JPH08298996A - Ｄ−ソルビトールの測定方法およびその測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】糖尿病、腎不全などの診断に有用な簡便で特異
的なＤ−ソルビトールの測定方法およびその測定用キッ
トを提供する。 【構成】検体に、Ｄ−グルコースを消去する前処理を施
した後、Ｄ−ソルビトールを酸化し得る酵素を作用さ
せ、該酵素反応によるＤ−ソルビトールの酸化で生成し
たＤ−グルコースに特異性の高い酵素などを作用させて
該グルコースを検出する特異的なＤ−ソルビトールの測
定方法およびその測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、簡便で特異的なＤ−ソ
ルビトールの測定方法およびその測定用キットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｄ−ソルビトールの測定方法に
は、ソルビトール脱水素酵素(EC 1.1.1.14) を使用し、
Ｄ−ソルビトールの脱水素反応によってＤ−フルクトー
スを生成させ、このＤ−フルクトースの６位をヘキソキ
ナーゼ(EC 2.7.1.1)でリン酸化し、生成したＤ−フルク
トース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸イソメラ
ーゼ(EC 5.3.1.9)でＤ−グルコース−６−リン酸に異性
化し、このＤ−グルコース−６−リン酸のグルコース−
６−リン酸脱水素酵素(EC 1.1.1.49) による脱水素反応
によって生成した補酵素ＮＡＤＰの還元体であるＮＡＤ
ＰＨの吸光度を測定する方法（ベーリンガー社のキッ
ト) が知られている。

【０００３】また、ソルビトール脱水素酵素(EC 1.1.1.
14) を使用し、Ｄ−ソルビトールの脱水素反によって生
成した補酵素ＮＡＤの還元体であるＮＡＤＨの蛍光強度
を測定する方法(Clin. Chem.34 2327 (1988)、特開平６
−１０９７２６) 、ソルビトール脱水素酵素(EC 1.1.1.
14) を使用し、この酵素の補酵素であるＮＡＤＨとチオ
−ＮＡＤの共存下にＤ−ソルビトールの脱水素反応と逆
反応のＤ−フルクトースの還元反応を行い、この酵素サ
イクリング反応によって生成したチオ−ＮＡＤの還元体
であるチオ−ＮＡＤＨの吸光度を測定する方法（特開平
４−３４９８９７）等が知られている。

【０００４】更に、ソルビトール脱水素酵素（特開昭５
６−２９９９４）を使用し、電子伝達体の１−メトキシ
−５−フェナゾリウムメチルサルフェイト（１−ＭＰＭ
Ｓ）と還元発色性色素のテトラゾリウム塩の存在下にＤ
−ソルビトールの脱水素反応を行い、この反応によって
生成したホルマザン色素の吸光度を測定する方法（特開
平６−１８９７９０）が知られている。

【０００５】また、ソルビトール脱水素酵素（特開昭５
６−２９９９４）を使用し、１−ＭＰＭＳの存在下にＤ
−ソルビトールの脱水素反応を行い、この反応によって
生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼを使用する各
種検出法で測定する方法（特開平６−２０９７９３）、
ソルビトール酸化酵素（特開平６−１６９７６４）を使
用し、酸素の存在下にＤ−ソルビトールを酸化し、この
反応によって生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ
を使用する各種検出法で、測定する方法（特開平６−１
６９７６４）等が知られてる。

【０００６】しかしながら、Ｄ−ソルビトールの２位を
酸化してＤ−フルクトースを生成させるソルビトール脱
水素酵素(EC 1.1.1.14）やＤ−ソルビトールの１位を酸
化してＤ−グルコースを生成させるソルビトール酸化酵
素（特開平６−１６９７６４）を使用する何れの測定法
においても、それぞれの酵素の基質特異性が悪いことか
ら、Ｄ−ソルビトールの測定値の信頼性には疑問があ
る。従って、これらの測定法の対象とする検体としては
Ｄ−ソルビトールの含有量が多く且つ干渉する成分の含
有量が少ない食品や赤血球などに限定されている。

