JPS60262599A - アスコルビン酸の新規な分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アスコルビン酸の新規な分解方法に関する。

アスコルビン酸は、ビタミンＣとして良く知られた還元
性物質であり、これが被検試料例えば体液成分中に共存
する場合は、酸化還元反応を利用するそれら被検試料中
の目的成分の定量の際、その還元性に起因して、正又は
負の誤差を与える原因となることが良く知られている。

これらアスコルビン酸の分解方法としては、アスコルビ
ン酸オキシダーゼを用いる方法（％公昭５６−３９１９
８）、ヨウ素酸若しくはその塩を用いる方法、又は過ヨ
ウ素酸類若しくはこれらの塩を用いる方法（特開昭５６
−１．０９５９５、特開昭５６−１５１３５８、特開昭
５６−１０７１．６１）などが、臨床化学、製薬化学、
生化学、食品化学のような分野の課題を解決する技術と
して、開示されている。

しかしながら、アスコルビン酸オキシダーゼを用いる場
合は、アスコルビン酸オキシダーゼが酵素であるが故の
固有の問題点即ち熱安定性及び貯蔵安定性の問題がある
上、酸化還元反応を利用する被検試料中の目的成分の定
量の際、最も要求される、１液中、１ステツプで及び所
要の試薬が全て１液中に存在する一液型の試薬を用いて
反応させる場合には、アスコルビン酸オキシダーゼを多
量に用いなければ、測定の目的成分である基質に酸化酵
素が先に作用して、まだ、分解すべきアスコルビン酸が
存在するうちに酸化酵素による過酸化水素の生成反応が
優先して進行し、結果として。

そのような酸化酵素を用いる酵素反応を利用する目的成
分の定量に適用することができない。

又、ヨウ素酸若しくはその塩、父は過ヨウ素酸類若しく
はこれらの塩を用いる場合は、これら酸化剤の酸化作用
により酸化酵素などの酵素活性が阻害される場合もあっ
て、結果として、測定の目的成分である基質に酸化酵素
が作用する酵素反応を阻害する場合が生じる上、これら
酸化酵素がその酵素活性を阻害されることなく基質に作
用して定量的に過酸化水素を生成したとしても、そのよ
うにして定量的に生成する過酸化水素を吸光度測定によ
り定量する際に、典型的に用いられる被酸化性呈色試薬
の発色至適ｐＨと、ヨウ素酸若しくはその塩、又は過ヨ
ウ素酸類若しくはそれらの塩がアスコルビン酸を分解す
る至適ｐＨとが一致するような被酸化性呈色試薬が、現
在のところ開発されていないため、又、過ヨウ素酸類若
しくはこれらの塩を用いる場合は、過剰の過ヨウ素酸類
若しくはこれらの塩を分解するアルコール類とかアルデ
ヒド類といったような分解剤を必要とするため、１液中
、１ステツプで、及び所要の試薬が全て１液中に存在す
る一液型の試薬を用いて反応させる、最も要求される反
応の場合には、適用する５− ことができない現状にある。

一方アスコルビン酸が、ニ価の銅イオン（Ｃｕ２＋イオ
ン）の存在下に酸化されてデヒドロアスコルビン酸及び
Ｈ２Ｏ２を生成する反応は古くから知られている（　Ｅ
、Ｓ、　、Ｇ［ＪＺＭＡＮ　ＢＡＲＲＯＮ。

Ｒ，Ｈ、Ｄｅ−ＭＥＩＯ，ＡＮＤ　ＦＩＲＩＥＤＲＩＣ
Ｉ−ＩＫＬＥＭＰＥＲＥＲ，Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅ
ｍ、　１１２，６２５〜６４０　（１９３６））、　Ｌ
、かしながら、これは、デヒドロアスコルビン酸と共に
Ｈ２Ｏ２が生成する反応であり、この分解反応を、基質
に酸化酵素を作用させることにより生成するＨ２Ｏ２を
測定して被検試料中のそれら目的成分を定量する反応に
適用すると、それら両方の反応で生成したＨ２Ｏ２を、
各々、別々に、認識し又は検出できない限り、到底、そ
のような定量反応に適用することはできない。

従って、このような、即ち、Ｃｕ　イオンの存在下にア
スコルビン酸が酸化されて分解するような反応を、基質
に酸化酵素を作用させることにより生成するＨ２Ｏ２を
測定して被検試料中のそれら目的成分を定量する反応に
適用することなど到底−〇− 考えられないことであった。

本発明者らは、このような現状に鑑み、銅イオンの存在
下のアスコルビン酸の分解反応に付き鋭意研究の途上、
アスコルビン酸が銅イオンの存在下に酸化されてデヒド
ロアスコルビン酸及（ｊＨ２０を生成する反応が存在す
ること、及びそのような分解反応には銅イオンの他にペ
ルオキシダーゼ及び、■４−アミノアンチピリン、■３
−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン、■２，２′−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホ
ン酸）、■トリフェニルメタン系ロイコ色素、■フェノ
ール系化合物、■アニリン系化合物、■ナフトール系化
合物から成る群より選ばれた一種又は二種以上の化合物
の存在が必要であること、更に、この方法が基質に酸化
酵素を作用させてＨ２０２を生成させ、これを測定する
ことにより被検試料中の目的成分を定量する、体液成分
の定量方法に適用し得ることを見出し、本発明を完成す
るに到った。

即ち、本発明は、−価又は二価の銅イオン、ペルオキシ
ダーゼ、及び下記■〜■から成る群より選ばれた一種又
は二種以上の化合物を共存させることを特徴とする、ア
スコルビン酸の分Ｍ方法である。

■４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）■３−メチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ） ■２，２′−丁ジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ） ■トリフェニルメタン系ロイコ色素 ■フェノール系化合物 ■アニリン系化合物 ■ナフトール系化合物 本発明の反応は、次式に従って進行する。

デヒドロアスコルビン数十Ｈ２０＋ 従来、アスコルビン酸の酸化分解反応の反応系にＣｕ２
＋イオンが存在すれば、デヒドロアスコルビン酸と共に
生成する物質はＨ２Ｏ２であると固定的に考えられてい
たことを考慮に入れると、そのようなＣＬＩ２＋イオン
が存在するアスコルビン酸の酸化分解反応に於てデヒド
ロアスコルビン酸が生成すると共に１−１２０が生成す
る反応が存在するとは、全く思いも寄らず、極めて意想
外のことであるといわざるを得ない。

