の影響：検体に予じめ、ア
スコルビン酸を１２．５，２５，５０双９／ｄ‘の濃度
で添加した検体について実施例１により吸光度を測定し
た。 結果を第３図に示した。本条件下にアスコルビン酸８０
の９／ｄ‘相当までは完全に消去され影響を受けないこ
とは明らかである。実施例 ２ トリグリセライド測定
法 試薬 ‘・｝ ２坪Ｍ ｍ一ＰＭＳ ＩＯＯＯＷ／〆 ベルオキシターゼ 】．６×１『ｖ／そ ＩＪパーゼ を含む０．０２Ｍ Ｎ，Ｎ′ービス（２ーハイドロキシ
ェチル）−２一アミノェタンスルホン酸バツフア−（Ｂ
ＥＳ）ＰＨ７．７ ‘２｝ ８仇／ク グリセロキナーゼ ２４０び／〆 グリセロール３リン酸オキシターゼ５
山Ｍ フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）１
．秋Ｍ Ａｍ１５ｍＭ ＭｇＣ１２ ０．１ｍＭ ４ーアミノアンチピリン ０．５ｍＭ Ｎ−エチル一Ｎースルホプロピルーｍ
ートルイジンを含む０．０２ＭＢＥＳバッファーｐＨ７
．７操作法試薬ｍ０．５の‘に検体２叫〆を加え３７℃
１ひげ間保温後、試薬■２．５の【を加え、されに３７
０１５分間保温し、波長５５仇皿で吸光度を測定する。 ８Ｕに濃度既知の検体を上記と同様に操作し検量線を作
りこの検量線より検体のトリグリセライド含量を求める
。 試験例 ２ トリグリセラィド測定法におけるアスコル
ビン酸の影響：検体に予じめ、アスコルビン酸を１０，
１７．５，２５３５ｍｐ／のの濃度で添加した検体につ
いて実施例２により吸光度を測定した。 結果を第４図に示した。酸イは酵素を用いた場合にも本
条件下にアスコルビン酸３０桝ノの相当までは完全に影
響を除くこが可能である。 以上述べたように、本発明方法は簡単な方法で検体中の
アスコルビン酸の干渉作用を除去し、試薬の無駄な使用
もなく正確な測定を可能にした点で有用なものである。 図面の簡単な説明第１図はアスコルビン酸の吸収スペク
トルを、第２図はアスコルビン酸量の酸化反応における
隆時変化を示す。 第３図はＱ−アミラーゼ活性測定法におけるアスコルビ
ン酸濃度の影響を示す。第４図はトリグリセラィド測定
法におけるアスコルビン酸の濃度の影響を示す。第３図 第４図 第１図 第２図
Claims (1)
- １ 生体液中の成分を脱水素酵素あるいは酸化酵素によ
る酸化還元反応を用いて測定する方法において、当該反
応に干渉作用を有する生体液中のアスコルビン酸を発色
性電子受容体の存在しない状態でフエナジンメトサルフ
エートあるいはその誘導体およびカタラーゼまたはペル
オキシダーゼと作用させ、その還元性を消失せしめるこ
とを特徴とする生体液中の成分の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14325782A JPS6036755B2 (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 生体液中の成分の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14325782A JPS6036755B2 (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 生体液中の成分の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5934900A JPS5934900A (ja) | 1984-02-25 |
| JPS6036755B2 true JPS6036755B2 (ja) | 1985-08-22 |
Family
ID=15334535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14325782A Expired JPS6036755B2 (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 生体液中の成分の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6036755B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3620817A1 (de) * | 1986-06-21 | 1987-12-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
-
1982
- 1982-08-20 JP JP14325782A patent/JPS6036755B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5934900A (ja) | 1984-02-25 |
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