JPH043197B2

JPH043197B2 -

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Publication number: JPH043197B2
Application number: JP11042383A
Authority: JP
Priority date: 1983-06-20
Filing date: 1983-06-20
Publication date: 1992-01-22
Also published as: JPS602198A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、オキシダーゼによる基質の新規定量
方法に関するものである。更には臨床化学検査等
に於ける、血液成分等を基質とする酵素反応利用
の定量方法に関する。酵素就中オキシダーゼによる基質定量方法で
は、その酵素反応で生成するものは、水であり、
炭酸ガスであり、過酸化水素であるが、近来その
生成過酸化水素を測定して、基質の定量を行うこ
とは、酵素に先天的な特異性が即ち定量性である
という極めて常識的な生化学の知識によつて、広
い実用性を獲得した。これにより従前の化学的定
量法が、定量性を保持するには種々の工夫が要る
こと、薬品の腐食性が隘路になること、特異性に
問題があることなどの欠点から、駆逐されたに近
い状態になつていることは周知である。而も尚、
近来の酵素法が、十分満足できるものであるとは
限らない。これらのことを、コレステロールの定
量を例として述べれば次の通りである。コレステロールの増加を高コレステロール血
症、減少を低コレステロール血症というが、前者
はネフローゼ症候群、重症糖尿病、甲状腺機能低
下症、グリコーゲン蓄積症、家族性高脂血症等に
みられ、後者は重症な肝疾患、栄養不良、甲状腺
機能亢進症等にみられ、コレステロールの定量
は、臨床化学検査の分野で必須の試験項目であ
る。一般にリーベルマン・ブルクハルト反応やキリ
アニイ反応を、比色反応に用いたザク・ヘンリイ
変法とかズルコウスキー法があつたが、コレステ
ロールを、△⁴−コレステノンと過酸化水素とに
酸化する酵素と、生成過酸化水素を測定する試薬
との組合せが提唱されたあと、方法の主流はこの
酵素法へ完全に移つた。しかしこれも体液中の還
元性物質の影響を回避できず、改良が提案されね
ばならず、また感度が充分でなく、より長波長側
で発色する被酸化性呈色試薬を使う方法への改良
が求められている。本発明者らはこれらの問題点に鑑み、各種基質
に対する夫々特異のオキシダーゼの酵素反応が、
水や過酸化水素のような最終生成物を単純に産生
するという従来の知識に疑問をもち、これら酵素
反応を深く解析すれば新しい利用方法が展開する
と期待、鋭意研究した結果、先に体液成分等の種
種の基質とそれらの基質に夫々特異性を示すオキ
シダーゼとの組合せにつき、基質に対し夫々のオ
キシダーゼが酵素反応をなすとき、スーパーオキ
サイドイオンが定量的に生成、あらためて次の段
階を経てこれが例えば過酸化水素に変換して行く
ことを確認し、スーパーオキサイドイオンを測定
する、基質の有用な実用的定量方法を提案した。
（特願昭57−128700号、特願昭57−170639号）これらの提案された定量方法は、スーパーオキ
サイドイオンの還元性を利用する基質の定量方法
であり、オキシダーゼの酵素反応であるスーパー
オキサイドイオンの生成及びスーパーオキサイド
イオンの被還元性呈色試薬に対する還元反応をパ
ーオキシダーゼ、アミン類又はフエノール類（ナ
フトール類を含む）及びSH基をもつ化合物を以
つて促進するものである。本発明者らは、更に考察を深め、ポルフイリン
の鉄錯体又はコンプレキサンの鉄キレートが上記
パーオキシダーゼの作用、効果と同様の作用効果
を示すのではないか、との着想のもとに、鋭意研
究の結果、そのような着想は、そのとおり実現さ
れ、再現性よく具体化されるものであるとの知見
を得、本発明を完成させるに至つた。即ち、本発明は、基質にオキシダーゼを作用さ
せてスーパーオキサイドイオンを生成させ、生じ
た該スーパーオキサイドイオンが被還元性呈色試
薬に作用して生ずる呈色を測定することにより行
う基質の定量法に於て、スーパーオキサイドイオ
