JPS602198A - オキシダーゼによる基質の新規定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オキシダーゼによる基質の新規定量方法及び
定量用試薬に関するものである。更には臨床化学検査等
に於ける、血液成分等全基質とする酵素反応利用の定量
方法及び定量用試薬に関する。

酵素起中オキシダーゼによる基質定量方法では、その酵
素反応で生成するものは、水であり、炭酸ガスであり、
過酸化水素であるが、近来その生成過酸化水素を測定し
て、基質の定量を行うことは、酵素に先天的な特異性が
即ち定量性であるという極めて常識的な生化学の知識に
よって、広い実用性を獲得した。これにより従前の化学
的定量法が、定量性全保持するには種々の工夫が要るこ
と、薬品の腐食性が隘路になること、特異性に問題があ
ることなどの欠点から、駆送されたに近い状態になって
いることは周知である。而も尚、近来の酵素法が、十分
満足できるものであるとは限らない。

これらのことを、コレステロールの定量を例として述べ
れは次の通りである。

コレステロールの増加を高コレステロール血症、減少を
低コレステロール血症というが、前者はネフローゼ症候
群、重症糖尿病、甲状腺機能低下症、グリコーゲン蓄積
症、家族性高脂血症等にみられ、後者は重症な肝疾患、
栄養不良、甲状腺機能低下症等にみられ、コレステロー
ルの定量は、臨床化学検査の分野で必須の試験項目であ
る。

−Ｊ’ｉ２にリーベルマン・プルクハルト反応やキリア
ニイ反応金、比色反応に用いたザク・ヘンリイ変法とか
ズルコウスキー法があったが、コレステロールを、バー
コレステノンと過酸化水素とに酸化する酵素と、生成過
酸化水素を測定する試薬との組合せが提唱されたあと、
方法の主流はこの酵素法へ完全に移った。しかしこれも
体液中の還元性物質の影響全回避できず、改良が提案さ
れねばならず、また感度が充分でなく、より長波長側で
発色する被酸化性呈色試薬を使う方法への改良がめられ
ている。

本発明者らはこれらの問題点に鑑み、各種基質に対する
夫々特異のオキシダーゼの酵素反応が、水や過酸化水素
のような最終生成物全単純に産生ずるという従来の知識
に疑問？もち、これら酵素反応を深く解析すれば新しい
利用方法が展開すると期待、鋭意研究した結果、先に体
液成分等の植種の基質とそれらの基質に夫々特異性を示
すオキシダーゼとの組合すにつき、基質に対し夫々のオ
キシダーゼが酵素反応をなすとき、スーパーオキサイド
イオンが定量的に生成、あらためて次の段階を経てこれ
が例えば過酸化水素に変換して行くことを確認し、スー
パーオキサイドイオン’ｋ　ＩＩＩ　定する、基質の有
用な実用的定量方法を提案した。

（特願昭５７−１２８７００号、特願昭５７−１７０６
３９号） これらの罐案された定量方法は、スーパーオキサイドイ
オンの還元性を利用する基質の定量方法であり、オキシ
ダーゼの酵素反応であるスーパーオキサイドイオンの生
成及びスーパーオキサイドイオンの被還元性呈色試薬に
対する還元反応をパーオキシダーゼ、アミン類又はフェ
ノール類（ナフトール類す含む）及びＳ”Ｈ基をもつ化
合物を以って促進するものである。

本発明者らは、更に考察全深め、ポルフィリンの鉄錯体
又はコンプレキサンの鉄キレートが上記パーオキシダー
ゼの作用、効果と同様の作用効果を示すのではないか、
との着想のもとに、鋭意研究の結果、そのような着想は
、そのとおり実現され、再現性よく具体化されるもので
あるとの知見を得、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、基質にオキシダーゼを作用させて生成
するスーパーオキサイドイオンを測定する、基質の定量
方法に於て、オキシダーゼの酵素反応即ちスーパーオキ
サイドイオンの生成、及びスーパーオキサイドイオンの
被還元性呈色試薬に対する還元反応全、ポリフィリンの
鉄錯体又はコンブレキサンの鉄キレート、アミン類又は
フェノール類（ナフトール類を含む。）及びＳＲ基をも
つ化合物を以って促進することを特徴とする、オキシダ
ーゼによる基質の新規定量法である。

