JPH0673474B2 - ス−パ−オキサイドアニオンの定量法 - Google Patents
ス−パ−オキサイドアニオンの定量法Info
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- JPH0673474B2 JPH0673474B2 JP7209187A JP7209187A JPH0673474B2 JP H0673474 B2 JPH0673474 B2 JP H0673474B2 JP 7209187 A JP7209187 A JP 7209187A JP 7209187 A JP7209187 A JP 7209187A JP H0673474 B2 JPH0673474 B2 JP H0673474B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，スーパーオキサイドアニオン（02 -）の定量
法に関する。
法に関する。
（従来の技術） スーパーオキサイドアニオン（02 -）は，生体内の各種
の反応により生じることが知られている。例えば，過酸
化脂質の生成はこの02 -によると言われており,02 -の生
成は酸素毒性との関係で注目されている。02 -を測定す
ることは，生体内における活性酸素の生成とその作用機
作を知るうえで重要であると考えられる。02 -を測定す
る方法としては，チトクロームＣの還元量を測定する方
法；ルミノールの酸化による化学発光を酸化触媒の非存
在下で測定する方法；およびペルオキシダーゼが02 -と
結合することにより形成されるコンプレックスIIIを測
定する方法が知られている。
の反応により生じることが知られている。例えば，過酸
化脂質の生成はこの02 -によると言われており,02 -の生
成は酸素毒性との関係で注目されている。02 -を測定す
ることは，生体内における活性酸素の生成とその作用機
作を知るうえで重要であると考えられる。02 -を測定す
る方法としては，チトクロームＣの還元量を測定する方
法；ルミノールの酸化による化学発光を酸化触媒の非存
在下で測定する方法；およびペルオキシダーゼが02 -と
結合することにより形成されるコンプレックスIIIを測
定する方法が知られている。
スーパーオキサイドアニオンの発生は，生体外では特に
オキシダーゼ反応において知られている。例えば下記の
反応式で示されるキサンチンオキシダーゼ（XOD）によ
るヒポキサンチン→キサンチン→尿酸の酸化過程におい
て,H2O2以外に02 -が生じることが知られている。
オキシダーゼ反応において知られている。例えば下記の
反応式で示されるキサンチンオキシダーゼ（XOD）によ
るヒポキサンチン→キサンチン→尿酸の酸化過程におい
て,H2O2以外に02 -が生じることが知られている。
02 -を生成するオキシダーゼは一電子還元型酵素であり,
H2O2を生成するオキシダーゼは二電子還元型酵素である
が，上記XODは実際には両者の性質をあわせ持つことが
多く，上記のようにH2O2および02 -の両者が生成する。
上記のような反応性を示すオキシダーゼとしては，ミル
ク由来のキサンチンオキシダーゼ，アルデヒドオキシダ
ーゼ，ジアミンオキシダーゼなど亜硫酸とコンプレック
スを形成しないフラビン酵素が挙げられる。これらの他
にも酸素との反応特性によりH2O2および02 -を生成する
オキシダーゼ類が存在する。
H2O2を生成するオキシダーゼは二電子還元型酵素である
が，上記XODは実際には両者の性質をあわせ持つことが
多く，上記のようにH2O2および02 -の両者が生成する。
上記のような反応性を示すオキシダーゼとしては，ミル
ク由来のキサンチンオキシダーゼ，アルデヒドオキシダ
ーゼ，ジアミンオキシダーゼなど亜硫酸とコンプレック
スを形成しないフラビン酵素が挙げられる。これらの他
にも酸素との反応特性によりH2O2および02 -を生成する
オキシダーゼ類が存在する。
ところで，上記オキシダーゼ反応は生体成分，例えばグ
アナーゼなどの測定のため，下記H2O2測定法と共役させ
て臨床検査に利用されている。例えば，（１），（２）
式の反応系において生じるH2O2をペルオキシダーゼの存
在下で色原体に作用させ，この色原体を酸化して発色さ
せその吸光度を測定する方法（トリンダー法）が汎用さ
れる。しかし，このような測定方法においては，上記の
ようにH2O2と他に02 -が生成する。H2O2と02 -とを別々に
測定するのは困難であるため，通常,02 -をH2O2に変化さ
せる方法が採用される。02 -をH2O2に変化させるには，
反応系を放置し,02 -を自然不均化反応によりH2O2に変
化させる方法；および反応系にスーパーオキサイドア
ニオンジスムターゼ（SOD）を共存させることにより02 -
からH2O2への不均化（202 -＋2H+→H2O2＋02）速度を高
める方法が知られている。しかし，の方法において