また、従来、アスコルビン酸を分解する銅イオンは２価
の銅イオンであるとされていたが、本発明者らは、４−
アミノアンチピリンや３−メチルベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン等の還元性物質の共存下に於ては、ＣＬＩ２＋
は還元されてＣｕ＋とじて存在し、尚且つ、アスコルビ
ン酸を分解して、これをデヒドロアスコルビン酸とｌ−
１２０に変え得ることをも見出した。即ち、アスコルビ
ン酸を分解する銅イオンは二価の銅イオンに限定される
ものではなく、−価の銅イオンも同様の作用効果を有す
ることを本発明者らは初めて見出したのである。

また、本発明の方法を実施するに用いる１価又は２価の
銅イオン、°ペルオキシダーゼ、及ヒ■４−アミノアン
チピリン、■３−メチルベンゾチア９− シリノンヒドラゾン、■２．２’−アジノビス（３−ニ
チルベンソチアソリン−６−スルホン酸）、■トリフェ
ニルメタン系ロイコ色素、■フェノール系化合物、■ア
ニリン系化合物、■ナフトール系化合物から成る群より
選ばれた一種又は二種以上から成る新規なアスコルビン
酸分解用試薬組成物は、アスコルビン酸と同じ還元性物
質であるビリルビンにも作用して、その還元性を失わせ
る効果をも併せて有する。従って、本発明の方法をＨ２
０２のような酸化性物質を測定することにより目的成分
を定量するような反応即ち、酸化還元反応（レド・ンク
ス反応）により目的成分を定量する反応に。

これを適用すると、そのような反応系に存在するアスコ
ルビン酸やビリルビンのような還元性物質の妨害を効果
的に回避することができるので、目的成分を、そのよう
な妨害による悪影響なしに、正確に定量することができ
る。

本発明に於て、Ｈ２Ｏ２の生成なしにアスコルビン酸を
分解させるに必要な銅イオンは、１価の銅イオンであっ
ても、２価の銅イオンであってもよ−１：Ｏ− く、併用する上記■〜■の試薬の遣光力の強さにより、
１価のイオンの状態で存在することも、２価のイオンの
状態で存在することもあり得る。

本発明に於て、　Ｈ２Ｏ２の生成なしにアスコルビン酸
を分解させる目的で、１価又は２価の銅イオン及びペル
オキシダーゼと共に用いられる、４−アミノアンチピリ
ン、３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン、２．２
’−アジノピス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルホン酸）、　）リフェニルメタン系ロイコ色素、フェ
ノール系化合物、アニリン系化合物、ナフトール系化合
物に於て、トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例と
しては、従来から公知のロイコマラカイトグリーン、ロ
イコクリスタルヴアイオレット等の他、最近開発された
。ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）２−スルホフェ
ニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）４−
スルホプロポキシフェニルメタンナトリウム塩、ビス（
ｐ−ジエチルアミノフェニル）　３．４−ジスルホプロ
ポキシフェニルメタンジナトリウム塩（以下Ｂ　Ｓ　ｄ
ｉｐｒｏＰ　Ｍと略称する０）等が挙げられる。

また、フェノール誘導体の具体例としては、フェノール
ｈｐ　’７０口フェノール、　２．４−ジクロロフェノ
ール　、７％ロモフェノール、０−クロロフェノール、
ｍ−クロロフェノールなどが挙ケられ、アニリン誘導体
としては、アニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、
Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイ
ジン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシ
エチル）−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−）ルイジン、３，５−
ジメチルーＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホブロビル）アニリン、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エ
チル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリ
ンなどが挙げられる。

更に、ナフトール誘導体としては１−す７トール、■−
ナフトールー２−スルホン酸、１．−ナフトール−２−
カルボン酸、１−ナフトール−８−スルホン酸、１−ナ
フトール−３−スルホン酸、１−ナフトール−５−スル
ホン酸などが挙げられる。

本発明の、還元性物質の分解反応は、通常は、溶液中で
実施される。

そのような溶液中のＣＬＩ＋又はＣｕ２＋イオン濃度と
しては、通常、０．００１〜１　ｍｍｏｔ／ｌであり、
ｐ［■は、例えば、６．０〜８．５が選ばれ、そのよう
なｐＨに溶液を維持するための緩衝液としては、例えば
、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩緩衝液、グツド緩衝液など、汎用されているもの
が使用されるが、その好ましい一例を挙げるとｔｏ、０
０１〜２　Ｍ　＋７ン酸緩衝液が挙げられる。

そのような溶液中に於て、Ｃｕ＋又はＣｕ２＋イオンを
与える化合物としては、例えば、硫酸銅、塩化第ニ銅、
塩化第一銅、硝酸銅、臭化第二銅、臭化第一銅、リン酸
第二銅などの水溶性無機銅塩、酒石酸銅、クエン酸銅、
酢酸銅などの水溶性有機銅塩、などの水溶性銅化合物、
が挙げられる。

本発明に用いるペルオキシダーゼの＠度は、通常２０〜
５０００［Ｊ＃６　であり、好ましくは、５〇１３− 〜２０００Ｕ／１７１！である。

また、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）　の濃度
は１通常、０．００１〜０．０５％であり、好ましくは
、０．００３〜０．０３チである。

３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢ　Ｔ　
Ｈ）　＋７）濃度は、通常、０．０００５〜０．２％で
あり。

好ましくは、０．００１〜０．０５％である。

２．２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の濃度は、通常、０．０
０２〜０．４％であり、好ましくは、０．０２〜０．２
チである。

