JPS608750A - 血清成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清成分の測定方法に係９、更に詳しくは血清
成分の測定をビリルビンの干渉を回避または軽減して行
なう方法に関する。

血清中には単独あるいはグルクロン酸包合、硫酸包合な
どさまざまの形態でビリルビンが存在し、正常人では総
ビリルビンとして約１．０１ｎ９７ｄｌｌ以下が普通で
あるが、病的には著しく増加し４０９’ｄＡ以上に達す
ることもある。このビリルビンは血清成分の測定に檎々
の干渉を行ない、測定値に誤差を与える原因となる。即
ち直接的には、黄色の色素であるビリルビンは約４５０
ｎｍに吸収極太を有し、黄色あるいは赤色の呈色反応を
利用する血清成分の直接法による定量に妨害効果を発揮
し、通常異常に高い測定値を与える。これは例えば、血
清中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ　）’を定量する場合などに
現われ、ＦＦＡＯ銅錯塩を作りクロロホルム抽出を行な
って比色法によシ定量する場合測定波長が４４０ｎｍと
なってビリルビンの影響が無視しえないものとなる。

また、特に最近では酵素を用いる生体成分の測定が汎用
されているが、なかでもペルオキシダーゼ−過酸化水素
−被酸化体系（過酸化水素系）の検出系が数多く使用さ
れている。この系においてビリルビンは被酸化体と規合
し測定値に負の影響を与える（臨床化学第８巻１号６３
−７２（１９７９））。例えば、血清中のグルコースの
測定には酵素反応系が適用され、グルコースオキシダー
ゼによシ過酸化水素が生成され、この過酸化水素とペル
オキシダーゼの作用によシ発色性水素供与体から発色体
を生成ヒせることが行なわれるが、この場合にもビリル
ビンは発色性水素供与体と競合して負の影響を与えるこ
とが知られている。

このようなビリルビンの干渉は、測定する成分が上述の
グルコースに比べて血清中に少址しか存在しない場合に
特に問題となる。例えばトリグリセライド、尿酸、クレ
アチニン、ＦＦＡ、スフイボミニリンおよびリゾレアチ
ンの場合がそれでアリ、史に微量成分の場合は問題は深
刻で過酸化水素系ないしは酵素反応系の適用が困離とい
う隘路がおυ、これらの検出糸を用いる測定においてビ
１ノルビンの干渉を受けない方法の開発が強く望まれて
いた。

そこでこれらの問題に関する先行技術としてはすでに７
工ロシアン化合物やアミノピリンを用いる方法が報告さ
れている。例えば特開昭４９−５０９９１号やピー・フ
オサツチ（Ｐ、Ｆｏｓｓａｔｉ　）等、クリニカルケミ
ストリー２６７２．２２７−２３１（１９８０）にはフ
ェロシアン化合物をベルオキシタ゛−ゼー過酸化水素−
発色性水素供与体系の検出系に存在させてビリルビンの
干渉を回避させる方法が記載され′ている。ところが、
このフェロシアン化合物おるいは酸化体であるフェリシ
アン化合物はそれら自体に毒性はないとされているが）
元゛または酸処理で分解し、シアン化合物を遊離する可
能性があるので排水の水質汚濁の点で問題力；ある。

また、アミノビリン金剛いる方法は、例えば特開昭５６
−１２４３９８号やエフｅゾツビ（Ｆ。

Ｚｏｐｐｌ　）等、クリニカルケミストリー２７／１１
．１９４１−１９４２　（１９８１）に開示されており
、毒性の点では問題はないが、検出系に１〜３０　Ｑ／
ｌ　、好ましくは１５１／Ｉｔという比較的高製置で添
加する必要があシ、しかもこの場合でも充分なビリルビ
ン干渉除去効果が得られなかった。また予め血清中の共
存物質を消去した後、目的成分を比色法により定量する
共存物質消去法による検出系に存在させた場合、消去反
応を著しく遅滞させる。

