JP2003319797A

JP2003319797A - 抱合型ビリルビン測定用組成物の安定化方法及び抱合型ビリルビン測定用組成物

Info

Publication number: JP2003319797A
Application number: JP2002131553A
Authority: JP
Inventors: Mamiko Hashimoto; 麻美子橋本; Akihiro Niizaki; 晃弘新崎
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 2002-05-07
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2003-11-11
Anticipated expiration: 2022-05-07
Also published as: JP4090266B2

Abstract

(57)【要約】【課題】抱合型ビリルビンのみを長期に渡り正確に分
別測定ができる抱合型ビリルビン測定用組成物を提供す
る。【解決手段】アルカリ金属のフッ化物塩および／また
はチオール基を有する化合物を共存させることを特徴と
するビリルビンオキシダーゼの反応を利用した抱合型ビ
リルビン測定用組成物に、ジエチレントリアミン五酢酸
を含有させることを特徴とする抱合型ビリルビン測定用
組成物の安定化方法およびビリルビンオキシダーゼの反
応を利用する抱合型ビリルビン測定用組成物において、
ジエチレントリアミン五酢酸を含有させることを特徴と
する抱合型ビリルビン測定用組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抱合型ビリルビン
測定用組成物の安定化方法および安定化された抱合型ビ
リルビン測定用組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンはテトラピロール類に属する
黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁
色素の主成分をなすものであることが知られている。血
清等の生体液中においてビリルビンは三種類の形態で主
に存在する。すなわち、抱合ビリルビン、非抱合ビリル
ビン及びデルタビリルビンの三種類に分類され、これら
の合計が総ビリルビンと称される。

【０００３】抱合ビリルビンは、ビリルビンが肝臓中で
グルクロン酸抱合を受けて生成したもので、グルクロン
酸1分子が結合したモノグルクロナイドビリルビン又は2
分子結合したジグルクロナイドビリルビンが存在する。
非抱合ビリルビンは上記の抱合作用を受けていないビリ
ルビンである。抱合及び非抱合ビリルビンは血清中では
アルブミンと比較的緩く結合した状態で存在する。ま
た、デルタビリルビンは肝・胆道疾患等で、肝細胞から
血中に逆流した抱合ビリルビンの一部が血中でアルブミ
ンと共有結合して生成されたものである。

【０００４】デルタビリルビンの半減期はアルブミンに
依存して、抱合ビリルビンと比較して極端に長く、肝・
胆道機能が正常化して抱合ビリルビンが正常値まで低下
した患者においてもデルタビリルビンは低下しない。こ
のような患者においては、デルタビリルビンとグルクロ
ン酸抱合ビリルビンが精密に分別定量されないと、誤っ
て異常と診断が下されることになる。したがって、抱合
ビリルビンとデルタビリルビンを精密に分別定量するこ
とは、臨床検査の現場において非常に重要である。

【０００５】従来ビリルビンの定量法としては、ジアゾ
試薬を用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを利用
する方法、バナジン酸イオン又は三価のマンガンイオン
等の酸化剤を利用する方法、及びビリルビンオキシダー
ゼ（BOD）等の酸化酵素を利用する方法等を挙げること
ができる。

【０００６】生体液中のビリルビンは、近年まで、ジア
ゾ法により反応促進剤の添加を必要としない直接ビリル
ビンと、それを必要とする間接ビリルビンに大別されて
いた。直接及び間接の呼称はジアゾ反応に対するビリル
ビンの反応性の違いによる命名であり、それぞれが血中
に存在する抱合及び非抱合ビリルビンに対応するもので
はなく、ジアゾ法で直接ビリルビンとして測定されるビ
リルビンには、抱合ビリルビン及びデルタビリルビンの
約８割程度とが含まれて〔クリニカル・ケミストリー
（Clinical Chemistry）第28巻、第629頁（1982年）〕
おり、さらに非抱合ビリルビンの一部も直接ビリルビン
として測り込まれている〔クリニカル・ケミストリー
（Clinical Chemistry）第31巻、第1560頁（1985
年）〕。ジアゾ反応を利用する代表的な試薬としては、
マロイ及びエヴェリン（Malloy & Evelyn）による試薬
〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry）、第119巻、第48
1頁（1937年）〕等がある。