トリフェニルメタン系ロイコ化合物の濃度は、通常、０
．００５〜０．５　ｍｍｏｌ／ｌであり、好ましくは、
０．０　：３−０．３　ｍｍｏｌ／ｌである。

また、フェノール系化合物、アニリン系化合物又はナフ
トール系化合物の濃度は、通常、ｏ、ｏ］〜０．５係で
あり、好ましくは、０．０３〜０．３ｔ１６である。

本発明の還元性物質の分解方法は、また、すべての試薬
が吸収性担体中に又はフィルム中に乾燥した形で存在す
る試験紙にも同様にして用いること１４− ができる。

生体液中の成分の測定に先立って前処理として本発明方
法を行なうと、アスコルビン酸及びビリルビンは速やか
に酸化されて、その妨害作用は消失する。

本発明の還元性物質の分解方法を適用して特に効果的な
測定方法は、被検試料が体液であり、定量の目的成分が
体液成分であるような測定方法であるが、そのような、
目的成分を定量する反応として代表的なものに、定量の
目的成分が基質又は酵素であって汀つその酵素が基質に
作用しでＨ２Ｏ２を生成するような酸化酵素である酵素
反応があり、このような反応の例としては、基質がグル
コース、コレステロール、ダリセロール、グリセロール
リン酸エステル、コリン、アシルＣＯＡ　、ピルビン酸
。

尿酸、キサンチン又は乳酸であり、それらの基質に作用
する酸化酵素が、各々グルコースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グ
リセロールリン酸エステルオキシダーゼ、コリンオキシ
ダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、ピルビン酸オキシ
ダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ又は乳酸
オキシダーゼである系等が挙げられる。

このような反応で生成したＨ２Ｏ２を定量することによ
り目的成分を定量する場合は、それら生成したＨ２Ｏ２
によって、ペルオキシダーゼの存在下に酸化されて呈色
する被酸化性呈色試薬を用い。

その呈色を測定することによって目的成分を定量するの
が、一般的である。

かかる目的に用いられる被酸化性呈色試薬としては、４
−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）　とフェノール系
化合物との組合せ試薬、４−アミノアンチピリン（４−
ＡＡＰ）とアニリン系化合物との組合せ試薬、４−アミ
ノアンチピリン（４−ＡＡＰ）とナフトール系化合物と
の組合せ試薬、３−　メチルベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（ＭＢ’ｒＨ）とアニリン系化合物との組合せ試薬
、２．２’−アジ７） ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
（ＡＢＴＳ）、）リフェニルメタン系ロイコ色素等、先
に述べた、本発明に於て、Ｈ２Ｏ２の生成なしにアスコ
ルビン酸を分解させるに必要な試薬と同じものが、単独
で、若しくは組合せ試薬として挙げられる。また、ここ
で使用するトリフェニルメタン系ロイコ色素、フェノー
ル系化合物、アニリン系化合物、ナフトール系化合物等
の具体例も、先に述べた、本発明で用いられるトリフェ
ニルメタン系ロイコ色素、フェノール系化合物、アニリ
ン系化合物、ナフトール系化合物の具体例と同じものが
挙げられる。

従って、かかる測定系に本発明のアスコルビン酸の分解
方法を適用した場合には、　Ｈ２Ｏ２の生成を伴わずに
アスコルビン酸を分解させる目的で、銅イオン、ペルオ
キシダーゼと共に用いる上記■〜■の化合物が、そのま
ま被酸化性呈色試薬として、又は被酸化性呈色試薬のカ
プラー若しくはデベロッパーとして使用し得るので、新
たに他の被酸化性呈色試薬を加える必要はない。即ち、
前記目的で、銅イオン、ペルオキシダーゼと共にカプラ
ーを用いた場合にはデベロッパーヲ、デベロッパーを用
いた場合にはカプラーを後から加えれば１９− 良いし、それ自体被酸化性呈色試薬であるＡＢＴＳやト
リフェニルメタン系ロイコ色素を用いた場合、場合、並
びにＭ　Ｂ　Ｔ　Ｈとアニリン系化合物の組合せ試薬を
用いた場合などは、当然のことながら。

そのままそれらが被酸化性呈色試薬となり得るので、更
に他の被酸化性呈色試薬を加える必要は全くない。

本発明の方法を適用できる、基質に酸化酵素を作用させ
てＨ２０２を生成させ、これを測定することにより被検
試料中の目的成分を定量する体液成分の定量方法に於け
る定量試薬の例を挙げると。

次のとおりである。

（１１基質測定用の系がグルコースを測定するために用
いられ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
４−アミノアンチピリン、フェノール又はＮ、Ｎ−ジエ
チルキシリジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

（２）基質測定用の系が尿酸を測定するために用い−ｉ
、８− られ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ
−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン、４−アミノアン
チピリ／および緩衝剤を含有する試薬。

（３）基質測定用の系がコレステロールを測定するため
に用いられ、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステ
ルヒドロラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、４−ア
ミノアンチピリン、フェノール又はＮ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチル−ｍ　−トルイジンおよび緩衝剤を含有
する試薬。

（４）基質測定用の系がトリグリセライドを測定するた
めに用いられ、ペルオキシダーゼ、リポプロティンリパ
ーゼ、グリセロキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ｐ−クロロ・フ
ェノール又はＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−
）ルイジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

（５）基質測定用の系がリン晰質を測定するために用い
られ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ１）、コリン
オキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フェノール又
はＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン
および緩衝剤を含有する試薬。

（６）基質測定用の系がアシルＣｏＡを測定するために
用いられ、ペルオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダー
ゼ、４−アミノアンチピリン、ｐ−クロロ・フェノール
又はＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−）ルイジ
ンおよび緩衝剤を含有する試薬。

（７）基質測定用の系がピルビン酸を測定するために用
いられ、ペルオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、
フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフ
ェート、４−アミノアンチピリン、ｐ−クロロフェノー
ル又はＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−）ルイ
ジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

（８）基質測定用の系がグリセロールを測定するために
用いられ、ペルオキシダーゼ、グリセロールオキシダー
ゼ、４−アミノアンチピリン、ｐ−り０９７エ／　ｋ　
又ハＮ　−ｘ−ｙ−ルーＮ−ヒドロキシエチル−ｍ−ト
ルイジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

（９）基質測定用の系がコリンを測定するために用いら
れ、ペルオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−アミ
ノアンチピリン、フェノール又はＮ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチル−ｍ−トルイジンおよび緩衝剤を含有する
試薬。

（ｌＯ）基質測定用の系がグリセロール−３−リン酸を
測定するために用いられ、ペルオキシダーゼ。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、４−アミノア
ンチピリン、ｐ−クロ９・フェノール又はＮ−エチルー
Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−）ルイシンおよび緩衝剤を
含有する試薬。。