本発明者等は、従来技術の有する上述の問題点を解消し
て血清に共存するビリルビンの干渉を回避または軽減し
て、しかも煩しい特殊な操作法を付は加えることなく同
一反応液で同時に簡便に１亀清成分を正確に定量し得る
方法を見出すべく鋭意研究した結果、血清成分の測定を
アルブミン、またはアルブミ／およびＮ、Ｎ−ジアルキ
ルアミノフェナジン誘導体の存在下で行なうことにより
これらの目的が達成されることを見出し、本発明を完成
し／こ。

即ち、本発明の血清成分の測定方法は、血ｉｆｆ成分の
測定全アルブミン、またはアルブミンおよび一般式（Ｉ
）： （式中、Ｒ１およびＲ２は互いに同一でありまたは異な
夛、それぞれ炭素数１〜４のアルキル基を表わす。Ｒ３
は−・ロダン原子または１価の有機基を表わす。ｎはＯ
〜３の整数を表わす。）で示されるＮ、Ｎ−ジアルキル
アミノフェナジン誘導体の存在下で行なうことにより血
清に共存するビリルビンの干渉を回ｍまたは軽減せしめ
ることを特徴とし、アルブミン、またはアルブミンおよ
び一般式（１）で示されるＮ、Ｎ−ジアルキルアミノフ
ェナジン訪導体を存在させることにより、常にビリルビ
ンの共存下におかれる血清成分測定に際して充分な高正
確度化を達成することができる。このような効果は、ア
ミノピリン単独で用いる先行技術からは達成し得す、ま
た予想しえないものであシ、シかもビリルビンが単に遊
離した形態のみでなく様々な結合形態で共存するヒト血
清において、これらのビリルビンの干渉を高い効率で回
避または軽減することは、本発明方法によって初めて成
し得たものである。本発明におけるビリルビン干渉除去
効果は、ビリルビン濃度の高い異常ビリルビン血清にお
いてとりわけ顕著に発揮される。

本発明で使用するアルブミンは、人、動物など由来を問
わず、またメチル化アルブミンのような修飾されたアル
ブミンをも伝言するが、通常好ましくは牛アルブミンが
使用される。

本発明で使用するＮ、Ｎ−ジアルキルアミノフェナジン
誘導体において、一般式（１）のＲお工びＲ２びＲ２が
共にメチル基またはエチル基を表わす場合である。Ｒ３
で表わされるハロダン原子は塩素、臭素、フッ素、沃素
等であジ、１価の有機基はアルキル基（例えばメチル基
、エチル基、１−グロビル基、ｔ−ブチル基）、アルコ
キシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−グロピル
オキシ基〕、ヒドロキシル基、オキシカルボニル＆　（
例えばヒドロキシカルボニル基、アルキルオキシカルボ
ニル基、アリールオキシカルボニル基）、カルバモイル
基（ｆｌｌえば−ＣＯＮＨ２、アルキルカルバモイル基
、アリールカルバモイル基）などでちる。Ｒ３の好まし
くは−・ロダン原子、アルキル基およびアルコキシ基で
ある。Ｒはθ〜３の整数を表わすが、ｎが２以上の場合
、複数個存在するＲ３は互いに同じでも異なっていても
よい。これらのＮ、Ｎ−ジアルキルアミノフェナジン誘
導体は、従来公知の方法によシ容易に合成することがで
きる。

本発明で使用するＮ、Ｎ−ジアルキルアミノフェナジン
肪導体の特に好ましくは、アミノビリンである。

本発明方法はビリルビンの干渉作用を受ける広範な血清
成分の測定に有効であるが、特にペルオキシダーゼ、Ａ
酸化物および過酸化物により酸化される被酸化体を組合
せた検出系によシ行なわれる血清成分の測定に有利な測
定方法である。このような検出系にアルブミンを存在さ
せることによシビリルビンの干渉がいかにして回避ある
いは軽減せしめられるかは充分に解明されていないが、
ビリルビンがアルブミンと結合して複合体を形成し易い
ことから、ビリルビンを基質特異性の広いペルオキシダ
ーゼの基質の一種と考えた場合アルブミンとビリルビン
との複合体はペルオキシダーゼの基質となりにくくなる
ことによって、被酸化体との競合が解消されるためであ
ると推察される。