は，反応系にカタラーゼが存在すると，生成したH2O2が
分解する欠点がある。のSODを用いる方法では反応が
速やかに行われるためカタラーゼによる分解が起こりに
くい。しかし，この方法においては，たとえSODの量を
増加させても上記トリンダー法における発色の回収率が
理論量の100％に達しないことが発明者らの実験により
判明した。
アナーゼなどの測定のため，下記H2O2測定法と共役させ
て臨床検査に利用されている。例えば，（１），（２）
式の反応系において生じるH2O2をペルオキシダーゼの存
在下で色原体に作用させ，この色原体を酸化して発色さ
せその吸光度を測定する方法（トリンダー法）が汎用さ
れる。しかし，このような測定方法においては，上記の
ようにH2O2と他に02 -が生成する。H2O2と02 -とを別々に
測定するのは困難であるため，通常,02 -をH2O2に変化さ
せる方法が採用される。02 -をH2O2に変化させるには，
反応系を放置し,02 -を自然不均化反応によりH2O2に変
化させる方法；および反応系にスーパーオキサイドア
ニオンジスムターゼ（SOD）を共存させることにより02 -
からH2O2への不均化（202 -＋2H+→H2O2＋02）速度を高
める方法が知られている。しかし，の方法において
は，反応系にカタラーゼが存在すると，生成したH2O2が
分解する欠点がある。のSODを用いる方法では反応が
速やかに行われるためカタラーゼによる分解が起こりに
くい。しかし，この方法においては，たとえSODの量を
増加させても上記トリンダー法における発色の回収率が
理論量の100％に達しないことが発明者らの実験により
判明した。
この理由はH2O2生成と共に生じる02 -がペルオキシダー
ゼと結合し，コンプレックスIIIを形成し，このコンプ
レックスIIIはその02 -分解作用により02 -をH2O2に不均
化する前に分解してしまい，その速度はSODの不均化反
応より早く，とりわけ，水素供与体としての色原体が存
在する場合，コンプレックスIIIの02 -分解作用は極めて
促進されることによると考えられる。一度生成した色素
が02 -により還元されて退色する場合があるが，これは
時間と共に再び酸化されて回復する。上記回収率が理論
量に達しないのはペルオキシダーゼが02 -と結合してコ
ンプレックスIIIをつくり,02 -分解作用を示すことに起
因し，この02 -による直接的退色とは異なる。
ゼと結合し，コンプレックスIIIを形成し，このコンプ
レックスIIIはその02 -分解作用により02 -をH2O2に不均
化する前に分解してしまい，その速度はSODの不均化反
応より早く，とりわけ，水素供与体としての色原体が存
在する場合，コンプレックスIIIの02 -分解作用は極めて
促進されることによると考えられる。一度生成した色素
が02 -により還元されて退色する場合があるが，これは
時間と共に再び酸化されて回復する。上記回収率が理論
量に達しないのはペルオキシダーゼが02 -と結合してコ
ンプレックスIIIをつくり,02 -分解作用を示すことに起
因し，この02 -による直接的退色とは異なる。
一方，デヒドロゲナーゼにより生じるNADHやNADPHを測
定する方法として，オキシダーゼ反応または電子伝達体
を利用してH2O2に導き，これを測定する方法が採用され
ている。例えばNADHを，フェナジウムメチルサルフェー
ト（PMS）または微生物由来のジアホラーゼなどにより
酵素と反応させ，生じるH2O2を測定する方法が知られて
いる。この系においてもペルオキシダーゼの存在下でH2
O2により色原体を酸化・発色させ，発色の度合を可視部
吸光法において測定する方法が採用されている。この方
法においては，上記NADHやNADPHを直接吸光度計で測定
するよりも感度が上昇し，かつホルマザン発色方法によ
る測定機器の汚染（着色）を回避することが可能であ
る。しかし，このようなタイプの反応においてもPMSま
たはジアホラーゼが基本的には一電子還元型であるため
02 -が生成し，上記XODタイプのオキシダーゼ反応の場合
と同様に正確な測定値が得られない。SODの添加による
効果もXODの場合と同様に充分な効果をもたらさない。
定する方法として，オキシダーゼ反応または電子伝達体
を利用してH2O2に導き，これを測定する方法が採用され
ている。例えばNADHを，フェナジウムメチルサルフェー
ト（PMS）または微生物由来のジアホラーゼなどにより
酵素と反応させ，生じるH2O2を測定する方法が知られて
いる。この系においてもペルオキシダーゼの存在下でH2
O2により色原体を酸化・発色させ，発色の度合を可視部
吸光法において測定する方法が採用されている。この方
法においては，上記NADHやNADPHを直接吸光度計で測定
するよりも感度が上昇し，かつホルマザン発色方法によ
る測定機器の汚染（着色）を回避することが可能であ
る。しかし，このようなタイプの反応においてもPMSま
