JPH05207895A - 還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法 - Google Patents
還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法Info
- Publication number
- JPH05207895A JPH05207895A JP25553992A JP25553992A JPH05207895A JP H05207895 A JPH05207895 A JP H05207895A JP 25553992 A JP25553992 A JP 25553992A JP 25553992 A JP25553992 A JP 25553992A JP H05207895 A JPH05207895 A JP H05207895A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nicotinamide adenine
- adenine dinucleotide
- dehydrogenase
- phosphate
- nad
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドまたは還元型および酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法に関する。 【構成】触媒の存在下NAD(P)HまたはNAD(P)を含む試料
とレサズリンまたはｐ−ヨードニトロテトラゾリュウム
ヴァイオレット（INT-V）を反応せしめて、それと共軛
するNAD(P)-NAD(P)Hサイクリングの基質と酵素系により
増幅された可視部の吸光度の変化を測定することを特徴
とするNAD(P)HまたはNAD(P)またはそれに関連する酵素
や基質または生成物の微量定量法。
ヌクレオチドまたは還元型および酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法に関する。 【構成】触媒の存在下NAD(P)HまたはNAD(P)を含む試料
とレサズリンまたはｐ−ヨードニトロテトラゾリュウム
ヴァイオレット（INT-V）を反応せしめて、それと共軛
するNAD(P)-NAD(P)Hサイクリングの基質と酵素系により
増幅された可視部の吸光度の変化を測定することを特徴
とするNAD(P)HまたはNAD(P)またはそれに関連する酵素
や基質または生成物の微量定量法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は還元型および酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型および
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下これらをNAD(P)HおよびNAD(P)という）の微量定
量法に関し、さらに詳しくは触媒の存在下NAD(P)Hを含
む試料とレサズリンまたはｐ−ヨードニトロテトラゾリ
ュウムヴァイオレット（INT-V）を反応せしめて、それ
と共軛するNAD(P)-NAD(P)Hサイクリングの基質と酵素系
により増幅された可視部の吸光度の変化を測定すること
を特徴とするNAD(P)Hまたはそれに関連する酵素や基質
または生成物の微量定量法に関する。
チンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型および
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（以下これらをNAD(P)HおよびNAD(P)という）の微量定
量法に関し、さらに詳しくは触媒の存在下NAD(P)Hを含
む試料とレサズリンまたはｐ−ヨードニトロテトラゾリ
ュウムヴァイオレット（INT-V）を反応せしめて、それ
と共軛するNAD(P)-NAD(P)Hサイクリングの基質と酵素系
により増幅された可視部の吸光度の変化を測定すること
を特徴とするNAD(P)Hまたはそれに関連する酵素や基質
または生成物の微量定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来のNAD(P)Hを定量する方法は、
（１）それ自身の有する紫外部の吸収または蛍光を測定
する方法、（２）ジアホラーゼ（DA）の存在下NAD(P)H
とMTTやニトロブルーなどのテトラゾリュウム化合物の
色原体を反応せしめてホルマザン色素に導き、その可視
部の吸収を測定する方法および（３）触媒の存在下NAD
(P)Hとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィン
の蛍光を測定する方法｛メソッズ イン エンザイモロ
ジ（Meth. Enzymol.）第41巻、53-56頁、1975年｝がし
られている。
（１）それ自身の有する紫外部の吸収または蛍光を測定
する方法、（２）ジアホラーゼ（DA）の存在下NAD(P)H
とMTTやニトロブルーなどのテトラゾリュウム化合物の
色原体を反応せしめてホルマザン色素に導き、その可視
部の吸収を測定する方法および（３）触媒の存在下NAD
(P)Hとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィン
の蛍光を測定する方法｛メソッズ イン エンザイモロ
ジ（Meth. Enzymol.）第41巻、53-56頁、1975年｝がし
られている。
【０００３】上記紫外部の吸収を測定する方法は、血清
などの生体体液を試料とする場合は共存する紫外部に吸
収をゆうする物質によって妨害をうけることおよび感度
が低いという欠点があり、また蛍光を測定する方法は測
定感度が高いにもかかわらず、蛍光光度計が高価で一般
的に普及していないため繁用されていない。
などの生体体液を試料とする場合は共存する紫外部に吸
収をゆうする物質によって妨害をうけることおよび感度
が低いという欠点があり、また蛍光を測定する方法は測
定感度が高いにもかかわらず、蛍光光度計が高価で一般
的に普及していないため繁用されていない。
【０００４】また上記ホルマザン色素を測定する方法は
該色素が難溶性であるため光度計のセルやチューブに付
着することおよび測定感度が低いという欠点がある。
該色素が難溶性であるため光度計のセルやチューブに付
着することおよび測定感度が低いという欠点がある。
【０００５】NAD(P)Hは脱水素酵素および還元酵素の補
酵素であり、生体体液中に存在するこれら酵素の測定ま
たはこれら酵素の基質となる生体体液中の成分の定量の
際に、酵素反応によって生じたNAD(P)Hの変化が測定さ
れるが、通常の比色法では感度が低い。
酵素であり、生体体液中に存在するこれら酵素の測定ま
たはこれら酵素の基質となる生体体液中の成分の定量の
際に、酵素反応によって生じたNAD(P)Hの変化が測定さ
れるが、通常の比色法では感度が低い。
【０００６】現在、生体体液中の成分の定量には酸化酵
素を用いる方法がもっぱら利用されているが、この方法
は試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの
還元性物質による妨害を受けやすいという欠点がある。
素を用いる方法がもっぱら利用されているが、この方法
は試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの
還元性物質による妨害を受けやすいという欠点がある。
【０００７】脱水素酵素または還元酵素を用いる方法は
このような還元性物質による影響を受けにくい有利な方
法であるが、前記した理由によりあまり利用されていな
いのが実状である。
このような還元性物質による影響を受けにくい有利な方
法であるが、前記した理由によりあまり利用されていな
いのが実状である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は前記した従来
のNAD(P)Hの定量に於ける欠点を改良した、簡便で高感
度な微量定量法を提供することを目的とする。
のNAD(P)Hの定量に於ける欠点を改良した、簡便で高感
度な微量定量法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者はNAD(P)Hおよ
びNAD(P)の定量法に関して、実用的に有利な発色色素を
利用する手段がないかと鋭意研究した結果、触媒の存在
下NAD(P)Hとレサズリンからレゾルフィンを生成せしめ
る反応に於いて、レサズリンおよびレゾルフィンが可視
部の特定の波長に吸収極大を有するという性質を利用し
てNAD(P)Hを定量する方法を見出した。
びNAD(P)の定量法に関して、実用的に有利な発色色素を
利用する手段がないかと鋭意研究した結果、触媒の存在
下NAD(P)Hとレサズリンからレゾルフィンを生成せしめ
る反応に於いて、レサズリンおよびレゾルフィンが可視
部の特定の波長に吸収極大を有するという性質を利用し
てNAD(P)Hを定量する方法を見出した。
【００１０】即ち、レサズリンは微アルカリ性側で600n
m附近に吸収極大を有する青色物質であり、一方レゾル
フィンは570nm附近に吸収極大を有する赤色物質である
から、それぞれの吸収極大附近の波長における吸光度を
測定することによりNAD(P)Hが定量される。NAD(P)Hとレ
サズリンの反応式を次にしめす。