しかも驚くべきことに、アルブミンとアミノビリンとを
併用する本発明方法においては、これらアルブミンおよ
びアミノビリンが相乗して本発明効果を発揮している。

本発明方法においては、血清成分の測定に酵素反応系を
適用することができる。この場合は、過酸化物として血
清成分に直接、あるいは基質および／ｆ：だは他の酵素
の誘導により生成される物質に、酸化酵素が作用して生
成する過酸化水素を用い、血清成分の測定をペルオキシ
ダーゼの存在下で過酸化水素によシ酸化きれる被酸化体
を用いて行なうことができる。この被酸化体としては、
一般に発色性水素供与体が用いられ、ペルオキシダーゼ
の作用によシ発色性水紫供与体の水素が離脱しこの水素
が過酸化水素と反応して水を生成すると共に発色性水素
供与体から発色体が形成され、この発色体を比色屋箪す
ることにより血清成分の量をめる。この様なペルオキシ
ダーゼ、過酸化物および被酵化体を組合せた検出系にお
いては、ペルオキシダーゼ自体、過酸化物あるいは酵素
の活性を測定することも行なわれる。これは、例えば抗
原もしくは抗体に標識されたペルオキシダーゼを用いて
、目的成分である抗原もしくは抗体との間で抗原抗体反
応を行なわしめ、その抗原抗体反応物中に存在するペル
オキシダーゼ活性をめ目的成分を検出するところの免疫
学的手法に用いられるペルオキシダーゼ活性の測定の様
な場合であり、これらの場合においても勿論、本発明方
法を実施することができる。本発明において特に有効に
実施することのできる酵素反応系および検出系の組合せ
を以下に例示するが、これらに限疋されない。

