JPS60214900A - 血清中総胆汁酸濃度の自動分析測定方法および測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清中総胆汁酸濃度の自動分析測定方法およ
びその測定試薬に関する。

コレステロールからの胆汁酸の合成、胆汁酸の１１１〆
１中への排泄、並びに血中からの胆汁酸の取込め等の機
能は、肝細胞のめによってなされるものであり、その機
能力征常である限り、胆汁酸の大部分は極めて閉鎖的な
回路の中に主として存在し、血中には徽屡にしか存在し
ない。このため胆汁酸は、古（から肝機能を知る重要な
指標と考えられてきた乙こもかがわらず、測定が困鮨て
、日常的に検査することができなかったのが実情である
。・近年、ガスクロス法やラジオイムノア・２セイ法が
開発され、また酵素比色法という測定系も確立されてい
る。しかし、力２、クロス法やラジオイムノアッセイ法
は装置・施設なとの点で実用性に乏しい。一方、酵素社
色法は、下記のように、胆ン１酸（３α〜ヒドロキシス
テロイド）を３α−ヒ１−ロキシステ口イドデヒトロゲ
ナーセ（３α−ＨＳＤ）の作用により、３−ケトステロ
イドに変換する際に、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オヂド（ＮＡＤ）をＮＡＤＨ十Ｈ’に変換し、更にジア
ホラーゼの存在下にＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ＋　Ｈ’をＮＡＤに
変換するとともに、二ｌ−＋ロブルーテトラゾリウム（
ＮＢＴ）をジホルマザンに変換し、ジボルマリ６ンの生
成に伴う吸光度の増加から血中の総１１ＬＪ汁酸澹度を
めるものである。

胆汁酸　ＮＡＤ゛　ジポルマリ′ン ３−ケトステロイド　Ｎ　Ａ　Ｉ）　Ｈ→１ビ　Ｎ　＋
３１’しかしながら、現在までのとごろ、上記酵素比色
法は、用手法により行なわれており、基質となり得る胆
汁酸を完全に消費し尽してしまうまで反応を進行さゼる
エントボイントアソセイ法が実用化されているに過ぎな
い。その測定法による胆汁酸の測定に当たっては、検体
血清を、ブランク測定用として余分に４Ｉす定に供する
必要があり、そのために誤差などを生じ易いという欠点
がある。同法を自動分析装置に適用する場合にも、やは
りブランク測定用のチャンネルが余分に必要となる。

また、現在使用されている自動分析機はその測定形テ（
」ムエントボイント法の適用できる機種に制限があり、
多くの場合自動分析を断念ゼねばならないのが実情であ
る。

本発明は上記実情に対処するためになされたものであり
、」二記測定原理（反応原理）による酵素比色法におい
て、ジボルマザンの生成に伴う単位時間当りの吸光度の
増加量（吸光度変化率）により、基質となる胆汁酸を濃
度依存的に測定するものである。

本発明方法によれば、検体血清に、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ２ｙ
依存型ジアホラーゼ、ニコチンアミドアテニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）、および二）・ロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）を含む緩衝液（以下、「酵素試液Ａ」およ
び３α−ヒドロキシステＩ」イトデヒドロゲナーゼ（３
α−ＨＳ　Ｉ）　）を含む緩衝液（以下、「酵素試液Ｂ
Ｊ）を添加し、反応により生成するジホルマザンの特性
吸収（５４（ｌｎｍ）における吸光度変化率から、検体
血清中の総１１旧１酸凋度がめられる。

本発明に使用される酵素試液Ａは、Ｎ　Ａ　Ｉ）　ｔｌ
□依存型ジアホラーゼを０．２〜１０．０単位／ｍｆｆ
、Ｎ△Ｄを１．０　Ｘｌ０−’〜１０．ＯＸ　１０−’
　ＭおよびＮ　Ｂ　Ｔを０゜０５〜０．５ｍｇ／　ｍｎ
含有するｐ　Ｈ６，５〜７．５の緩衝液（リン酸緩衝液
、グツド緩衝液、トリス緩衝液など）であり、酵素試液
Ｂば、３α−１１３Ｉ）を０．１〜１．０単位／ｍｌ含
有するｐ　Ｈ６，５〜７．５の緩衝液（リン酸緩衝液、
グツド緩衝液、１−リス緩衝液など）である。