本発明によると、オキシダーゼの酵素反応即ちスーパー
オキサイドイオンの生成、及びスーパーオキサイドイオ
ンの被還元性呈色試薬に対する還元反応９、反応速度全
効果的に促進することができるので、基質にオキシダー
ゼ全作用させて生成するスーパーオキサイドイオンを測
定する、基質の定量方法の定量性が効果的に向上し、測
定時間ばかりでなく感度の点に於ても要求される水準に
充分対応することができる。

オキシダーゼと、ポルフィリンの鉄錯体又はコンブレキ
サンの鉄キレートと、アミン譚又はフェノール類（ナフ
トール類？含む。）と、ＳＨ基をもつ化合物と、被還元
性呈色試薬との組み合せに、更に、キレート剤を共存さ
せると、チオール化合物等の添加剤の、またはおｉらく
は測定時の反応の好ましくない副β灼である、自動酸化
を除去することができるので、所望の反応全安定に進行
させることができることが判明した。

本発明は、例えば、次のようにして各易に実施をするこ
とができる。

０．１モル・トリス緩衝液（ｐＨ８，０）に、チトクロ
ームＣが２．５　Ｘ　ｌ　Ｏ＝モルに、コレステロール
オキシダーゼが１５単位／ｄｌに、ヘミンがｌダ／ｃｌ
ｌに、フェノールが０．１％になるように溶解、これに
同一じ緩劇液にグルタ−チオ（ン（還元−型）が０．８
％溶解した１０を加え、この両液の混故にコレステロー
ル２００ｍ９．；’ｄｌ’ｘ含むインプロパツールを添
加、３７℃で例えば１０分間インキュベートする。チト
クロームＣが発色し、波長５５０ｎｍの吸光度は試薬盲
検を対照に（即ちＯ，Ｄ、（−Ｂ　ｔ）は）　０．’Ｌ
　Ｏｋ示ス。コレステロールのインプロパツール溶液の
代りに、同量のインプロパツールのみを与える場合、チ
トクロームＣの発色はない。また被還元性呈色試薬に２
．２′−ジ（４−ニトロフェニル）−５，５′−ジフェ
ニル−３，３’　−（３，３’−ジメトキシ−４，４’
−ジフェニレγ）ジテトラブリウムークロリド（以下ニ
トロＴＢという）を用いても同様である。且つこれらの
呈色は、スーパーオキサイドイオンに特異的に作用する
、スーパーオキサイドジスムターゼを大量に存在させる
ことによって阻害？認める。即ち本発明の呈色は、スー
パーオキサイドイオンの還元作用によることが確認され
るのである。

オキシダーゼは酸化酵素であり、基質毎に特異的にその
オキシダーゼが存在する。グルコースに対してはグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールに対してはコレステ
ロールオキシダーゼといった具合であることは周知であ
り、それらを産生ずる生物体から収得されて市販され、
使用されていることも周知であり、これらを夫々使用す
れば良い。

ポルフィリンの鉄錯体としては、ヘミン、α。

β、γ、δ−テトラフェニルポルフィントリスルホン酸
鉄錯体、α、β、γ、δ−テトラフェニルポルフィント
リスルホン酸鉄錯体、α、β、γ、δ−テトラキス（４
Ｎ−メチルビリジルノボルフィン鉄錯体、テトラフェニ
ルポルフィリン鉄錯体、オクタエチルポルフィリン鉄錯
体等であり、反応液中０．００７〜０．０６　ｍＭ／　
を程度存在するように用いれは良し）。

コンブレキサンの鉄キレートとしては、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパコールエーテル
ジアミン四酢醒等のコンブレキサンの鉄キレートであり
、特にＥＤＴＡ−Ｆｅ（Ｍ）が有効に利用され得る。こ
れらは反応液中０．０１〜０．０７　ｍ１ＶＩ／　ｌ−
程度存在するように用いれば良い。

アミン類は通常の有機アミンが使用される。脂肪族アミ
ンに比べて芳香族アミンが、使用量少なくても効果があ
る。−級、二級、三級を問わない。

実用に当っては、アニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ、
Ｎ−ジメチルアニリン、’　Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン
、’　Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジン、Ｎ−エチル
−Ｎ−β−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン、３．５
−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−ソジワムスルホプロビル）アニリンなど、入手し易い
安価なものを適宜に選んで使用すれば良く、多くの場合
呈色の段階で、反応液中０・０００１％〜０．２％程度
存在するように添加すれば良い。