【０００７】一方、酢酸菌の細胞膜由来であり、Ｄ−ソ
ルビトールの５位を酸化してＬ−ソルボースを生成させ
るソルビトール脱水素酵素（特開昭５６−２９９９４）
を使用するＤ−ソルビトールの測定法においては、Ｄ−
ソルビトールに対する特異性が高いとは言え、熱安定性
に問題があり、診断薬を開発する上で、実用的ではなか
った。この様に、ソルビトールの含有量が少なく、測定
に干渉する基質成分が相対的に多い血清や血漿につい
て、酵素法で正確に測定できたとの報告は未だにない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記実情に
鑑みなされたものであり、本発明の目的は、複雑な前処
理操作を必要とせず、汎用型の自動生化学測定装置にも
対応可能であり、簡便で特異性の高いＤ−ソルビトール
の測定法の提供に存する。また、本発明の他の目的は、
腎不全、糖尿病などの診断に利用できるＤ−ソルビトー
ルの測定用キットの提供に存する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｄ−ソルビト
ールを酸化してＤ−グルコースを生成する酸化酵素が、
効率よくＤ−ソルビトールを酸化して定量的にＤ−グル
コースを生成すること、この反応によって生成したＤ−
グルコースをＤ−グルコースの検出系と組み合わせ、更
に特定の前処理と組み合わせることにより、Ｄ−ソルビ
トールに対して極めて特異性の高い測定系になることを
見いだし、本発明に至ったものである。

【００１０】すなわち、本発明の第１の要旨は、Ｄ−ソ
ルビトールとＤ−グルコースを含有する検体に、Ｄ−グ
ルコースを消去する前処理を施した後、Ｄ−ソルビトー
ルを酸化してＤ−グルコースを生成させる酸化酵素を作
用させ、該酵素反応によるＤ−ソルビトールの酸化で生
成したＤ−グルコースを検出することにより、検体中の
Ｄ−ソルビトールを特異的に測定する方法に関する。

【００１１】本発明の第２の要旨は、Ｄ−ソルビトール
を酸化してＤ−グルコースを生成する酸化酵素がソルビ
トールオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ又はマ
ンニトールオキシダーゼであるＤ−ソルビトールの測定
方法に関する。

【００１２】本発明の第３の要旨は、Ｄ−グルコースを
消去する前処理の方法およびＤ−グルコースを検出する
方法がグルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダー
ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼを使用するＤ−ソルビト
ールの測定方法に関する。

【００１３】本発明の第４の要旨は、Ｄ−グルコースを
消去する前処理剤、Ｄ−ソルビトールを酸化してＤ−グ
ルコースを生成させる酸化酵素およびＤ−グルコース検
出試薬を含有するＤ−ソルビトール測定用キットに関す
る。

【００１４】更に、本発明の第５の要旨は、Ｄ−グルコ
ース消去用前処理とＤ−ソルビトール検出試薬に同一酵
素を使用するＤ−ソルビトール測定用キットに関にす
る。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
で、Ｄ−ソルビトール測定の対象となる検体とは、Ｄ−
ソルビトールの測定を必要とするものであれば特に制限
されない。例えば、Ｄ−ソルビトールとＤ−グルコース
を含有する生体試料、食品、それらの抽出液や各種の処
理液などが挙げられる。また、Ｄ−ソルビトールは、腎
不全や糖尿病の診断指標として期待されており、生体試
料としては、赤血球、血漿、血清、組織の抽出液、尿な
どが有用である。

【００１６】本発明で使用されるＤ−ソルビトールを酸
化してＤ−グルコースを生成させる酸化酵素としては、
Ｄ−ソルビトールの１位を酸化してＤ−グルコースを生
成させる能力のある酵素であれば特に制限されない。