【０００７】高速液体クロマトグラフィーによって分画
定量する方法には、逆相HPLCカラムを使用して各種ビリ
ルビンをリン酸緩衝液及びイソプロパノールのグラジェ
ントによって溶出、分析するラウフ（Lauff）らの方法
〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of
Chromatography）、第226巻、第391頁（1981年）〕等
がある。

【０００８】酸化剤を利用する方法は、酸化剤を作用さ
せることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン自体
のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前後の吸光度
変化量によりビリルビンを測定するものである。この場
合、反応条件を種々変えることにより、直接ビリルビン
を酸化させることができる。この方法において使用され
る試薬としては、例えばバナジン酸イオンを用いる試薬
〔臨床化学、第22巻、第116頁（1993年）〕があり、間
接ビリルビンの反応抑制剤、緩衝液等の選定によって、
直接ビリルビンに酸化剤が働く条件を設定した直接ビリ
ルビン測定用試薬が提案されている。このような直接ビ
リルビン測定用試薬としては、例えば酸化剤としてバナ
ジン酸イオン又は三価のマンガンイオンを用い、間接ビ
リルビンの反応抑制剤としてヒドラジン類、ヒドロキシ
ルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノ
ール類、水溶性高分子及びHLB値が15以上の非イオン性
界面活性剤からなる群より選ばれた1種以上の化合物を
使用して、直接ビリルビンを定量する試薬（特開平5-18
978号公報）がある。

【０００９】酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作
用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン
自体のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前後の吸
光度変化量よりビリルビンを測定するものである。この
場合も、反応条件を種々変えることにより直接ビリルビ
ンを酸化させることができると報告されている。この方
法において使用される試薬としては、例えばBODを用い
る試薬〔クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemist
ry）、第20巻、第783頁（1974年）〕、ラッカーゼ、チ
ロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化酵素
を用いる試薬（特公昭62-33880号公報）があり、pH、緩
衝液、界面活性剤の選定、酵素の特異性を向上させる化
合物の添加によって、直接ビリルビンにBODが働く条件
を設定した直接ビリルビン測定試薬が提案されている。

【００１０】このような直接ビリルビン測定試薬として
は、例えばpH3.5〜4.5の緩衝液中でBODを作用させて直
接ビリルビンを定量する試薬（特公昭61-44000号公
報）、pH2.0〜3.3のフェロシアン化カリウム及び／又は
フェリシアン化カリウムを含有する緩衝液中でBODを作
用させて直接ビリルビンを定量する試薬（特開平1-5499
号公報）等がある。また特開平9-37795号公報では、フ
ェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カ
リウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキ
シド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ば
れる１種または２種以上との熟成物の存在下にキレート
剤の１種または２種以上、好ましくは更に金属イオン類
の１種または２種以上を添加して直接ビリルビンを測定
する方法が提案されている。また、pH、緩衝液の選定に
よって、抱合ビリルビンのみにBODが働く条件を設定し
た直接ビリルビン測定用試薬も提案されている。このよ
うな直接ビリルビン測定用試薬としては、例えば陰イオ
ン性界面活性剤を含有するpH9〜11の範囲の緩衝液中でB
ODを作用させて抱合ビリルビンを定量する試薬（特公平
5-68240号公報）、陰イオン性界面活性剤を含有するpH5
〜6の酸性緩衝液中でBODを作用させて抱合ビリルビンを
定量する試薬（特公平5-9066号公報）がある。