たはジアホラーゼが基本的には一電子還元型であるため
02 -が生成し，上記XODタイプのオキシダーゼ反応の場合
と同様に正確な測定値が得られない。SODの添加による
効果もXODの場合と同様に充分な効果をもたらさない。
このようにスーパーオキサイドアニオンの定量法，特に
オキシダーゼ反応またはPMSTなどの電子伝達体により生
じるH2O2と同時に生成する02 -を効果的に定量し得る方
法は開発されていないのが現状である。
オキシダーゼ反応またはPMSTなどの電子伝達体により生
じるH2O2と同時に生成する02 -を効果的に定量し得る方
法は開発されていないのが現状である。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり，その
目的とするところは，スーパーオキサイドアニオンの効
果的な定量方法を提供することにある。本発明の他の目
的は，オキシダーゼ反応などによりH2O2とともに生成す
るスーパーオキサイドアニオンをH2O2として正確に定量
しうる方法を提供することにある。
目的とするところは，スーパーオキサイドアニオンの効
果的な定量方法を提供することにある。本発明の他の目
的は，オキシダーゼ反応などによりH2O2とともに生成す
るスーパーオキサイドアニオンをH2O2として正確に定量
しうる方法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段および作用） 本発明者らは，従来の技術の項において記載した02 -か
らH2O2への変換を効果的に，かつカタラーゼなどの他の
因子の妨害を受けることなく行う方法についての検討を
行った。まず，従来技術の項に記載した（１），（２）
の反応系において,XODとしてミルク由来のキサンチンオ
キシダーゼを用い，生成するH2O2をトリンダー法で測定
する反応系においてSODを添加し，その濃度を変化させ
て効果を調べた。しかし,200U/mlという高濃度の終濃度
のSODを添加しても発色の回収率（分子吸光係数から算
出）は理論値の80％であった。そしてこのとき,SODの添
加量の多少に関わらず生成する尿酸量は同一であった。
これは，生じた02 -が系内に存在するペルオキシダーゼ
と結合しコンプレックスIIIを形成し，そして，このコ
ンプレックスIIIは02 -分解作用を有するため,02 -がH2O2
に不均化する前に該02 -を分解してしまい，その速度はS
ODの不均化反応速度よりもはるかに速いためと考えらえ
る。特に系内に存在する色原体が水素供与体となる場合
には，コンプレックスIIIの02 -分解作用は促進される。
らH2O2への変換を効果的に，かつカタラーゼなどの他の
因子の妨害を受けることなく行う方法についての検討を
行った。まず，従来技術の項に記載した（１），（２）
の反応系において,XODとしてミルク由来のキサンチンオ
キシダーゼを用い，生成するH2O2をトリンダー法で測定
する反応系においてSODを添加し，その濃度を変化させ
て効果を調べた。しかし,200U/mlという高濃度の終濃度
のSODを添加しても発色の回収率（分子吸光係数から算
出）は理論値の80％であった。そしてこのとき,SODの添
加量の多少に関わらず生成する尿酸量は同一であった。
これは，生じた02 -が系内に存在するペルオキシダーゼ
と結合しコンプレックスIIIを形成し，そして，このコ
ンプレックスIIIは02 -分解作用を有するため,02 -がH2O2
に不均化する前に該02 -を分解してしまい，その速度はS
ODの不均化反応速度よりもはるかに速いためと考えらえ
る。特に系内に存在する色原体が水素供与体となる場合
には，コンプレックスIIIの02 -分解作用は促進される。
以上の考察から，発明者らは種々の酸化剤，還元剤，不
均化剤およびそれらが関与する酵素類を用いて実験を行
い,02 -がコンプレックスIIIを形成して02 -分解作用によ
る分解を受けることなく速やかにH2O2に変換され得る方
法の検討を行った。その結果，金属塩などが02 -を極め
て迅速に還元してこれをH2O2に変換しうることを見出し
本発明に到達した。
均化剤およびそれらが関与する酵素類を用いて実験を行
い,02 -がコンプレックスIIIを形成して02 -分解作用によ
る分解を受けることなく速やかにH2O2に変換され得る方
法の検討を行った。その結果，金属塩などが02 -を極め
て迅速に還元してこれをH2O2に変換しうることを見出し
本発明に到達した。
すなわち，本発明のスーパーオキサイドアニオンの定量
法は，スーパーオキサイドアニオンを含む試料に還元
剤，または還元剤とその補助剤とを作用させて該スーパ
ーオキサイドアニオンを過酸化水素に変換し，該過酸化
水素を測定することを特徴とする。
法は，スーパーオキサイドアニオンを含む試料に還元
剤，または還元剤とその補助剤とを作用させて該スーパ
ーオキサイドアニオンを過酸化水素に変換し，該過酸化