【００１７】アルコール基を酸化する酵素は、電子受容
体の種類により、(1) ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ⁺ ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェート（ＮＡＤＰ⁺ ）を電子受容体とす
るもの、(2) シトクロムを電子受容体とするもの、(3)
酸素を電子受容体とするもの、(4) その他に分類（酵素
ハンドブック：丸尾文治、田宮信雄監修；朝倉書店）さ
れているが、Ｄ−ソルビトールからＤ−グルコースを生
成させる能力があれば、何れのものであってもよい。

【００１８】例えば、酸素を電子受容体とする酸化酵素
としては、キサントモナスに属する微生物由来のソルビ
トールオキシダーゼ（特開平６−１６９７６４）、スト
レプトミセスに属する微生物由来のキシリトールオキシ
ダーゼ（例えば、工業技術院生命工学工業技研究所寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９由来のキシリトールオキ
シダーゼ）、蝸牛由来のマンニトールオキシダーゼ(In
t. J. Biochem. 18 337-344(1986)) 等が挙げられる。

【００１９】下記に本発明で使用できるストレプトミセ
スに属する微生物由来のキシリトールオキシダーゼ（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４３３９由来のキシリトールオキシダー
ゼ）の一例を示す。

【００２０】

【表１】 (1) 作用 ：酸素の存在下、キシリト
ール及びＤ−ソルビトールを酸化し、過酸化水素、Ｄ−
キシロース及びＤ−グルコースを生成する。 (2) 基質特異性 ：Ｄ−ソルビトール、キシ
リトール、Ｄ−ガラクチトール等に強く作用し、Ｄ−マ
ンニトール、Ｄ−アラビニトール等にも作用する。 (3) 至適 pH 及び pH 安定性：至適 pH は７．５付近で
あり、安定 pH 範囲は５．５〜１０．５である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度は５５℃付近で
あり、 pH ７．５で３０分間の処理では、６５℃まで安
定である。 (5) 阻害剤 ：塩化銅、塩化水銀、硝酸
銀等で強く阻害される。 (6) 分子量 ：ゲル濾過法で測定した分
子量は約４３，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量
も約４３，０００である。

【００２１】本発明で使用されるＤ−グルコースを検出
する方法としては、実質的にＤ−グルコースに特異性が
高い検出方法であれば何れの方法であってもよく、公知
の化学的な方法から生化学的な方法まで幅広く包含し、
特に制限されるものではない。特に好ましくは、Ｄ−グ
ルコースに対して特異性に優れ、汎用型の自動生化学測
定装置に適用可能な、酵素を使用するＤ−グルコースの
検出法がある。

【００２２】この酵素を使用するＤ−グルコースの検出
法としては、血糖測定用試薬として販売されている既存
の方法がそのまま利用できる。具体例としては、グル
コースオキシダーゼ（ＧＯＤ：EC 1.1.3.4）を使用して
Ｄ−グルコースを酸化し、その反応で生成した過酸化水
素を比色法で検出する方法、ピラノースオキシダーゼ
（ＰＲＯＤ：EC 1.1.3.10)を使用してＤ−グルコースを
酸化し、その反応で生成した過酸化水素を比色法で検出
する方法などが知られている。

【００２３】また、グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＤＨ：EC 1.1.1.47 ）を使用し、補酵素ＮＡＤ⁺ 又はＮ
ＡＤＰ⁺ 〔ＮＡＤ（Ｐ）と略す〕の存在下にＤ−グルコ
ースを脱水素反応し、その反応で生成した補酵素の還元
体であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略
す〕の吸光度を比色法で検出する方法などが知られてい
る。

【００２４】更に、アデノシントリホスフェ−ト（Ａ
ＴＰ）の存在下、ヘキソキナーゼ（ＨＫ：EC 2.7.1.1）
又はグルコキナーゼ（ＧＫ：EC 2.7.1.2）でＤ−グルコ
ースをリン酸化し、生成したＤ−グルコース−６−リン
酸を補酵素ＮＡＤＰ⁺ の存在下にグルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ：EC 1.1.1.49)
を使用して脱水素反応し、その反応により生成した補酵
素の還元体であるＮＡＤＰＨの吸光度を比色法で検出す
る方法などが知られている。