フェノール類も特に他の置換基によって支障を生ずると
いうことはない。フェノール、クロロフェノール類、ジ
クロロフェノール類、ナフトールスルホン酸類など、入
手し易い安価なものを適宜選んで使用すれば良く、多く
の場合呈色の段階で、反応液中Ｌ０，０００１　％〜０
．２％程度存在するよまた例えば１−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノ−４−ナフ）−ルトカ、４−Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ミノサリチル酸のように、一つの化合物がフェノール類
でもあり、アミン類でもある化合物を使用することもで
きる。但し基質がアミンとかし一アミノ酸などで、オキ
シダーゼが夫々アミンオキシダーゼとかし一アミノ酸オ
キシダーゼなどである場合、アミン類でなくフェノール
類を用いるととは当然でおる。

チオール化合物についても特に制限はなく、還元型グル
タチオン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、
チオサリチル酸、システアミン、システィン、ジメルカ
プトコハク酸などが例示され、入手し易い安価なものを
適宜選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の時点で、
反応液中１〜５０ｍ９／ｄｌ程度存在するように用いれ
ば良い。

被還元性呈色試薬としては、適当な酸化還元電位を示し
て、スーパーオキサイドイオンによって還元されて呈色
するもの、既に化学分析に於て多数のものが使用されて
いる中から゛、適宜に選んで使用すれば良い。二１・口
ＴＢ、　２−（４−ヨーＦフェニル）−３−（４−ニト
ロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム−クロリド
（以下ＩＮＴという）、または３−　（４，５−ジメチ
ルチアゾリル−２）　−２，５−ジフェニルテトラゾリ
ワム＝プロミド（ＭＴＴ）等のテトラゾリウム塩、チト
クロームＣ１テトラニトロメタン（危険性の故に実用は
奨められない）、プラストシアニン、ブループロティン
等が例示できる。被還元性呈色試薬は通常呈色の時点で
、反応液中１〜４０ｍ９／ｄｌ程度存在するように用い
れば良い。テトラゾリウム類は、従来それらが還元され
て生ずるホルマザン類が水難溶で、呈色の定量性及び機
器類汚染につき問題ありとされることがあった力へ近時
染着防止剤の使用又は溶解性基を巧みに導入することに
より、その問題点の解消が進み、本発明の実施に貢献す
るようになった。

キレート剤も、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ（）ランス−シク
ロヘキサンジアミン四酢酸二トランス−１，２−シクロ
ヘキサンジアミン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラアセチ
ックアシド）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸
＝ジエチレントリアミン−Ｎ、Ｎ、Ｎ！、Ｎ“、Ｎ“−
ペンタアセチックアシド）と略称される通常周知のもの
を始め、極めて多数のものがあるが、これもそれらの中
から、入手し易い安価なものを適宜選んで使用すれば良
く、多くの場合呈色の段階で、反応液中０．５〜５ｍＭ
／ｄｉ程度存在するように用いれば良い。キレート剤添
加効果は、現象的には試薬盲検直の変動が小さいという
結果を招来する。

上記の各化合物全適宜に組み合せて使用する場合、呈色
全測定しようとする最終混液に、それは臨床化学分析に
ままあることであるが、万−濁りが生じて測定に支障を
来たす場合は、適宜界面活性剤乃至浴解補助剤を予め加
えて、この問題を解消する通常の手法を用いる。

またキレート剤を使用するのであるが、これは抗；凝固
剤として、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、シュワ酸ナ
トリウムと同様に使用され、別の目的で使用されている
場合もあるが、キレ−１・剤の存在は前述の通り、本発
明方法及び試薬では積極的に使用すべきものである。他
の抗凝固剤、またフッ化ナトリウムの如き解糖阻止剤の
存在は、本発明方法及び試薬による呈色を全く阻害しな
い。また生体に生理的に病理的にまたは治療のために投
与することにより存在する量の、アスコルビン酸、ビリ
ルビン、ヘモグロビン、尿酸、ピルビン酸、グルコース
等は、各々目的の基質に対する夫々のオキシダーゼの特
異性の故に、全く目的の呈色◆を阻害しない。