m附近に吸収極大を有する青色物質であり、一方レゾル
フィンは570nm附近に吸収極大を有する赤色物質である
から、それぞれの吸収極大附近の波長における吸光度を
測定することによりNAD(P)Hが定量される。NAD(P)Hとレ
サズリンの反応式を次にしめす。
【００１１】
【化１】
【００１２】またINT-Vもレサズリンに比べ感度は低い
が同様に使用出来、そのホルマザンの492nmの吸収を測
定する。本発明のNAD(P)HおよびNAD(P)の感度はマイク
ロプレートを使用すれば、さらに高められる。
が同様に使用出来、そのホルマザンの492nmの吸収を測
定する。本発明のNAD(P)HおよびNAD(P)の感度はマイク
ロプレートを使用すれば、さらに高められる。
【００１３】本発明によるNAD(P)HおよびNAD(P)の定量
はNAD(P)HおよびNAD(P)を補酵素とする酸化還元酵素の
活性の測定または該酵素を用いた基質の測定に利用する
ことができる。
はNAD(P)HおよびNAD(P)を補酵素とする酸化還元酵素の
活性の測定または該酵素を用いた基質の測定に利用する
ことができる。
【００１４】このような酸化還元酵素の例としては、ガ
ラクトース脱水酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、ロ
イシン脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素
酵素（ADH）、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水
素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、α−グリ
セロリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ピロ
リン−５−カルボン酸還元酵素などが挙げられ、請求項
１記載の基質と酵素とに制限を受けない。
ラクトース脱水酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、ロ
イシン脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素
酵素（ADH）、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水
素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、α−グリ
セロリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ピロ
リン−５−カルボン酸還元酵素などが挙げられ、請求項
１記載の基質と酵素とに制限を受けない。
【００１５】
実施例１ レサズリンによるNAD(P)Hの定量 レサズリン40または100nmol、DA（ベーリンガー製）20
または60mU、ADH（オリエンタル酵母製）16.6mU、８％
エタノール10μl、0.3Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を
含む250μlの反応液を標準試料のNAD(P)Hを0.1、0.2、
0.3、0.5、0.7、１、２、３nmolを入れたマイクロプレ
ートに加えて、37℃、10または30分間反応後停止液とし
て10mM Cu++溶液10μl加えてマイクロプレート方式の
分光光度計（コロナ電気製MTP-32型）を使って反応液の
630nmまたは550nmに於ける吸光度を測定した結果の検量
線を図１に示す。
または60mU、ADH（オリエンタル酵母製）16.6mU、８％
エタノール10μl、0.3Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を
含む250μlの反応液を標準試料のNAD(P)Hを0.1、0.2、
0.3、0.5、0.7、１、２、３nmolを入れたマイクロプレ
ートに加えて、37℃、10または30分間反応後停止液とし
て10mM Cu++溶液10μl加えてマイクロプレート方式の
分光光度計（コロナ電気製MTP-32型）を使って反応液の
630nmまたは550nmに於ける吸光度を測定した結果の検量
線を図１に示す。
【００１６】上記の標準試料に代えて濃度未知の試料を
用いて上記と同様の操作を行ない得られた吸光度を図１
の検量線と対比して試料中のNAD(P)Hを定量出来る。
用いて上記と同様の操作を行ない得られた吸光度を図１
の検量線と対比して試料中のNAD(P)Hを定量出来る。
【００１７】実施例２ INT-VによるNAD(P)Hの定量 INT-V 40または400nmol、DA 200mU、ADH 16.6U、0.8
