JPH07231795A - 直接型ビリルビン測定用試薬 - Google Patents
直接型ビリルビン測定用試薬Info
- Publication number
- JPH07231795A JPH07231795A JP6264197A JP26419794A JPH07231795A JP H07231795 A JPH07231795 A JP H07231795A JP 6264197 A JP6264197 A JP 6264197A JP 26419794 A JP26419794 A JP 26419794A JP H07231795 A JPH07231795 A JP H07231795A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- bilirubin
- direct
- sample
- absorbance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/145555—Hetero-N
- Y10T436/146666—Bile pigment
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ビリルビンオキシダーゼ、酸化剤またはジア
ゾニウム塩を反応させて直接型ビリルビンの変化を光学
的に測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダ
ーゼ、酸化剤またはジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させる。 【効果】 閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕
著に増大することが知られている直接型ビリルビンを間
接型ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨
床検査その他において有用である。
ゾニウム塩を反応させて直接型ビリルビンの変化を光学
的に測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダ
ーゼ、酸化剤またはジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させる。 【効果】 閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕
著に増大することが知られている直接型ビリルビンを間
接型ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨
床検査その他において有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、生体液中の直接型ビ
リルビンの測定用試薬に関するものである。
リルビンの測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ビリルビンはテトラピロール類に属する
黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁
中にもっとも多く存在することが知られている。また、
生体液中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリ
ルビンとに大別される。溶血性貧血、溶血性黄疸などの
病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸など
の病態では直接型ビリルビン量が増大することから、こ
れらビリルビンの分別定量は臨床診断などにおいて重要
な位置を占めている。実際、従来より臨床検査などで測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接型ビリルビン
であり、直接型ビリルビンの正確な定量は臨床検査など
においては不可欠になっている。
黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁
中にもっとも多く存在することが知られている。また、
生体液中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリ
ルビンとに大別される。溶血性貧血、溶血性黄疸などの
病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸など
の病態では直接型ビリルビン量が増大することから、こ
れらビリルビンの分別定量は臨床診断などにおいて重要
な位置を占めている。実際、従来より臨床検査などで測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接型ビリルビン
であり、直接型ビリルビンの正確な定量は臨床検査など
においては不可欠になっている。
【０００３】直接型ビリルビンのみを定量しうるものと
しては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなど
の酸化酵素を利用する方法、バナジン酸イオンまたは三
価のマンガンイオン等の酸化剤を利用する方法などが挙
げられる。このうちジアゾ試薬を用いる方法について
は、使用するジアゾ化反応促進剤の種類と、生成するア
ゾビリルビンの定量方法の違いにより、種々のものが報
告されている。例えば、代表的なものとしては、マロイ
およびエヴェリン(Malloy &Evelyn) による試薬〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal
of Biological Chemistry) 、第１１９巻、第４８１頁
（１９３７年）〕などがある。
しては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなど
の酸化酵素を利用する方法、バナジン酸イオンまたは三
価のマンガンイオン等の酸化剤を利用する方法などが挙
げられる。このうちジアゾ試薬を用いる方法について
は、使用するジアゾ化反応促進剤の種類と、生成するア
ゾビリルビンの定量方法の違いにより、種々のものが報
告されている。例えば、代表的なものとしては、マロイ
およびエヴェリン(Malloy &Evelyn) による試薬〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal
of Biological Chemistry) 、第１１９巻、第４８１頁
（１９３７年）〕などがある。
【０００４】高速液体クロマトグラフィーによって分画
定量する方法には、逆相ＨＰＬＣカラムを使用して各種
ビリルビンをリン酸緩衝液およびイソプロパノールのグ
ラジエントによって溶出、分析するラウフ(Lauff) らの
方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(Journal
of Chromatography) 、第２２６巻、第３９１頁（１９
８１年）〕などがある。
定量する方法には、逆相ＨＰＬＣカラムを使用して各種
ビリルビンをリン酸緩衝液およびイソプロパノールのグ
ラジエントによって溶出、分析するラウフ(Lauff) らの
