JPWO2003033730A1 - アジ化ナトリウムを用いた測定方法 - Google Patents

Abstract

酸化還元反応を用いた測定方法であって、測定精度に優れる方法を提供する。テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、試料中の測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する。テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムの添加割合は、２０：３〜２０：１２の範囲である。また、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液を、予めエージングしてから、測定試料に添加することが好ましい。

Description

技術分野
本発明は、酸化還元反応を用いた測定方法に関する。
背景技術
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する還元剤を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
発明の開示
しかし、これらの従来の方法では、試料によっては測定感度が十分でないために、測定精度が向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、測定感度に優れる測定方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定することを特徴とする。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行えば、その作用機作は不明であるが、測定感度を向上させることができる。なお、本発明において、「測定対象物由来の還元物質または酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化還元物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化還元物質の双方を意味する。
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との添加割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であることが好ましい。
本発明の測定方法において、例えば、前記酸化還元反応の反応溶液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
本発明の測定方法において、より一層感度を向上できることから、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加することが好ましい。
前記エージングの処理温度は、２０〜６０℃の範囲であることが好ましく、また、エージングの処理時間は、６時間以上であることが好ましく、より好ましくは６〜１２０時間の範囲である。
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素であり、前記酸化還元反応の測定が、前記過酸化水素量の測定であることが好ましい。この過酸化水素量の測定は、例えば、酸化酵素と酸化により発色する基質（以下、発色性基質という）とを用いた測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記試料の種類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
また、前記測定対象物としては、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、測定対象物としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等もあげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。
本発明の測定方法において、前記測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸も、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明におけるテトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
また、テトラゾリウム化合物は、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
また、前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
また、少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｐ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ_６Ｈ_５−）、スチリル基（Ｃ_６Ｈ_５ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、ｐｒａ−）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
Ｒ^１−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｒ^２ ＋ Ｈ_２Ｏ ＋ Ｏ_２
→Ｒ^１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ_２−Ｒ^２ ＋ Ｈ_２Ｏ_２ …（１）
前記式（１）において、Ｒ^１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ^１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ^１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ^１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］_ｎ−ＣＨ_２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ^２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ^２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ^３−ＣＯ−Ｒ^４ …（２）
前記式（２）において、Ｒ^３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ^４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ^３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ^３−ＣＯ）_ｎ−ＯＨ …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ^２は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ^５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ^６）−ＣＯ−Ｒ^７ …（４）
前記式（４）において、Ｒ^５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ^５は
−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ^５は、
−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ^６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ^３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ^３−ＮＨ）_ｎ−Ｈ …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ^７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ^３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ^３−ＣＯ）_ｎ−ＯＨ …（６）
前記ＦＡＯＤとしては、例えば、以下の菌から生産されるものも使用できる。そのような菌としては、例えば、フサリウム属（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アルミラリア属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）、カルダリオマイセス属（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、ガノデルマ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等に属する菌があげられる。具体例には、例えば、フサリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓ−１Ｆ４）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１０）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．リニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｉｎｉ）（ＩＦＯ ＮＯ．５８８０）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．バタタス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｂａｔａｔａｓ）（ＩＦＯ ＮＯ．４４６８）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ニベウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．４４７１）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ククメリニウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．６３８４）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ＳＰ．メロンゲナエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅ）（ＩＦＯ ＮＯ．７７０６）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．アピ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ａｐｉｉ）（ＩＦＯ ＮＯ．９９６４）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ピニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ＳＰ．ｐｉｎｉ）（ＩＦＯ ＮＯ．９９７１）、フサリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．フラガリエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ）（ＩＦＯ ＮＯ．３１１８０）、ギベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（ＩＦＯ ＮＯ．６３５６，６６０５）、ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ Ｓ−３４１３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４７５）、ペニシリウム・ヤンシネルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．４６５１、６５８１、７９０５）、ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．５７４８）、ペニシリウム・ヤバニクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｖａｎｉｃｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．４６３９）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．４８９７）、ペニソリウム・シアネウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙａｎｅｕｍ）（ＩＦＯ ＮＯ．５３３７）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）（ＩＦＯ ６３６５）、アスペルギルス・テレウスＧＰ−１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＧＰ−１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８４）、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＦＯ ４２４２）、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＦＯ ５７１０）等があげられる。
