JPH0668490B2 - 生体試料中の還元物質の除去法 - Google Patents
生体試料中の還元物質の除去法Info
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- JPH0668490B2 JPH0668490B2 JP62035191A JP3519187A JPH0668490B2 JP H0668490 B2 JPH0668490 B2 JP H0668490B2 JP 62035191 A JP62035191 A JP 62035191A JP 3519187 A JP3519187 A JP 3519187A JP H0668490 B2 JPH0668490 B2 JP H0668490B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体試料成分の光学的測定において、妨害とな
る還元物質を除去し、測定を正確に行う方法に関する。
る還元物質を除去し、測定を正確に行う方法に関する。
（従来技術） 生体試料成分の分析は臨床検査診断の分野において重要
であり、血液、尿、唾液、涙液等が検査試料となる。し
かし乍ら、これら生体試料には代謝物としての還元物質
が多く含まれ、酸化及び還元反応を利用した光学的測定
法において、酸化反応の抑制、もしくは過剰な還元反応
として、測定を妨げる場合がある。典型的な例は、アス
コルビン酸であるが、アスコルビン酸オキシダーゼによ
り酸化する方法が有利である。またビリルビンについて
はビリルビンオキシダーゼを用いて消去するなどの工夫
がなされている。しかし乍ら、血清中の還元物質につい
ては比較的よく研究されているが、尿については、還元
物質の実体も不明であり、ましてその消去法について十
分に検討されていない。測定対象成分が二電子還元をう
ける受容体により酸化される場合にも、生体成分中に存
在する一電子還元性成分が、妨害を与え、特異性の高い
酵素を使用しても、酸化発色の抑制もしくは過剰な還元
反応が出現する。しかも、これらの還元成分は検体によ
り組成・濃度が異なり、検体ブランクを用いて補正する
必要がある。しかし、あまりに大きい妨害発色の場合に
補正は困難であり、逆に酸化発色の抑制については検体
ブランクによる補正そのものが不可能となる。
であり、血液、尿、唾液、涙液等が検査試料となる。し
かし乍ら、これら生体試料には代謝物としての還元物質
が多く含まれ、酸化及び還元反応を利用した光学的測定
法において、酸化反応の抑制、もしくは過剰な還元反応
として、測定を妨げる場合がある。典型的な例は、アス
コルビン酸であるが、アスコルビン酸オキシダーゼによ
り酸化する方法が有利である。またビリルビンについて
はビリルビンオキシダーゼを用いて消去するなどの工夫
がなされている。しかし乍ら、血清中の還元物質につい
ては比較的よく研究されているが、尿については、還元
物質の実体も不明であり、ましてその消去法について十
分に検討されていない。測定対象成分が二電子還元をう
ける受容体により酸化される場合にも、生体成分中に存
在する一電子還元性成分が、妨害を与え、特異性の高い
酵素を使用しても、酸化発色の抑制もしくは過剰な還元
反応が出現する。しかも、これらの還元成分は検体によ
り組成・濃度が異なり、検体ブランクを用いて補正する
必要がある。しかし、あまりに大きい妨害発色の場合に
補正は困難であり、逆に酸化発色の抑制については検体
ブランクによる補正そのものが不可能となる。
（発明の目的） 生体成分中の還元物質の影響を除去し、測定を精度よく
行う方法に関する発明であつて、二電子還元成分と一電
子還元成分を分離することにより測定することを特徴と
する。
行う方法に関する発明であつて、二電子還元成分と一電
子還元成分を分離することにより測定することを特徴と
する。
（発明の構成の説明） すなわち本発明は生体試料中の成分を二電子受容体の還
元を利用する二電子還元系にて、光学的に測定する系に
おいて、反応を妨害する還元性物質を安息香酸、パラヒ
ドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブロモ
フェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を用い
て除去することを特徴とする生体試料中の還元物質の除
去法である。
元を利用する二電子還元系にて、光学的に測定する系に
おいて、反応を妨害する還元性物質を安息香酸、パラヒ
ドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブロモ
フェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を用い
て除去することを特徴とする生体試料中の還元物質の除
去法である。
本発明において生体試料として血液や尿を対象とする
が、測定対象成分が試料中に少ない場合、多量の試料を
反応系に加えて測定するために生じる還元成分による影
響の回避法が主題である。未同定の還元成分の多い試料
として尿があるので主要に尿について説明する。尿中の
アスコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼにより消
去することは公知であるが、他の成分については、同じ
反応組成液により消去系を組み、主反応をあとから行う
方法がとられている。しかし乍ら、尿の還元成分は、こ
の方法でも消去するのに時間がかかりすぎる場合があ
る。例えば、フエナジンメトサルフエート（ＰＭＳ）、
１−メトキシ−ＰＭＳ，ＦＭＮ，ＦＡＤなどを前処理剤
として加えて還元物質を酸素との反応により過酸化水素
に転換して消去する方法が考えられる。この場合はカタ
ラーゼの添加が反応を促進するが、尿を対象とした場
合、消去に時間を要し、実用性があるとはいえない方法
である。上記方法も一電子還元物質を除去する方法であ
るが、反応系に共存させると、かえつて還元発色もしく
は酸化の抑制を促進する。主反応における酵素反応にお
いては更に妨害となる還元成分が生成することがある。
理由は反応に必要な酵素が非特異的なためである。測定
系の主反応が二電子還元系であるものとして代表例はＮ
ＡＤ（Ｐ）依存性脱水素酵素、フラビン（ＦＭＮ，ＦＡ
Ｄ、リボフラビン）依存性脱水素酵素がある。なお、こ
れらの酵素を使用して、生体試料成分を光学的に測定す
るには、還元型発色色素、すなわちホルマザン系色素を
使用する。
が、測定対象成分が試料中に少ない場合、多量の試料を
反応系に加えて測定するために生じる還元成分による影
響の回避法が主題である。未同定の還元成分の多い試料
として尿があるので主要に尿について説明する。尿中の
アスコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼにより消
去することは公知であるが、他の成分については、同じ
反応組成液により消去系を組み、主反応をあとから行う
方法がとられている。しかし乍ら、尿の還元成分は、こ
の方法でも消去するのに時間がかかりすぎる場合があ
る。例えば、フエナジンメトサルフエート（ＰＭＳ）、
１−メトキシ−ＰＭＳ，ＦＭＮ，ＦＡＤなどを前処理剤
として加えて還元物質を酸素との反応により過酸化水素
に転換して消去する方法が考えられる。この場合はカタ
ラーゼの添加が反応を促進するが、尿を対象とした場
合、消去に時間を要し、実用性があるとはいえない方法
である。上記方法も一電子還元物質を除去する方法であ
るが、反応系に共存させると、かえつて還元発色もしく
は酸化の抑制を促進する。主反応における酵素反応にお
いては更に妨害となる還元成分が生成することがある。
理由は反応に必要な酵素が非特異的なためである。測定
系の主反応が二電子還元系であるものとして代表例はＮ
ＡＤ（Ｐ）依存性脱水素酵素、フラビン（ＦＭＮ，ＦＡ
Ｄ、リボフラビン）依存性脱水素酵素がある。なお、こ
れらの酵素を使用して、生体試料成分を光学的に測定す
るには、還元型発色色素、すなわちホルマザン系色素を
使用する。
しかし、後者は本来二電子還元型であるが、酸素が共存
すると、フラビンセミキノンのまま酵素に電子伝達して
スーパーオキサイド（Ｏ ）を生成する場合がある。ラ
ジカルスキヤベンジヤーを共存させると、反応が阻害さ
れ、セミキノンの生成が認められるフラビン依存性脱水
素酵素がある。
すると、フラビンセミキノンのまま酵素に電子伝達して
スーパーオキサイド（Ｏ ）を生成する場合がある。ラ
ジカルスキヤベンジヤーを共存させると、反応が阻害さ
れ、セミキノンの生成が認められるフラビン依存性脱水
素酵素がある。
また、尿中ではＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を添加すること
により、ホルマザン系色素を還元発色させる成分が存在
し、ホルマザン系色素を用いる測定を妨害する。これは
ＮＡＤ（Ｐ）＋が一電子還元されたまた、ホルマザン系
色素を還元する場合で、340nmの吸収は増加せず、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈが生成していないことが判る。従つて、本発
明ではこの一電子還元成分の受容体である安息香酸、パ
ラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブ
ロモフェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を
添加し、二電子還元性の酵素反応、とりわけＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ生成の脱水素反応を行い、二電子還元性の発色
反応、例えばジアフオラーゼを用いることにより、選択
的に生体内成分の測定が可能となつた。
により、ホルマザン系色素を還元発色させる成分が存在
し、ホルマザン系色素を用いる測定を妨害する。これは
ＮＡＤ（Ｐ）＋が一電子還元されたまた、ホルマザン系
色素を還元する場合で、340nmの吸収は増加せず、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈが生成していないことが判る。従つて、本発
明ではこの一電子還元成分の受容体である安息香酸、パ
ラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブ
ロモフェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を
添加し、二電子還元性の酵素反応、とりわけＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ生成の脱水素反応を行い、二電子還元性の発色
反応、例えばジアフオラーゼを用いることにより、選択
的に生体内成分の測定が可能となつた。
すなわち本発明は、生体試料中の成分を二電子受容体の
還元を利用する二電子還元系にて光学的に測定する系に
おいて、反応を妨害する還元性物質を安息香酸、パラヒ
ドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブロモ
フェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を用い
て除去することを特徴とする生体試料中の還元物質の除
去法である。生体試料中の成分を二電子受容体の還元を
利用する二電子還元系にて光学的に測定する系は、具体
的にはＮＡＤ（Ｐ）依存性脱水素酵素またはフラビン依
存性脱水素酵素および還元型発色色素を使用する二電子
還元系である。還元型発色色素とは、ＮＡＤ（Ｐ）また
はフラビンを補酵素とする脱水素酵素の反応において生
成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは還元型フラビンの存
在下に、テトラゾリウム塩類をホルマザンとするホルマ
ザン系色素である。テトラゾリウム塩類としては、例え
ばＭＴＴ(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl
-2H tetrazoriumu bromide)などが挙げられる。
還元を利用する二電子還元系にて光学的に測定する系に
おいて、反応を妨害する還元性物質を安息香酸、パラヒ
ドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブロモ
フェノールからなる群から選ばれた一電子受容体を用い
て除去することを特徴とする生体試料中の還元物質の除
去法である。生体試料中の成分を二電子受容体の還元を
利用する二電子還元系にて光学的に測定する系は、具体
的にはＮＡＤ（Ｐ）依存性脱水素酵素またはフラビン依
存性脱水素酵素および還元型発色色素を使用する二電子
還元系である。還元型発色色素とは、ＮＡＤ（Ｐ）また
はフラビンを補酵素とする脱水素酵素の反応において生
成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたは還元型フラビンの存
在下に、テトラゾリウム塩類をホルマザンとするホルマ
ザン系色素である。テトラゾリウム塩類としては、例え
ばＭＴＴ(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl
-2H tetrazoriumu bromide)などが挙げられる。
本発明では一電子還元系の受容体として、安息香酸、パ
ラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブ
ロモフェノールからなる群から選ばれた化合物を用いる
ことが極めて有効であり、この受容体は、一電子還元反
応の受容体となり、ホルマザン系色素を還元しない。ホ
ルマザン系色素は二電子還元により発色するが、一電子
キヤリヤー２分子によつても発色する。従つて、安息香
酸などは一電子還元系の受容体であつて、ホルマザン系
色素を更に還元しない。更に安息香酸の還元は無発色で
あり、還元発色を妨害しない。
ラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブ
ロモフェノールからなる群から選ばれた化合物を用いる
ことが極めて有効であり、この受容体は、一電子還元反
応の受容体となり、ホルマザン系色素を還元しない。ホ
ルマザン系色素は二電子還元により発色するが、一電子
キヤリヤー２分子によつても発色する。従つて、安息香
酸などは一電子還元系の受容体であつて、ホルマザン系
色素を更に還元しない。更に安息香酸の還元は無発色で
あり、還元発色を妨害しない。
また、フエノール類としてジブロモフエノールなど測定
波長に影響しないものを選ぶが、一電子受容体であつて
ホルマザン系色素を還元発色させない物質であればこれ
を用いることができる。
波長に影響しないものを選ぶが、一電子受容体であつて
ホルマザン系色素を還元発色させない物質であればこれ
を用いることができる。
一方で酸化発色の場合は更に簡単で、Ｈ2Ｏ2生成反応を
用いてペルオキシダーゼによる色原体の酸化発色を行
う。この場合一電子還元性成分をＨ2Ｏ2を発生しない形
で消去すればよい。ＰＭＳやフラビンを用いることはＨ
2Ｏ2を発生させるので、少くともＯ2 -のままペルオキシ
ダーゼのカタラーゼ作用により消去する必要がある。Ｎ