%エタノール10μlを含む130μlを試料のNAD(P)H 0.1、
0.3、0.5、１、２、３、５nmolを入れたマイクロプレー
ト中に加えて、37℃、10分反応後停止液10mM Cu++溶液
10μl添加後マイクロプレートリーダー（東洋ソーダ製M
PR-A4）を用いて反応液の492〜415nmの吸光度を測定し
た結果の検量線が図２である。
%エタノール10μlを含む130μlを試料のNAD(P)H 0.1、
0.3、0.5、１、２、３、５nmolを入れたマイクロプレー
ト中に加えて、37℃、10分反応後停止液10mM Cu++溶液
10μl添加後マイクロプレートリーダー（東洋ソーダ製M
PR-A4）を用いて反応液の492〜415nmの吸光度を測定し
た結果の検量線が図２である。
【００１８】上記の標準試料に代えて濃度未知の試料で
同様の操作を行ない、得られた吸光度を上記検量線と対
比することにより試料中のNAD(P)Hが定量される。
同様の操作を行ない、得られた吸光度を上記検量線と対
比することにより試料中のNAD(P)Hが定量される。
【００１９】実施例３ ガラクトースとガラクトース１
燐酸の定量 ガラクトースまたはガラクトース１燐酸を含む標準血液
濾紙（2、4、6、8、10、16、20mg/dl）3mm径１個をマイ
クロプレートの中で血色素固定後、下記の反応液30μl
を入れ37℃、1時間反応する。Ｉ液（NAD 100nmol、ア
ルカリフォスファターゼ 200mU、βガラクトース脱水
素酵素 25mUの0.02M トリス−塩酸緩衝液）、II液
（Ｉ液からアルカリフォスファターゼを除く）、III 液
（Ｉ液からβガラクトース脱水素酵素を除く）を目的に
応じて使用する。
燐酸の定量 ガラクトースまたはガラクトース１燐酸を含む標準血液
濾紙（2、4、6、8、10、16、20mg/dl）3mm径１個をマイ
クロプレートの中で血色素固定後、下記の反応液30μl
を入れ37℃、1時間反応する。Ｉ液（NAD 100nmol、ア
ルカリフォスファターゼ 200mU、βガラクトース脱水
素酵素 25mUの0.02M トリス−塩酸緩衝液）、II液
（Ｉ液からアルカリフォスファターゼを除く）、III 液
（Ｉ液からβガラクトース脱水素酵素を除く）を目的に
応じて使用する。
【００２０】反応後0.02M トリス塩酸緩衝液（pH8.0）
70μlを入れ混合して、その80μlを測定用のマイクロプ
レートに分注し、1N NaOH 10μl加えプレートにシー
ルを貼り60℃、15分放置後、3N HClと1Mトリス塩酸緩
衝液（pH8）70μlで中和し、レサズリン100nmol、ADH
16.6U、DA 60mU、８％エタノール10μl 総量220ulを
加えて37℃、30分反応後停止液10μlで反応を止め、630
nmの吸光度を測定した結果を図３にしめす。
70μlを入れ混合して、その80μlを測定用のマイクロプ
レートに分注し、1N NaOH 10μl加えプレートにシー
ルを貼り60℃、15分放置後、3N HClと1Mトリス塩酸緩
衝液（pH8）70μlで中和し、レサズリン100nmol、ADH
16.6U、DA 60mU、８％エタノール10μl 総量220ulを
加えて37℃、30分反応後停止液10μlで反応を止め、630
nmの吸光度を測定した結果を図３にしめす。
【００２１】未知濃度の試料を上記と同様に操作し検量
線と対比して求めるが、その時ガラクトース１燐酸はＩ
液−II液から、ガラクトースはII液−III液からその濃
度を計算することが出来る。また上記の反応系のレサズ
リンだけをINT-V 40nmolにすると図３の検量線にな
る。
線と対比して求めるが、その時ガラクトース１燐酸はＩ
液−II液から、ガラクトースはII液−III液からその濃
度を計算することが出来る。また上記の反応系のレサズ
リンだけをINT-V 40nmolにすると図３の検量線にな
る。
【００２２】実施例４ フェニルアラニンの定量 マイクロプレート中にフェニルアラニンを含む標準血液
濾紙（2、4、6、8、12、20mg/dl）デイスク3mm径１個を
入れ、0.3Nトリクロル酢酸50ulを加えて、10分間混合し
た後、NAD 33mg、 フェニルアラニン脱水素酵素（チバ
コーニング製）33U/mlの150ulを含む0.2M グリシンKCl
-KOH緩衝液（pH10.4）16ml溶液の150μlを添加して37
℃、１時間反応後その内の100μlを測定用マイクロプレ
ートに分注し、1N NaOH 15μlを入れて、シールを貼
り、60℃、15分放置後中和し、INT-V 40nmol、ADH 1
6.6U、DA 200mU、８％エタノール10μl 総量230μlで
反応させ10分後に停止液10μlを加えて492〜415nmの吸