方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(Journal
of Chromatography) 、第２２６巻、第３９１頁（１９
８１年）〕などがある。
【０００５】酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作
用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン
自体のもつ４５０ｎｍ付近の黄色を消失させ、反応前後
の吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。
この場合、反応条件を種々変えることにより、直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化させることができる。この
方法において使用される試薬としては、例えばビリルビ
ンオキシダーゼを用いる試薬〔クリニカル・ケミストリ
ー(Clinical Chemistry)、第２０巻、第７８３頁（１９
７４年）〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いる試薬（特公昭６
２−３３８８０号公報）がある。さらに、ｐＨ、緩衝
液、界面活性剤の選定によって、直接型ビリルビンのみ
にビリルビンオキシダーゼが働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定用試薬も提案されている。このような
直接型ビリルビン測定用試薬としては、例えばｐＨ９〜
１１の範囲の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用
させて直接型ビリルビンを定量する試薬（特公平５−６
８２４０号公報）、陰イオン性界面活性剤を含有するｐ
Ｈ５〜６の酸性緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作
用させて直接型ビリルビンを定量する試薬（特公平５−
９０６６号公報）、ｐＨ３．５〜４．５の緩衝液中でビ
リルビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを
定量する試薬（特公昭６１−４４０００号公報）、ｐＨ
２．０〜３．３のフェロシアン化カリウムおよび／また
はフェリシアン化カリウムを含有する緩衝液中でビリル
ビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを定量
する試薬（特開平１−５４９９号公報）などがある。
用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン
自体のもつ４５０ｎｍ付近の黄色を消失させ、反応前後
の吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。
この場合、反応条件を種々変えることにより、直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化させることができる。この
方法において使用される試薬としては、例えばビリルビ
ンオキシダーゼを用いる試薬〔クリニカル・ケミストリ
ー(Clinical Chemistry)、第２０巻、第７８３頁（１９
７４年）〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いる試薬（特公昭６
２−３３８８０号公報）がある。さらに、ｐＨ、緩衝
液、界面活性剤の選定によって、直接型ビリルビンのみ
にビリルビンオキシダーゼが働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定用試薬も提案されている。このような
直接型ビリルビン測定用試薬としては、例えばｐＨ９〜
１１の範囲の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用
させて直接型ビリルビンを定量する試薬（特公平５−６
８２４０号公報）、陰イオン性界面活性剤を含有するｐ
Ｈ５〜６の酸性緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作
用させて直接型ビリルビンを定量する試薬（特公平５−
９０６６号公報）、ｐＨ３．５〜４．５の緩衝液中でビ
リルビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを
定量する試薬（特公昭６１−４４０００号公報）、ｐＨ
２．０〜３．３のフェロシアン化カリウムおよび／また
はフェリシアン化カリウムを含有する緩衝液中でビリル
ビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを定量
する試薬（特開平１−５４９９号公報）などがある。
【０００６】また、酸化剤を利用する方法は、酸化剤を
作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビ
ン自体のもつ４５０ｎｍ付近の黄色を消失させ、反応前
後の吸光度変化量によりビリルビンを測定するものであ
る。この場合も、反応条件を種々変えることにより、直
接型ビリルビンのみを特異的に酸化させることができ
る。この方法において使用される試薬としては、例えば
バナジン酸イオンを用いる試薬〔臨床化学、第２２巻、
第１１６頁（１９９３年）〕がある。さらに、間接型ビ
リルビンの反応抑制剤、緩衝液等の選定によって、直接
型ビリルビンのみに酸化剤が働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定試薬も提案されている。このような直
接型ビリルビン測定試薬としては、例えば酸化剤として
バナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオンを用い、
間接型ビリルビンの反応抑制剤としてヒドラジン類、ヒ
ドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン
類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢ値が１５
以上の非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれた１
種以上の化合物を使用して、直接型ビリルビンを定量す
る試薬（特開平５−１８９７８号公報）がある。
作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビ
ン自体のもつ４５０ｎｍ付近の黄色を消失させ、反応前
後の吸光度変化量によりビリルビンを測定するものであ
る。この場合も、反応条件を種々変えることにより、直
接型ビリルビンのみを特異的に酸化させることができ
る。この方法において使用される試薬としては、例えば
バナジン酸イオンを用いる試薬〔臨床化学、第２２巻、
第１１６頁（１９９３年）〕がある。さらに、間接型ビ
リルビンの反応抑制剤、緩衝液等の選定によって、直接
型ビリルビンのみに酸化剤が働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定試薬も提案されている。このような直
接型ビリルビン測定試薬としては、例えば酸化剤として
バナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオンを用い、
間接型ビリルビンの反応抑制剤としてヒドラジン類、ヒ
ドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン
類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢ値が１５
以上の非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれた１
種以上の化合物を使用して、直接型ビリルビンを定量す
る試薬（特開平５−１８９７８号公報）がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、高速液
体クロマトグラフィーによって直接型ビリルビンを分画
定量する従来の方法は、十分な分別性を有しているが、
高価で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこ
と、一度に多数検体を処理できないなどの問題がある。
体クロマトグラフィーによって直接型ビリルビンを分画
定量する従来の方法は、十分な分別性を有しているが、
高価で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこ
と、一度に多数検体を処理できないなどの問題がある。
【０００８】一方、ビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵
素を作用させて直接型ビリルビンを定量する方法は、光
学的測定という特長を有し、簡便かつ比較的精度の高い
方法であるが、ビリルビンの分別性が十分でないために
直接型ビリルビンに対する反応が完全でなく、あるい
は、直接型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビ
ンにも反応してしまうという問題がある。また、この試
薬はビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨ範囲外のｐＨで
測定を行わなければならないため、必然的に大量の酵素
が必要となり測定に要する費用が高くなるという問題点
もある。そこで、この発明の発明者らはフッ素化合物お
よび／または還元剤を含有させて直接型ビリルビンへの
特異性を向上させた、至適ｐＨ範囲内のｐＨで測定する
ことができる直接型ビリルビン測定試薬を提案している
（特開平５−２７６９９２号公報）。ただし、この試薬
の場合にも、ビリルビンの分別性は完全とはいえない。
素を作用させて直接型ビリルビンを定量する方法は、光
学的測定という特長を有し、簡便かつ比較的精度の高い
方法であるが、ビリルビンの分別性が十分でないために
直接型ビリルビンに対する反応が完全でなく、あるい
は、直接型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビ
ンにも反応してしまうという問題がある。また、この試
薬はビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨ範囲外のｐＨで
測定を行わなければならないため、必然的に大量の酵素
が必要となり測定に要する費用が高くなるという問題点
もある。そこで、この発明の発明者らはフッ素化合物お
よび／または還元剤を含有させて直接型ビリルビンへの
特異性を向上させた、至適ｐＨ範囲内のｐＨで測定する
ことができる直接型ビリルビン測定試薬を提案している
（特開平５−２７６９９２号公報）。ただし、この試薬
の場合にも、ビリルビンの分別性は完全とはいえない。
【０００９】また、酸化剤としてバナジン酸イオンまた
は三価のマンガンイオンを利用した試薬による測定法
は、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類
などの間接型ビリルビン反応抑制剤を添加しても、直接
型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビンにも反
応してしまい、分別定量が不十分であるという問題を有
している。
は三価のマンガンイオンを利用した試薬による測定法
は、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類
などの間接型ビリルビン反応抑制剤を添加しても、直接
型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビンにも反
応してしまい、分別定量が不十分であるという問題を有
している。
【００１０】さらに、ジアゾ試薬を用いる方法は、ジア
ゾ化反応の反応促進剤を含有するか否かによって直接型
ビリルビンと間接型ビリルビンを分別測定しているが、
その分別性は、酸化酵素や酸化剤を利用した試薬による
測定法と同様に、実際上不十分であるという問題があ
る。特にこの分別性の不十分さは、アルブミン含量の低
い検体あるいはサリチル酸などの薬剤を含む検体につい
て顕著である。
ゾ化反応の反応促進剤を含有するか否かによって直接型
ビリルビンと間接型ビリルビンを分別測定しているが、
その分別性は、酸化酵素や酸化剤を利用した試薬による
測定法と同様に、実際上不十分であるという問題があ
る。特にこの分別性の不十分さは、アルブミン含量の低
い検体あるいはサリチル酸などの薬剤を含む検体につい
て顕著である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】この発明の発明者は、以
上の通りの事情に鑑みて、従来の直接型ビリルビン測定
用試薬におけるこれらの問題点を解決するための検討を
進めた結果、ビリルビンオキシダーゼによって直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化する直接型ビリルビン測定
用試薬、酸化剤によって直接型ビリルビンのみを特異的
に酸化する直接型ビリルビン測定用試薬、およびジアゾ
ニウム塩を作用させて直接型ビリルビンをアゾビリルビ
ンに変化させる直接型ビリルビン測定用試薬において、
テトラピロール環化合物を共存させることにより、ビリ
ルビン含有試料中の間接型ビリルビンに反応することな
く、直接型ビリルビンを精度良く測定できることを見い
出し、この発明を完成するに至った。
上の通りの事情に鑑みて、従来の直接型ビリルビン測定
用試薬におけるこれらの問題点を解決するための検討を
進めた結果、ビリルビンオキシダーゼによって直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化する直接型ビリルビン測定
用試薬、酸化剤によって直接型ビリルビンのみを特異的
に酸化する直接型ビリルビン測定用試薬、およびジアゾ
ニウム塩を作用させて直接型ビリルビンをアゾビリルビ
ンに変化させる直接型ビリルビン測定用試薬において、
テトラピロール環化合物を共存させることにより、ビリ
ルビン含有試料中の間接型ビリルビンに反応することな
く、直接型ビリルビンを精度良く測定できることを見い
出し、この発明を完成するに至った。
【００１２】すなわち、この発明は、ビリルビンオキシ
ダーゼを反応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に