水素を測定することを特徴とする。
本発明方法に使用される還元剤としては金属塩，金属錯
体，金属を含む蛋白などが利用される。ここでいう金属
塩とは，塩を形成する金属の酸化数が反応により容易に
変化し得，反応液中で電子を供与することの可能な金属
塩を指す。このような金属塩としては，マンガン，クロ
ム，バナジウム，チタン，スズなどの塩が挙げられる。
金属錯体もまた電子供与性の金属含有有機化合物であ
り，それには，ヘミンなどのポリフィリン鉄，フェロセ
ン，クロロフィルなどがある。金属を含む蛋白として
は，ヘモグロビン，ヘモシアニン，チトクロームなどが
挙げられる。還元補助剤は，上記還元剤が02 -に電子を
供与する反応を補助しうる化合物であり，それには例え
ば，キレート剤，環状炭水化物および蛋白が挙げられ
る。キレート剤としては，エチレンジアミンテトラ酢酸
（EDTA），イミノジ酢酸（IDA），エチレンジアミン二
酢酸（EDDA），トリエチレンテトラミン六酢酸（TTHA）
などがある。環状炭水化物としては，シクロデキストリ
ン，クラウングルカン，クラウンエーテルなどがあり，
蛋白としてはウシ血清アルブミン（BSA），各種グロブ
リンなどがある。
体，金属を含む蛋白などが利用される。ここでいう金属
塩とは，塩を形成する金属の酸化数が反応により容易に
変化し得，反応液中で電子を供与することの可能な金属
塩を指す。このような金属塩としては，マンガン，クロ
ム，バナジウム，チタン，スズなどの塩が挙げられる。
金属錯体もまた電子供与性の金属含有有機化合物であ
り，それには，ヘミンなどのポリフィリン鉄，フェロセ
ン，クロロフィルなどがある。金属を含む蛋白として
は，ヘモグロビン，ヘモシアニン，チトクロームなどが
挙げられる。還元補助剤は，上記還元剤が02 -に電子を
供与する反応を補助しうる化合物であり，それには例え
ば，キレート剤，環状炭水化物および蛋白が挙げられ
る。キレート剤としては，エチレンジアミンテトラ酢酸
（EDTA），イミノジ酢酸（IDA），エチレンジアミン二
酢酸（EDDA），トリエチレンテトラミン六酢酸（TTHA）
などがある。環状炭水化物としては，シクロデキストリ
ン，クラウングルカン，クラウンエーテルなどがあり，
蛋白としてはウシ血清アルブミン（BSA），各種グロブ
リンなどがある。
本発明によりスーパーオキサイドアニオンを定量するに
は,02 -を含む系に上記還元剤および必要に応じて上記還
元補助剤を加える。還元剤は，通常，反応液中に10μＭ
〜1Mの割合で添加される。還元補助剤の濃度は通常0.1
〜100mMである。反応系に含まれる02 -は，上記還元剤に
より速やかに還元されてH2O2に変換するため，このH2O2
を常法により定量する。H2O2の測定としては，ペルオキ
シダーゼ系反応を利用する方法が採用される。例えば，
ペルオキシダーゼ存在下でH2O2により色原体を酸化縮合
させて発色させ，その吸光度を測定する方法（発色
法）；ペルオキシダーゼ存在下でH2O2によりｐ−ヒドロ
キシフェニル酢酸，ホモバニリン酸，ロイコジクロロフ
ルオレセインなどを酸化縮合させて生じる螢光を測定す
る方法（螢光法）；ペルオキシダーゼ存在下でH2O2によ
りルミノールやイソルミノールを酸化させて生じる発光
を測定する方法（発光法）が挙げられる。
は,02 -を含む系に上記還元剤および必要に応じて上記還
元補助剤を加える。還元剤は，通常，反応液中に10μＭ
〜1Mの割合で添加される。還元補助剤の濃度は通常0.1
〜100mMである。反応系に含まれる02 -は，上記還元剤に
より速やかに還元されてH2O2に変換するため，このH2O2
を常法により定量する。H2O2の測定としては，ペルオキ
シダーゼ系反応を利用する方法が採用される。例えば，
ペルオキシダーゼ存在下でH2O2により色原体を酸化縮合
させて発色させ，その吸光度を測定する方法（発色
法）；ペルオキシダーゼ存在下でH2O2によりｐ−ヒドロ
キシフェニル酢酸，ホモバニリン酸，ロイコジクロロフ
ルオレセインなどを酸化縮合させて生じる螢光を測定す
る方法（螢光法）；ペルオキシダーゼ存在下でH2O2によ
りルミノールやイソルミノールを酸化させて生じる発光
を測定する方法（発光法）が挙げられる。
本発明方法は02 -を生成するオキシダーゼの反応系にお
ける基質（例えばヒポキサンチン，ジアミン，尿素な
ど）および酵素活性（例えばキサンチンオキシダーゼな
ど）の測定に好適に利用される。また本発明方法は,02 -
を生成するオキシダーゼの反応系と他の酵素反応を組合
わせて，基質（例えばグアニン，無機燐など）および酵
素活性（例えばグアナーゼ）の測定にも好適に利用され
る。さらに本発明方法はデヒドロゲナーゼにより生ずる
NADHやNADPHの測定方法にも利用される。
ける基質（例えばヒポキサンチン，ジアミン，尿素な
ど）および酵素活性（例えばキサンチンオキシダーゼな
ど）の測定に好適に利用される。また本発明方法は,02 -