（１１）基質測定用の系が尿酸を測定するために用いら
れ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、２．２’−アジノ
ービス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）及び緩衝剤を含有する試薬。

以上のような定量用試薬を用いて被検試料中の体液成分
を定量する方法に、本発明に係るアスコルビン酸の分解
方法及び分解用試薬を適用する場合は、酸化還元反応（
レドックス反応）を利用する被検試料中の目的成分の定
量の際、最も要求さ２１− れる、１液中、１ステツプで及び所要の試薬が全て一液
中に存在する一液型の試薬を用いて反応させた場合に於
ても、それら酸化性物質や還元性物質を測定することに
より目的成分を定量する反応系に共存スるアスコルビン
酸やビリルビンのような還元性物質の妨害を効果的に回
避することができるので、目的成分を、そのような妨害
による悪影響なしに、正確に定量することができる。

例えば、血清中の遊離コレステロールを定量するには、
ＣＬＩＳＯ４・５Ｈ２００，００１〜］、　ｍｍｏｔ／
ｌ、　４−ＡＡＰｏ、００３〜０．０３係、フェノール
系化合物、アニリン系化合物又はナフトール系化合物０
．０３〜０．３ｑ６、ペルオキシダーゼ　５０〜２ｏｏ
ｏ雫ｄｌコレステロ一ルオキシダーゼ５〜１ｏｏＵ／ｄ
ハ界面活性剤０．０５〜０．２チの濃度になるよう、こ
れらを溶解した緩衝液を測定試薬として用いると。

血清中に存在するアスコルビン酸やビリルビンのような
還元性物質の妨害を効果的に回避し、より正確な遊離コ
レステロール値を測定することができる。

−２２＝ 以上述べたように、本発明は、本発明者ら独自の着想に
より、従来全く適用困難と考えられていた、−価又は二
価の銅イオンの存在下にアスコルビン酸が酸化されて分
解する反応を、酸化還元反応（レドックス反応）を利用
する被検試料中の目的成分の定量に適用することができ
る方法及び試薬を提供するものであり、斯界に貢献する
ところ極めて大なるものである。

以下に実験例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。

実験例１ 〔測定試薬〕 ■第１試液：ＣＬＩＳＯ４・５Ｈ２０、ペルオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）、フェノール、】−ナフトール−２−スル
ホン酸、４−ＡＡＰを夫々単独で、又は二種以上組み合
わせたものを、０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐ　ｌ−１
＝　７．０　’）に溶解する。但し、ＣｕＳＯ４・５Ｉ
］２０は０００３％、ＰＯＤは３００Ｕ／Ｊ、フェノー
ルはＯ，１％、］−］ナフトールー２−スルホンは０．
１％、４−ＡＡＰ　は０．０１％の濃度になるよう調製
する。

■第２試液（発色試液）：ＰＯＤを３００　’Ｕ／ｌｉ
ｅ、。

フェノールを０．１９６．４−ＡＡＰ　を００１係の濃
度になるように、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ−Ｉ　
−７，０）に溶解したものを、発色試液とする。

但し、第１試液で１−ナフトール−２−スルホン酸を含
む試液を用いた場合には、第２試液（発色試液）として
、ＰＯＤを３００　Ｕ／ｄｌ、］−］ナフトールー２−
スルホンを０．′１チ、４−ＡＡＰを０．０１％の濃度
になるように、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０
）に溶解したものを用いる。

〔測定方法〕

アスコルビン酸溶液（１００ｍＷｌｄｌ＞を５０　μｔ
とり、これに第１試液２ｍｌを加え、３７°Ｃで３分間
加温した後、第２試液（発色試液）２ｍｌを加え。

３７°Ｃで５分間加温する。試薬盲検を対照として波長
５０５　ｎｍ　に於ける吸光度を測定する。測定ト 結果を表１に示す。

表　１ 注）アスコルビン酸が分解してＨ２０２を生成している
場合には、系内の４−ＡＡＰとフェノール。

あるいは４−ＡＡＰ　と１−ナフトール−２−スルホン
酸が、そのＨ２Ｏ２により酸化を受けて波長５０５　ｎ
ｍ近辺に吸収が現われる。

本実験より、銅イオンとＰ　０１）の他に、　４−ＡＡ
Ｐ。

フェノール、１−ナフトール−２−スルホン酸。

及びフェノールと４−ＡＡＰあるいは°４〒ΔＡ　Ｆｌ
ｖと１−ナフトール−２−スルホン酸の両方が共存−２
５＝ している場合には、Ｈ２Ｏ２の生成が認められないこと
がわかる。但し、第１試液中に、銅イオンとＰＯＤの他
に、４−ＡＡＰ、フェノール、■−ナフトールー２−ス
ルホン酸のいずれか１つが共存している場合には、仮に
Ｈ２０２が生成したとしても、ＰＯＤと４−ＡＡＰ、フ
ェノール又は１−ナフトール−２−スルホン酸によって
Ｈ２Ｏ２が消去されてしまうため、見かけ上検出されな
いことも考えられる（４−ＡＡＰ単独、フェノール単独
、又は１−ナフトール−２−スルホン酸単独の場合には
、酸化されても外観上さほど変化がない為、本実験から
では確認できない）。そこで、次に、これらの場合にも
、アスコルビン酸がＨ２Ｏ２の生成を伴わずに分解され
ていることを確認する実験を行なった。

実験例２ 〔測定試薬〕 ■第１試液：　ＣｕＳＯ４＠　５Ｈ２０を０．００３％
、ＰＯＤを３００　Ｕ／ｄｅ、及び４−ＡＡＰを０．０
１７％（又はフェノールを０．０１％、又は１−ナフト
ール−２６− ２−スルホン酸を０．０１．％）　の濃度になるように
。

００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）に溶解する。

■第２試液（発色試液）　：　Ｎａ１Ｏ＋を２０ｍｆ／
ｄｌ、フェノールを０．１係（又は４−ＡＡＰを０．０
目１の濃度になるように、０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ＝　７．５　）に溶解する。

但し、第１試液で４−ＡＡＰ　を含む試液を用いた場合
には、第２試液でフェノールを含む試液を使用し、第１
試液でフェノール又は１−ナフトール−２−スルホン酸
を含む試液を用いた場合には。