【００２５】さらに詳しくは、酵素を使用してＤ−グル
コースを検出する方法においては、前記の酵素反応また
は酵素反応系を使用して、電子受容体をＤ−グルコース
の存在量を検出し易い中間物質、例えば、過酸化水素や
補酵素の還元体へ酵素的に変換し、最終的には、これら
の中間物質を安定かつ高感度に検出することによって実
施され得る。この中間物質が過酸化水素の場合は、過酸
化水素の検出法として知られている比色法、蛍光法、化
学発光法、電極法などが使用できる。

【００２６】比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色
させ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダ
ーゼの基質としては、０−フェニレンジアミン、５−ア
ミノサリチル酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジン等の芳香属アミン系の物質、トリンダー系試薬
と称するフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−ト
リヨード安息香酸などのフェノール系の物質やＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等の
アニリン系の物質と４−アミノアンチピリンの組み合わ
せ等が利用できる。

【００２７】更に、２，２’−アジノビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、１０（メチルア
ミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−
フェノチアジン、１０（カルボキシメチルアミノカルボ
ニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチア
ジン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−
４−ジメチル−アミノフェニル〕アミン等の過酸化水素
検出用の高感度基質とされる物質などが利用できる。

【００２８】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強
度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質とし
ては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸
エステル類の化合物などが利用できる。

【００２９】中間物質が補酵素ＮＡＤ⁺ 、ＮＡＤＰ⁺ 、
チオ−ＮＡＤ⁺ 、チオ−ＮＡＤＰ⁺等の還元体であるＮ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰ
Ｈ等の場合は、これら補酵素の還元体の検出法として公
知の方法が利用できる。例えば、補酵素の還元体の吸
光度や蛍光強度を、直接測定する方法、酵素のジアホ
ラーゼ又は電子伝達体の１−ＭＰＭＳ等を使用し、補酵
素の還元体であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤ
Ｈ、チオ−ＮＡＤＰＨ等と還元発色性色素の各種テトラ
ゾリウム塩類とを反応させ、この反応によって生成する
ホルマザン色素の吸光度を測定する方法がある。

【００３０】また、脱水素酵素を使用し、補酵素とし
てＮＡＤ（Ｐ）Ｈとチオ−ＮＡＤ（Ｐ）の共存下、この
酵素のチオ−ＮＡＤ（Ｐ）による脱水素反応とＮＡＤ
（Ｐ）Ｈによるこの逆反応の還元反応をサイクルさせ、
この酵素の基質を介する酵素サイクリング反応によって
生成するチオ−ＮＡＤ（Ｐ）の還元体であるチオ−ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの吸光度を測定する方法などがある。

【００３１】更に、補酵素の還元体の酸化酵素または
電子伝達体の１−ＭＰＭＳ等によって補酵素の還元体で
あるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−Ｎ
ＡＤＰＨ等を酸化し、この時発生する過酸化水素を、前
記の過酸化水素の検出法で検出する方法がある。

【００３２】本発明で使用されるＤ−グルコースを消去
する前処理とは、Ｄ−ソルビトールの検出を妨害する内
因性のＤ−グルコースを消去する方法である。Ｄ−グル
コースの消去法としては、前記のＤ−ソルビトールの検
出を妨害しない方法であれば何でもよく、Ｄ−グルコー
スを除去する方法と、Ｄ−グルコースを別物質に変換す
る方法がある。

【００３３】Ｄ−グルコースを除去する方法としては、
物理的に樹脂に吸着させ除去する方法がある。すなわ
ち、強塩基性樹脂が、アルドースやケトースを吸着する
性質を利用するものであり、強塩基性樹脂を充填したカ
ラムに検体を通し、Ｄ−グルコースを吸着し、吸着され
ずに溶出してきたＤ−ソルビトールを検出する方法（特
開平３−４７０９４）である。

【００３４】Ｄ−グルコースを別物質に変換する方法と
しては、化学的または生化学的な方法がある。汎用型の
自動生化学測定装置で測定する場合、酵素を使用する生
化学的な変換法が好ましい。生化学的な変換法として
は、前記の酵素を使用するＤ−グルコースの検出法にお
いて述べたＤ−グルコースの変換法がそのまま利用でき
る。