トリグリセリ　ドの測定 リボグロテイ／リパーゼ のトリグリセリ　ドーーーーーーーーーーーーー→グリ
セロール＋脂肪酸 グリセロキナーゼ グリセロール＋ＡＴＰ−−−−−−−−→グリセロール
ー３−リン酸→−ＡＤＰ グリセロール− グリセロール−３−リン酸＋ｏ２□ ３−リン酸オキシダーゼ ノハイドロキシア セトンリン酸＋Ｈ２Ｏ２ ２Ｈ２０２＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ＋エチル−Ｎ
−スルホゾロビル−ｍ−トルイジン□オ°キシダー−ビ 紫色キノン型色素相＋４Ｈ２゜ グルコースの測定 グルコースオキシダーゼ ■グルコース＋Ｈ２０＋　０２−−一−−−−−−−−
→Ｈ２Ｏ２＋グルコン酸 ２Ｈ２０□＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ、Ｎ−ノエチ
ルアニリノ＋Ｈ ペルオキシダーゼ 紫色キノン型色素＊２）＋４Ｈ２０ リン脂質の測定 ■リン脂質（レシチン、スフィンゴミエリン、リレシチ
ン〕 ホスフォリパーゼＤ コリン＋（ホスフェート ン酸、Ｎ−アシルスフィンゴシルホスフェート、リゾホ
スファチジン酸） コリンオキシダーゼ コリン＋２０２＋Ｈ２Ｏ ２Ｈ２Ｏ２＋ベタイン ２Ｉ（２０２＋　４−アミノアンチピリン＋７エノール
ヱ土エエエ！二！→赤色キノン型色ｚ＊３）＋Ｈ２０ 総コレステロールの測定 コレステロ− ■エステル型コレステロール十Ｈ２０□ルエ名テラーゼ 遊離型コレステロール＋脂 肪酸 遊離型コレステロール＋ｏｊ＆Ｚｆ二重土！！シダーゼ 一一−−→Ｈ２０□＋Δ４−コレステノン２Ｈ２０２＋
４−アミノアンチピリン十Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン＋
Ｈン１丘三−二」ぐ！二重ざ→紫色キノン型色素＊２）
＋４Ｈ２０ 遊離脂肪酸の測定 アシルＣｏＡシンセターゼ ■遊離脂肪酸＋ＡＴＰ＋Ｃ°Ａ　Ｍｇ・アシルＣｏＡ＋
甚十ビロリン酸 アシルＣｏＡオキシダーゼ アシルＣｏＡ　＋　０２ ２．３−　）ランスエノールＣｏＡ　＋　Ｈｚ０２２Ｈ
２０２＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−トルイジン＋Ｈ＋ゴヱー！ニー３ニ
ニニニご→キノン型色素＊１）＋４Ｈ２０尿酸の測定 ウリカーゼ ■尿酸＋０２＋２Ｈ２０アラントイン＋Ｃ０２＋Ｈ２Ｏ
２ ２ＩＩ２０２＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ＝エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン＋Ｈ＋づｌ−竺二
ｉヱ一（二重ゴ→キノン型色素″１）＋　４Ｈ２０コリ
ンエステラーゼの測定 ■ベア　：／’　イ／ｌ／　＝ｙ　リフ　＋　Ｈ２Ｏ已
り乙五二重二二二→コリン十安息香酸 コリンオキシダーゼ コリン＋２０２＋Ｈ２Ｏ ２Ｈ２Ｏ２＋ベタイン ２Ｈ２０２＋４−アミノアンチピリン＋フェノールゴ：
竺ヱ工ｉ乏εに二重！→キノン型色素＊２）＊１） （福ａｘ”５５０　ｎｍ） ＊２） （λｍａｘ　”’　５６０　ｎｍ） ＊６〉 本発明に特によく用いられる測定法は、血清成分に作用
させるための酵素、補酵素／または基質、ならびに必要
ならば過酸化水素を生成せしめる酸化酵素の作用段階ま
で誘導するに必要な１種以上の他の酵素と、検出系ｔ−
Ｗ成するペルオキシダーゼおよび被酸化体を含有せしめ
、更にアルブミン、またはアルブミンおよびアミノビリ
ンを添加せしめた任意の緩衝作用を得さしめだ１液の試
薬で構成することができる。また必要に応じ酵素、活性
化剤、保存剤、界面活性剤などを含ませてよい。

あるいは、共存物質消去法として、少くとも血清成分に
直接作用する酵素および発色性被酸化体の一部あるいは
全部を除いて構成される共存物質消去のだめの第１試薬
、ならびに少くとも血清成分に直接作用する酵素および
発色を完全ならしむるに必要な被酸化体を含んで構成さ
れる第２試薬の２液で構成されていてもよい。前記第１
試薬には血清中の共存物質を消去するだめの非発色性の
被酸化体が含まれていてもよい。このような検出系には
、第１試薬にアルブミンを、第２試薬にアミノビリンお
よび／またはアルブミンを添加することが好ましい。共
存物質の消去を行なう第１試薬にアミノビリンを添加す
ると、該消去反応が著しく遅延するため好ましくない。

もちろんこの場合にも、通常調製時、緩衝性を得さしめ
るための試薬、酵素活性化剤、保存剤、界面活性剤など
が加えられる。この検出系を適用して消去する共存物　
１質としては、トリグリセリド測定における遊離グリセ
ロール、遊離脂肪酸測定におけるピルビン酸、ノリン脂
質測定におけるコリン、α−アミラーゼ活性測定におけ
るグルコース、トランスアミナーゼ法における酵素反応
系にまつわる目的成分以外の血中共有物の関与はすべて
この方法の適用により、ノ 消′去が可能である。