第２試液で４．−ＡＡＰを含む試液を使用する。

〔測定方法〕

試料トして、アスコルビン酸を各々、　Ｏｍｔｌｄ７！
、１００　ｍＷ／ｄｌ、　２００ｍｆ／ｄｌ　（１１ｍ
ｍｏｔ／ｌ）の濃度になるように０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．５）に溶解したもの、あるいは、Ｈ２０
２を各々、Ｏｍｍｏｔ／ｌ、５　ｍｍｏｌ／ｌ、　１０
　ｍｍｏｔ／ｌの濃度になるように０．０５ＭＩＪン酸
緩衝液に溶解したものを用いる。

試料を１００μｔとり、これに第１試液２　ｍｌを加え
、３７°Ｃで１０分間加温する。この混合液を１００μ
ｌとり、これに第２試液（発色試液）３ｍｌを加え、３
７°Ｃで５分間加温後、試薬盲検を対照として波長５０
５　ｎｍに於ける吸光度を測定する。

測定結果を表２に示す。

２９− 以上、銅イオンによるアスコルビン酸の分解に於て、共
存している４−ＡＡＰ、フェノール、１−ナフトール−
２−〜スルホン酸が何ら変化を受けていないので、本反
応系ではＨ２Ｏ２の生成はないといえる。一方、アスコ
ルビン酸とほぼ等量のＨ２Ｏ２を試料とした場合には、
明らかにＨ２Ｏ２にょる４−ＡＡＰ、フェノール、１−
ナフトール−２−スルホン酸への酸化が起こり、４−Ａ
ＡＰ共存系ではれていることがわかる。

実験例３゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液：　Ｃｕ５Ｏｎ−５Ｈ２０，Ｐ　ＯＤ　、３
−　メチＡ／　−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエ
チル）−アニリン（ＭＢＨＡ）、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を夫々単独で、
又は二種以上組み合わせたものを、０．０’　５　Ｍリ
ン゛酸緩衝液ＣＩ）Ｈ＝　７．０　）に溶解する。但し
、ＣｕＳ０４＊５Ｈ２０は０．００３％、ＰＯＤは３０
０　Ｕ／ｄ１１ＭＥ１１１ｙ−３０＝ は０．０５％、ＭＢＴＨは０．０３チの濃度になるよう
調製する。

■第２試液（発色試液）：第１試液でＭＥＨＡを含む試
液を用いた場合には、第２試液（発色試液）として、Ｐ
ＯＤを３００Ｕ／ｄｌ！、、４−ＡＡＰを０．０１％の
濃度になるように、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７
．０）に溶解したものを用い、第１試液でＭＢＴＨを含
む試液を用いた場合には、第２試液（発色試液）として
、ＰＯＤを３００Ｕ／、１５．ＭＥＨＡを００２％の濃
度になるように、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に溶解したものを用いる。１だ、第１試液中にＭＥ
ＨＡもＭ　Ｂ　Ｔ　Ｈも含まない場合には、第２試液（
発色試液）として、ＰＯＤを３００　Ｕ／ｄｌ、ＭＥＨ
Ａを０．０５チ、４−ＡＡＰを０．０１チの濃度になる
ように、００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解
したものを用いる。

〔測定方法〕

アスコルビン酸浴液（１００〜／ｄｌ）を５０μｌとり
、これに第１試液２　ｍｌを加え、３７℃で５分間加温
した後、第２試液（発色試液）２−を加え、３７℃で５
分間加温する。試薬盲検を対照として、波長５５　Ｑ　
ｎｍに於ける吸光度を測定する。測定結果を表３に示す
。

表　３ 本実験より、第１試液中に、銅イオンとＰＯＤの他に、
ＭＦｉＨＡ又はＭＢＴＨが共存している場合には、外観
上、Ｈ２Ｏ２の生成はないようである。

しかしながら、本実験からでは、アスコルビン酸　、の
分解が確かにＨ２Ｏ２の生成力しに起こっているかどう
かはわからないので、これを確認するため、次のような
実験を行なった。

実験例４゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液：　ＣｕＳＯ４−５Ｉ（ｚＯｆ：Ｏ，ＯＯ３
％、ＰＯＤを３００Ｕ／ｄｌ、及びＭＥＨＡをＱ、０１
９％（又はＭＢＴＨを０．０２５％）の濃度になるよう
に、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ，＝７．５）に溶解
する。

■第２試液（発色試液）　：　ＮａＩＯ４を２０ｎｖ／
ｃｔｅ、４−ＡＡＰを０．０１係（又はＭＥＨＡを０．
０１％）の濃度になるように、ｏ、ｏｓＭリン酸緩衝液
（ｐＨ−７，５）に溶解する。

但し、第１試液でＭＥＨＡを含む試液を用いた場合には
、第２試液で４−ＡＡＰを含む試液を使用し、第１試液
でＭＢＴＨを含む試液を用いた場合には、第２試液でＭ
　ＥＨＡを含む試液を使用する。

〔測定方法〕

試料として、アスコルビン酸ヲ各々、０〜／ｄｅ。

１００ｍ９／ｄｌ　、　２００ｍ９／ｄｌ　（１１ｍｍ
ｏｌ／Ａ）の濃度になるように００５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ−７，５）に溶解したもの、あるいは、Ｈ２Ｏ２を
各々、３３− Ｏｍｍｏｌ／Ａ！　、　５ｍｍｏｌ／ｌ、　１０ｍｍｏ
ｌ／Ａ！の濃度になるように０．０５　Ｍ　ＩＪン酸緩
衝液（’Ｃ溶解したものを用いる。

試料を１００μｌ　とり、これに第１試液２　ｒｎｌを
加え、３７℃で１０分間加温する。この混合液を１００
μｌとり、これに第２試液（発色試液）３ｄを加え、３
７℃で５分間加温後、試薬盲検を対照として波長５５０
１ｍに於ける吸光度を測定する。測定結果を表４に示す
。

表　４ ＊：第１試液中の銅イオン及びＰＯＤ以外の成分。

以上、銅イオンによるアスコルビン酸の分解に於て、共
存しているＭＥＨＡ、ＭＢＴＨが何ら変＝３４− 化を受けていないので、本反応系ではｌ−１２０２の生
成はないといえる。一方、アスコルビン酸とほぼ等がわ
かる。