【００１１】しかし特公平5-9066号公報記載のBODを利
用した直接型ビリルビン測定試薬は公知のジアゾ法と非
常に高い相関を示しており、抱合ビリルビンだけでな
く、一部のデルタビリルビン及び非抱合ビリルビンを含
む直接ビリルビンを測定していることは明確である。ま
た、特公平5-68240号公報の方法はBODの至適pH範囲を大
きく外れたpHで測定する必要があるため、抱合ビリルビ
ンに対する反応性が低いという問題がある。一方、アル
カリ金属のフッ化物塩および／またはチオール基を有す
る化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリルビ
ン測定試薬（特許第2846179号）はデルタビリルビン及
び非抱合ビリルビンへの反応が抑制されており、さらに
BODを至適pH付近で使用するため抱合型への反応性は高
く、非常に分別性に優れた試薬である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記の通り、特許第28
46179号のアルカリ金属のフッ化物塩および／またはチ
オール基を有する化合物を共存させることを特徴とする
直接型ビリルビン測定試薬は非常に分別性に優れた試薬
であるが、この測定試薬も作製後時間が経過するにつ
れ、徐々にデルタビリルビン及び非抱合ビリルビンの分
別能が低下していくという問題をはらんでいた。特に昨
今は、測定の際の利便性から調整の必要のない液状試薬
が求められており、液状で保存が必要となる場合は、更
に保存に伴う分別能の低下の問題が顕著となる。本発明
は、抱合型ビリルビンのみを長期に渡り正確に分別測定
ができる抱合型ビリルビン測定用組成物を提供すること
を目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の事
情を鑑み、従来の直接型ビリルビン測定試薬におけるこ
れらの問題点を解決するための検討を進めた結果、アル
カリ金属のフッ化物塩および／またはチオール基を有す
る化合物を共存させることを特徴とする抱合型ビリルビ
ン測定試薬にジエチレントリアミン五酢酸（以後、DTPA
と略する）を添加することにより、長期に渡りビリルビ
ン含有試料中のデルタビリルビン及び非抱合ビリルビン
にほとんど反応することなく、しかもその分別能を長期
にわたり持続させられることを見い出し、この発明を完
成するに至った。

【００１４】すなわち、本発明の第一は、アルカリ金属
のフッ化物塩および／またはチオール基を有する化合物
を共存させることを特徴とするビリルビンオキシダーゼ
の反応を利用した抱合型ビリルビン測定用組成物に、ジ
エチレントリアミン五酢酸を含有させることを特徴とす
る抱合型ビリルビン測定用組成物の安定化方法を要旨と
するものである。また、本発明の第二は、ビリルビンオ
キシダーゼおよびアルカリ金属のフッ化物塩および／ま
たはチオール基を有する化合物を含有する抱合型ビリル
ビン測定用組成物において、ジエチレントリアミン五酢
酸を含有することを特徴とする抱合型ビリルビン測定用
組成物を要旨とするものである。

【００１５】

【発明の実施の態様】この発明の抱合型ビリルビン測定
試薬は、DTPAを含む第1試薬と、使用時にこの第1試薬と
混合するBOD等を含む第2試薬とからなり、使用時にこれ
らの第1試薬と第2試薬とを混合して使用する形態のもの
でもよく、或いはまた、それぞれの試薬成分を凍結乾燥
試薬と液状試薬に分配しておき、使用時にこれらを混合
して使用する形態のものでも良い。DTPAは第1試薬、第2
試薬のいずれに添加してもよく、その必要量は0.001mM
〜20mM、好ましくは0.05mM〜5mMである。

【００１６】この試薬に用いるBODとしては、例えばミ
ロセシウム属またはトラキデルマ属に属する菌株から得
られる酵素が挙げられ、その必要量は0.001〜200単位/m
L、望ましくは0.005〜20単位/mLである。

【００１７】用いる緩衝液はpH8.0以下、望ましくは使
用する酵素の安定性、活性の面で有利となるpH4.5〜6.5
までの間に緩衝能をもつものであればよく、例えば、フ
タル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝
液、MES−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩
衝液の濃度は2〜500mM、好ましくは30〜300mMである。