本発明における前記１液法または２液法の検出系にアル
ブミン、あるいはアルブミンおよびアミノビリンを添加
する量は、検体として使用する血清量や、そこに共存す
るビリルビンの量によって一部には言えないが、ビリル
ビン濃度がＩ　ＣＰ９／ｄＡを超す異常ビリルビン血清
においても例えば検体２０μｔを使用した時アルブミン
１．５９／ｌおよびアミノビリン０．３５　Ｅｌ／！ｌ
という極めて少ない添加量においてもビリルビンの干渉
を充分に抑え得ることが確認された。また、アミノビリ
ンを余り高農度で用いると反応液自身の着色など好まし
くない状態を生ずる可能性もある。このことがら、ビリ
ルビン濃度が未知の血清を対象とする場合にも、所定の
しかも少量を添加しておくことにより、ビリルビンの干
渉を排除した血清成分の測定を行なうことが可能となる
。有効に作用させるための添ルブミンの場合正常人血清
中のアルブミン含有量は５０９／ｌであるが通常、反応
液中では０，１〜０．５１１／ｌ程度となり、この量で
は効果がなく、概ね新たに、１１４以上を加えて、反応
試薬とすることが好ましい。

なお本発明者らは、本発明の実証に、牛、胆汁由来等の
ビリルビン試料は用いずに、直接、ビリルビン高値の人
血清を用いて行った。つまシ、人血清中のビリルビンの
直接の存在様式に従い、本発明を例証した。

以下に試験例、実施例を示して本発明を更に詳しく説明
するが、本発明の実施の態様はこれにより限定されるこ
とはない。

試験例１ ビリルビンの負の干渉について、過酸化水素−ペルオキ
シダーゼ−被酸化体系とビリルビンの存在スる場合のア
ルブミン単独、あるいは、アルブミンおよびアミノビリ
ン併用の効果を示すため、次の試験を行なった。

１、試薬 （１）４−アミノアンチピリン　０．５　ｍｍｏ　ｌ／
ｌＮ−エチル−Ｎ−スルホ ゾロビｐｖ−Ｈ１−トＡイジン（ＥＳＰＴ）　０．５ｍ
ｍｏｌμペルオキシダーゼ　２００，０００則ｑを含む
１００　ｍｍｏ　ｌ／７　トｊｌスー塩酸緩衝液。

ｐＨ７，０ （２）　アミノビリン添加物 １５　ｊｊ／ｌアミノビリンを上記試薬（１）に溶解す
る。（特開昭５６−１２４３９８号に開示された好まし
い添加量） （３）　アルブミン添加物 ３　ｊ；ｌ／ｌアルブミンを上記試薬（１）に溶解する
。

（４）　アルブミン・アミノビリン添加物３！！／　ｌ
アルブミン、ｏ、３ｓ、９／Ａ！アミノピリンを上記試
薬（１）に溶解する。

（５）人血清 ビリルビン濃度２０．７ｍ１ｉ／ｄｅの人血清。（ビリ
ルビンの測定はヤトロン社製イアドロー）ｆＡ　７０５
Ｔ−ＢＩＬを用いて測定した。） （６）　過酸化水素 約４　ｍｍｏｌ／／過酸化水素溶液。

２、操作 試薬（１）３ゴに、上記人血清（５）　２０μｌまたは
精製水２０μｌを添加し、さらに過酸化水素溶液（６）
　２０μｌまたは精製水２０μｌを添加し、３７℃５分
間加温する。

同様のことを、試薬（１）の替シに試薬（２）、（３）
および（４）について行い、全て、波長５５０　ｎｍで
吸光度を測定した。

その結果を表１に示す。

表１から、アルブミン単独またはアルフミンオよびアミ
ノビリン併用の本発明方法によシ、発色性水素供与体の
発色に対するビリルビンの負の干渉は、アミノビリン単
独に比べ改良されていることが明らかである。