また、市販のＦＡＯＤとしては、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、商品名フルクトシルアミンオキシダーゼ（旭化成社製）等があげられる。
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
つぎに、前記溶血試料に対し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加する。
このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することにより、無添加の場合に比べて、その感度が、約１．２〜３倍の範囲で向上する。
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、０．２〜２体積％の場合、濃度０．００５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩の場合は、濃度０．００４〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
また、前記テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、例えば、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であり、好ましくは２０：５〜２０：１１の範囲、より好ましくは２０：６〜２０：１０の範囲である。
前記テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液およびアジ化ナトリウム溶液として、または、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する混合液（テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。
前記各種溶液におけるテトラゾリウム化合物（Ｃ）またはアジ化ナトリウム（Ｄ）の濃度は、前記溶血試料に添加する場合の希釈倍率等に応じて適宜決定できるが、テトラゾリウム化合物（Ｃ）の濃度は、例えば、０．６〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、０．７５〜３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜２．４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記混合液の場合、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との配合割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、例えば、Ｃ：Ｄ＝２０：５〜２０：１１の範囲であり、好ましくは２０：６〜２０：８の範囲である。
前記溶液の溶媒としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ，ＤＩＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液や、リン酸緩衝液等が使用でき、好ましくは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳである。前記溶媒のｐＨは、例えば、５．０〜７．０の範囲であり、好ましくは、５．５〜６．５の範囲であり、より好ましくは５．５である。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記溶血試料に添加した場合の処理溶液における最終濃度は、例えば、０．７〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、０．８〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングすることが好ましい。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約１．２〜３倍に向上する。
前記エージングにおいて、例えば、処理温度は、４０〜６０℃の範囲が好ましく、より好ましくは５０〜６０℃の範囲である。処理時間は、例えば、６時間以上であり、好ましくは６〜１２０時間の範囲、より好ましくは６〜７２時間の範囲である。
前記溶血試料に対して、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度４０〜６０℃の範囲で、６〜７２時間インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリウム化合物で前処理することによって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度が向上できるからである。そして、このようにテトラゾリウム化合物は、測定精度の向上にも寄与するが、本発明の目的である測定感度の向上には、テトラゾリウム化合物だけでなくアジ化ナトリウムの共存が必要であり、それによって本発明に特有の効果が奏される。
続いて、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを、測定対象物に作用し易くするためである。
前記プロテアーゼとしては、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロティナーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロティナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロティナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロティナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロティナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
前記緩衝液としては、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは７〜１１の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロティナーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメタロプロティナーゼ濃度０．１〜４０ＭＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
また、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげらる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげらる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
前記発色程度は、例えば、吸光度測定以外にも、反射率等の光学的測定によって測定することもできる。また、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
このように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加すれば、酸化還元反応を利用する前記糖化タンパク質の測定を感度よく行うことができる。
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの添加工程の順序は、特に制限されないが、前述のように、前記両者をエージングすることによって、より一層の効果が得られることから、予め両者を混合しておくことが好ましい。
また、前述のように、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。これらを測定する場合は、例えば、前述と同様にして測定試料にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後、以下に示すように測定対象物由来の還元物質または酸化物質を生成して、その量を酸化還元反応により測定すればよい。
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
また、前記測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行なうことができる。
前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、例えば、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
前記還元により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等も使用できる。なお、より優れた信頼性の測定値を得るために、例えば、前記測定対象物由来の還元物質を測定する前に、予め吸光度を測定しておくことが好ましい。
実施例
（実施例１および比較例１）
まず、Ｈｂ濃度１５０ｇ／Ｌ（ＨｂＡ１ｃ ５．８％）の血液に、下記溶血試薬０．３ｍＬを添加して溶血させ、溶血試料を調製した。この溶血試料２５μＬに精製水２０μＬを混合し、さらに、３ｇ／Ｌアジ化ナトリウム水溶液を所定濃度（０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６１６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．９２４ｍｍｏｌ／Ｌ、１．２３２ｍｍｏｌ／Ｌ、１．５４ｍｍｏｌ／Ｌ）含有する下記第１試薬６５μＬをそれぞれ添加して、３７℃で５分間インキュベートした。なお、前記第１試薬は、前記溶血試料に添加する前に、５０℃で２０時間エージング処理を行った。続いて、下記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して３７℃で３分間インキュベートした後、この反応液について、生化学自動分析機（商品名Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ：日本電子社製）を用いて、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表１に示す。なお、アジ化ナトリウム無添加（０ｇ／Ｌ）のものが比較例１となる。