光度を測定した結果が図３の検量線である。
濾紙（2、4、6、8、12、20mg/dl）デイスク3mm径１個を
入れ、0.3Nトリクロル酢酸50ulを加えて、10分間混合し
た後、NAD 33mg、 フェニルアラニン脱水素酵素（チバ
コーニング製）33U/mlの150ulを含む0.2M グリシンKCl
-KOH緩衝液（pH10.4）16ml溶液の150μlを添加して37
℃、１時間反応後その内の100μlを測定用マイクロプレ
ートに分注し、1N NaOH 15μlを入れて、シールを貼
り、60℃、15分放置後中和し、INT-V 40nmol、ADH 1
6.6U、DA 200mU、８％エタノール10μl 総量230μlで
反応させ10分後に停止液10μlを加えて492〜415nmの吸
光度を測定した結果が図３の検量線である。
【００２３】未知濃度の試料は上記と同様の操作を行な
い検量線と対比して求めることが出来る。
い検量線と対比して求めることが出来る。
【００２４】実施例５ 蛍光および比色に及ぼすNAD(P)
濃度の影響[NAD(P)Hの酸分解法における] ガラクトース16mg/dl血液デイスク3mm径１個［血色素固
定法で処理：特許出願番号昭和57年特許願第149466号：
血液成分の測定法］、NAD １〜９nmol、β−ガラクト
ース脱水素酵素 25mu、0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH8）
20μlを含む30μlの二系列を37℃、１時間反応させ、一
方には蒸留水200μlをいれ混合しその200μlをストリッ
プウエルに移しコロナ蛍光光度計（MTP100型）によりEx
360nm、Em450nmで測定した。
濃度の影響[NAD(P)Hの酸分解法における] ガラクトース16mg/dl血液デイスク3mm径１個［血色素固
定法で処理：特許出願番号昭和57年特許願第149466号：
血液成分の測定法］、NAD １〜９nmol、β−ガラクト
ース脱水素酵素 25mu、0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH8）
20μlを含む30μlの二系列を37℃、１時間反応させ、一
方には蒸留水200μlをいれ混合しその200μlをストリッ
プウエルに移しコロナ蛍光光度計（MTP100型）によりEx
360nm、Em450nmで測定した。
【００２５】他方には上記緩衝液70μlを加え混合し、
その80μlを測定用マイクロプレートに移し、その中に1
N HCl 10μlをいれ室温または37℃、10〜15分放置しN
ADHを分解し、1M 同緩衝液（pH8）20μlで中和後、そ
の中にレサズリン100または150nmol 10μl、８％エタ
ノール10μl、ADH 16.6U 10μl、DA ２〜６mU 10μ
lを加え37℃、30〜60分後に停止液10mM CU++10μlをい
れて東洋ソーダ製プレートリーダーの620nm/415nmで測
定し、ガラクトース0mg/dlまたはblankをゼロ補正して
計算する。
その80μlを測定用マイクロプレートに移し、その中に1
N HCl 10μlをいれ室温または37℃、10〜15分放置しN
ADHを分解し、1M 同緩衝液（pH8）20μlで中和後、そ
の中にレサズリン100または150nmol 10μl、８％エタ
ノール10μl、ADH 16.6U 10μl、DA ２〜６mU 10μ
lを加え37℃、30〜60分後に停止液10mM CU++10μlをい
れて東洋ソーダ製プレートリーダーの620nm/415nmで測
定し、ガラクトース0mg/dlまたはblankをゼロ補正して
計算する。
【００２６】その結果蛍光ではNAD ３nmolまではNAD量
に比例しそれ以上は一定の蛍光量となる（図４の上）。
しかし比色ではレサズリン150nmolでNAD 2.6nmolが、
レサズリン100nmolではNAD 2nmolで最大吸収となる
（図４の中と下）。
に比例しそれ以上は一定の蛍光量となる（図４の上）。
しかし比色ではレサズリン150nmolでNAD 2.6nmolが、
レサズリン100nmolではNAD 2nmolで最大吸収となる
（図４の中と下）。
【００２７】実施例６ NADH分解法によるガラクトース
の定量 ガラクトースを含む標準血液濾紙（2、4、6、8、10、1
6、20mg/dl）3mm径１個をマイクロプレートにいれ、実
施例５と同様に血色素固定後、NAD 2.0、2.4、2.6、3.
0nmol以外は実施例５と同じ条件で反応させ測定した。
の定量 ガラクトースを含む標準血液濾紙（2、4、6、8、10、1
6、20mg/dl）3mm径１個をマイクロプレートにいれ、実
施例５と同様に血色素固定後、NAD 2.0、2.4、2.6、3.