【００３５】具体的には、ＧＯＤ（EC 1.1.3.4）を使
用してＤ−グルコースを酸化する方法、ＰＲＯＤ（EC
1.1.3.10)を使用してＤ−グルコースを酸化する方法、
ＧＤＨ（EC 1.1.1.47 ）を使用して補酵素ＮＡＤ
（Ｐ）の存在下にＤ−グルコースを酸化する方法、Ｈ
Ｋ（EC 2.7.1.1）又はＧＫ（EC 2.7.1.2）でＤ−グルコ
ースをリン酸化し、生成したＤ−グルコース−６−リン
酸を、Ｇ６ＰＤＨ（EC 1.1.1.49)を使用して、補酵素Ｎ
ＡＤＰ⁺ の存在下に酸化する方法などがある。

【００３６】なお、前処理用の酵素とＤ−グルコース検
出用の酵素とを、必ずしも同じにする必要はないが、前
処理法と共通にするほうが簡便であり好ましい。例え
ば、後記のＡ法に記載の様に、Ｇ６ＰＤＨを使用するＤ
−グルコース測定系で前処理しておき、キシリトールオ
キシダーゼ添加後の吸光度増加を測定したり、または、
後記のＢ法に記載の様に、ＧＯＤを使用して前処理して
おき、キシリトールオキシダーゼと合わせて過酸化水素
の検出系を整え、キシリトールオキシダーゼ添加後の吸
光度増加だけを測定するのが合理的である。

【００３７】本発明で使用される酵素、補酵素、試薬な
どは、臨床検査に使用できる程度に精製されたものが好
ましい。また、反応は、公知の方法に準じて行うことが
出来る。これらの酵素や試薬などの使用量は、反応温
度、反応時間、反応 pH 、レート法またはエンドポイン
ト法などの反応速度論上の設定、使用する酵素の性質や
試薬の純度などにより左右されるが、一例を挙げると概
ね以下に示す量である。

【００３８】キシリトールオキシダーゼは通常0.01〜50
U/mL、好ましくは 0.1〜20U/mLである。Ｇ６ＰＤＨは通
常 0.5〜500U/mL 、好ましくは 2〜100U/mL である。Ｇ
ＯＤは通常 0.1〜10000U/mL 、好ましくは10〜5000U/mL
である。その他の酵素、試薬などを使用する場合も、公
知の方法に準じて適宜使用できる。反応温度は通常 5〜
50℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間は通常 1〜
60分、好ましくは 1〜10分である。

【００３９】反応 pH は使用する酵素によって異なり、
各酵素の至適 pH の近辺が望ましいが、複数の酵素を同
時に作用させるような場合には、必ずしも個々の酵素の
至適pH にこだわる必要はなく、酵素の反応率、基質親
和性、特異性、安定性、経済性などの点で制約の大きい
酵素に有利なように、各酵素の活性が消失しない pH範
囲から選択すればよい。

【００４０】酵素反応は、速度論上からはレート法とエ
ンドポイント法の２つに分類されている。本質的にはこ
れらの何れであってもよいが、検体の種類、干渉成分の
存在、測定対象とする基質の濃度、反応時間、要求され
る精度などの条件により、適宜選択される。

【００４１】Ｄ−ソルビトールの測定に必要な前記の各
成分を含む試薬溶液を、常法にしたがって調製し、Ｄ−
ソルビトールの測定用キットとして診断薬に組み立てる
ことが出来る。各成分は、前記の使用量に応じた割合と
なるように組み合わせて、キットとすることが出来る。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例
に限定されるものではない。