実際の測定に当っては、適宜の媒体（通常緩衝液である
が）の中に於て、被検液に、定量対象品質に特異なオキ
シダーゼ、ポルフィリンの鉄錯体又はコンプレキサンの
鉄キレート、アミン類またはフェノール類、チオール化
合物、及び被還元性呈色試薬、更ノこ好ましくはキレー
ト剤の混合を与え、インキュベートして所望の反応全所
望の程度に迄進行させ、結果として生ずる呈色またはそ
れらの変化を測定、被検液中の基算を定量する。その方
法のためにオキシダーゼ以下の添加剤乃至試薬を、一つ
に混合、或は幾つかの群に分けて単独にまたは混合し、
該当の基質の測定用試薬として組み合せ、本発明の試薬
が得られる。試験中のｐｆ（が７．０以上、好ましくは
７．５以上になるように、試薬の媒体乃至反応液の媒体
を選んで処方する。

斯く本発明は、スーパーオキサイドイオンを測定するこ
とにより、体液成分などの基質を定量する方法と試薬と
を提供する、極めて画期的な発明であり、斯界に貢献す
る処著しいものである。以下に実施例を示すが、これら
は限定的な例示ではない。実施例中の発色試液は本発明
試薬の実施例であり、これによる測定定量が本発明方法
の実施例である。

実施例　１　（コレステロール） ニトロＴＢが２０ｍ９／ｄｌｌ、フェノールが１．０６
ｍＭ　／　ｌ　、還元型グルタチオンがＱ、６５　ｍＭ
／　ｔ　。

ヘミンが１ｍ９／ｄ１１　コレステロールオキシダーゼ
が　ｌ　５Ｕ／ｄｌ、　ト　リ　ト　７Ｘ−１００が　
ＯＡ　ｇ　／ｄｌの濃度になるようにＯ−Ｉ　Ｍ　）　
ＩＩス緩衝液ＣｐＨ８，０）に溶解した発色試液と、コ
レステロール２．００ｍｇを、インプロパツールに溶解
して１００　ｍｌとした被検試液を準備する。

被検試液５０ＩＬｔに発色試液３．０ｍｌ’に加え、３
７℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試薬ブランク
全対照として波長５６　（］　ｎｍに於ける吸光度を測
定する。

比較例　１　（コレステロール） 実施例１０発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパー
オキシダーゼｆ＜３００Ｕ／ｄｉ含む試液全調製し、こ
れを用いて実施例１の方法で吸光度を測定する。

比較例　２　（コレステロール） 実施例１０発色試′液調製法に於て、ヘミンを削除した
試液を調製し、これを用いて実施例１の方法で吸光度全
測定する。

第１表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダーゼ
・と同等以上の効果金有すること・が知られる。

第１表 実施例　２　（コレステロール） 実施例１０発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにＥＤ
ＴＡ　−Ｆｅ（ＩＩＦ）　’ｔ１ｍ９／ｄｉ含む試液を
調製し、これを用いて実施例１の方法で吸光度を測定す
る。

第２表に示す結果が得られ、ＥＤ　Ｔ　Ａ　−Ｆｅ（Ｉ
ｌ［）がパーオキシダーゼと同等の効果を有することが
知られる。

第２表 比、較例　３　（コレステロール） 実施例１０発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにＥＤ
ＴＡ、２Ｎａ塩’ｌ：：１ｍ９／ｄｌ含む試液を調製゛
し、これ音用いて実施例１の方法で吸光度を測定する。

第３表に示す結果が得られ、ＥＤＴＡ、２Ｎａ塩は効果
が認められない。

第３表 比較例　４　（コレステロール） 実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにＥＤ
ＴＡ−Ｎｉ（［）及びＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−Ｍｎ（［）’
に夫夫ｌＩｎ９７ｄｌ含む試液全調製し、これを用いて
実施例１の方法で吸光度全測定する。