ンの生成反応時及びスーパーオキサイドイオンに
よる被還元性呈色試薬の還元反応時に、ポルフイ
リンの鉄錯体又はコンプレキサンの鉄キレート、
アミン類又はフエノール類（ナフトール類を含
む。）、及びSH基を持つ化合物を共存させること
を特徴とする基質の定量法である。本発明によると、オキシダーゼの酵素反応即ち
スーパーオキサイドイオンの生成、及びスーパー
オキサイドイオンの被還元性呈色試薬に対する還
元反応の、反応速度を効果的に促進することがで
きるので、基質にオキシダーゼを作用させて生成
するスーパーオキサイドイオンを測定する、基質
の定量方法の定量性が効果的に向上し、測定時間
ばかりでなく感度の点に於ても要求される水準に
充分対応することができる。オキシダーゼと、ポルフイリンの鉄錯体又はコ
ンプレキサンの鉄キレートと、アミン類又はフエ
ノール類（ナフトール類を含む。）と、SH基をも
つ化合物と、被還元性呈色試薬との組み合せに、
更に、キレート剤を共存させると、チオール化合
物等の添加剤の、またはおそらくは測定時の反応
の好ましくない副反応である、自動酸化を除去す
ることができるので、所望の反応を安定に進行さ
せることができることが判明した。本発明は、例えば、次のようにして容易に実施
をすることができる。 0.1モル・トリス緩衝液（PH8.0）に、チトクロ
ームＣが2.5×10^-5に、コレステロールオキシダ
ーゼが15単位／dlに、ヘミンが１mg／dlに、フエ
ノールが0.1％になるように溶解、これに同じ緩
衝液にグルタチオン（還元型）が0.8％溶解した
液を加え、この両液の混液にコレステロール200
mg／dlを含むイソプロパノールを添加、37℃で例
えば10分間インキユベートする。チトクロームＣ
が発色し、波長550nmの吸光度は試薬盲検を対照
に（即ちO.D.（−Bl）は）0.10を示す。コレステ
ロールのイソプロパノール溶液の代りに、同量の
イソプロパノールのみを与える場合、チトクロー
ムＣの発色はない。また被還元性呈色試薬に３，
3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニリレ
ン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フ
エニル−2Hテトラゾリウムクロライド］（以下ニ
トロTBという）を用いても同様である。且つこ
れらの呈色は、スーパーオキサイドイオンに特異
的に作用する、スーパーオキサイドジスムターゼ
を大量に存在させることによつて阻害を認める。
即ち本発明の呈色は、スーパーオキサイドイオン
の還元作用によることが確認されるのである。オキシダーゼは酸化酵素であり、基質毎に特異
的にそのオキシダーゼが存在する。グルコースに
対してはグルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルに対してはコレステロールオキシダーゼといつ
た具合であることは周知であり、それらを産生す
る生物体から収得されて市販され、使用されてい
ることも周知であり、これらを夫々使用すれば良
い。基質とそれに作用するオキシダーゼとに組み合
わせを具体的に例示すると、例えばグルコースと
グルコースオキシダーゼ、コレステロールとコレ
ステロールオキシダーゼ、グリセロールとグリセ
ロールオキシダーゼ、グリセロール−３−燐酸と
グリセロール−３−燐酸オキシダーゼ、コリンと
コリンオキシダーゼ、アシル−CoAとアシル−
CoAオキシダーゼ、ピルビン酸とピルビン酸オ
キシダーゼ、尿酸とウリカーゼ、キサンチンとキ
サンチンオキシダーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼ
等が挙げられる。ポルフイリンの鉄錯体としては、ヘミン、α，
β，γ，δ−テトラフエニルポルフイントリスル
ホン酸鉄錯体、α，β，γ，δ−テトラキス（４
−Ｎ−メチルピリジル）ポルフイン鉄錯体、テト
ラフエニルポルフイリン鉄錯体、オクタエチルポ
ルフイリン鉄錯体等であり、反応液中0.007〜
0.06mM／程度存在するように用いれば良い。コンプレキサンの鉄キレートとしては、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、ジアミノプロパン