【００４３】参考例１ Ａ法（ＧＫとＧ６ＰＤＨによる
方法） 200mg/L 濃度のＤ−ソルビトール標準液を蒸留水で倍々
希釈し、標準液の希釈系列を作製した。この標準液の希
釈系列を検体とし、それぞれ 50 μL の各検体に、5U/m
L のＧＫ、10U/mLのＧ６ＰＤＨ、10mmol/LのＡＴＰ、10
mmol/LのＮＡＤＰ⁺ 、20mmol/LのＭｇＣｌ₂ を含む 100
mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH 7.5) 950μL を添加し、３
７℃で１０分間インキュベートして恒温化した。

【００４４】次に、２U/mL濃度のキシリトールオキシダ
ーゼ（ストレプトミセス属の微生物由来）を 85 μL 添
加して攪拌後、３７℃で１０分間反応し、キシリトール
オキシダーゼ添加後の３４０ nm における吸光度の増加
を分光光度計で測定した。検量線の測定結果を図１に示
す。検量線は１から100mg/L まで直線となり、Ｄ−ソル
ビトールの測定が可能であることが示された。

【００４５】実施例１ （Ａ法による血清検体の測定） 健常者の血清Ｍと、この血清ＭにＤ−ソルビトール 50m
g/L を添加したものを検体として、Ａ法（参考例１）に
従って操作し、図１の検量線から検体中のＤ−ソルビト
ール濃度を求めた。その結果を表２に示す。Ｄ−ソルビ
トールは、健常者の血清には極わずかしか含まれていな
いことが知られている。また、腎不全患者を想定したＤ
−ソルビトール添加血清での測定値は、ほぼ理論値に近
い回収率であった。このことから、Ａ法は信頼できるＤ
−ソルビトールの測定法であることが示された。

【００４６】実施例２ （Ａ法の汎用型生化学分析装置
への適用） Ｄ−ソルビトールの標準液と実施例１と同一の血清Ｍを
検体とし、これら検体のそれぞれ10μL に、5U/mL のＧ
Ｋ、10U/mLのＧ６ＰＤＨ、10mmol/LのＡＴＰ、10mmol/L
のＮＡＤＰ⁺ 、20mmol/LのＭｇＣｌ₂ を含む 100mmol/L
トリス塩酸緩衝液(pH 7.5)からなる第１試薬（Ｒ−１）
340 μL を添加して３７℃で５分間インキュベートし
た。

【００４７】その後、４U/mL濃度のキシリトールオキシ
ダーゼ（ストレプトミセス属の微生物由来）を含む 100
mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH 7.5)からなる第２試薬（Ｒ
−２）50μL を添加して３７℃で５分間反応し、第２試
薬添加後の主波長 340nm（副波長 405nm）における吸光
度の増加を、日立７１５０形自動分析装置で測定した。
測定結果を表２に示す。実施例１とほぼ同様な結果が得
られた。

【００４８】

【表２】

【００４９】参考例２ Ｂ法（ＧＯＤを使用する方法） 40mg/L濃度のＤ−ソルビトール標準液を蒸留水で倍々希
釈し、標準液の希釈系列を作製した。この標準液の希釈
系列を検体とし、それぞれ 25 μL の各検体に、400U/m
L のＧＯＤ、400U/mL のカタラーゼ、3U/mL のムタロタ
ーゼ、1.5mmol/L の４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ
Ｐ）を含む 100mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）
475 μL を添加し、３７℃で２０分間反応した。

【００５０】次に、10U/mL濃度のキシリトールオキシダ
ーゼ（ストレプトミセス属の微生物由来）、25U/mL濃度
のペルオキシダーゼ (西洋わさび由来) 、1mg/mLのＮａ
Ｎ₃、7.5mmol/L の３−ヒドロキシ−２，４，６−トリ
ヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）を含む 100mmol/Lリン酸カ
リウム緩衝液（pH 7.5）100 μL を添加し、３７℃で２
０分間発色反応を行い、発色反応における 515nmの吸光
度の増加を分光光度計で測定した。検量線の測定結果を
図２に示す。検量線は１から 40mg/L まで直線となり、
Ｄ−ソルビトールの測定が可能であることが示された。