【００１８】その他の成分として、p-トルエンスルホン
酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、界面活性剤、アラ
ニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポ
リエチレングリコール等のポリオール類、NaCl等の塩
類、アルブミン等のタンパク質等を適宜に添加すること
ができる。さらに、抱合ビリルビンと非抱合ビリルビン
との分別性をより完全にするためにテトラピロール化合
物を添加することも有用である。また、その他の試薬
類、例えば防腐剤等は、公知の化学的酸化法やBOD法等
において使用される例えばパラベン等の防腐剤から必要
に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用
濃度や測定試薬のpH等も公知の方法において採用されて
いる測定試薬のそれに準じて適宜設定することができ
る。

【００１９】また、この発明においては、前記成分を適
宜選択して常法により混合することにより、抱合ビリル
ビンと非抱合ビリルビンとの分別能の優れた直接型ビリ
ルビン測定用組成物を得ることができる。好ましい具体
例としては、例えば第1試薬はpH4.5〜6.5に調整された
フタル酸緩衝液10〜200mM、p-トルエンスルホン酸1〜10
0mM、ヒト血清アルブミン0.001〜1%、フッ化ナトリウム
0.05〜200mM、N-アセチルシステイン0.02〜10mM、DTPA
0.05〜5mMを含み、第2試薬はトラキデルマ属の菌株由来
のBOD 0.001〜100単位/mL、及びpH5〜6に調整されたフ
タル酸緩衝液10〜200mMを含むことができる。

【００２０】本発明の抱合型ビリルビン測定用組成物を
用いて抱合ビリルビンを測定するための具体例は以下の
通りである。まず、前述のDTPA、非イオン性界面活性剤
等を含む第1試薬に各種ビリルビンを含む検体（血清、
血漿、尿等の生体液等）を適量加え溶液とし、分光光度
計のセル室内にて予備加温後、この溶液の特定波長（46
0 nm付近）における吸光度を測定する（吸光度1）。こ
れにBODを含む第2試薬を添加し、1〜10分間反応させて
抱合ビリルビンのみを酸化させた後、460nm付近におけ
る吸光度を再度測定する（吸光度2）。得られた吸光度1
及び吸光度2の値に液量補正値等を乗ずる等した後、上
記の特定波長における吸光度変化量（A）を求める。

【００２１】次に、既知濃度のジタウロビリルビンを含
む標準物質を同様に測定し、吸光度変化量（B）を求め
る。この吸光度変化量（B）から作成した検量線に上記
の吸光度変化量（A）を当てはめることによって試料中
の抱合ビリルビン量を測定することができる。また、吸
光度変化量（A）及び（B）から、次式により検体中の抱
合ビリルビン含量を求めることができる。

【００２２】検体中の抱合ビリルビン濃度（mg/dL）＝A
/B×標準物質中のジタウロビリルビン濃度（mg/dL）

【００２３】なお、測定波長は460nmに限定されるもの
ではなく、400〜480nmの任意の波長を選ぶことができ
る。また第1、第2試薬、検体の液量は適宜変化させるこ
とができる。反応は通常の条件下で行い、例えば、反応
温度は20〜45℃、好ましくは30〜40℃、反応時間は1〜3
0分、好ましくは3〜15分である。

【００２４】

【実施例】以下に、実施例及び比較例を挙げ、本発明を
更に具体的に説明するが、本発明はこれらによってなん
ら限定されるものではない。実施例１ pH5.5のフタル酸緩衝液120mM、p-トルエンスルホン酸50
mM、ヒト血清アルブミン0.005%、フッ化ナトリウム2.5m
M及びN-アセチルシステイン2.5mM、DTPA 0.1mMからなる
試薬１、BOD 12単位/mL及びpH5.5のフタル酸緩衝液120m
Mからなる試薬２を調製した。

【００２５】実施例２ pH5.5のフタル酸緩衝液120mM、p-トルエンスルホン酸50
mM、ヒト血清アルブミン0.005%、フッ化ナトリウム2.5m
M及びN-アセチルシステイン2.5mM、DTPA 0.5mMからなる
試薬３を調製した。