四酢酸、トランス−シクロヘキサンジアミン四酢
酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、
グリコールエーテルジアミン四酢酸等のコンプレ
キサンの鉄キレートであり、特にEDTA・Fe
（）が有効に利用され得る。これらは反応液中
0.01〜0.07mM／程度存在するように用いれば
良い。アミン類は通常の有機アミンが使用される。脂
肪族アミンに比べて芳香族アミンが、使用量少な
くても効果がある。一級、二級、三級を問わな
い。実用に当つては、アニリン、Ｎ−エチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−ｍ
−トルイジン、3.5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ソジウムスルホプロ
ピル）アニリンなど、入手し易い安価なものを適
宜に選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の段
階で、反応液中0.0001％〜0.2％程度存在するよ
うに添加すれば良い。フエノール類も特に他の置換基によつて支障を
生ずるということはない。フエノール、クロロフ
エノール類、ジクロロフエノール類、ナフトール
スルホン酸類など、入手し易い安価なものを適宜
選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の段階
で、反応液中0.0001％〜0.2％程度存在するよう
にすれば良い。フエノール類とアミン類とを併用することも、
また例えば１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−４−ナ
フトールとか、４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノサリ
チル酸のように、一つの化合物がフエノール類で
もあり、アミン類でもある化合物を使用すること
もできる。但し基質がアミンとかＬ−アミノ酸な
どで、オキシダーゼが夫々アミンオキシダーゼと
かＬ−アミノ酸オキシダーゼなどである場合、ア
ミン類でなくフエノール類を用いることは当然で
ある。チオール化合物についても特に制限はなく、還
元型グルタチオン、チオグリコール酸、メルカプ
トエタノール、チオサリチル酸、システアミン、
システイン、ジメルカプトコハク酸などが例示さ
れ、入手し易い安価なものを適宜選んで使用すれ
ば良く、多くの場合呈色の時点で、反応液中１〜
50mg／dl程度存在するように用いれば良い。被還元性呈色試薬としては、適当な酸化還元電
位を示して、スーパーオキサイドイオンによつて
還元されて呈色するもの、既に化学分析に於て多
数のものが使用されている中から、適宜に選んで
使用すれば良い。ニトロTB、３−（ｐ−ヨード
フエニル）−２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フ
エニル−2Hテトラゾリウムクロライド（以下
INTという）、または３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフエニル−2Hテト
ラゾリウムブロミド（MTT）等のテトラゾリウ
ム塩、チトクロームＣ、テトラニトロメタン（危
険性の故に実用は奨められない）、プラストシア
ニン、ブループロテイン等が例示できる。被還元
性呈色試薬は通常呈色の時点で、反応液中１〜40
mg／dl程度存在するように用いれば良い。テトラ
ゾリウム類は、従来それらが還元されて生ずるホ
ルマザン類が水難溶で、呈色の定量性及び機器類
汚染につき問題ありとされることがあつたが、近
時染着防止剤の使用又は溶解性基を巧みに導入す
ることにより、その問題の解消が進み、本発明の
実施に貢献するようになつた。キレート剤も、EDTA、CyDTA（トランス−
シクロヘキサンジアミン四酢酸＝トランス−１，
２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，N′，
N′−テトラアセチツクアシド）、DTPA（ジエチ
レントリアミン五酢酸＝ジエチレントリアミン−
Ｎ，Ｎ，N′，N″，N″−ペンタアセチツクアシ