【００５１】実施例３ （Ｂ法による血清検体の測定） 健常者の血清Ｋ、Ｓ及びそれらの血清やＤ−グルコース
溶液(100mg/L) にＤ−ソルビトールを添加したものを検
体として、Ｂ法（参考例２）に従って操作し、図２の検
量線から検体中のＤ−ソルビトール測定値を求めた。そ
の結果を表３に示す。Ｄ−ソルビトールは、健常者の血
清には僅かしか含まれていないことが知られている。ま
た、腎不全患者を想定したＤ−ソルビトール添加血清で
の測定値は、ほぼ理論値に近い回収率であった。このこ
とから、Ａ法と同様に、Ｂ法は信頼できるＤ−ソルビト
ールの測定法であることが示された。

【００５２】実施例４ （Ｂ法の汎用型生化学分析装置
への適用） Ｄ−ソルビトールの標準液および実施例３と同一の血清
を検体とし、これらの検体のそれぞれ 10 μL に、2000
U/mLのＧＯＤ、400U/mL のカタラーゼ、10U/mLのムタロ
ターゼ、1.5mmol/L の４−アミノアンチピリン（４−Ａ
ＡＰ）を含む 100mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH 7.
5）からなる第１試薬（Ｒ−１）300 μLを加えて３７℃
で５分間インキュベートした。

【００５３】その後、10U/mL濃度のキシリトールオキシ
ダーゼ（ストレプトミセス属の微生物由来）、50U/mL濃
度のペルオキシダーゼ (西洋わさび由来) 、1mg/mLのＮ
ａＮ₃ 、7.5mmol/L の３−ヒドロキシ−２，４，６−ト
リヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）を含む 100mmol/Lリン酸
カリウム緩衝液（pH 7.5）からなる第２試薬（Ｒ−２）
50μL を添加し、３７℃で５分間発色反応を行い、第２
試薬添加後の主波長 546nm（副波長 660nm）における吸
光度の増加を、日立７１５０形自動分析装置で測定し
た。結果を表３に示す。実施例３とほぼ同様な結果が得
られた。

【００５４】

【表３】

【００５５】

【発明の効果】以上説明した本発明によれば、腎不全、
糖尿病などの診断に利用できる簡単で特異的なＤ−ソル
ビトールの測定方法およびＤ−ソルビトールの測定用キ
ットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＡ法によるＤ−ソルビトールの検量線
である。

【図２】本発明のＢ法によるＤ−ソルビトールの検量線
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小村 啓悟 広島県福山市南松永町２−179−２ (72)発明者 岡本 英里 広島県福山市柳津町2271−142 (72)発明者 中川 泰三 埼玉県大宮市三橋４−671−３

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄ−ソルビトールとＤ−グルコースを含
   有する検体に、Ｄ−グルコースを消去する前処理を施し
   た後、Ｄ−ソルビトールを酸化してＤ−グルコースを生
   成させる酸化酵素を作用させ、該酵素反応によるＤ−ソ
   ルビトールの酸化で生成したＤ−グルコースを検出する
   ことを特徴とする検体中のＤ−ソルビトールの測定方
   法。
2. 【請求項２】 Ｄ−ソルビトールを酸化してＤ−グルコ
   ースを生成させる酸化酵素がソルビトールオキシダー
   ゼ、キシリトールオキシダーゼ又はマンニトールオキシ
   ダーゼである請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 Ｄ−グルコースを消去する前処理の方法
   およびＤ−グルコースを検出する方法がグルコースオキ
   シダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒド
   ロゲナーゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロ
   ゲナーゼを使用する方法である請求項１又は請求項２記
   載の測定方法。
4. 【請求項４】 Ｄ−グルコースを消去する前処理剤、Ｄ
   −ソルビトールを酸化してＤ−グルコースを生成させる
   酸化酵素およびＤ−グルコース検出試薬を含有するＤ−
   ソルビトール測定用キット。
5. 【請求項５】 Ｄ−グルコース消去用前処理とＤ−ソル
   ビトール検出試薬に同一酵素を使用する請求項４の測定
   用キット。