実験例５゜ 〔測定試薬〕 （ａ）Ｃｕ８Ｕ４−５ＨｚＯｏ、　００３　％、Ｐ　Ｏ
Ｄ　３００Ｕ／ｄｌ。

ＡＢＴＳｏ、１％を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝
　７．０　）に溶解したもの。

（ｂｌ　Ｃｕ８０４−５Ｈ２００，００３％、ＰＯＤ　
３００Ｕ〆ｎ。

ビス（ｐ’＝ｒ〜ジエチルアミノフェニル）３．４−）
ス）Ｌ’　ホ７”　ｔｌポキシフェニルメタンジナトリ
ウム塩（慢≠世〒Ｂ　Ｓ　ｄｉｐｒｏ　Ｐ　Ｍ　番１翻
称モ≠＊千）　０．０　５　ｍ　Ｍを、００５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解したもの。

〔測定方法］ アスコルビン酸溶液（１００ｍ９７ｄｌ）を５０１！と
り、これに測定試薬（ａ）又は（ｂ）を加え、３７℃で
３分間加温した後、試薬盲検を対照として、夫々波長６
６０ｎｍ、又は６２０　ｎｍに於ける吸光度を測定する
。測定結果を表５に示す。

表　５ 本実験よシ、銅イオンとＰＯＤ及びＡＨＴ８が共存する
場合、並びに銅イオンとＰＯＤ及びトリフェニルメタン
系ロイコ色素が共存する場合にも、アスコルビン酸がＨ
２Ｏ２の生成を伴わずに分解されていることがわかる。

次に、本発明の反応系に於て、銅イオンが２価で存在し
ているか、１価で存在しているかを確認する実験を、Ｃ
ｕ＋の発色剤であるバックプロインスルホン酸ナトリウ
ムを用いて行なった。

シ 実験例６゜ 〔測定試料〕 Ｃｕ８０４＠　５Ｈ２ＣＬ　Ｐ　ＯＤ　、フェノール、
１−ナフトール−２−スルホン酸、４−ＡＡＰ、ＡＢＴ
ＪＢ　Ｓ　ｄｉｐｒｏ　ＰＭ、　Ｍ　Ｂ　Ｔ　）１を夫
々各種組み合わせたものを、０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ＝７．０）に？ａＦＦＪする。但し、Ｃｕ５０４−
５Ｉ−１２０は０．００３　％、ＰＯＤは３００Ｕ／ｄ
７１！、フェノールは０．１％、１−ナフトール−２−
スルホン酸は０．１係、４−ＡＡＰは００１チ、ＡＢＴ
８は０．１％、Ｂ　Ｓ　ｄｉｐｒｏＰＭは０．１．ｍｍ
ｏｌ　／ｌ、ＭＢＴＨｉｌｏ、１　％ノ濃度にナルよう
調製する。

〔発色試液〕

バックプロインスルホン酸ナトリウム１０ｍｇ／ｄｌを
０．５　Ｍリン酸カリウム（ｐＨ＝４．４）に溶解する
。

〔測定方法〕

各種組成の測定試料０．５　ｍｌに、発色試液２　ｍｌ
を加え、波長４３Ｑｎｍに於ける吸光度を測定し、これ
より測定試料中のＣｕ＋の濃度を算出する。更に、この
反応液中に、アスコルビン酸２０■を加え、再び、波長
４８０ｎｍに於ける吸光度を測定し、これより測定試料
中のＣｕ＋の濃度を算出する。

３７− 測定結果を表６．に示す。

表　６ ＊反応液が黄緑色となシ判別がつかない。しかし、この
系に、４−ＡＡＰを添加したところ、黄褐色となり、明
らかにＣｕ”＋はＣｕ＋となって、８８− バンクプロインスルホン酸ナトリウムと反応が起こって
いることが確認できた。従って、ＡＢＴＳとＣｕ”＋と
では、Ｃｕ＋にはなッテイないことがわかる。

上記実験より、２価の銅イオンは、フェノール、１−ナ
フトール−２−スルホン酸、Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ又はＢ　Ｓ
　ｄｉｐｒｏ　Ｐ　Ｍと共存の場合には、２価の銅イオ
ンのまま存在しているが、４−ＡＡＰ、又はＭ　ＢＴ　
Ｈと共存の場合には、１価の銅イオンとして存在してい
ることがわかる。

実施例１．　血清総コレステロールの測定〔測定試薬〕 各々、硫酸銅Ｑ、ｌ　２ｍｍｏｌ／ｌ、フェノール０．
１係、４−アミノアンチピリン０．０１％、ペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）６００Ｕ／ｄｌ、コレステロールエス
テルヒドロラーゼ３０Ｕ／ｄｌ、コレステロールオキシ
ダーゼ１５Ｕ／ｄ１１！、ロッシェル塩０５チ、トリト
ンＸ−１０・０・０．１係の濃度になるように、これら
を０．０５Ｍリン酸惜緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解する
。

〔測定方法〕

試料溶液として、血清１００　ｍｌに、アスコルビン酸
を各々０．５．１０．２０．３０．６０．８０゜１００
■／ｄｌ添加したものを用いる。

試料溶液を２０μｌ　とり、測定試薬３　ｍｌを加えて
、３７℃恒温槽中１０分間加温した後、試薬盲検を対照
として波長５Ｑ５ｎｍに於ける吸光度を測定する。

別に作成した検量線（第１図）から試料中の総コレステ
ロール濃度を算出する。測定結果を表７に示す。

比較例１ 〔測定試薬〕 実施例１．の測定試薬からＣｕｂ（Ｊ＋・５Ｉ−１２０
を除いたもの。

〔測定方法］ 実施例１と同じ試料溶液を用い、実施例１．の測定方法
に従い、総コレステロールの測定を行なう。

測定結果を表７に示す。

参考例１゜ 〔測定試薬〕 実施例１．の測定試薬に於て、Ｃｕ８０４・５Ｈ２０の
代わりに、ＡＯＤを１００Ｕ／ｄＪになるように加えた
もの。

〔測定方法〕

実施例１．と同じ試料溶液を用い、実施例１．の測定方
法に従い、総コレステロールの測定を行なう。

測定結果を表７に示す。

表　７ 注）（）内の数値はコレステロール回収率（チ）を示す
。

４１− 表７に示されるように、銅イオン、Ｐ　Ｕ　Ｄ　、フェ
ノール及び４−ＡＡＰを共存させた実施例】、に於ては
、アスコルビン酸が２０１ｎ９７ｄｌまで共存しても、
総コレステロール値には影響は認められないが、比較例
１．に於ては、アスコルビン酸が５　ｍｑｌｄｌ共存し
ても負の影響がでている。