0nmol以外は実施例５と同じ条件で反応させ測定した。
【００２８】その結果NAD 2.6nmolが最も感度が高く、
ガラクトース0〜20mg/dlで1.8 ODあり、また0〜10mg/d
lで1.1 ODとNAD分解法より高感度である。NAD 2.4と
3.0nmolはやや感度がおちるが同じレベルであった。未
知試料を上記標準試料と同様の操作を行い、得られた吸
光度を上記検量線と対比することにより試料中のガラク
トース量を定量する。
ガラクトース0〜20mg/dlで1.8 ODあり、また0〜10mg/d
lで1.1 ODとNAD分解法より高感度である。NAD 2.4と
3.0nmolはやや感度がおちるが同じレベルであった。未
知試料を上記標準試料と同様の操作を行い、得られた吸
光度を上記検量線と対比することにより試料中のガラク
トース量を定量する。
【００２９】
【発明の効果】本発明による可視吸光光度計を用いる簡
便な方法により微量で高感度なNAD(P)HおよびNAD(P)の
定量が可能と成った。また、本発明の波及的効果とし
て、試料中に共存する還元性物質による妨害を受けにく
いこの補酵素の関与する酸化還元酵素の測定法または該
酵素を用いる生体液成分の微量定量法が確立された。
便な方法により微量で高感度なNAD(P)HおよびNAD(P)の
定量が可能と成った。また、本発明の波及的効果とし
て、試料中に共存する還元性物質による妨害を受けにく
いこの補酵素の関与する酸化還元酵素の測定法または該
酵素を用いる生体液成分の微量定量法が確立された。
【図１】本発明によるレサズリンによるNAD(P)Hの微量
定量に於ける検量線である。
定量に於ける検量線である。
【図２】本発明のINT-VによるNAD(P)Hの微量定量に於け
る検量線である。
る検量線である。
【図３】本発明のNAD(P)Hの定量法を利用したガラクト
ース及びガラクトース１燐酸の定量に於けるレサズリン
とINT-Vを用いた時の検量線及び本発明のNAD(P)Hの定量
法を利用したフェニルアラニンの定量に於ける検量線を
示す図である。
ース及びガラクトース１燐酸の定量に於けるレサズリン
とINT-Vを用いた時の検量線及び本発明のNAD(P)Hの定量
法を利用したフェニルアラニンの定量に於ける検量線を
示す図である。
【図４】NAD(P)濃度と生成蛍光量及びNAD(P)H酸分解法
による比色法の吸光度を示す図である。
による比色法の吸光度を示す図である。
【図５】NADH酸分解法によるガラクトースの検量線を示
す図である。
す図である。
Claims (10)
- 【請求項１】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸を補酵素とする生体中の酵素基質と酵素の共軛
反応系を用いて、反応後の未反応または残存ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸あるいは還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸か、生成した還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチ
ンアミノアデニンジヌクレオチドリン酸あるいはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸かのいずれかを完全に分
解させた後に、この試料とレサズリンまたはｐ−ヨード
ニトロテトラゾリュウムヴァイオレットの色素をデイア
フォラーゼの触媒の存在下で反応せしめ、更にアルコー
ル脱水素酵素の触媒とアルコールの様にニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドを補酵素とする系またはグルコ
ース６リン酸脱水素酵素の触媒とグルコース６リン酸の
様にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補
酵素とする系によりサイクリングをすることにより増幅
され感度を高めて生じた可視部に於ける吸光度の変化を
測定することを特徴とする還元型および酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型および酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量
定量法。 - 【請求項２】レサズリンに由来する600〜630nmに於ける
吸光度の変化を測定する請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項３】反応により生成したレゾルフィンに由来す
る550nmに於ける吸光度の変化を測定する請求項１記載
の微量定量法。 - 【請求項４】反応により生成したp-ヨードニトロテトラ
ゾリュムフォルマザンに由来する492nmに於ける吸光度
の変化を測定する請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項５】触媒がデイアフォラーゼやN-メチルフェナ
ジンメトサルフェートである請求項１記載の微量定量
法。 - 【請求項６】マイクロプレート方式の分光光度計を用い
て吸光度を測定する請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項７】反応後の未反応のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸をpH12〜13附近にて60℃放置で分解後、目
的のpHに調節してサイクリングによる増幅で感度を高め
る請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項８】反応後に生成した還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸をpH１〜２付近にて室温また
は37℃で分解後、目的のpHに調節してサイクリングによ
る増幅で感度を高める請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項９】請求項１記載の生体中の酵素基質が、ガラ
クトース（ガラクトース−１−リン酸も含む）、フェニ
ルアラニン、ロイシン、（バリン、イソロイシンも含
む）、乳酸、アルコール類、リンゴ酸、グルタミン酸、
グルコース−６−リン酸、６−ホスホグルコン酸、α−
グリセロリン酸、グリセロール、ピロリン−５’−カル
ボン酸などを測定する請求項１記載の微量定量法。 - 【請求項１０】請求項１記載の生体中の酵素が、ガラク
トース脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、ロイ
シン脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素（ＡＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水
素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホス
ホグルコン酸脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵
素、グリセロール脱水素酵素、ピロリン−５’−カルボ
ン酸還元酵素などを測定する請求項１記載の微量定量