を生成するオキシダーゼの反応系と他の酵素反応を組合
わせて，基質（例えばグアニン，無機燐など）および酵
素活性（例えばグアナーゼ）の測定にも好適に利用され
る。さらに本発明方法はデヒドロゲナーゼにより生ずる
NADHやNADPHの測定方法にも利用される。
例えば，従来技術の項で述べたXODによる酵素反応（式
（１）および（２））の系に上記還元剤および必要に応
じて還元補助剤を加えると02 -は速やかにH2O2に変換さ
れる。このH2O2を，ペルオキシダーゼ活性を有する酸化
触媒下において４−アミノアンチピリンおよびフェノー
ル類に作用させると，該４−アミノアンチピリンとフェ
ノール類とが酸化縮合し発色する。この発色の度合を測
定することによりヒポキサンチンの定量がなされる。こ
のようなトリンダー法による測定の他，吸光法，螢光
法，発光法などの既知のH2O2定量法が採用され得る。
（１）および（２））の系に上記還元剤および必要に応
じて還元補助剤を加えると02 -は速やかにH2O2に変換さ
れる。このH2O2を，ペルオキシダーゼ活性を有する酸化
触媒下において４−アミノアンチピリンおよびフェノー
ル類に作用させると，該４−アミノアンチピリンとフェ
ノール類とが酸化縮合し発色する。この発色の度合を測
定することによりヒポキサンチンの定量がなされる。こ
のようなトリンダー法による測定の他，吸光法，螢光
法，発光法などの既知のH2O2定量法が採用され得る。
上記02 -を生成するオキシダーゼとしては，キサンチン
オキシダーゼ，白血球NADPHオキシダーゼ，アルデヒド
オキシダーゼ，ジアミンオキシダーゼ,NHDHジアフォラ
ーゼ，旧黄色酵素，ザルコシンオキシダーゼ，ウリカー
ゼなどがある。このようなオキシダーゼによる他,0
2 -は，非酵素的に,NADH,NADPHを例えばPMSなどにより酸
化することによっても生成する。
オキシダーゼ，白血球NADPHオキシダーゼ，アルデヒド
オキシダーゼ，ジアミンオキシダーゼ,NHDHジアフォラ
ーゼ，旧黄色酵素，ザルコシンオキシダーゼ，ウリカー
ゼなどがある。このようなオキシダーゼによる他,0
2 -は，非酵素的に,NADH,NADPHを例えばPMSなどにより酸
化することによっても生成する。
上記ペルオキシダーゼ活性を有する触媒としては，例え
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ，ラクトペルオキシダー
ゼ，ミエロペルオキシダーゼ，微生物由来のペルオキシ
ダーゼ，ミクロペルオキシダーゼなどの各種ペルオキシ
ダーゼ；ヘミン，ヘマチンなどの非触媒酵素；メトヘモ
グロビンなどの蛋白が挙げられる。
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ，ラクトペルオキシダー
ゼ，ミエロペルオキシダーゼ，微生物由来のペルオキシ
ダーゼ，ミクロペルオキシダーゼなどの各種ペルオキシ
ダーゼ；ヘミン，ヘマチンなどの非触媒酵素；メトヘモ
グロビンなどの蛋白が挙げられる。
次に，キサンチンオキシダーゼにより生じるH2O2および
02 -をすべてH2O2としてトリンダー法により測定する方
法を用いて本発明を詳細に説明する。
02 -をすべてH2O2としてトリンダー法により測定する方
法を用いて本発明を詳細に説明する。
還元剤の加えられていない従来のオキシダーゼ反応は，
従来の技術の項に示されるように次式（１）および
（２）で示される。
従来の技術の項に示されるように次式（１）および
（２）で示される。
この反応系に例えば還元剤としてMn2+（MnCl2など）が
0.5M前後で存在すると，次のような反応となる。
0.5M前後で存在すると，次のような反応となる。
ここに示すように,Mn2+のような還元剤存在下における
オキシダーゼ反応はすべて一電子還元型の反応となり,H
2O2ではなく02 -が形成される（式（１）−ａおよび式
（２）−ａ）。このようにして形成される02 -は合計４
分子であり，これがH2O2に変換されて（（３）式）４分
子のH2O2が生成する。（１）−a,（２）−ａおよび
（３）の反応は極めて速やかに進行し，このMn2+の存在
は，反応に悪影響をおよぼさない。上記系において尿酸
は，それ以上に分解を受けず,02 -の還元反応（３）にお
ける水素供与体とはならない。上記反応系は尿酸生成側
に平衡が傾いており（pH6.3において）,Mn2+非存在下に
おけるよりも尿酸の生成量が多い。このようにして生成
するH2O2は，（４）式のように，ペルオキシダーゼ存在
下で４−アミノアンチピリン（4AA）およびＮ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジン（TOOS）に作用し，キノンイミン色素を形成
する。
オキシダーゼ反応はすべて一電子還元型の反応となり,H
2O2ではなく02 -が形成される（式（１）−ａおよび式
（２）−ａ）。このようにして形成される02 -は合計４