ＡＤ（Ｐ）ＨをＨ2Ｏ2に転換する場合は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈオキシダーゼ活性を有するジアフオラーゼ又は旧黄色
酵素により直接Ｈ2Ｏ2を生成させる。Ｈ2Ｏ2の生成を助
けるために不均化剤を添加することがよい。いづれにし
てもＯ2に対する二電子反応が行われれば、一電子還元
系は安息香酸の添加により消去される。
用いてペルオキシダーゼによる色原体の酸化発色を行
う。この場合一電子還元性成分をＨ2Ｏ2を発生しない形
で消去すればよい。ＰＭＳやフラビンを用いることはＨ
2Ｏ2を発生させるので、少くともＯ2 -のままペルオキシ
ダーゼのカタラーゼ作用により消去する必要がある。Ｎ
ＡＤ（Ｐ）ＨをＨ2Ｏ2に転換する場合は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈオキシダーゼ活性を有するジアフオラーゼ又は旧黄色
酵素により直接Ｈ2Ｏ2を生成させる。Ｈ2Ｏ2の生成を助
けるために不均化剤を添加することがよい。いづれにし
てもＯ2に対する二電子反応が行われれば、一電子還元
系は安息香酸の添加により消去される。
上記の方法は吸光法以外に、レサズリン−レゾルフイン
系の螢光法において、ＮＡＤＨ−ジアフオラーゼ系にお
いて成立する。場合によつてはＨ2Ｏ2発生系をカタラー
ゼとメタノールを用いてホルムアルデヒドに転換したあ
とホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼによりＮＡＤＨに
転換してジアフオラーゼ発色あるいは発螢光させること
ができる。発光反応の場合はフラビンレダクターゼによ
りＮＡＤ（Ｐ）ＨはＦＭＮＨ2に転換され、小さいKm値
をもつルシフエラーゼに結合され発光するが、還元物質
は、発光における酸化反応を妨害する場合がある。この
妨害はやはり安息香酸などの一電子受容体によりトラツ
プすることで消去される。Ｈ2Ｏ2の化学発光についても
同様の方法で妨害が回避される。
系の螢光法において、ＮＡＤＨ−ジアフオラーゼ系にお
いて成立する。場合によつてはＨ2Ｏ2発生系をカタラー
ゼとメタノールを用いてホルムアルデヒドに転換したあ
とホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼによりＮＡＤＨに
転換してジアフオラーゼ発色あるいは発螢光させること
ができる。発光反応の場合はフラビンレダクターゼによ
りＮＡＤ（Ｐ）ＨはＦＭＮＨ2に転換され、小さいKm値
をもつルシフエラーゼに結合され発光するが、還元物質
は、発光における酸化反応を妨害する場合がある。この
妨害はやはり安息香酸などの一電子受容体によりトラツ
プすることで消去される。Ｈ2Ｏ2の化学発光についても
同様の方法で妨害が回避される。
本法の適用例として、尿中ポリアミンの測定の場合を挙
げることができる。既に説明したように、尿中には、ホ
ルマザン系発色を生じる成分があるが、１〜１００mMの
安息香酸などを加えると、バツクグラウンド発色は消失
する。更にデアセチラーゼにより抱合型ポリアミンを遊
離型に変換する際、デアセチラーゼが他の抱合体を水解
して生成する成分にＮＡＤ＋と反応するものがあり、一
電子還元型でホルマザン発色させる。このものは安息香
酸などにより大幅に消失させることが出来、ホルマザン
発色はきわめて低い一定比率で還元されるようになる。
この結果、バツクグラウンドの増加はきわめて少なく、
プトレシンオキシダーゼの添加では、ポリアミン量の測
定が可能になる。
げることができる。既に説明したように、尿中には、ホ
ルマザン系発色を生じる成分があるが、１〜１００mMの
安息香酸などを加えると、バツクグラウンド発色は消失
する。更にデアセチラーゼにより抱合型ポリアミンを遊
離型に変換する際、デアセチラーゼが他の抱合体を水解
して生成する成分にＮＡＤ＋と反応するものがあり、一
電子還元型でホルマザン発色させる。このものは安息香
酸などにより大幅に消失させることが出来、ホルマザン
発色はきわめて低い一定比率で還元されるようになる。
この結果、バツクグラウンドの増加はきわめて少なく、
プトレシンオキシダーゼの添加では、ポリアミン量の測
定が可能になる。
この測定系では、ポリアミンオキシダーゼが生成するア
ミノアルキルアルデヒドをアミノブチルアルデヒド脱水
素酵素によりＮＡＤＨに転換しているが、Ｈ2Ｏ2を測定
する場合も本法が有効である。生成したＮＡＤＨはＮＡ
ＤＨオキシダーゼ活性のないジアフオラーゼにより二電
子還元型でホルマザン発色を行う。
ミノアルキルアルデヒドをアミノブチルアルデヒド脱水
素酵素によりＮＡＤＨに転換しているが、Ｈ2Ｏ2を測定
する場合も本法が有効である。生成したＮＡＤＨはＮＡ
ＤＨオキシダーゼ活性のないジアフオラーゼにより二電
子還元型でホルマザン発色を行う。
なお先述したように、デアセチラーゼが尿に作用した
時、アミノブチルアルデヒドと反応する成分が出現し、
このものは二電子還元型でＮＡＤＨを生成するが測定感
度を保証する試料量においては、バツクグラウンドとな
るＮＡＤＨの生成はごくわずかであり、一定のレートで
増加する。
時、アミノブチルアルデヒドと反応する成分が出現し、