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25553992A JPH05207895A (ja) | 1991-09-11 | 1992-08-31 | 還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30858091 | 1991-09-11 | ||
| JP3-308580 | 1991-09-11 | ||
| JP25553992A JPH05207895A (ja) | 1991-09-11 | 1992-08-31 | 還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05207895A true JPH05207895A (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=26542268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25553992A Pending JPH05207895A (ja) | 1991-09-11 | 1992-08-31 | 還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05207895A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6344332B1 (en) * | 1997-09-05 | 2002-02-05 | Thaco Research, Ltd. | Methods for the rapid detection of actively respiring microorganisms |
| WO2006022113A1 (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Toyama Prefecture | His-Tag融合フェニルアラニン脱水素酵素を用いた固定化酵素チップによるL-フェニルアラニンの定量方法 |
| WO2015076361A1 (ja) * | 2013-11-21 | 2015-05-28 | 国立大学法人東京大学 | 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 |
-
1992
- 1992-08-31 JP JP25553992A patent/JPH05207895A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6344332B1 (en) * | 1997-09-05 | 2002-02-05 | Thaco Research, Ltd. | Methods for the rapid detection of actively respiring microorganisms |
| WO2006022113A1 (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Toyama Prefecture | His-Tag融合フェニルアラニン脱水素酵素を用いた固定化酵素チップによるL-フェニルアラニンの定量方法 |
| WO2015076361A1 (ja) * | 2013-11-21 | 2015-05-28 | 国立大学法人東京大学 | 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 |
| JP5875096B2 (ja) * | 2013-11-21 | 2016-03-02 | 国立大学法人 東京大学 | 蛍光又は吸光度の検出方法、バックグラウンド抑制方法、ａｄｐの測定方法、ａｄｐを生成する酵素の活性測定方法、及び糖転移酵素の活性測定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0496730B1 (en) | Method and reagent for determination of an analyte via enzymatic means using a ferricyanide/ferric compound system | |
| JPS58175498A (ja) | 液体中の物質の測定用試験系および試験方法 | |
| JPH0687793B2 (ja) | 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 | |
| EP0124909A2 (en) | Process for determining reduced form coenzymes | |
| EP0639646B1 (en) | High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| JPS6357040B2 (ja) | ||
| US6130054A (en) | Test strip for creatine kinase activity measurement | |
| US7122333B2 (en) | Method and reagent for visually measuring ATP | |
| JPH05207895A (ja) | 還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の微量定量法 | |
| US5286627A (en) | Method of high-sensitive analysis of bile acid and reagent composition for the analysis | |
| JPH06217799A (ja) | 物質の測定法 | |
| KR970001814B1 (ko) | 체액중의 성분 농도 측정방법 | |
| JPS63248397A (ja) | Ｄ−マンノ−スの定量法 | |
| JP3981190B2 (ja) | コレステロールの定量方法及び定量用試薬 | |
| JPS6191570A (ja) | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の定量法 | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JPS63254998A (ja) | 微量のピリジンヌクレオチド補酵素分析法 | |
| JPH08256794A (ja) | カルシウム測定用試薬 | |
| JPS63116700A (ja) | 微量物質の分析方法 | |
| JPH0668490B2 (ja) | 生体試料中の還元物質の除去法 | |
| JPS61237060A (ja) | 化学発光法による生体成分の定量法 | |
| JPH0779714B2 (ja) | Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 | |
| JPH0654318B2 (ja) | 還元性物質の定量方法及びその定量用試薬 | |
| JPS62232398A (ja) | 酵素活性または基質の測定法 | |
| JPS62138200A (ja) | 還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の分析法 |