分子であり，これがH2O2に変換されて（（３）式）４分
子のH2O2が生成する。（１）−a,（２）−ａおよび
（３）の反応は極めて速やかに進行し，このMn2+の存在
は，反応に悪影響をおよぼさない。上記系において尿酸
は，それ以上に分解を受けず,02 -の還元反応（３）にお
ける水素供与体とはならない。上記反応系は尿酸生成側
に平衡が傾いており（pH6.3において）,Mn2+非存在下に
おけるよりも尿酸の生成量が多い。このようにして生成
するH2O2は，（４）式のように，ペルオキシダーゼ存在
下で４−アミノアンチピリン（4AA）およびＮ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジン（TOOS）に作用し，キノンイミン色素を形成
する。
これに対して，従来の反応系（１）および（２）の系に
おいては，フリーの02 -がペルオキシダーゼと結合し，
カタラーゼ活性が発現されるため充分なペルオキシダー
ゼ反応が進行しない。
おいては，フリーの02 -がペルオキシダーゼと結合し，
カタラーゼ活性が発現されるため充分なペルオキシダー
ゼ反応が進行しない。
（実験例） 上記反応系について本発明と従来例との比較を実験例を
挙げて説明する。
挙げて説明する。
まず,20mM MESバッファー（pH6.3）中にヒポキサンチン
（終濃度10.6μＭ）,XOD,4AAおよびTOOSを溶解させて充
分に時間をかけて反応させた。（１）および（２）式が
完了し,02 -は自然不均化反応によりH2O2に変換された。
次にこの反応系にペルオキシダーゼを加えて，生成する
キノンイミン色素を500nmの吸収を測定することにより
定量した。その結果を第１図にトレースＡとして示す。
この量は，尿酸−ウリカーゼ系で求めた分子吸光係数1
6.4M-1cm-1とよく一致し，尿酸（290nmにて測定）１分
子に対し２分子のH2O2が生成していることがわかる。
（終濃度10.6μＭ）,XOD,4AAおよびTOOSを溶解させて充
分に時間をかけて反応させた。（１）および（２）式が
完了し,02 -は自然不均化反応によりH2O2に変換された。
次にこの反応系にペルオキシダーゼを加えて，生成する
キノンイミン色素を500nmの吸収を測定することにより
定量した。その結果を第１図にトレースＡとして示す。
この量は，尿酸−ウリカーゼ系で求めた分子吸光係数1
6.4M-1cm-1とよく一致し，尿酸（290nmにて測定）１分
子に対し２分子のH2O2が生成していることがわかる。
次に，上記バッファー中にXOD,4AA,TOOSおよびペルオキ
シダーゼを溶解させ，これにヒポキサンチンを添加する
ことにより反応を開始させ，同様に生成したキノンイミ
ンの測定を行った。その結果を第１図にトレースＢとし
て示す。この系においては，（１）および（２）式にお
いて生成した02 -がペルオキシダーゼと結合してカタラ
ーゼ作用を示すため,H2O2が分解し，その結果，キノン
イミン色素の生成量が低くなる。
シダーゼを溶解させ，これにヒポキサンチンを添加する
ことにより反応を開始させ，同様に生成したキノンイミ
ンの測定を行った。その結果を第１図にトレースＢとし
て示す。この系においては，（１）および（２）式にお
いて生成した02 -がペルオキシダーゼと結合してカタラ
ーゼ作用を示すため,H2O2が分解し，その結果，キノン
イミン色素の生成量が低くなる。
次に，上記トレースＢの系において，反応時にSODを200
U/mlの割合で添加して同様に反応を行った。この結果を
第１図にトレースＣとして示す。この系においては,02 -
からH2O2への不均化（202 -＋2H+→H2O2＋02）が促進さ
れるためトレースＢの系の場合よりはキノンイミン色素
量が高くなるが，自然不均化反応が完了したトレースＡ
の系のレベルにまでは到達していない。
U/mlの割合で添加して同様に反応を行った。この結果を
第１図にトレースＣとして示す。この系においては,02 -
からH2O2への不均化（202 -＋2H+→H2O2＋02）が促進さ
れるためトレースＢの系の場合よりはキノンイミン色素
量が高くなるが，自然不均化反応が完了したトレースＡ
の系のレベルにまでは到達していない。
次に，トレースＢの系においてMnCl2を0.5Mの割合で添
加して同様に反応を行った。その結果を第１図にトレー
スＤとして示す。この系においては，上記（１）−a,
（２）−a,（３）および（４）の反応が連続して速やか
に進行するため４分子のH2O2,つまりトレースＡの系の
２倍のH2O2（キノンイミン色素）が生成する。この系の
尿酸生成量を測定したところ，上記トレースＡ〜Ｃの系
における生成量の約1.18倍であることが確認された。こ
のように，この系においては，反応は尿酸の生成系に傾
いている。トレースＤのキノンイミン生成量はトレース
Ａの約2.36倍であり，この反応により理論上妥当なキノ