ド）と略称される通常周知のものを始め、極めて
多数のものがあるが、これもそれらの中から、入
手し易い安価なものを適宜選んで使用すれば良
く、多くの場合呈色の段階で、反応液中0.5〜
5mM／dl程度存在するように用いれば良い。キ
レート剤添加効果は、現象的には試薬盲検値の変
動が小さいという結果を招来する。上記の各化合物を適宜に組み合せて使用する場
合、呈色を測定しようとする最終混液に、それは
臨床化学分析にままあることであるが、万一濁り
が生じて測定に支障を来たす場合は、適宜界面活
性剤乃至溶解補助剤を予め加えて、この問題を解
消する通常の手法を用いる。またキレート剤を使用するのであるが、これは
抗凝固剤として、ヘパリン、クエン酸ナトリウ
ム、シユウ酸ナトリウムと同様に使用され、別の
目的で使用されている場合もあるが、キレート剤
の存在は前述の通り、本発明方法及び試薬では積
極的に使用すべきものである。他の抗凝固剤、ま
たフツ化ナトリウムの如き解糖阻止剤の存在は、
本発明方法及び試薬による呈色を全く阻害しな
い。また生体に生理的に病理的にまたは治療のた
めに投与することにより存在する量の、アスコル
ビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン、尿酸、ピル
ビン酸、グルコース等は、各々目的の基質に対す
る夫々のオキシダーゼの特異性の故に、全く目的
の呈色を阻害しない。実際の測定に当つては、適宜の媒体（通常緩衝
液であるが）の中に於て、被検液に、定量対象基
質に特異なオキシダーゼ、ポルフイリンの鉄錯体
又はコンプレキサンの鉄キレート、アミン類また
はフエノール類、チオール化合物、及び被還元性
呈色試薬、更に好ましくはキレート剤の混合を与
え、インキユベートして所望の反応を所望の程度
に迄進行させ、結果として生ずる呈色またはそれ
らの変化を測定、被検液中の基質を定量する。そ
の方法のためにオキシダーゼ以下の添加剤乃至試
薬を、一つに混合、或は幾つかの群に分けて単独
にまたは混合し、該当の基質の測定用試薬として
組み合せ、本発明の試薬が得られる。試験中のPH
が7.0以上、好ましくは7.5以上になるように、試
薬の媒体乃至反応液の媒体を選んで処方する。斯く本発明は、スーパーオキサイドイオンを測
定することにより、体液成分などの基質を定量す
る方法と試薬とを提供する、極めて画期的な発明
であり、斯界に貢献する処著しいものである。以
下に実施例を示すが、これらは限定的な例示では
ない。実施例１（コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが
1.06mM／、還元型グルタチオンが0.65mM／
、ヘミンが１mg／dl、コレステロールオキシダ
ーゼが15U／dl、トリトンＸ−100（ロームアン
ドハース社商品名）が0.1ｇ／dlの濃度になる
ように0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）に溶解した発
色試液と、コレステロール200mgを、イソプロパ
ノールに溶解して100mlとした被検試液を準備す
る。被検試液50μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例１（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを300U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例１の方法で吸光度を測
定する。比較例２（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンを削
除した試液を調製し、これを用いて実施例１の方
法で吸光度を測定する。第１表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例２（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにEDTA・Fe（）を１mg／dl含む試液を調製
し、これを用いて実施例１の方法で吸光度を測定
する。第２表に示す結果が得られ、EDTA・Fe（）
がパーオキシダーゼと同等の効果を有することが
知られる。