このものは二電子還元型でＮＡＤＨを生成するが測定感
度を保証する試料量においては、バツクグラウンドとな
るＮＡＤＨの生成はごくわずかであり、一定のレートで
増加する。
よつて、尿中ポリアミンは自動分析機により測定の可能
な時間内に反応を終結し、簡便な測定法が実現した。以
下に、尿中ポリアミンの測定例を示し、一電子受容体を
加えない場合と加えた場合について各々比較例と実施例
を示す。
な時間内に反応を終結し、簡便な測定法が実現した。以
下に、尿中ポリアミンの測定例を示し、一電子受容体を
加えない場合と加えた場合について各々比較例と実施例
を示す。
比較例 試液１ リン酸バツフアー，pH7.0（含0.1％トリトンＸ−100）
１００mM アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ２５Ｕ／ｍ アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍ ＮＡＤ＋ １mM アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ 0.5Ｕ／ｍ ジアフオラーゼ １Ｕ／ｍ ＭＴＴ 0.03％ ＭＴＴは、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl
-2H tetrazolium bromide 試液２ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM プトレシンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍ 試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加え、３７℃５分
間、５６５nmの吸光度を測定したあと、0.1ｍの試液
２を加え、更に５分間測定する。最初の反応で出現する
吸光度増加及び後段の反応の吸光度増加を図１に示す。
明らかに非特異的なＭＴＴの還元反応が出現し試液２を
加えると、更に非特異的なＭＴＴの還元反応が増加し、
ポリアミン濃度が正確に求められない。しかも検体によ
りこの非特異的な還元反応の程度が異つていることが他
の実験から示されている。
１００mM アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ２５Ｕ／ｍ アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍ ＮＡＤ＋ １mM アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ 0.5Ｕ／ｍ ジアフオラーゼ １Ｕ／ｍ ＭＴＴ 0.03％ ＭＴＴは、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl
-2H tetrazolium bromide 試液２ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM プトレシンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍ 試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加え、３７℃５分
間、５６５nmの吸光度を測定したあと、0.1ｍの試液
２を加え、更に５分間測定する。最初の反応で出現する
吸光度増加及び後段の反応の吸光度増加を図１に示す。
明らかに非特異的なＭＴＴの還元反応が出現し試液２を
加えると、更に非特異的なＭＴＴの還元反応が増加し、
ポリアミン濃度が正確に求められない。しかも検体によ
りこの非特異的な還元反応の程度が異つていることが他
の実験から示されている。
実施例１ 尿中ポリアミンの測定において、安息香酸を一電子受容
体として添加した場合を実施例として示す。
体として添加した場合を実施例として示す。
試液１ リン酸バツフアー，pH7.0（含0.1％トリトンＸ−100）
１０
０mM アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ２５Ｕ／ｍ アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍ 安息香酸 ６０mM ＮＡＤ １mM アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ 0.5Ｕ／ｍ ジアフオラーゼ １Ｕ／ｍ ＭＴＴ 0.03％ 試液２ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM プトレシンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍ 試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加え、３７℃５分
間、５６５nmの吸光度を測定したあと、0.1ｍの試液
２を加え、更に５分間測定する。最初の反応で出現する
