JPH0461640B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血清成分の測定方法に係り、更に詳し
くは血清成分の測定をビリルビンの干渉を回避ま
たは軽減して行なう方法に関する。 血清中には単独あるいはグルクロン酸包合、硫
酸包合などさまざまの形態でビリルビンが存在
し、正常人では総ビリルビンとして約1.0mg／dl
以下が普通であるが、病的には著しく増加し40
mg／dl以上に達することもある。このビリルビン
は血清成分の測定に種々の干渉を行ない、測定値
に誤差を与える原因となる。即ち直接的には、黄
色の色素であるビリルビンは約450nｍに吸収極
大を有し、黄色あるいは赤色の呈色反応を利用す
る血清成分の直接法による定量に妨害効果を発揮
し、通常異常に高い測定値を与える。これは例え
ば、血清中の遊離脂肪酸（FFA）を定量する場
合などに現われ、FFAの銅錯塩を作りクロロホ
ルム抽出を行なつて比色法により定量する場合測
定波長が440nｍとなつてビリルビンの影響が無
視しえないものとなる。 また、特に最近では酵素を用いる生体成分の測
定が汎用されているが、なかでもペルオキシダー
ゼ−過酸化水素−被酸化体系（過酸化水素系）の
検出系が数多く使用されている。この系において
ビリルビンは被酸化体と競合し測定値に負の影響
を与える（臨床化学第８巻１号63−72（1979））。
例えば、血清中のグルコースの測定には酵素反応
系が適用され、グルコースオキシダーゼにより過
酸化水素が生成され、この過酸化水素とペルオキ
シダーゼの作用により発色性水素供与体から発色
体を生成させることが行なわれるが、この場合に
もビリルビンは発色性水素供与体と競合して負の
影響を与えることが知られている。 このようなビリルビンの干渉は、測定する成分
が上述のグルコースに比べて血清中に少量しか存
在しない場合に特に問題となる。例えばトリグリ
セライド、尿酸、クレアチニン、FFA、スフイ
ゴミエリンおよびリゾレシチンの場合がそれであ
り、更に微量成分の場合は問題は深刻で過酸化水
素系ないしは酵素反応系の適用が困難という隘路
があり、これらの検出系を用いる測定においてビ
リルビンの干渉を受けない方法の開発が強く望ま
れていた。 そこでこれらの問題に関する先行技術としては
すでにフエロシアン化合物やアミノピリンを用い
る方法が報告されている。例えば特開昭49−
50991号やピー・フオサツチ（P.Fossati）等、ク
リニカルケミストリー26／２、227231（1980）に
はフエロシアン化合物をペルオキシダーゼ−過酸
化水素−発色性水素供与体系の検出系に存在させ
てビリルビンの干渉を回避させる方法が記載され
ている。ところが、このフエロシアン化合物ある
いは酸化体であるフエリシアン化合物はそれら自
体に毒性はないとされているが、光または酸処理
で分解し、シアン化合物を遊離する可能性がある
ので排水の水質汚濁の点で問題がある。 また、アミノピリンを用いる方法は、例えば特
開昭56−124398号やエフ・ゾツピ（F.Zoppi）
等、クリニカルケミストリー27／11、1941−1942
（1981）に開示されており、毒性の点では問題は
ないが、検出系に１〜30ｇ／、好ましくは15
ｇ／という比較的高濃度で添加する必要があ
り、しかもこの場合でも充分なビリルビン干渉除
去効果が得られなかつた。また予め血清中の共存
物質を消去した後、目的成分を比色法により定量
する共存物質消去法による検出系に存在させた場
合、消去反応を著しく遅滞させる。 本発明者等は、従来技術の有する上述の問題点
を解消して血清に共存するビリルビンの干渉を回
避または軽減して、しかも煩しい特殊な操作法を
付け加えることなく同一反応液で同時に簡便に血
清成分を正確に定量し得る方法を見出すべく鋭意
研究した結果、血清成分の測定をアルブミンおよ
びアミノピリンの存在下で行うことによりこれら
の目的が達成されることを見出し、本発明を完成