【表】比較例３（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにEDTA、2Na塩を１mg／dl含む試液を調製
し、これを用いて実施例１の方法で吸光度を測定
する。第３表に示す結果が得られ、EDTA、2Na塩
は効果が認められない。

【表】比較例４（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにEDTA・Ni（）及びEDTA・Mn（）を夫
夫１mg／dl含む試液を調製し、これを用いて実施
例１の方法で吸光度を測定する。第４表に示す結果が得られ、実施例２の吸光度
と比較して殆ど効果が認められない。

【表】実施例３（コレステロール）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りに、ジアミノプロパン四酢酸鉄（）、
（Methyl−EDTA・Fe（））、トランス−シクロ
ヘキサンジアミン四酢酸鉄（）（CyDTA・Fe
（））及びヒドロキシエチルエチレンジアミン三
酢酸鉄（）EDTA−OH・Fe（））を夫々１
mg／dl含む試液を調製し、これを用いて実施例１
の方法で吸光度を測定する。第５表に示す結果が得られ、比較例２の吸光度
と比較して、夫々の鉄キレート添加による効果が
知られる。

【表】実施例４（アシルCoA）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが
1.06mM／、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタ
チオンが20mg／dl、アシルCoAオキシダーゼが
240U／dlとなるように、0.1Mトリス緩衝液（PH
8.0）に溶解した発色試液と、パルミトイルCoA
の2mM水溶液とした被検試液を準備する。被検試液100μに発色試液3.0mlを加え、37℃
恒温槽中10分間インキユベートし、試液ブランク
を対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例５（アシルCoA）実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例４の方法で吸光度を測
定する。第６表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例５（グルコース） INTが10mg／dl、３，５−ジメトキシ−Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ソジウムス
ルホプロピル）アニリンが0.1％、ヘミンが１
mg／dl、還元型グルタチオンが20mg／dl、グルコ
ースオキシダーゼが3000U／dlの濃度になるよう
に、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解した発色
試液と、ブドウ糖の200mg／dl水溶液とした被検
試液を準備する。被検試液20μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長500nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例６（グルコース）実施例５の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例５の方法で吸光度を測
定する。第７表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例６（ピルビン酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが
1.06mM／、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタ
チオンが10mg／dl、ピルビン酸オキシダーゼが
700U／dl、フラビンアデニンジヌクレオチドが
２mg／dl、チアミンピロホスフエートが44mg／
dl、酢酸マグネシウムが0.15％の濃度になるよう
に、0.02Mリン酸緩衝液（PH7.1）に溶解した発
色試液と、ピルビン酸リチウムをピルビン酸とし
て10mg／dl水溶液とした被検試液を準備する。被検試液100μに発色試液3.0mlを加え、37℃
恒温槽中15分間インキユベートし、試薬ブランク
を対照として波長560nmに於ける吸光度を測定、
0.050を得る。実施例７（コリン）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが
1.06mM／、ヘミンが１mg／dl、チオサリチル
酸が10mg／dl、コリンオキシダーゼが500U／dl
となるように、0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）に溶
解した発色試液と、塩化コリンを70mg／dl水溶液
とした被検試液を準備する。被検試液20μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例７（コリン）実施例７の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例７の方法で吸光度を測
定する。第８表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例８（グリセロール−３−リン酸）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.5mM／
、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタチオンが20
mg／dl、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
が600U／dlとなるように、0.1Mトリス緩衝液
（PH8.0）に溶解した発色試液と、グリセロール−
３−リン酸を10mM（172mg／dl）水溶液とした被
検試液を準備する。被検試液50μに発色試液4.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例８（グリセロール−３−リン酸）実施例８の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例８の方法で吸光度を測
定する。第９表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例９（グリセロール）ニトロTBが10mg／dl、フエノールが0.5mM／
、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタチオンが20
mg／dl、グリセロールオキシダーゼが600U／dl
となるように、0.05Mリン酸緩衝液（PH8.0）に
溶解した発色試液と、グリセリンを2mM水溶液
とした被検試液を準備する。被検試液50μに発色試液4.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例９（グリセロール）実施例９の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例９の方法で吸光度を測
定する。第10表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例 10 （尿酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが
1.06mM／、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタ
チオンが10mg／dl、ウリカーゼが30U／dlとなる
ように、0.1Mトリス緩衝液（PH7.1）に溶解した
発色試液と、尿酸を10mg／dlになるように溶解し
た１％炭酸リチウム水溶液を被検試液として準備
する。被検試液60μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例 10 （尿酸）実施例10の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例10の方法で吸光度を測
定する。第11表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例 11 （Ｌ−乳酸）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが
1.06mM／、ヘミンが１mg／dl、還元型グルタ
チオンが10mg／dl、Ｌ−乳酸オキシダーゼが
85U／dlとなるように、0.1Mトリス緩衝液（PH
7.5）に溶解した発色試液と、Ｌ−乳酸ナトリウ
ムを10mM水溶液とした被検試液を準備する。被検試液50μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、試薬ブランクを
対照として波長560nmに於ける吸光度を測定す
る。比較例 11 （Ｌ−乳酸）実施例11の発色試液調製法に於て、ヘミンの代
りにパーオキシダーゼを600U／dl含む試液を調
製し、これを用いて実施例11の方法で吸光度を測
定する。第12表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキ
シダーゼと同等以上の効果を有することが知られ
る。