吸光度増加Ａ１を図２のように外挿し、後段の反応Ａ２
との吸光度差を求めれば、液比補正後尿中ポリアミン濃
度が求められる。
１０
０mM アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ２５Ｕ／ｍ アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍ 安息香酸 ６０mM ＮＡＤ １mM アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ 0.5Ｕ／ｍ ジアフオラーゼ １Ｕ／ｍ ＭＴＴ 0.03％ 試液２ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM プトレシンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍ 試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加え、３７℃５分
間、５６５nmの吸光度を測定したあと、0.1ｍの試液
２を加え、更に５分間測定する。最初の反応で出現する
吸光度増加Ａ１を図２のように外挿し、後段の反応Ａ２
との吸光度差を求めれば、液比補正後尿中ポリアミン濃
度が求められる。
実施例２ 実施例１の尿中のポリアミンの測定において、安息香酸
に代えて、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香
酸またはジブロモフェノールを使用して、尿検体中のポ
リアミンを実施例１と同様にして測定した。図２と同じ
ような希釈曲線が得られた。
に代えて、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香
酸またはジブロモフェノールを使用して、尿検体中のポ
リアミンを実施例１と同様にして測定した。図２と同じ
ような希釈曲線が得られた。
参考例１ 尿中の還元物質の影響を回避してポリアミンの測定をペ
ルオキシダーゼの酸化発色系について行つた。
ルオキシダーゼの酸化発色系について行つた。
試液１ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ２５Ｕ／ｍ アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍ ベンゾイツクアシツド ６０mM ４−アミノアンチピリン 0.04％ ペルオキシダーゼ ３Ｕ／ｍ （ＮＡＤ＋ １mM） （アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ 0.5Ｕ／ｍ） （ジアフオラーゼ（ＮＡＤＨオキシダーゼ） １Ｕ／ｍ） 試液２ リン酸バツフアー，pH7.0 １００mM プトレシンオキシダーゼ ５Ｕ／ｍ ＥＨＳＰＴ 0.02％ ＥＨＳＰＴは、N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-
m-toluidine sodium dihydrate 試料１よりＮＡＤ＋、アミノブチルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ、ジアフオラーゼを除いた場合、反応はプトレ
シンオキシダーゼ作用により生成するＨ2Ｏ2を測定し、
試液１の組成では、アミノブチルアルデヒドもＨ2Ｏ2に
転換されて２分子のＨ2Ｏ2が測定される。反応は３７
℃、５５３nmの吸光度を測定した。図３に、反応の時間
経過を示す。試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加
え、５分間反応後0.1ｍの試液２を加える。反応後の
発色は極めて安定であり、Ａはアミノブチルアルデヒド
をＨ2Ｏ2として測定した場合、Ｂはプトレシンオキシダ
ーゼにより生成するＨ2Ｏ2を測定した場合を示す。
m-toluidine sodium dihydrate 試料１よりＮＡＤ＋、アミノブチルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ、ジアフオラーゼを除いた場合、反応はプトレ
シンオキシダーゼ作用により生成するＨ2Ｏ2を測定し、
試液１の組成では、アミノブチルアルデヒドもＨ2Ｏ2に
転換されて２分子のＨ2Ｏ2が測定される。反応は３７
℃、５５３nmの吸光度を測定した。図３に、反応の時間
経過を示す。試液１ 2.7ｍに0.2ｍの尿検体を加
え、５分間反応後0.1ｍの試液２を加える。反応後の
発色は極めて安定であり、Ａはアミノブチルアルデヒド
をＨ2Ｏ2として測定した場合、Ｂはプトレシンオキシダ
ーゼにより生成するＨ2Ｏ2を測定した場合を示す。
図１：尿中のポリアミンのホルマザン系発色の時間経過 図２：尿へのプトレシン添加による希釈直線性（ホルマ
ザン発色系） 図３：尿中ポリアミンのペルオキシダーゼによる酸化発
色の時間経過
ザン発色系） 図３：尿中ポリアミンのペルオキシダーゼによる酸化発
色の時間経過
Claims (4)
- 【請求項１】生体試料中の成分を二電子受容体の還元を
利用する二電子還元系にて、光学的に測定する系におい