また、表１中Ａを比較すると、アミノビリン単独で多量
に用いると、試薬ブランクの上昇が著しく、試薬として
使用するのに、著しく欠点となる。

試験例２ 試験例１で用いた（１）〜（６）のそれぞれの代わシに
下記試薬（７）〜（１２）を用いた以外は試験例１と同
一の試験を行ない吸光度を測定した。結果を表（２）に
示した。

（７）４−アミノアンチピリン　０．５　ｍｍｏ　ｌ／
Ａ！ＥＳＰＴ　０．５　ｍｍｏ　１．／７ にルオキシダーゼ　２００，０００　Ｕ／ｌを含む０．
１　ｍｍｏｌ／ｌ）　！ｊス・塩酸緩衝液。

ｐｉ−１７，０ （８）　アミノビリン添加物 １０　ｉ／ｌの濃度でアミノビリンを上記試薬（７）に
溶解する。

（９）　アルブミン添加物 ３９／ｌの濃度でアルブミンを上記試薬（７）に溶解す
る。

（１の　アルブミン・アミノビリン添加物３　ｇ／ｌア
ルブミン、０．３５　！ｊ／ｌ　アミノビリンを上記試
薬（７）に溶解する。

（１１）人血清 ビリルビン濃度４３ｆｎ９／ｄｌ　の人血清。

（１２）過酸化水素溶液 約４　ｍｍｏｌ／Ａ！過酸化水素溶液。

表２から、ビリルビン濃度が４３ダ／ｄＡ！　、！：極
めて高い濃度の血清試料に対しても本発明方法が有効で
あることがわかる。

実施例１１液法によるトリグリセリド（ＴＧ）測定にお
けるアルブミン・アミノビリンの添加効果１、試薬 （１３）リパーゼ　１２０，０ＯＯＵ／Ａグリセロール
キナーゼ　７　Ｕ／Ｉ Ｌ−グリセロール−３−リン酸酸化酵素６５０Ｕ／１ ペルオキシダーゼ　２×１０６Ｕ／ｌ アデノシン三リン酸　０．２　ｍｍｏｌ／ｊ？ＭｇＣＬ
２１　ｍｍｏｌ／ｌ ｔ−’）　）　ンＸ−１００１ｉ／１ ４−アミノアンチピリン　０．４　ｍｍｏ　１／Ａ’Ｅ
ＳＰＴ　０．５　ｍｍｏ　ｌ／ｌ を含む１００　ｍｍｏ　１／６’　）リス−塩酸緩衝液
。

ｐＨ７，０゜ （１４）試薬（１３）二アミノヒリン１０ｇ／ｌ添加。

（１５）試薬（１３）にアルラミン３ｉ／ｌ添加。

（１６）試ｆｆｉ　（，１３）にアルブミン３９／１３
アミノビリンｏ、３５ｇ／ｌを添加。

（１７）人血清総ビリルビン漉度既知（それぞれの測定
９度を表３に示した）の試料１０種。

２、測　定 試薬（１３）　（１４）　（１５）および（１６）のそ
れぞれ３．Ｏｒ／Ｌｌに（１７）人血清２０μｌを添加
し、３７℃１０分間加温した後、波長５５０　ｎｍでそ
れぞれの吸光度を測定した。結果を表３に示した。

表３から、総ビリルビン量に比例してＴＧ値が上昇する
ことが判シ、このＴＧ値の上昇の割合は、アミノビリン
単独の場合に比べ、アルブミン単独の場合、更にはアル
ブミンおよびアミノビリン併用の場合の方が大きく、本
発明方法によってビリルビンの干渉回避効果が著しく発
揮されることが判る。

実施例２　イーリンガ−法と本発明方法との比較トリグ
リセリド測定方法として原理上、ビリルビンの干渉をま
ぬがれる測定法とみなされる正確度ノ’４ＦＩ　イヘ−
！Ｊンガー法（ペーリンガー・マンハイム社製製品番号
１２６０１２、トリグリセライド・ＵＶ・テスト）と本
発明方法とを以下の要領で比較した。