前記メタロプロティナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロティナーゼを、テトラゾリウム化合物としては、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製、以下「ＷＳＴ−３」という）を使用した。

前記表１に示すように、実施例１ではテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行うことにより、発色基質ＤＡ−６４の発色量が増加したため、比較例１よりも高い吸光度が得られた。このことから、本発明の測定方法によれば、測定感度が向上するといえる。
（実施例２および比較例２）
この実施例は、ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムの添加割合を変化させ、かつ前記両者のエージングによる、さらなる感度の向上を確認した例である。
（試薬サンプル）
ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムとを下記添加割合となるように混合して、試薬サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を調製した。そして、サンプル（Ｂ）〜（Ｅ）については、４０℃で２０時間インキュベートを行った。続いて、サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を４℃以下に保ち、メタロプロティナーゼを２．６６ＭＵ／Ｌとなるように添加した。

（溶血溶液）
血球に蒸留水を添加し、これを凍結させた後、溶解することによって血球の溶血を行った。これによって得られた溶血溶液は、Ｈｂ濃度が１００ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃが４．９％であった。
調製した前記溶血試料に、下記組成となるように下記前処理試薬を添加し、前処理を行った。

前記前処理試薬は、界面活性剤を２０重量％となるように緩衝液と混合して調製した。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名Ｎｉｋｋｏｌ、日本サーファクタント社製）を使用した。また、緩衝液としては、グリシンアミドの終濃度が２００ｍＭ、グリシンの終濃度が４０ｍＭとなるように、グリシンアミド緩衝液とグリシン溶液とを混合した混合緩衝液を使用した（ｐＨ９．５）。

（測定方法）
前記溶血溶液を蒸留水で２．４倍希釈した希釈液２０μＬに、前記各試薬サンプル６０μＬ、前記発色試薬Ｂ５０μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、生化学自動分析機（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表２および図１のグラフに示す。前記図１は、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との関係を示すグラフである。

前記表２および図１に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって高い吸光度を示し、さらにインキュベート（エージング）を行うことによって、より一層吸光度が向上した（（Ｂ）〜（Ｅ））。また、Ｈｂ濃度の増加に伴って吸光度が増加していることから、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム自身の吸収によって吸光度が増加しているのではなく、これらの添加により発色基質ＤＡ−６４の吸光度が増加しているといえる。また、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムの添加割合がモル比３：１であり、かつエージングした場合に、高い吸光度の増加が見られた。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって、発色基質の発色量が増加し、さらにエージングすることによってより一層増加が見られることから、測定感度が向上したといえる。
（実施例３）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
まず、ＷＳＴ−３濃度が３．３３ｍｍｏｌ／Ｌであり、アジ化ナトリウム濃度が０．０８３３ｇ／Ｌである混合液を準備した。そして、これを６０℃でインキュベートすることによりエージングを行い、所定の時間（０時間、１時間、６時間、１４時間、１６時間、１８時間）にサンプリングしたものを試薬サンプルとした。
一方、前記実施例２と同様にして溶血溶液（Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ４．９％）を調製し、所定量（２μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、３０μＬ）の前記溶血溶液と、下記前処理試薬３００μＬと混合して、基質Ｈｂ溶液（Ａ〜Ｅ）調製した。

そして、前記基質Ｈｂ溶液を蒸留水で２倍希釈した希釈液２０μＬに、前記試薬サンプルを含む下記第２試薬６５μＬおよび発色試薬Ｃ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表３および図２に示す。前記図２は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。

前記表３および図２に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液をエージングした後に使用することによって、Ｈｂ濃度に関わらず、測定感度はさらに向上することがわかった。また、エージング処理の時間が、６時間以上である場合に、測定感度は最大となった。
（実施例４）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
まず、ＷＳＴ−３およびアジ化ナトリウムを含む下記混合液を調製して、これを所定温度（３０℃、４０℃、５０℃、６０℃）で所定時間（０時間、６時間、１５時間、２４時間、４８時間、７２時間）インキュベートしてエージングを行ったものを試薬サンプルとした。

一方、実施例２と同様にして調製した基質Ｈｂ溶液（Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌ）を精製水で２倍希釈（体積）し、希釈溶液を調製した。また、エージングした前記試薬サンプル９ｍＬとメタロプロティナーゼ（２．７ＭＵ／Ｌ）１ｍＬとを混合して、メタロプロティナーゼ溶液を調製した。そして、前記希釈溶液２０μＬに、前記メタロプロティナーゼ溶液６５μＬおよび前記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表４および図３に示す。前記図３は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。

前記表４および図３に示すように、６０℃でエージングした場合に速やかに吸光度が増加したことから、エージング温度が高い程、短時間のエージング処理で測定感度を向上できるといえる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明の酸化還元反応を用いた測定方法は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを用いるため、測定感度に優れている。このため、本発明の測定方法を、例えば、赤血球中のＨｂＡ１ｃの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が高い測定を実現でき、この結果、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の一実施例において、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との相関関係を示したグラフである。
図２は、本発明の測定方法のその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。
図３は、本発明の測定方法のさらにその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。

Claims (14)

1. 試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定することを特徴とする測定方法。
2. テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との添加割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲である請求の範囲１記載の測定方法。
3. 前記酸化還元反応の反応液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である請求の範囲１または２記載の測定方法。
4. テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、試料に添加する請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
5. エージングの処理温度が、２０〜６０℃の範囲である請求の範囲４記載の測定方法。
6. エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲である請求の範囲４または５記載の測定方法。
7. テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲８記載の方法。
10. 測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素である請求の範囲１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 過酸化水素が、糖化タンパク質の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの反応により生成する過酸化水素である請求の範囲１０に記載の方法。
12. 酸化物質である過酸化水素の量の測定が、酸化酵素と酸化により発色する基質とを用いた測定である請求の範囲１０または１１記載の方法。
13. 前記過酸化水素の測定が、酸化により発色する基質の発色程度の光学的な測定である請求の範囲１２記載の方法。
14. 光学的測定が、吸光度または反射率の測定である請求の範囲１３記載の方法。

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