した。 即ち、本発明の血清成分の測定方法は、ペルオ
キシターゼ、酵素反応系により生成する過酸化水
素および該過酸化水素により酸化される発色性水
素供与体を組合せた検出系により行われる血清成
分の測定をアルブミンおよびアミノピリンの存在
下で行うことにより血清に共存するビリルビンの
干渉を回避または軽減せしめることを特徴とし、
アルブミンおよびアミノピリンを存在させること
により、常にビリルビンの共存下におかれる血清
成分測定に際して充分な高正確度化を達成するこ
とができる。このような効果は、アミノピリン単
独で用いる先行技術からは達成し得ず、また予想
しえないものであり、しかもビリルビンが単に遊
離した形態のみでなく様々な結合形態で共存する
ヒト血清において、これらのビリルビンの干渉を
高い効率で回避または軽減することは、本発明方
法によつて初めて成し得たものである。本発明に
おけるビリルビン干渉除去効果は、ビリルビン濃
度の高い異常ビリルビン血清においてとりわけ顕
著に発揮される。 本発明で使用するアルブミンは、人、動物など
由来を問わず、またメチル化アルブミンのような
修飾されたアルブミンをも包含するが、通常好ま
しくは牛アルブミンが使用される。 本発明方法はビリルビンの干渉作用を受ける広
範な血清成分の測定に有効であるが、特にペルオ
キシダーゼ、過酸化物および過酸化物により酸化
される被酸化体を組合せた検出系により行なわれ
る血清成分の測定に有利な測定方法である。この
ような検出系にアルブミンを存在させることによ
りビリルビンの干渉がいかにして回避あるいは軽
減せしめられるかは充分に解明されていないが、
ビリルビンがアルブミンと結合して複合体を形成
し易いことから、ビリルビンを基質特異性の広い
ペルオキシターゼの基質の一種と考えた場合アル
ブミンとビリルビンとの複合体はペルオキシダー
ゼの基質となりにくくなることによつて、被酸化
体との競合が解消されるためであると推察され
る。しかも驚くべきことに、アルブミンとアミノ
ピリンとを併用する本発明方法においては、これ
らアルブミンおよびアミノピリンが相乗して本発
明効果を発揮している。 本発明方法においては、血清成分の測定に酵素
反応系を適用することができる。この場合は、過
酸化物として血清成分に直接、あるいは基質およ
び／または他の酵素の誘導により生成される物質
に、酸化酵素が作用して生成する過酸化水素を用
い、血清成分の測定をペルオキシイダーゼの存在
下で過酸化水素により酸化される被酸化体を用い
て行なうことができる。この被酸化体としては、
一般に発色性水素供与体が用いられ、ペルオキシ
ダーゼの作用により発色性水素供与体の水素が離
脱しこの水素が過酸化水素と反応して水を生成す
ると共に発色性水素供与体から発色体が形成さ
れ、この発色体を比色定量することにより血清成
分の量を求める。この様なペルオキシダーゼ、過
酸化物および被酸化体を組合せた検出系において
は、ペルオキシダーゼ自体、過酸化物あるいは酵
素の活性を測定することも行なわれる。これは、
例えば抗原もしくは抗体に標識されたペルオキシ
ダーゼを用いて、目的成分である抗原もしくは抗
体との間で抗原抗体反応を行なわしめ、その抗原
抗体反応物中に存在するペルオキシダーゼ活性を
求め目的成分を検出するところの免疫学的手法に
用いられるペルオキシダーゼ活性の測定の様な場
合であり、これらの場合においても勿論、本発明
方法を実施することができる。本発明において特
に有効に実施することのできる酵素反応系および
検出系の組合せを以下に例示するが、これらに限
定されない。 トリグリセリドの測定 トリグリセリドリポプロテインリパーゼ ―――――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロキナーゼ ―――――――――→ ←――――――――― グリセロール−３−リン酸＋ADP グリセロール−３−リン酸＋O₂グリセロール−３−リ