本発明の測定法は、ブランクを必要としない測定形式で
あるから、非特異的反応として生起する危険性のあるラ
クテート・デヒドロゲナーゼ（ＬＤ　Ｈ）の関与を防止
するために、Ｉ−Ｄ　Ｈ活性阻害剤とじ−ζ、ピルヒン
酸塩（アルカリ金属塩等）およびオキザム酸を、単独ま
たは混合して酵素試液Ａまたは酵素試液Ｂに含有させる
ことが望ましい。

ピルヒン酸塩の含有量は０．５　ｘｘｏ−２〜２．ＯＸ
ｌ０−２Ｍ、オキザム酸のそれは１．０　Ｘｌ０−２〜
５．ＯＸｌ０−”Ｍが適当である。

酵素試液ＡおよびＢによる胆汁酸の測定は、酵素試液Ａ
を第１試薬、酵素試液Ｂを第２試薬とし、第２試薬の添
加を出発点として反応を開始させる２試薬系により行わ
れるほか、測定前に酵素試液へとＩ３を適当な比率（Ａ
／Ｂ：約２〜１０）で混合し、１試薬系として反応を開
始することもできる。

酵素試液ＡおよびＢは、それぞれ凍結乾燥物としてｆｆ
１ｌ’ｉ　（ＩＭされ、測定開始に際して、これをｐＨ
６゜５〜７．５の緩衝液（リン酸緩衝液、グツド緩衝液
、トリス緩衝液等）からなる溶解液に溶解して所定ン農
度の酵素試液ＡおよびＢに調製される。酵素試液Ａおよ
びＢの凍結乾燥物の処方には、賦形剤・安定化剤として
牛血清アルブミンが使用される。

熔解液には、液組成物の安定化・清澄化剤として０．１
〜０．５％トリトン（Ｔ’ｒｉＬｏｎ）　Ｘ−１０（１
等の界面活性剤が添加されるほか、Ｌ　Ｉ）　Ｈ阻害剤
としてのビルヒン酸塩および／またはオキナム酸、防腐
剤（例えば、アジ化ナトリウム）等が所望により添加さ
れる。なお、ＬＤＨ阻害剤は、溶解液に含有させる代り
に、酵素試液ＡまたはＢに含有さゼてもよい（製剤上、
酵素試液Ａに含有させるのがよい）。

次に、酵素試液ＡおよびＢ（凍結乾燥物）、並びに溶解
液の処方および組成の具体例を示す。

（１）　ン容解液 積製氷に下記成分を溶解した０、０５〜０．３Ｍリン酸
緩衝ンＣε　（ｐＨ６，５〜７．５）。

リン酸２ナトリウム・１２水塩 ・・・１．０７〜６．０４　ｇ／　ｄｉミリン１カリウ
ム　・・・０．２７〜１．６２　ｇ／　ｄｉアジ化ナナ
トリウム・・・０．１ｇ７ｄ１０．１〜０．５％トリト
ンＸ−１００ ・　・　・０．１　〜０．５　ｇ／　ｄｉ〔２〕酵素試
液Δ（凍結乾燥物） 溶解液に下記成分を溶解し、ｐＨ６，５〜７．５にＡｌ
Ａｌ節された溶液を凍結乾燥。

０．１〜０．５％トリトンＸ−１００ ・・・０．１〜０．５ｇ／ＬＵ ピルビン酸リチウム ・・・２ＸＩＯ−２〜８ｘｌＯ−２Ｍ オキ４ツム酸　・・・４Ｘ１０−２〜２０Ｘ１０−２Ｍ
牛血？ｉ’ｊアルブミン　・・・０．０５〜０．１ｇ／
ｄＩＮ　ＨＴ　・・・０．０２〜０．２　ｇ／　ｔＵＮ
Ａｌ）　・・・４ＸＩＯ−’〜４０Ｘ１０−’Ｍジアポ
ラーセ　・・・０．８〜４０単位／ｍβ〔３〕酵素試液
Ｂ（凍結乾燥物） 溶解液にド記成分を溶解し、ｐＨ６，５〜７．５に調節
された溶液を凍結乾燥。

３α−Ｉ］ＳＤ　・・・０．４〜４０単位７ｍＡ生血清
アルブミン　・・・０．０５〜０．１ｇ／ｄ１次に、実
施例により本発明の試薬の処方、並びに血清中総胆汁酸
？農度の自動測定について説明する。