■試薬 １、　イーリンガ−法 （１８）　リノや−ゼ　８０，０００ル４エステラーゼ
　６００　Ｕ／１ ピルベートキナーゼ　１，０００　Ｕ／ｌ乳酸脱水素酵
素　６，０００　Ｕ／１ ニコチンアミドアデニン・ ジヌクレオチド、還元型　０．２　ｍｍｏ　１／１３ア
デノシン三リン酸　０．４　ｍｍｏ　１／ｌホスホエノ
ールピリピン酸０．３　ｍｍｏ　ｔ／ｉｇドデシル硫酸
ナトリウム　０．４　ｍｍｏ　１／１２Ｍｇ５Ｏ４４，
Ｏｍｍｏ　ｌＡ を含む２０　ｍｍｏ　ｌＡリン酸緩衝液ｐＨ７，０（１
９）グリセロールキナーゼ　１５０Ｕ／＋＋＋ｊ’２、
本発明方法 （２０）　リパーゼ　１２０，０ＯＯＵ／７１１グリセ
ロキナーゼ　７Ｕ／ｌ Ｌ−グリセロール−３−リン酸酸化酵素６５０　Ｕ／１ ペルオキシダーゼ　２×１０６ＵＡ アデノシン三リン酸　０．２　ｍｍｏ　ｌ／Ａ！ＭｇＣ
１，２１ｍｍｏ　ｔＡ １−　’）　）　ｙＸ−１００１１１／１４−アミノア
ンチピリン　０．４　ｍｍｏ　ｌ／ｊ！ＥＳＰＴ　０．
５　ｍｍｏ　ｌ／ｌ を含む１００　ｍｍｏ　ｘ／Ａ！　）リス塩酸緩衝液。

声７．０・（２１）　上記試薬（２０に３ｇ／１１７Ａ
、ラミン−１０，３５ｇ／ｌアミノピリンを添加する。

■検体 人血清　ビリルビン　正常　５　検体 ビリルビン　異常　１０　検体 ■　操作法 １、　イーリンガ−法 キエペットに、試薬（１８）　２．５　ｍｔを入れ、人
血清５０μｇまたは精製水５０μｌを添加し、３７℃１
０分間放置後３４０　ｎｍの吸光度ＥＩ　ａ　ＥＯＩを
読み、次に、試薬（１９）　０．０１１ｎｌをそれぞれ
に添加し、３７℃、１０分間放置後３４０　ｎｍの吸光
度Ｅｌ　＃　Ｅｏｓ　を読み、下式よルトリグリセライ
ド値を計算する。

トリグリセライド（〜〆ｄｔ）−Ｊ（Ｅ＋−Ｅｘ）−（
Ｅｏｔ　Ｅｏｚ））Ｘ７１１２、本発明方法 試薬（２のを３−と勺、人血清２０μｌを添加し３７℃
、１０分間加温後波長５５０　ｎｍでそれぞれの吸光度
を測定する。なお、標準液を同様に操作し、トリグリセ
ライド値を計算する。

また試薬（２１）を用いて上記の操作法と同様に行なう
。得られたＴＧ値を表４に示した。

表　４ 表４から、本発明方法は正確度の高いとされるイーリン
ガ−法と同程度に高い正確度を有している。一方、アル
ブミンおよびアミノビリンを用いない従来の対照法にお
いては、ＴＧ値が極めて低い値となシビリルビンの干渉
が特に異常ビリルビン血清の場合に顕著に現われること
が判る。

更に、イーリンガ−法は測定操作が煩雑で多検体試料や
自動分析に応用しにくいのに比べ、本発明方法は測定が
簡便に行なえ、多検体試料や自動分析にも有利に用いら
れる方法である。