ン酸オキシダーゼ ――――――――――――――――――――――→ ジハイドロキシアセトンリン酸＋H₂O₂ 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−ｍ−トルイジン ペルオキシダーゼ −−−−−−−−―→ 紫色キノン型色素^*1)＋4H₂O グルコースの測定 グルコース＋H₂O＋O₂グルコースオキシダーゼ ―――――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ，Ｎ−ジエチル
アニリン＋H⁺ ペルオキシダーゼ −−−−−−−−―→ 紫色キノン型色素^*2)＋4H₂O リン脂質の測定 リン脂質（レシチン、スフインゴミエリン、リレシチ
ン）ホスフオリパーゼＤ ――――――――――→ コリン＋ （ホスフアチジン酸、Ｎ−アシルスフインゴシルホスフ
エート、リゾホスフアチジン酸） コリン＋20₂＋H₂Oコリンオキシダーゼ ――――――――――→ 2H₂O₂＋ベタイン 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋フエノールペルオ
キシダーゼ −−−−−−−−―→ 赤色キノン型色素^*3)＋4H₂O 総コレステロールの測定 エステル型コレステロール＋H₂Oコレステロールエス
テラーゼ ――――――――――――――→ 遊離型コレテロール＋脂肪酸 遊離型コレステロール＋O₂コレステロールオキシター
ゼ ―――――――――――――――→ H₂O₂＋Δ⁴−コレステノン 2H₂O₂＋−アミノアンチピリン＋Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン＋H⁺ ペルオキシダーゼ −−−−−−−−―→ 紫色キノン型色素^*2)＋4H₂O 遊離脂肪酸の測定 遊離脂肪酸＋APT＋CoAアシルCoAシンセターゼ ―――――――――――――→ Mg²⁺アシルCoA＋AMP＋ピロリン酸 アシルCoA＋O₂アシルCoAオキシターゼ ―――――――――――――→ ２，３−トランスエノールCoA＋H₂O₂ 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−ｍ−トルイジン＋H⁺ ぺルオキシダーゼ −−−−−−−−―→ キノン型色素^*1)＋4H₂O 尿酸の測定 尿酸＋O₂＋2H₂Oウリカーゼ −−−−――→ アラントイン＋CO₂＋H₂O₂ 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−ｍ−トルイジン＋H⁺ ぺルオキシダーゼ −−−−−−−――→ キノン型色素^*1)＋4H₂O コリンエステラーゼの測定 ベンゾイルコリン＋H₂Oコリンエステラーゼ ―――――――――――→ コリン＋安息香酸 コリン＋2O₂＋H₂Oコリンオキシダーゼ ――――――――――→ 2H₂O₂＋ベタイン 2H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋フエノールペルオ
キシダーゼ ―――−――――――→ キノン型色素^*2) 本発明に特によく用いられる測定法は、血清成
分に作用させるための酵素、補酵素／または基
質、ならびに必要ならば過酸化水素を生成せしめ
る酸化酵素の作用段階まで誘導するに必要な１種
以上の他の酵素と、検出系を構成するペルオキシ
ターゼおよび被酸化体を含有せしめ、更にアルブ
ミンおよびアミノピリンを添加せしめた任意の緩
衝作用を得さしめた１液の試薬で構成することが
できる。また必要に応じ酵素、活性化剤、保存
剤、界面活性剤などを含ませてよい。あるいは、
共存物質消去法として、少くとも血清成分に直接
作用する酵素および発色性被酸化体の一部あるい
は全部を除いて構成される共存物質消去のための
第１試薬、ならびに少くとも血清成分に直接作用
する酵素および発色を完全ならしむるに必要な被
酸化体を含んで構成される第２試薬の２液で構成
されていてもよい。前記第１試薬には血清中の共
存物質を消去するための非発色性の被酸化体が含