【００２６】比較例１ pH5.5のフタル酸緩衝液120mM、p-トルエンスルホン酸50
mM、ヒト血清アルブミン0.005%、フッ化ナトリウム2.5m
M及びN-アセチルシステイン2.5mM、エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）2Na 0.1mMからなる試薬４を調製した。

【００２７】実施例３〔安定化の評価〕検体はヒト血清１、ヒト血清２、ヒト血清３、ヒト血清
４、ヒト血清５、合成デルタビリルビン（5mg/dL）、非
抱合ビリルビン（1mg/dL）を使用した。ヒト血清は、表
1の通り総ビリルビンのうち16%〜55%のデルタビリルビ
ン、5%〜60%の非抱合ビリルビンが含まれていることをH
PLC分析により確認している。HPLC分析は、ラウフ（Lau
ff）らの方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー
（Journalof Chromatography）、第226巻、第391頁（19
81年）〕に準拠して行った。合成デルタビリルビンは
「医学検査」43巻7号1253(93)〜1255(95)「デルタビリ
ルビンの抽出とその化学的合成法」に従って作製した。

【００２８】

【表１】

【００２９】実施例１または実施例２、または比較例１
において0.28mLの試薬１または試薬３、または試薬４と
14μLの各検体を混合し37℃で５分間加温後、0.07mLの
試薬２を添加して37℃で5分間反応させた。この際の450
nmにおける吸光度変化を記録した。検体の代わりに既知
濃度のジタウロビリルビンを含む標準物質を同様に操作
し、得られた吸光度変化量から検体中の直接型ビリルビ
ン濃度を求めた。なお、以上の操作は日立7070型自動分
析装置で行った。

【００３０】また実施例１および実施例２、および比較
例１において、試薬１〜４を25℃でそれぞれ2週間、4週
間保存し、同様に操作して各検体中の直接型ビリルビン
濃度を測定した。その結果、表２に示す通り、いずれの
検体においても実施例１および実施例２では測定値の経
時的上昇が見られなかったのに対し、比較例１では測定
値の経時的上昇が見られた。合成デルタビリルビンで特
にその違いが顕著であることから、ヒト検体においても
含有されるデルタビリルビンとの交差反応性の違いが、
測定値の経時的上昇の有無に大きく関与していると考え
られる。

【００３１】

【表２】

【００３２】次に実施例１および実施例２、および比較
例１において、試薬１〜４を10℃でそれぞれ2ヶ月、9ヶ
月保存し、同様に操作して各検体中の直接型ビリルビン
濃度を測定した。その結果、表３に示す通り、いずれの
検体においても実施例１および実施例２では測定値の経
時的上昇が見られなかったのに対し、比較例１では測定
値の経時的上昇が見られた。表１の結果と同じく、含有
されるデルタビリルビンとの交差反応性の違いが、測定
値の経時的上昇の有無に大きく関与していると考えられ
る。

【００３３】

【表３】

【００３４】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、閉
塞性黄疸等の患者の生体液中において顕著に増大するこ
とが知られている抱合型ビリルビンのみを長期に渡り正
確に分別測定することができ、臨床検査その他において
有用性の高い抱合型ビリルビン測定試薬が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリ金属のフッ化物塩および／また
はチオール基を有する化合物を共存させることを特徴と
するビリルビンオキシダーゼの反応を利用した抱合型ビ
リルビン測定用組成物に、ジエチレントリアミン五酢酸
を含有させることを特徴とする抱合型ビリルビン測定用
組成物の安定化方法。
【請求項２】ビリルビンオキシダーゼおよびアルカリ
金属のフッ化物塩および／またはチオール基を有する化
合物を含有する抱合型ビリルビン測定用組成物におい
て、ジエチレントリアミン五酢酸を含有することを特徴
とする抱合型ビリルビン測定用組成物。