第４表に示す結果が得られ、実施例２の吸光度と比較し
て殆ど効果が認められない。

第４表 実施例　３　（コレステロール） 実施例１０発色試液調製法に於て、ヘミンの代りに、ジ
アミノプロパン四酢酸鉄（ＩＩＩ）、（Ｍｅｔｈｙｌ　
−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−Ｆｅ、’（Ｎ））、トランス−シク
ロヘキサンシアミン四酢酸鉄（Ｉｌｌ）　（Ｃｙ　Ｄ　
Ｔ　Ａ−Ｆｅ（ＩＩ））及び　ヒドロキシエチルエチレ
ンジアミン三酢酸鉄（ＩＩＩ）　ＥＤ　Ｔ　Ａ　−０Ｈ
−Ｆｅ（ＩＩＩ）　）　ｆｆｉ夫々１ｍｇ１ｄｌ含む試
液全調製し、これを用いて実施例１の方法で吸光度を測
定する。

第５表に示す結果が得られ、比較例２の吸光度と比較し
て、夫々の鉄キレート添加による効果が知られる。

第５表 実施例　４　（アシルＣ０Ａ） ニトロＴＢが１０■／　ｄｌ　、フェノールが１．０６
ｍＭ／ｌ、ヘミンが１＋！／ｄＬ還元゛型グルタチオン
が２０ｍｇ／ｄ１２、アシルＣＯＡオキシダーゼが２４
ｑＵｌｄｌとなるように、０．１１ＶＩトリス緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶解した発色試液と、バルミトイルＣＯ
Ａの２ｍＭ水浴液とした被検試９ａ全準備する。

被検試液１００μ乙に発色試液３．０ｍ１ｆ加え、３７
℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試液ブランクを
対照として波長５６０　ｎｍに於ける吸光度全測定する
。

比較例　５　（アシルＣＯＡ　） 実施例１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパー
オキシダーゼ’ｒ６００Ｕ／ｄｌ含む試液を調製し、こ
れ？用いて実施例４の方法で吸光度を測定する。

第６表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキソダーゼ
と同等以上の効果を有することが知られる。

第６表 実施例　５　（グルコース） ＩＮＴが１０Ｔｎ９／ｄｌ、３．５−ジメトキシ−Ｎ−
エチル−Ｎ　−（２−ヒドロキシ−３−ソシワムスルホ
ブロビル）アニリンが０．１％、ヘミンが１〃ｌ／　ｄ
ｅ　、還元型グルクチオンが２０ｍ９／ｄ１．、グルコ
ースオキシダーゼが３０００Ｕ／ｄβの濃度になるよう
に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　ｎ８−ｏ　＞に溶解し
た発色試液と、ブドウ糖の２００■／ｄｌ水溶液とした
被検試液を準備する。

被検試液２０μ乙に発色試液３．０ｒｎｌヲ加え、３７
℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試薬ブランクを
対照として波長５００　ｎｍに於ける吸光度を測定する
。

比較例　６　（グルコース） 実施例５０発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパー
オキソダーゼ＠　６　（１，ｏ　Ｕｉｄｅ含む試液を調
製し、これを用いて実施例５の方法で吸光度を測定する
。

第７表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダーゼ
と同等以上の効果を有するこおが知られる。

実施例　６　（ピルビン酸） ニトロＴＢが２０〜／ｄｌ、フェノールが１．０ＢｍＭ
　／　ｌ　、ヘミンが１１ψ／ｄ１４．還元型グルタチ
オンが１０〜／ｄｉ、ピルビン酸オキシダーゼが７００
Ｕ　／　ｃｔｅ　、フラビンアデニンジヌクレオチドが
２１ｎｇｌｄｌ、チアミンピロポスフェートが４４１ｎ
９７ｄｅ。

酢酸マグネシウムが０．１５％の濃度になるように、ｏ
：ｏ２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に溶解した発色試
液と、ピルビン酸すチワムｔピルビン酸として１０　ｍ
９　／　ｄｉ水溶液とした被検試液を準備する。

被検試液１００μ乙に発色試液３．（ＩＬＡ！’ｚ加え
、３７℃恒温槽中１５分間インキュベートし、試薬ブラ
ンク全対照として波長５６０１１ｍに於ける吸光度全測
定、０．０５０を得る。