まれていてもよい。このような検出系には、第１
試薬にアルブミンを、第２試薬にアミノピリンお
よび／またはアルブミンを添加することが好まし
い。共存物質の消去を行なう第１試薬にアミノピ
リンを添加すると、該消去反応が著しく遅延する
ため好ましくない。もちろんこの場合にも、通常
調製時、緩衝性を得さしめるための試薬、酵素活
性化剤、保存剤、界面活性剤などが加えられる。
この検出系を適用して消去する共存物質として
は、トリグリセリド測定における遊離グリセロー
ル、遊離脂肪酸測定におけるピルビン酸、リン脂
質測定におけるコリン、α−アミラーゼ活性測定
におけるグルコース、トランスアミナーゼ測定に
おけるピルビン酸などであるが任意の測定法にお
ける酵素反応系にまつわる目的成分以外の血中共
有物の関与はすべてこの方法の適用により消去が
可能である。 本発明における前記１液法または２液法の検出
系にアルブミンおよびアミノピリンの添加する量
は、検体として使用する血清量や、そこに共存す
るビリルビンの量によつて一概には言えないが、
ビリルビン濃度が10mg／dlを超す異常ビリルビン
血清においても例えば検体20μを使用した時ア
ルブミン1.5ｇ／およびアミノピリン0.35ｇ／
という極めて少ない添加量においてもビリルビ
ンの干渉を充分に抑え得ることが確認された。ま
た、アミノピリンを余り高濃度で用いると反応液
自身の着色など好ましくない状態を生ずる可能性
もある。このことから、ビリルビン濃度が未知の
血清を対象とする場合にも、所定のしかも少量を
添加しておくことにより、ビリルビンの干渉を排
除した血清成分の測定を行なうことが可能とな
る。有効に作用させるための添加量の下限は必ず
しも定かではないが、例えばアルブミンの場合正
常人血清中のアルブミン含有量は50ｇ／である
が通常、反応液中では0.1〜0.5ｇ／程度とな
り、この量では効果がなく、概ね新たに、１ｇ／
以上を加えて、反応試薬とすることが好まし
い。 なお本発明者らは、本発明の実証に、牛、胆汁
由来等のビリルビン試料を用いずに、直接、ビリ
ルビン高値の人血清を用いて行つた。つまり、人
血清中のビリルビンの直接の存在様式に従い、本
発明を例証した。 以下に試験例、実施例を示して本発明を更に詳
しく説明するが、本発明の実施の態様はこれによ
り限定されることはない。 試験例 １ ビリルビンの負の干渉について、過酸化水素−
ペルオキシダーゼ−被酸化体系とビリルビンの存
在する場合のアルブミン単独、あるいは、アルブ
ミンおよびアミノピリン併用の効果を示すため、
次の試験を行なつた。 １ 試薬 (2) ４−アミノアンチピリン 0.5ｍmol／ Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トル
イジン（ESPT） 0.5ｍmol／ ペルオキシダーゼ 200000U／ を含む100ｍmol／トリス−塩酸緩衝液。 PH7.0 (2) アミノピリン添加物 15ｇ／アミノピリンを上記試薬(1)に溶解
する。（特開昭56−124398号に開示された好
ましい添加量 (3) アルブミン添加物 ３ｇ／アルブミンを上記試薬(1)に溶解す
る。 (4) アルブミン・アミノピリン添加物 ３ｇ／アルブミン、0.35ｇ／アミノピ
リンを上記試薬(1)に溶解する。 (5) 人血清 ビリルビン濃度20.7mg／dlの人血清。（ビ
リルビンの測定はヤトロン社製イアトロ−
HA705T−BILを用いて測定した。） (6) 過酸化水素 約４ｍmol／過酸化水素溶液。 ２ 操作 試薬(1)３mlに、上記人血清(5)20μまたは精
製水20μを添加し、さらに過酸化水素溶液(6)
20μまたは精製水20μを添加し、37℃５分
間加温する。 同様のことを、試薬(1)の替りに試薬(2)、(3)お
よび(4)について行い、全て、波長550nｍで吸
光度を測定した。 その結果を表１に示す。

【表】 注 ＋ 添加したもの
− 添加しなかつたもの
表１から、アルブミン単独またはアルブミン