ンイミン色素（H2O2）が回収されることがわかる。
加して同様に反応を行った。その結果を第１図にトレー
スＤとして示す。この系においては，上記（１）−a,
（２）−a,（３）および（４）の反応が連続して速やか
に進行するため４分子のH2O2,つまりトレースＡの系の
２倍のH2O2（キノンイミン色素）が生成する。この系の
尿酸生成量を測定したところ，上記トレースＡ〜Ｃの系
における生成量の約1.18倍であることが確認された。こ
のように，この系においては，反応は尿酸の生成系に傾
いている。トレースＤのキノンイミン生成量はトレース
Ａの約2.36倍であり，この反応により理論上妥当なキノ
ンイミン色素（H2O2）が回収されることがわかる。
次に,MnCl2を使用して還元剤の使用濃度についての検討
を行った。上記第１図のトレースＤの系においてMnCl2
濃度を０〜600mMに変化させて，キノンイミン色素の吸
光度を測定した。その結果を第２図にトレースＡで示
す。さらに同様の系にEDTAを1mMとなるように添加した
系において同様の反応を行った。その結果を第２図にト
レースＢで示す。第２図のトレースＡから,0.5MのMnCl2
が存在すれば02 -がすべてH2O2に還元されることがわか
る。さらに還元補助剤（EDTA）が存在すると02 -からH2O
2への反応が促進される。EDTAが上記濃度で存在する場
合には,MnCl2が0.4MでトレースＢは飽和し，充分なH2O2
への変換反応が行われることがわかる。
を行った。上記第１図のトレースＤの系においてMnCl2
濃度を０〜600mMに変化させて，キノンイミン色素の吸
光度を測定した。その結果を第２図にトレースＡで示
す。さらに同様の系にEDTAを1mMとなるように添加した
系において同様の反応を行った。その結果を第２図にト
レースＢで示す。第２図のトレースＡから,0.5MのMnCl2
が存在すれば02 -がすべてH2O2に還元されることがわか
る。さらに還元補助剤（EDTA）が存在すると02 -からH2O
2への反応が促進される。EDTAが上記濃度で存在する場
合には,MnCl2が0.4MでトレースＢは飽和し，充分なH2O2
への変換反応が行われることがわかる。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ 〔02 -の定量〕 10mM TOOS 0.3 ml 10mM 4−AA 0.15ml 100U/mlペルオキシダーゼ 0.03ml 2M MnCl2を含む20mM MESバッファー（pH6.3） 0.75ml 20mM MESバッファー（pH6.3） 1.75ml KO2を1Mとなるようにクラウンエーテルに溶解させ，そ
の溶液0.02mlを上記反応組成に加えた。KO2から生成す
る02 -は,H2O2に変換され，酸化によるキノンイミン色素
の発色として測定された。その結果,20μＭのKO2が定量
された。これに対して,MnCl2を含有しない系において
は，発色が起こらないため定量ができなかった。
の溶液0.02mlを上記反応組成に加えた。KO2から生成す
る02 -は,H2O2に変換され，酸化によるキノンイミン色素
の発色として測定された。その結果,20μＭのKO2が定量
された。これに対して,MnCl2を含有しない系において
は，発色が起こらないため定量ができなかった。
実施例２ 〔ヒポキサンチンの定量〕 10mM TOOS 0.3 ml 10mM 4−AA 0.15ml 1000U/mlペルオキシダーゼ 0.03ml 15U/mlキサンチンオキシダーゼ 0.02ml 2M MnCl2を含む20mM MESバッファー（pH6.3） 0.75ml 20mM MESバッファー（pH6.3） 1.73ml 上記反応組成にヒポキサンチン溶液（０〜20μＭ）0.02
mlを加え，反応系の吸光度を測定した。ヒポキサンチン
濃度が高くなると，生成するH2O2の量が増加し，そのた
めキノンイミン色素が増加して吸光度が上昇する。その
結果を第３図に示す。このように，ヒポキサンチン濃度
が20μＭまで，ヒポキサンチン濃度と吸光度との間に直
線的な関係が得られた。ヒポキサンチンを添加しない場
合（ブランク）の吸光度は極めて低く，かつ一定値を示
した。
mlを加え，反応系の吸光度を測定した。ヒポキサンチン
濃度が高くなると，生成するH2O2の量が増加し，そのた
めキノンイミン色素が増加して吸光度が上昇する。その
結果を第３図に示す。このように，ヒポキサンチン濃度
が20μＭまで，ヒポキサンチン濃度と吸光度との間に直
線的な関係が得られた。ヒポキサンチンを添加しない場
合（ブランク）の吸光度は極めて低く，かつ一定値を示
した。
実施例３ 〔グアナーゼの定量〕 200μＭグアニン 200μM MBTH 1mM ESPAS 0.2U/mlキサンチンオキシダーゼ 3U/mlペルオキシダーゼ 0.5M MnCl2 50mM リン酸バッファー（pH7.0） 上記組成の試液1mlにグアナーゼを０〜10U/の割合で