実施例　７　（コリン） ニトロＴＢが１０１ＴＩ９７ｄｌ、フェノールが１．０
６ｍＭ　／　ｌ　、ヘミンがＩＵ’ｊ／ｄｉ、チオサリ
チル酸が１０　Ｉｎ’；／　／　ｄｌｓ　コリンオキシ
ダーゼが５００Ｕ／ｄｉとなるように、０．．１Ｍトリ
ス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した発色試液と、塩化コ
リンｆ７０ｙｖ／ｄｌ水溶液とした被検試液を準備する
。

被検試液２０μ乙に発色試液３．０ｍ１ｋ加え、３７℃
恒温槽中１０分間インキユベートシ、試薬ブランクを対
照として波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定する、 比較例　７　（コリン） 実施例７の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパー
オキシダーゼｆ６００Ｕ／ｄｉ含む試液を調製し、これ
を用いて実施例７の方法で吸光度を測定する。

第８表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダーゼ
と同等以上の効果を有することが知られる。

環８表 実施例−８（グリセロール−３−リン＃）ニトロＴＢが
１０Ｉｎ９／ｄｌ、フェノールが０．５ｍＭ／１５ヘミ
ンが１　ｎ’＆　／　ｄｌ、還元型グルタチオンが２０
■／ｄｉ、グリセロニル−３−リン酸オキシダーゼが６
００Ｕ／ｄｉとなるように、ｏ、１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解した発色試液と、グリセｏ−）ｖ−３
−リン酸’ｘ　１０　ｍＭ　（１７２１１１ｆｉ’Ｊり
水溶液とした被検試液を準備する。

被検試液５０μ乙に発色試液４．０ｍＡ！に加え、３７
℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試薬ブランクを
対照として波長５６０　ｎｍに於ける吸晃度を測定する
。

比較例　８　（グリセロール−３−ＩＪ　７　ｅ　）実
施例８の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパーオ
キシダーゼに６００Ｕ／ｄＪ含む試液を調製し、これを
用いて実施例８の方法で吸光度を測定する。

第９表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダーゼ
と同等以上の効果を有することが知られる。

第９表 実施例　９　（グリセロール） ニドＤＴＢが１０ｍ９／ｄｉ、フェノールが０．５ｍＭ
／１．ヘミンがｌｔｎｇ／ｒｉｐ、還元型グルタチオン
が２０Ｔｎ９／ｄｌ、グリセロールオキシダーゼが６０
０Ｕ　／　ｄｉ　（！：なるように、’０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した発色試液と、グリセ
リン１２ｍ−Ｍ水溶液とした被検試液を準備する。

被検試液５０μ乙に発色試液４．０　ｄ　ｉ加え、３７
℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試薬ブランクを
対照として波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定する
。

比較例　９　（グリセロール） 実施例９の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパー
オキシダーゼ”ｆ：６００Ｕ／ｄｉ含む試液を調製し、
これ上用いて実施例９の方法で吸光度全測定する。

第１Ｏ表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダー
ゼと同等以上の効果全有することが知られる。

第１０表 実施例　１０　（尿酸） ニドＯＴＢが２０ｍ９７ｄｉ、フェノールが１．０６ｍ
Ｍ／ｌ、ヘミンが１ｍ’ｉ／ｄｉ、還元型グルタチオン
が１０ｍｆ／／ｄｌ、ウリカーゼが３０Ｕ／ｄ７！とな
るように、０．１Ｍ１−リス緩衝液（ｐＨ７，１）に溶
解した発色試液と、尿酸’ｊＫ、１０ｍ９／ｄｌになる
ように溶解した１％炭酸リチウム水溶液を被検試液とし
て準備する。

被検試液６０μｔに発色試液３．ＣＹｍｌｆ加え、３７
℃恒温槽中１０分間インキュベートし、試薬ブランクを
対照として波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定する
。

比較例　１０　（尿酸） 実施例１Ｏの発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパ
ーオキシダーゼを６００Ｕ／ｄｌ含む試液上調製し、こ
れを用いて実施例１ｏの方法で吸光菱會測定する。