およびアミノピリン併用の本発明方法により、
発色性水素供与体の発色に対するビリルビンの
負の干渉は、アミノピリン単独に比べ改良され
ていることが明らかである。 また、表１中Ａを比較すると、アミノピリン
単独で多量に用いると、試薬ブランクの上昇が
著しく、試薬として使用するのに、著しく欠点
となる。 試験例 ２ 試験例１で用いた(1)〜(6)のそれぞれの代わりに
下記試薬(7)〜(12)を用いた以外は試験例１と同一の
試験を行ない吸光度を測定した。結果を表(2)に示
した。 (7) ４−アミノアンチピリン 0.5ｍmol／ ESPT 0.5ｍmol／ ペルオキシダーゼ 200000U／ を含む0.1ｍmol／トリル・塩酸緩衝液。 PH7.0 (8) アミノピリン添加物 10ｇ／の濃度でアミノピリンを上記試薬(7)
に溶解する。 (9) アルブミン添加物 ３ｇ／の濃度でアルブミンを上記試薬(7)に
溶解する。 (10) アルブミン・アミノピリン添加物 ３ｇ／アルブミン、0.35ｇ／アミノピリ
ンを上記試薬(7)に溶解する。 (11) 人血清 ビリルビン濃度43mg／dlの人血清。 (12) 過酸化水素溶液 約４ｍmol／過酸化水素溶液。

【表】 表２から、ビリルビン濃度が43mg／dlと極めて
高い濃度の血清試料に対しても本発明方法が有効
であることがわかる。 実施例 １ １液法によるトリグリセリド（TG）測定にお
けるアルブミン・アミノピリンの添加効果 １ 試薬 (13) リパーゼ 120000U／ グリセロールキナーゼ 7U／ Ｌ−グリセロール−３−リン酸酸化酵素
650U／ ペルオキシダーゼ ２×10⁶U／ アデノシン三リン酸 0.2ｍmol／ MgCl₂ １ｍmol／ トリトンＸ−100 １ｇ／ ４−アミノアンチピリン 0.4ｍmol／ ESPT 0.5ｍmol／ を含む100ｍmol／トリス−塩酸緩衝液。 PH7.0。 (14) 試薬(13)にアミノピリン10ｇ／添加。 (15) 試薬(13)にアルブミン３ｇ／添加。 (16) 試薬(13)にアルブミン３ｇ／アミノピリン
0.35ｇ／を添加。 (17) 人血清総ビリルビン濃度既知（それぞれの
測定濃度を表３に示した）の試料10種。 ２ 測定 試薬(13)(14)(15)および(16)のぞれぞれ3.0mlに(17)
人
血清20μを添加し、37℃10分間加温した後、
波長550nｍでそれぞれの吸光度を測定した。
結果を表３に示した。

【表】

【表】 表３から、総ビリルビン量に比例してTG値
が上昇することが判り、このTG値の上昇の割
合は、アミノピリン単独の場合に比べ、アルブ
ミン単独の場合、更にはアルブミンおよびアミ
ノピリン併用の場合の方が大きく、本発明方法
によつてビリルビンの干渉回避効果が著しく発
揮されることが判る。 実施例 ２ ベーリンガー法と本発明方法との比較トリグリ
セリド測定方法として原理上、ビリルビンの干渉
をまぬがれる測定法とみなされる正確度の高いベ
ーリンガー法（ベーリンガー・マンハイム社製製
品番号126012、トリグリセライド・UV・テス
ト）と本発明方法とを以下の要領で比較した。 試薬 １ ベーリンガー法 (18) リバーゼ 80000U／ エステラーゼ 600U／ ピルベートキナーゼ 1000U／ 乳酸脱水酵素 6000U／ ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチ
ド、還元型 0.2ｍmol／ アデノシン三リン酸 0.4ｍmol／ ホスホエノールピリビン酸 0.3ｍmol／ ドデシル硫酸ナトリウム 0.4ｍmol／ MgSO₄ 4.0ｍmol／ 含む20ｍmol／リン酸緩衝液PH7.0 (19) グリセロールキナーゼ 150U／ml ２ 本発明方法 (20) リパーゼ 120000U／ グリセロキナーゼ 7U／ Ｌ−グリセロール−３−リン酸酸化酵素