て、反応を妨害する還元性物質を安息香酸、パラヒドロ
キシ安息香酸、パラアミノ安息香酸およびジブロモフェ
ノールからなる群から選ばれた一電子受容体を用いて除
去することを特徴とする生体試料中の還元物質の除去
法。 - 【請求項２】生体試料中の成分を二電子受容体の還元を
利用する二電子還元系にて、光学的に測定する系がＮＡ
Ｄ（Ｐ）依存性脱水素酵素またはフラビン依存性脱水素
酵素および還元型発色色素を使用する二電子還元系であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生体試
料中の還元物質の除去法。 - 【請求項３】生体試料中の成分がポリアミンであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生体試料中の
還元物質の除去法。 - 【請求項４】生体試料中の成分を二電子受容体の還元を
利用する二電子還元系にて、光学的に測定する系が ａ）プトレシンオキシダーゼ ｂ）アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ ｃ）ＮＡＤ ｄ）ジアホラーゼ ｅ）アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび ｆ）ホルマザン系色素 を用いて、ホルマザン系色素の還元を測定する系である
ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の生体試料
中の還元物質の除去法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62035191A JPH0668490B2 (ja) | 1987-02-17 | 1987-02-17 | 生体試料中の還元物質の除去法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62035191A JPH0668490B2 (ja) | 1987-02-17 | 1987-02-17 | 生体試料中の還元物質の除去法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21421893A Division JPH07102155B2 (ja) | 1993-08-30 | 1993-08-30 | 生体試料中の還元物質の除去法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63201567A JPS63201567A (ja) | 1988-08-19 |
| JPH0668490B2 true JPH0668490B2 (ja) | 1994-08-31 |
Family
ID=12434961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62035191A Expired - Lifetime JPH0668490B2 (ja) | 1987-02-17 | 1987-02-17 | 生体試料中の還元物質の除去法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0668490B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02200199A (ja) * | 1989-01-30 | 1990-08-08 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | 血中胆汁酸の定量用組成物 |
| JP2694004B2 (ja) * | 1989-03-24 | 1997-12-24 | 三光純薬株式会社 | 血清又は血漿中のフルクトサミンの測定法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60262599A (ja) * | 1984-06-09 | 1985-12-25 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アスコルビン酸の新規な分解方法 |
| JPS6125498A (ja) * | 1984-07-13 | 1986-02-04 | Yatoron:Kk | 生体液中の成分の定量用試薬 |
| JPS6188153A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-05-06 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 生体微量成分の定量法 |
-
1987
- 1987-02-17 JP JP62035191A patent/JPH0668490B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63201567A (ja) | 1988-08-19 |
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