第１１表に示す結果が得られ、ヘミンがパーオキシダー
ゼと同等以上の効果を有することが知られる。

第１１表 実施例１１　（Ｌ−乳酸） ニトロＴＢが２０ｍ９／ｄ１１！、フェノールが１．０
６ｍ’ｓ／１％ヘミンがＩＴｎ９／ｄβ、還元型グルタ
チオンが１０ｒｒＱ／ｄｌ、　Ｌ−乳酸オキシダーゼが
８５Ｕ／ｄ７！となるように、０．１１ＶＩ）リス緩衝
液（ｐＨ７，５）に溶解した発色試液と、Ｌ−乳酸ナト
リウムを１０ｒｎＭ水溶液とした被検試液を準備する。

被検試液５０μ乙に発色試液３．３＋ｕ６を加え、３７
℃恒温槽中ｌＯ分間インキュベートし、試薬ブランクを
対照として波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定する
。

比較例　１１　（Ｌ−乳酸） 実施例１１の発色試液調製法に於て、ヘミンの代りにパ
ーオキシダーゼ’ｘ６００Ｕ／ｄｌ含む試液全調製し、
これを用いて実施例１１の方法で吸光度を測定する。

第１２表に示す結果−が得られ、ヘミンがパーオキシダ
ーゼと同等以上の効ダ、勿有することが知ら実施例　１
２　（血清遊離コレステロール）ニトロＴＢが２０ｒｒ
ｖ／ｌｉｅ、フェノールが２７／１１還元型グルタチオ
ンが０．６５　ｍＭ／　ｔ、　Ｅ　ＤＴ　Ａ−Ｆｅ（Ｉ
ＩＩ）が０．０１７　ｍＭ／　ｔ、　コレステロールオ
キシダーゼが１５Ｕ／ｄｉ、トリドアＸ−１００が０．
１＆／ｄｅの濃度になるように、ｏ、ＩＭ）リス緩衝ｔ
ｉ、（ｐＨ８，０）に溶解した発色試液を準備する。

血清５０μ乙に発色試ｉ３．ｏｍｌ”を加え、３７°Ｃ
恒温槽中１０分間加温し、試薬ブランク全対照として波
長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定する。

別に作成した検量線から試料中の遊離コレステロール濃
度を算出する。

比較例　１２　（血清遊離コレステロール）フェノール
が０．１％、４−アミノアンチピリンが０．０１　％、
コレステロールオキシダーゼが１゜１Ｊ／ｄｌｌ、ペル
オキシダーゼか３００　Ｕ／ｄｉ、ｌ−リドンＸ−１０
０が０．１５　係の濃度になるように、０．１Ｍ＋リン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し発色試液とする。

血清５０　μｉに発色試液３．０ｍ１ｆ加え、３７°Ｃ
恒温槽中１５分間加温し、試薬ブランクを対照として波
長５０５　ｎｍの吸光度を測定する。

別に作成した検量線から試料中の遊離コレステロール濃
度を算出する。

第１３表に示すように、実施例１２と比較例１２の直は
よく一致し、有意差は認められない。

第１３表 γ＝０．９９６ Ｙ＝１．　００Ｘ−０，１３ 実施例　１３　（血清遊離コレステロール）実施例１２
０発色試液にＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　２．５　ｍＭ／　を濃度
になる占うに溶解したものを発色試液とする。

実施例１２の被検試液５０μｔをとり、これに発色試液
　、４加え、３７℃恒温槽中１０分間加温したのち、水
を対照さして、被検試液（Ｅ８）と試薬ブランク（ＥＢ
Ｌ）の吸光度を測定する。

第１４表に示す結果が得られ、本発明方法及び試薬に於
ける、ＥＤＴＡの添加効果が知られる。

第１４表 実施例　１４　（コレステロール） ニトロＴＢが２０Ｍ９／ｄｌ、第１５表のフェノール化
合物又はアミン化合物がｉ、０６　ｍＭ／　ｌ、還元型
グルタチオンが０．６　’５　ｍＭ／　ｌ、Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ−Ｆｅ（ＩＩＩ’）　’（ｒ　１　ｍｇ／ｄ１．、
コレステロールオキシダーゼがｌ　５　Ｕ／ｄ７１！、
ト　リ　ト　ン　Ｘ−１００が　ｏ、１　ｇ　／み、エ
マルゲン９２０が０．４．９　／　ｄｌの濃度になるよ
うに、０．１．Ｍｌ−リス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解
した発色試液と、コレステロール２００■ｋ、インプロ
パツールに溶解して１００　ｍｌとした被検試液を準備
する。