650U／ ペルオキシターゼ ２×10⁶U／ アデノシン三リン酸 0.2ｍmol／ MgCl₂ １ｍmol／ トリトンＸ−100 １ｇ／ ４−アミノアンチピリン 0.4ｍmol／ ESPT 0.5ｍmol／ を含む100ｍmol／トリス塩酸緩衝液。
PH7.0。 (21) 上記試薬(20)に３ｇ／アルブミン、
0.35ｇ／アミノピリンを添加する。 検体 人血清 ビリルビン 正常 ５ 検体 ビリルビン 異常 10 検体 操作法 １ ベーリンガー法 キエベツトに、試薬(18)2.5mlを入れ、人血
清50μまたは精製水50μを添加し、37℃
10分間放置後340nｍの吸光度E₁、E₀₁を読
み、次に、試薬(19)0.01mlをそれぞれに添加
し、37℃、10分間放置後340nｍの吸光度E₂、
E₀₂を読み、下式よりトリグリセライド値を
計算する。 トリグリセライド（mg／dl）＝｛（E₁−E₂
）−（E₀₁−E₀₂｝×711 ２ 本発明方法 試薬(20)を３mlとり、人血清20μを添加
し、37℃、10分間加温後波長550nｍでそれ
ぞれの吸光度を測定する。なお、標準液を同
様に操作し、トリグリセライド値を計算す
る。 また試薬（21）を用いて上記の操作法と同
様に行なう。得られたTG値を表４に示し
た。

【表】 表４から、本発明方法は正確度の高いとされる
ベーリンガー法と同程度に高い正確度を有してい
る。一方、アルブミンおよびアミノピリンを用い
ない従来の対照法においては、TG値が極めて低
い値となりビリルビンの干渉が特に異常ビリルビ
ン血清の場合に顕著に現われることが判る。 更に、ベーリンガー法は測定操作が煩雑で多検
体試料や自動分析に応用しにくいのに比べ、本発
明方法は測定が簡便に行なえ、多検体試料や自動
分析にも有利に用いられる方法である。 実施例 ３ 共存物質消去法（２液法）によるTGの定量 １ 試薬 (22) グリセロールキナーゼ 13U／ Ｌ−グリセロール−３−リ酸酸化酵素
1300U／ ペルオキシダーゼ ３×10⁵U／ アデノシントリフオスフエート
0.4ｍmol／ MHB 1.0ｍmol／ MgCl₂ １ｍmol／ トリトンＸ−100 １ｇ／ を含む100ｍmol／トリス−塩酸緩衝液
（PH7.0） (23) ４−アミノアンチピリン 0.8ｍmol／ ESPT 1.0ｍmol／ トリトンＸ−100 １ｇ／ リパーゼ 120000／ を含む100ｍmol／トリス−塩酸緩衝液
（PH7.0） (24) アルブミン添加試薬 アルブミン３ｇ／を試薬（22）に溶解す
る。 (25) アミノピリン添加試薬 アミノピリン0.7ｇ／を試薬（23）に溶
解する。 (26) 人血清 総ビリルビン濃度 既知 ２ 測定 (1) 検体血清（26）20μに試薬（22）1.5mlを
加え37℃、５分間加温し血清中に存在する妨
害成分である遊離グリセーロールを消去す
る。この場合妨害物質の大部分は遊離グリセ
ロールであるがその他グリセロールキナーゼ
以下の反応に関与する総ての血清副反応も消
去される。 次に試薬（23）1.5mlを加え混合し37℃、
10分間放置後波長550nｍで吸光度を測定す
る。 (2) 試薬（24）と試薬（23）を用い、同様に操
作し定量する。 (3) 試薬（22）と試薬（25）を用い、同様に操
作し定量する。 (4) 試薬（24）と試薬（25）を用い、同様に操
作し定量する。 結果を表５に示した。

【表】 表５から、第１試薬にアルブミンを用い、第２
試薬にアミノピリンを用いる本発明方法により、
アルブミン単独およびアミノピリン単独の場合よ
りビリルビンの干渉が著しく良好に回避されるこ
とが判る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペルオキシダーゼ、酵素反応系により生成す
   る過酸化水素および該過酸化水素により酸化され
   る発色性水素供与体を組合せた検出系により行わ
   れる血清成分の測定をアルブミンおよびアミノピ
   リンの存在下で行うことにより血清に共存するビ
   リルビンの干渉を回避または軽減せしめることを
   特徴とする血清成分の測定方法。