また、表７に示されるように、本発明の方法によるアス
コルビン酸の妨害除去効果は、ＡＯＤによるものとほぼ
同等であることがわかる。

実施例２．　血清グルコースの測定 〔測定試薬〕 各々、硫酸銅Ｑ、　２　ｍ　ｍｏｌ／　ｌ　、フェノー
ル０．１係、４−アミノアンチピリン０，０１％、ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）　２００Ｕ／ｄｌ、グルコース
オキシダーゼ４０００Ｕ／ｄ７１！、ムタロターゼ１０
Ｕ／ｄ７！、ロッシェル塩０．５％の濃度になるように
、これらを０．０５Ｍリン酸緩衝液（＋）Ｈ７，０）に
溶解する。

〔測定方法〕

試料溶液として、血清１０（ｌｌに、アスコルビー４２
＝ ン酸を各々０　、５　、１０　、２０　、３０　、６０
．８０゜１００ｍ９７ｄｅ添加したものを用いる。

−試料溶液を２０μｌ　とり、測定試薬３　ｍｌを加え
て、３７°Ｃ恒温槽中５分間加温した後、試薬盲検を対
照として波長５０５ｎｍに於ける吸光度を測定する。

別に作成した検量線（第２図）から試料中のグルコース
濃度をめる。測定結果を表８に示す。

比較例２゜ 〔測定試薬１ 実施例２．の測定試薬からＣｕ　８Ｑ　４・５Ｈ２０を
除いたもの。

〔測定方法〕

実施例２と同じ試料溶液を用い、実施例２．の測定方法
に従い、グルコースの測定を行なう。測定結果を表８に
示す。

参考例２゜ 〔測定試薬１ 実施例２．の測定試薬に於て、Ｃｕｂ（Ｊ＋・５Ｈ２０
の代わりに、ＡＯＤを１００Ｕ／ｄｅになるように加え
たもの。

〔測定方法〕

実施例２．と同じ試料溶液を用い、実施例２．の測定方
法に従い、グルコースの測定を行なう。測定結果を表８
に示す。

表　８ を 注）（）内の数値はグルコース回収率（チ）を示す。

表８に示されるように、銅イオン、ＰＯＤ、フェノール
及び４−ＡＡＰを共存させた実施例２．に於テｆｄ、ア
スコルビン酸が２０ｍ９７ｄｌまで共存しても、グルコ
ース値には影響は認められないが、比較例２．に於ては
、アスコルビン酸が５ｍ９７ｄｌ共存しても負の影響が
でている。

また、表８に示されるように、本発明の方法によるアス
コルビン酸の妨害除去効果は、ＡＯＤによるものとほぼ
同等であることがわかる。

実施例３．遊離コレステロールの測定〔２液法〕〔測定
試薬〕 ■第１試液 各々、ＣｕＳ０４　・５Ｈ２００，０１％、Ｂ　８　ｄ
ｉｐｒｏ　Ｐ　ＭＯ，１ｍｍｏ７／ｌ、ＰＯＤ５００Ｕ
／ｄｌ、ウリカーゼ３０Ｕ／ｄｌ、トリトンＸ−１００
０，１チの濃度になるように、これらを０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ，＝７．０）に溶解する。

■第２試液 各々、コレステロールオキシダーゼ２０Ｕ／ｄＬトリト
ンＸ−１０００，１％の濃度になるように、これらを０
０５Ｍリン酸緩衝褒（ｐ）］＝７．０）に溶＝４５− 解する。

〔測定方法〕

試料溶液として、血清１００＋＋＋ｌに、アスコルビン
酸を各々０．１．０．２０．３０．４０．５０．。

１００〜／ｄｌ添加したものを用いる。

試料溶液を１０μｌ　とり、第１試液１　ｍｌを加えて
、３７℃恒温槽中５分間加温した後、第２試液２　ｍｌ
を加え、更に、３７℃恒温槽中５分間加温する。その後
、試薬盲検を対照として波長６２０ｎｍに於ける吸光度
を測定する。測定結果を表９に示す。

比較例３゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液 実施例３．の第１試液からＣＩ］ＳＯ４・５Ｈ２０を除
いたもの。

■第２試液 実施例３に同じ。

〔測定方法〕

実施例３．と同じ試料溶液を用い、実施例３．の測４６
一 定力法に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測
定結果を表９に示す。

参考例３゜ 〔測定試薬〕 ■第１試液 各々、ＡＯＤ３　０Ｕ／ｄ（！、ＢＳｄｉｐｒｏＰＭ０
．１ｍｍａｉｌ　／　ｌ　、　Ｐ　ＯＤ　５００　Ｕ／
ｄ７！、ウリカーゼ３０Ｕ／ｄｅ、トＩＪ　）　ンＸ−
１００ｏ、１　％（Ｄ濃度ニナルように、これらを０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ−７，０）に溶解する。

■第２試液 実施例３．に同じ。

〔測定方法〕

実施例３．と同じ試料溶液を用い、実施例３．の測定方
法に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結
果を表９に示す。

実施例４　遊離コレステロールの測定〔ｌ減法〕〔測定
試薬〕 実施例３．の第１試液と第２試液を１：２の割合で混合
したものを用いる。

〔測定方法〕

実施例３と同じ試料溶液を用いる。

試料溶液を１０μｌ　とり、測定試薬３　ｍｌを加えて
、３７℃恒温槽中１０分間加温した後、試薬盲検を対照
として波長６２０ｎｍに於ける吸光度を測定する。測定
結果を表９に示す。

比較例４ 〔測定試薬〕 比較例３の第１試液と第２試液を１：２の割合で混合し
たものを用いる。

〔測定方法〕

実施例３と同じ試料溶液を用い、実施例４．の測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表９に示す。