被検試液５０μｔに発色試液３．６ｍＪ２加え、３７℃
恒温槽中１０分間インキュベートし、夫々試薬ブランク
全対照として波長５６　（ｌ　ｎｍに於ける吸光度全測
定する。

第１５表に示す結果が得られ、本発明方法及び試薬に於
ける、フェノール類又はアミン類の添加第１５表 実施例　１５　（コレステロール） ニトロＴＢが２０ｍ９／ｄｌ、フェノールが１．０６ｍ
Ｍ　／　ｌ　Ｎ　第１６表のチオール化合物が０．６５
　ｍＭ／　ｔ、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　＠Ｆｅ（ｍ）が１　ｑ
）　／　ｄｌ　ｓ　コレステロールオキシダーゼが１５
Ｕ／ｄｇの濃度になるように、０．１Ｍトリス緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶解した発色試液と、コレステロール２
００ｍｇを、インプロパツールに溶解して１’００ｍ４
とした被検試液全準備する。

被検試液５０μｔと発色試液３．０コで、実施例１４と
同様に測定、第１６表に示す結果を得、チオール化合物
の添加効果が知られる□ 第１６表 手続補正書 昭和ケ２年　７月　７１日 １、事件の表示 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。

６、補正の内容 （１）明細書４頁５行目ＶＣ記載の１−駆逐」を１−駆
逐」と補正する。

（２）明細書ｌＯ頁１行目から同頁２行目にかけて記載
の「α、β、γ、δ−テトラフェニルボルフインドリス
ルホ／酸鉄錯体、」を削除する。

以上

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質にオキシダーセ全作用させて生成するスーパ
   ーオキサイドイオンを測定する、基質の定量方法に於て
   、オキシダーゼの酵素反応即ちスーパーオキサイドイオ
   ンの生成、及びスーパーオキサイドイオンの被還元性呈
   色試薬に対する還元反応を、ポルフィリンの鉄錯体又は
   コンブレキサンの鉄キレート、アミン類又はフェノール
   類（ナフトール類を含む。）及びＳＨ！ｔもつ化合物を
   以って促進することを特徴とする、オキシダーゼによる
   基質の新規定量法。
2. （２）　、ｔ　キシター　セの酵素反応即ちスーパー、
   １キサイドイオンの生成、及びスーパ・−オキサイドイ
   オンの被還元性呈色試薬に対する還″１元反応全、キレ
   ート剤を存在させて、安定に進行させる、特許請求の範
   囲第１項記載の定量法。
3. （３）　クルコース、コレステロール、グリセロール、
   グリセロール燐酸エステル、コリン、アシルＣＯＡ％ピ
   ルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸を基質とし、その
   基質に作用するオキシダーゼが夫々グルコースオキシダ
   ーゼ、コレステロールオギシダーゼ、グリセロールオキ
   シダーゼ、グリセロール燐酸エステルオキシダーゼ、コ
   リンオキシダーゼ、アシルＣＯＡオキシダーゼ、ピルビ
   ン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダー
   ゼ又は乳酸オキシダーゼ全組み合せて行われる、特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の定量法。
4. （４）オキシダーゼと、ポルフィリンの鉄錯体又はコン
   ブレキサンの鉄キレートと、アミン類又はフェノール類
   （ナフトール類を含む。）と、ＳＨ基をもつ化合物と、
   被還元性呈色試薬とを組み合せて成る、オキシダーゼに
   よる基質の新規定量用試薬。
5. （５）キレート剤をも組み合せて成る、特許請求の範囲
   第４項記載の定量用試薬。
6. （６）基質カグルコース、コレステロール、グリセロー
   ル、グリセロール燐酸エステル、コリン、アシルＣＯＡ
   ％　ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸である場合
   、オキシダーゼが、夫々、グルコースオキシダーゼ、コ
   レステロールオキシダーゼ、りＩＪセロールオキシダー
   ゼ、グリセロール燐ｅ−ｒ−ステルオキシダーゼ、コリ
   ンオキシダーゼ、アシルＣＯＡオキシダーゼ、ピルビン
   酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ
   又は乳酸オキシダーゼである、特許請求の範囲第４項又
   は第５項記載の定量用試薬。