含有するグアナーゼ試料0.02mlを添加し,10分間吸光度
を測定した（レート法による）。その結果，グアナーゼ
濃度と吸光度とは10U/まで直線的な関係を示した。こ
れはMnCl2の代わりにスーパーオキサイドアニオンジス
ムターゼを200U/mlの割合で添加して測定した系の約2.5
倍の感度である。
含有するグアナーゼ試料0.02mlを添加し,10分間吸光度
を測定した（レート法による）。その結果，グアナーゼ
濃度と吸光度とは10U/まで直線的な関係を示した。こ
れはMnCl2の代わりにスーパーオキサイドアニオンジス
ムターゼを200U/mlの割合で添加して測定した系の約2.5
倍の感度である。
（発明の効果） 本発明方法によれば，スーパーオキサイドアニオンを正
確かつ短時間で測定することができる。この方法は,02 -
およびH2O2を生成するオキシダーゼ反応系を利用した基
質や酵素活性の測定に好適に利用され得る。
確かつ短時間で測定することができる。この方法は,02 -
およびH2O2を生成するオキシダーゼ反応系を利用した基
質や酵素活性の測定に好適に利用され得る。
第１図は，キサンチンオキシダーゼ存在下でのヒポキサ
ンチンの酸化反応において生成するH2O2をキノンイミン
色素に変換し，従来法および本発明方法によりそれぞれ
測定したときの吸光度を示す曲線；第２図は，本発明方
法において使用される還元剤の量とオキシダーゼ反応に
より生成するH2O2との関係を示すグラフ；そして第３図
はヒポキサンチンを本発明方法により定量したときの，
該ヒポキサンチンと吸光度との関係を示すグラフであ
る。
ンチンの酸化反応において生成するH2O2をキノンイミン
色素に変換し，従来法および本発明方法によりそれぞれ
測定したときの吸光度を示す曲線；第２図は，本発明方
法において使用される還元剤の量とオキシダーゼ反応に
より生成するH2O2との関係を示すグラフ；そして第３図
はヒポキサンチンを本発明方法により定量したときの，
該ヒポキサンチンと吸光度との関係を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】スーパーオキサイドアニオンを含む試料に
還元剤，または還元剤とその補助剤とを作用させて該ス
ーパーオキサイドアニオンを過酸化水素に変換し，該過
酸化水素を測定することを特徴とするスーパーオキサイ
ドアニオンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7209187A JPH0673474B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | ス−パ−オキサイドアニオンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7209187A JPH0673474B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | ス−パ−オキサイドアニオンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63236963A JPS63236963A (ja) | 1988-10-03 |
| JPH0673474B2 true JPH0673474B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=13479390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7209187A Expired - Lifetime JPH0673474B2 (ja) | 1987-03-25 | 1987-03-25 | ス−パ−オキサイドアニオンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673474B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4964887B2 (ja) * | 2006-08-28 | 2012-07-04 | 興和株式会社 | 鉛濃度測定用試薬及び鉛濃度測定方法 |
| KR100861126B1 (ko) | 2007-02-16 | 2008-09-30 | 서강대학교산학협력단 | 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약 및 이의 용도 |
-
1987
- 1987-03-25 JP JP7209187A patent/JPH0673474B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63236963A (ja) | 1988-10-03 |
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