実施例 （Ａ）試薬処方 （１）溶解液 リン酸２ナトリウム弓２水塩・・・２１．４９　ｇリン
酸１カリウム　・・・５．４４　Ｂアジ化す１〜リウム
　・・・１．０　ｇトリトンＸ−１００・　・　・２．
０ｇ上記各成分を積製氷に溶解し、１１とする。

（２）酵素試液Ａ（凍結乾燥物、但し、２０ｍｆｆ用）
溶解液５ｍｐに一つぎのちのを順次熔解し、ｐｌ−１７
゜０に調整する。

１−リドンＸ−１００・・・１０助【 ピルビン酸リチウム　・・・２０■ オキザム酸　・・・４０聞【 牛血清アルブミン　・・・５■ 上記の熔解を確認したのち、次のものを）容解する。

ＮＢＴ　・・・１０■ ＮＡＤ　・・・２６．５ｍｇ ジアホラーゼ　・・・２０．Ｏ単位 この溶液を凍結乾燥する。

（３）酵素試液Ｂ（凍結乾燥物、但し、２０ｍｆｆ用）
ン容解液２．５＋ｎｆｆ１に次のものを）容解する。

生血清アルブミン　・・・２．５■ ３α〜Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｉ）　・・・３．８５単位この溶液
を凍結乾燥する。

ＣＢ）血清中総胆汁酸の自動分析結果 前記処方による凍結乾燥物を溶解液に熔解して所定の成
分を含有するｐＨ７，０のリン酸緩衝液からなる酵素試
液ＡおよびＢを調製し、酵素試液Ａを第１試薬（ＲＩ）
、酵素試液Ｂを第２試薬（Ｒ２）として、自動分析機（
機種：日立７０５形）により血清中総胆汁酸濃度を測定
した。測定入力パラメータを第１表に示す。測定領域の
直線性を第１図に、マニュアル法との相関性を第２図に
示す。

第　１　表　（人力パラメータ） ＴＩＥＳＴ　Ｃ０ＤＥ　：　Ｂへ ＡＳＳＡＹ　Ｃ０ＤＥ　：　２−２−２６−３１ＳＡ’
ＬＥ　ＶＯＬＩＩＭＥ　：　２０ＲＩ　ＶＯＬ　：　３
５０−Ｙ Ｒ，：　５０−（）−Ｙ Ｒ３ ＷＡＶＥ　ＬＥＮＧＴＩＩ　１　：　７００ＷＡＶＥ　
ＬＥＮＧＴＨ２：　５４６ ＲＥＡＧＥＮＴ　ＢＬＡＮＫ　ＡｎＳＯＲＢＡＮＣＥ　
：　↓ＲＥＡＧＥＮＴ　ＢＬＡＮＫ　Ｃ０ＮＣＥＮＴＲ
ＡＴＩＯＮ　：　０３ＴＡＮＤＡＲＤ　Ｃ０ＮＣＥＮＴ
ＲＡＴＩＯＮ　：５０ＸＦＡＣＴＯＩＩ　：　↓ ５ＴＡＮＤ八ＲＤ　ＡＢＳＯＲＢＡＮＣＥ　ＡＬＬＯ弱
八ＮＣへ：　−ＮＯＲＭ八Ｌ　へＲＡＮＧＥ　ｌ、　：
　□ＮＯＲＭ八Ｌ　へＡＮＧＥ　ＩＩ　ニーＡＢＳＯＲ
ＢＡＮＣＥ　ＬＩＭＩＴ　（ＲＡＴＥ）　：　２０００
０（１）測定領域の直線性 第１図に示されるように、血清総胆汁酸濃度として、約
２００μＭまでは充分に直線的に測定ｒ＋Ｊ能である（
回帰式：　Ｙ　＝０．９１９５Ｘ　＋２．２５７６、相
関係数：　ｒ　＝０．９９９８、試料数：ｎ＝２０）。

これは、従来のマニュアル法−りもずくれている。

（２）マニュアル法との相関性 第２図に示されるように、本発明による測定値は、マニ
ュアル法による測定値（同法での直線性の上限は２００
μＭ）と極めて良い相関性を示す（回帰式：　Ｙ　＝０
．９７６３Ｘ　＋１．２５５７、相関係数：ｒ−０，９
９７９、試料数：　ｎ　＝２７）。

（Ｃ１Ｌ　Ｄ　Ｈの影響 一定濃度の胆汁酸含有プール血清にＬＤＨを順次高活性
に含むよう添加した試料について、前記処方の試薬を用
いて胆汁酸濃度を測定し、第３図に示す結果を得た。図
に示されるとおり、通常血清中に予期されるＬ　Ｄ　Ｈ
活性レヘル（〜２０００単位）内において、胆汁酸濃度
測定値の上昇は認められず、Ｌ　Ｉ）　Ｈの影響は完全
に除去されていることがわかる。