実施例３　共存物質消去法（２液法）によるＴＧの定量 １、試薬 （２２）グリ士ロールキナーゼ　１３　Ｕ／’ｌＬ−グ
リセロール−３−リン酸酸化酵素１３００　Ｕ／ｌ ペルオキシダーゼ　３×１０５Ｕ／ｌ アデノシントリノオスフエート　０．４　ｍｍｏ　］／
１２Ｗ（Ｂ　１．　Ｏｍｍｏ　ｌＡ ＭｇＣ１２１ｍｍｏ　１／１ ト　＋ｊ　ト　ンｘ−１ｏｏ　ｘｇ７ｅを含むｌ　００
　ｍｍｏ　ＩＡトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） （２３）　４−　／　ミ／７ンｆｅ　’）　ｙ　０．８
ｍｍｏｌ／Ａ！ＥＳＰＴ　１．０　ｍｍｏｌ／１ １−　！Ｊ　）　ｙＸ−１００１９／１３リ　パーザ　
１２０，０００　Ｕ／１ を含む１００Ｍ０１／ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０） （２４）アルブミン添加試薬 アルブミン３１７／ｌを試薬（２２）に溶解する。　゛
（２５）アミノピリン添加試薬 アミノビリン０．７．！ｉ１′／ｌを試薬（２３）に溶
解する。

（２６）人血清　総ビリルビン濃度　既知２、測定 （１）　検体血清（２６）２０μｅＫ試薬（２２）　１
．５　ｍｌ　ヲ加え３７℃、５分間加温し血清中に存在
する妨害成分である遊離グリ七−ロールを消去する。こ
の場合妨害物質の大部分は遊離グリセロールであるがそ
の他グリセロールキナーゼ以下の反応に関与する総ての
血清副反応も消去される。

次に試薬（２３）　１．５　ｍＪを加え混合し３７℃、
１０分間放置後波長５５０　ｎｍで吸光度を測定する。

（２）　試薬（２４）と試薬（２３）を用い、同様に操
作し定量する。

（３）　試薬（２２）と試薬（２５）を用い、同様に操
作し定量する。

（４）試薬（２４）と試薬（２５）を用い、同様に操作
し定量する。

結果を表５に示した。

表５から、第１試共にアルブミンを用い、第２試薬にア
ミノピリンを用いる本発明方法により、アルブミン単独
およびアミノビリン単独の場合よシビリルビンの干渉が
著しく良好に回避されることが慣する。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）血清成分の測定をアルブミン、またはアルブミン
   および一般式： （式中、Ｒ，およびＲ２は互いに同一でちゃまたは異な
   ９、それぞれ炭素数１〜４のアルキル基を表わす。Ｒ３
   はハロゲン原子または１価の有機基を表わす。ｎは０〜
   ３の整数を表わす。）で示されるＮ、Ｎ−ジアルキルア
   ミノフェナジン誘導体の存在下で行なうことによυ血清
   に共存するビリルビンの干渉を回避または軽減せしめる
   ことを特徴とする血清成分の測定方法。
2. （２）　Ｒ１およびＲ２が共にメチル基またはエチル基
   を表わす特許請求の範囲第（１）項記載の血清成分の測
   定方法。
3. （３）　Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノフェナジン誘導体は
   アミノビリンである特許請求の範囲第（１）項記載の血
   清成分の測定方法。
4. （４）　血清成分の測定は、ペルオキシダーゼ、過酸化
   物および該過酸化物により酸化される被酸化体を組合せ
   た検出系により行なわれる特許請求の範囲第（１）項記
   載の血清成分の測定方法。
5. （５）過酸化物は酵素反応系により生成する過酸化水素
   であシ、血清成分の測定はペルオキシダーゼの存在下で
   過酸化水素により酸化される被酸化体を用いて行なわれ
   る特許請求の範囲第（４）項記載の血清成分の測定方法
   。
6. （６）被酸化体は発色性水素供与体であり、血清成分の
   測定は前記発色性水素供与体を比色定量することにより
   行なわれる特許請求の範囲第（４）項または第（５）項
   記載の血清成分の測定方法。