参考例４゜ 〔測定試薬〕 参考例３．の第１試液と第２試液を１：２の割合） で混合したものを用いる。

〔測定方法〕

実施例３と同じ試料溶液を用い、実施例４．の測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表９に示す。

４９− ５０− 表９に示されるように、本発明の方法によるアスコルビ
ン酸の妨害除去効果は、１液法、２液法共Ａ、　ＯＤと
同等若しくはそれ以上で、２液法の場合ニハ、アスコル
ビン酸１００■ｌｄ１寸で完全に影響を回避し得る。

実施例５．遊離コレステロールの測定〔２液法〕〔測定
試薬〕 実Ｍ例３、に同じ。

〔測定方法〕

試料溶液として、直情１００ｍ１に、ビリルビンを谷ｋ
Ｏ，５，１０，１，５，２０ｍ９７ｄｅ添加したものを
用いる。

試料溶液を１０μｇ　とり、第１試液１　ｍｌを加えて
、３７℃恒温槽中５分間加温した後、第２試液２　ｍｌ
を加え、更に、３７℃恒温槽中５分間加温する。その後
、試薬盲検を対照として波長６２０Ｔｈｍに於ける吸光
度を測定する。測定結果を表１０に示す。

比較例５ 〔測定試薬〕 比較例３に同じ。

〔測定方法〕

実施例５と同じ試料溶液を用い、実施例５．の測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表１０に示す。

参考例５゜ 〔測定試薬〕 参考例３．に同じ。

〔測定方法〕

実施例５．と同じ試料溶液を用い、実施例５の測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表１０に示す。

実施例６．遊離コレステロールの測定〔１液法〕〔測定
試薬〕 実施例４．に同じ。

〔測定方法〕

実施例５．と同じ試料浴液を用いる。

試料溶液をＩＯμｌ　とり、測定試薬３ｍｌを加えて、
３７℃恒温槽中１０分間加温した後、試薬盲検を対照と
して波長６２０ｎｍに於ける吸光度を測定する。測定結
果を表１０に示す。

比較例６゜ 〔測定試薬〕 比較例４．に同じ。

〔測定方法〕

実施例５と同じ試料溶液を用い、実施例６．０測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表１０に示す。

参考例６゜ 〔測定試薬〕 参考例４．に同じ。

〔測定方法〕

実施例５と同じ試料溶液を用い、実施例６．の測定方法
に従い、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果
を表１０に示す。

５３− ５４− 表１０に示されるように、本発明の方法によるビリルビ
／の妨害除去効果は１液法、２液法共ＡＯＤと同等もし
くはそれ以上である。

実施例７゜ 〔測定試薬〕 各々、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，ＯＯ３％、ＡＢＴ８０
．１ｑ６、ＰＯＤ３ｏｏＵ／ｄｅ、コレステロールオキ
シダーゼ１５Ｕ／ｄｌ、トリトンＸ−１０００，１係の
濃度になるように、これらを０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐ）ｌ＝７．０）に溶解する。

〔測定方法〕

試料溶液として、１００ｍ１中コレステロール１００■
／ｄｌ及びアスコルビン酸を夫々０，１０゜２０．３０
．４０．５ｏｍ９／ｃｔｅ含む水溶液を用いる。

試料浴液を２０μｌ　とり、測定試薬３　ｍｌを加えて
、３７℃恒温槽中１０分間加温した後、試薬盲検を対照
として波長５５Ｑｎｍに於ける吸光度を測定する。測定
結果を表１１に示す。

比較例７゜ 〔測定試薬〕 実施例７．０測定試薬からＣｕ８０ｉ・５　Ｉ（２０を
除いたもの。

〔測定方法〕

実施例７．と同じ試料溶液を用い、実施例７．の測定方
法に従い、コレステロールの測定を行なう。

測定結果を表１１に示す・。

表　１１ 注）（）内の数値はコレステロール回収率（係）を示す
。

表１１より、銅イオン、ＰＯＤ及びＡＢ’ｒ８を共存さ
せた場合にもアスコルビン酸の妨害除去効果があること
がわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の６総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄｅ）について
得られた吸光度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。 第２図は、実施例２．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各グルコース濃度（■／ｄｌ）について得られた
吸光度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 ５７− 第１図 総コレステロール濃度　Ｃｑ／ｄｔ）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）−価又は二価の銅イオン、ペルオキシダーゼ。 及び下記■〜■から成る群より選ばれた一種又は二種以
   上の化合物を共存させることを特徴とする。 アスコルビン酸の分解方法。 ■４−アミノアンチピリン ■３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン■２，２１
   −アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
   ホン酸） ■トリフェニルメタン系ロイコ色素 ■フェノール系化合物 ■アニリン系化合物 ■ナフトール系化合物
2. （２）被検試料中のアスコルビン酸を分解する特許請求
   の範囲第１項記載の、アスコルビン酸の分解方法。
3. （３）被検試料が体液であり、酸化還元反応（レドック
   ス反応）により体液成分を定量する反応に於て還元性物
   質の妨害による悪影響を回避するため、アスコルビン酸
   が一価又は二価の銅イオンの存在下に酸化されてデヒド
   ロアスコルビン酸及ヒＨ２０を生成する反応によってア
   スコルビン酸を分解スる、特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の、アスコルビン酸の分解方法。
4. （４）酸化還元反応（レドックス反応）が、基質に酸化
   酵素が作用してＨ２Ｏ２を生成する酵素反応である、特
   許請求の範囲第３項記載の、アスコルビン酸の分解方法
   。
5. （５）基質カグルコース、コレステロール、グリセロー
   ル、グリセロールリン酸エステル、コリン。 アシルＣｏＡ、ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸
   であり、それらの基質に作用する酸化酵素が各？々−グ
   ルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
   グリセロールオキシダーゼ、グリセロールリン酸エステ
   ルオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣＯＡオ
   キシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、キ
   サンチンオキシダ−ゼ又は乳酸オキシダーゼで蔦る、特
   許請求の範囲第４項記載の、アスコルビン酸の分解方法
   。
6. （６）ペルオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２の存在下に被酸化
   性呈色試薬が酸化されて生ずる呈色を測定することによ
   り体液成分を特徴する特許請求の範囲第４項又は第５項
   記載の、アスコルビン酸の分解方法。