以上のように、本発明によれば、従来のマニュアル法と
異なる測定形式で、簡便な２試薬系にて血清中総胆汁酸
の自動分析を行うことができる・。

むろん、自動分析装置は前記例示のものに限られず、入
力パラメータ等を設定するだけで、各機種の分析装置に
適用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による測定領域の直線性を示すグラフ、
第２図は本発明測定値と従来のマニュアル法の測定値と
の相関性を示すグラフ、第３図は本発明の測定における
ＬＤＨの影響を示Ｊグラフである。 代理人　弁理士　宮崎新八部 ｔ１４１図 硬体希釈率 本＠ＥＩ４法１；まる咀市該壜渡（μＭ）第３Ｍ しＤＨ池・ｌ’ｉ　＜＄４に）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１１検体血清に、ＮＡＤＨ，依存型ジアホラーゼ０．
   ２〜１０．０単位７ｍ　ｌ、ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド１．ＯＸｌ０−’〜１０．０　Ｘ　１０−
   ’　Ｍおよびニトロブルーテトラゾリウム０．０５〜０
   ．５ｍｇ／　ｍ　Ｉｔを含イｊするｐＨ６，５〜７．５
   の緩衝液である酵素試液へと、３α−ヒドロキシステロ
   イドデヒドロゲナーゼ０．１〜１．０単位／ｍｎを含む
   ｐＨ６，５〜７．５の緩衝液である酵素試液Ｂとを添加
   し、胆汁酸を基質とする反応により生成するジホルマザ
   ンの特性吸収におりる吸光度の単位時間当りの増加量を
   測定することを特徴とする血清中総胆汁酸濃度の自動分
   析■り定方性。 （２）酵素試液Ａおよび酵素試液Ｂの少なくともいづれ
   か一方が、ラクテート・デヒドロゲナーゼ活性阻害剤と
   し゛ζピルビン酸塩０．５　Ｘ　１０−”〜２．０ｘｌ
   Ｑ−”Ｍおよび／またはオキ−リム酸１．０　ＸＩＯ”
   ”〜５、ＯＸｌ０−”Ｍ含有する」二記第ｆｌ）項に記
   載の自動分析測定方法。 （３）トリトンＸ〜１００　０．１〜０．５ｇ／　ｄｉ
   を含むｐＨ６，５〜７．５の緩衝液に、Ｎへ１〕■１□
   依存型ンアホラーゼ０．８〜４０．０単位／ｍ１、ユニ
   ｌチンアミドアデニンジヌクレオチド４．ＯＸｌ０−’
   〜４０．ＯＸ　１０−　’　Ｍ、ニトロブルーテトラゾ
   リウム０．２〜２　ｍｇ／ｍ　１および生血端アルブミ
   ン０．０５〜０．］ｇ／ｄ！Ｖ、を溶解した溶液の凍結
   乾燥物である酵素試薬へと、トリトンＸ−１０００，１
   〜０．５ｇ／　ｄｌを含むｐＨ１６，５〜７．５の緩衝
   ？＆に、３α−ヒトロキシステロイドデヒト１」ゲナー
   ゼ０．４〜４０単位／ｍρ、牛血清アルブミン０．０５
   〜ＯＡｇ／ｄｌを溶解した溶液の凍結乾燥物である酵素
   試薬Ｉ３と、トリトンＸ−１０００，１〜ｏ、ｓ、、７
   　ｄｌを含むｐＨ６，５〜７．５の緩衝液である溶解液
   の組合せζこなる血清中総組ン１酸濃度の自動分析Δ１
   り定用試薬。 （４）　酵素試薬への凍結乾燥物の使用時溶解液酵素試
   薬Ｂの凍結乾燥物の使用時溶解液、または溶解液の少く
   ともいづれが１つが、ラクテーレデヒドＬ１ゲプーーゼ
   活性阻害剤としてビルヒン酸塩０゜５　ｘｌＯ−２〜２
   ．ＯｘｌＯ−”Ｍおよび／またはオキサムＭ１．ＯＸ　
   １０−２〜５．ＯＸ　１０−２Ｍを含有するもノアする
   −に記載（３）項に記載の自動分析測定用試薬。