【表】実施例 12 （血清遊離コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが2mM／
、還元型グルタチオンが0.65mM／、
EDTA・Fe（）が0.017mM／、コレステロー
ルオキシダーゼが15U／dl、トリトンＸ−100（ロ
ームアンドハース社商品名）が0.1ｇ／dlの
濃度になるように、0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）
に溶解した発色試液を準備する。血清50μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒温槽
中10分間加温し、試薬ブランクを対照として波長
560nmに於ける吸光度を測定する。別に作成した検量線から試料中の遊離コレステ
ロール濃度を算出する。比較例 12 （血清遊離コレステロール）フエノールが0.1％、４−アミノアンチピリン
が0.01％、コレステロールオキシダーゼが10U／
dl、ペルオキシダーゼが300U／dl、トリトンＸ
−100（ロームアンドハース社商品名）が0.15
％の濃度になるように、0.1Mリン酸塩緩衝液
（PH7.0）に溶解し発色試液とする。血清50μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒温槽
中15分間加温し、試薬ブランクを対照として波長
505nmの吸光度を測定する。別に作成した検線線から試料中の遊離コレステ
ロール濃度を算出する。第13表に示すように、実施例12と比較例12の値
はよく一致し、有意差は認められない。

【表】実施例 13 （血清遊離コレステロール）実施例12の発色試液にEDTA2.5mM／濃度
になるように溶解したものを発色試液とする。実
施例12の被検試液50μをとり、これに発色試液
3.0mlを加え、37℃恒温槽中10分間加温したのち、
水を対照として、被検試液（E_S）と試薬ブランク
（E_BL）の吸光度を測定する。第14表に示す結果が得られ、本発明方法及び試
薬に於ける、EDTAの添加効果が知られる。

【表】実施例 14 （コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、第15表のフエノール化
合物又はアミン化合物が1.06mM／、還元型グ
ルタチオンが0.65mM／、EDTA・Fe（）を
１mg／dl、コレステロールオキシダーゼが15U／
dl、トリトンＸ−100（ロームアンドハース社
商品名）が0.1ｇ／dl、エマルゲン920（花王(株)商
品名）が0.4ｇ／dlの濃度になるように、0.1Mト
リス緩衝液（PH8.0）に溶解した発色試液と、コ
レステロール200mgを、イソプロパノールに溶解
して100mlとした被検試液を準備する。被検試液50μに発色試液3.0mlを加え、37℃恒
温槽中10分間インキユベートし、夫々試薬ブラン
クを対照として波長560nmに於ける吸光度を測定
する。第15表に示す結果が得られ、本発明方法及び試
薬に於ける、フエノール類又はアミン類の添加効
果が知られる。

【表】

【表】実施例 15 （コレステロール）ニトロTBが20mg／dl、フエノールが
1.06mM／、第16表のチオール化合物が
0.65mM／、EDTA・Fe（）が１mg／dl、コ
レステロールオキシダーゼが15U／dlの濃度にな
るように、0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）に溶解し
た発色試液と、コレステロール200mgを、イソプ
ロパノールに溶解して100mlとした被検試液を準
備する。被検試液50μと発色試液3.0mlで、実施例14と
同様に測定、第16表に示す結果を得、チオール化
合物の添加効果が知られる。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１基質にオキシダーゼを作用させてスーパーオ
キサイドイオンを生成させ、生じた該スーパーオ
キサイドイオンが被還元性呈色試薬に作用して生
ずる呈色を測定することにより行う基質の定量法
に於て、スーパーオキサイドイオンの生成反応時
及びスーパーオキサイドイオンによる被還元性呈
色試薬の還元反応時に、ポルフイリンの鉄錯体又
はコンプレキサンの鉄キレート、アミン類又はフ
エノール類（ナフトール類を含む。）、及びSH基
を持つ化合物を共存させることを特徴とする基質
の定量法。２スーパーオキサイドイオンの生成反応時及び
スーパーオキサイドイオンによる被還元性呈色試
薬の還元反応時に、更にキレート剤を共存させ
る、特許請求の範囲第１項に記載の定量法。３基質とそれに作用するオキシダーゼとの組み
合わせが、グルコースとグルコースオキシダー
ゼ、コレステロールとコレステロールオキシダー
ゼ、グリセロールとグリセロールオキシダーゼ、
グリセロール−３−燐酸とグリセロール−３−燐
酸オキシダーゼ、コリンとコリンオキシダーゼ、
アシル−CoAとアシル−CoAオキシダーゼ、ピ
ルビン酸とピルビン酸オキシダーゼ、尿酸とウリ
カーゼ、キサンチンとキサンチンオキシダーゼ、
又は乳酸と乳酸オキシダーゼである、特許請求の
範囲第１項又は第２項に記載の定量法。