測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダーゼ
とともに、テトラピロール環化合物を共存させることを
特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬（請求項１）を
提供する。また、この発明は、酸化剤を反応させて直接
型ビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬であ
って、酸化剤とともに、テトラピロール環化合物を共存
させることを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬
（請求項２）を提供する。
ダーゼを反応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に
測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダーゼ
とともに、テトラピロール環化合物を共存させることを
特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬（請求項１）を
提供する。また、この発明は、酸化剤を反応させて直接
型ビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬であ
って、酸化剤とともに、テトラピロール環化合物を共存
させることを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬
（請求項２）を提供する。
【００１３】さらに、この発明は、ジアゾニウム塩を反
応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に測定するた
めの試薬であって、ジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビ
リルビン測定用試薬（請求項３）をも提供する。この発
明の直接型ビリルビン測定用試薬は、テトラピロール環
を有する化合物を含む緩衝液（第１試薬）と、使用時に
この第１試薬と混合する第２試薬とからなる２試薬系の
ものでもよく、あるいはまた、全ての組成を予め混合し
た１試薬系であってもよい。２試薬系とした場合の第２
試薬は、請求項１の測定用試薬においてはビリルビンオ
キシダーゼを含む試薬、請求項２の測定用試薬において
は酸化剤を含む試薬、そして、請求項３の測定用試薬に
おいてはジアゾニウム塩を含む試薬である。
応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に測定するた
めの試薬であって、ジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビ
リルビン測定用試薬（請求項３）をも提供する。この発
明の直接型ビリルビン測定用試薬は、テトラピロール環
を有する化合物を含む緩衝液（第１試薬）と、使用時に
この第１試薬と混合する第２試薬とからなる２試薬系の
ものでもよく、あるいはまた、全ての組成を予め混合し
た１試薬系であってもよい。２試薬系とした場合の第２
試薬は、請求項１の測定用試薬においてはビリルビンオ
キシダーゼを含む試薬、請求項２の測定用試薬において
は酸化剤を含む試薬、そして、請求項３の測定用試薬に
おいてはジアゾニウム塩を含む試薬である。
【００１４】テトラピロール環化合物には、その種類に
特に限定はないが、例えば、ビリルビン、ビリベルジ
ン、ウロビリノーゲンなどを単独でまたは組合せて支障
なく使用できるが、なかでもビリルビンを使用すること
が好ましい。その濃度は０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌ、好ましくは０．４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍ
ｌである。テトラピロール環化合物の濃度が前記範囲の
下限未満であると、直接型ビリルビンを酸化する際に間
接型ビリルビンまでも酸化されてしまい、好ましくな
い。 この発明の請求項１の測定用試薬に使用するビリ
ルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属
またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が
挙げられ、その必要量は０．００１〜２００単位／ｍ
ｌ、好ましくは０．００５〜２０単位／ｍｌである。
特に限定はないが、例えば、ビリルビン、ビリベルジ
ン、ウロビリノーゲンなどを単独でまたは組合せて支障
なく使用できるが、なかでもビリルビンを使用すること
が好ましい。その濃度は０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌ、好ましくは０．４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍ
ｌである。テトラピロール環化合物の濃度が前記範囲の
下限未満であると、直接型ビリルビンを酸化する際に間
接型ビリルビンまでも酸化されてしまい、好ましくな
い。 この発明の請求項１の測定用試薬に使用するビリ
ルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属
またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が
挙げられ、その必要量は０．００１〜２００単位／ｍ
ｌ、好ましくは０．００５〜２０単位／ｍｌである。
【００１５】用いる緩衝液はｐＨ６．５以下、望ましく
は使用する酵素の安定性、活性の面で有利となるｐＨ
３．０〜６．５までの間に緩衝能を持つものであれば良
く、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リン
ゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナ
トリウム緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は２０
〜５００ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭである。
は使用する酵素の安定性、活性の面で有利となるｐＨ
３．０〜６．５までの間に緩衝能を持つものであれば良
く、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リン
ゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナ
トリウム緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は２０
〜５００ｍＭ、好ましくは３０〜３００ｍＭである。
【００１６】その他の成分として、ｐ−トルエンスルホ
ン酸、安息香酸などの芳香族カルボン酸、界面活性剤、
アラニン、セリンなどのアミノ酸、マンニトールなどの
糖類、ポリエチレングリコールなどのポリオール類、Ｎ
ａＣｌなどの塩類、アルブミンなどの蛋白質などを適宜
に添加することができる。この発明の請求項２の測定用
試薬に酸化剤として用いるバナジン酸イオンとしては、
その種類に特段の制限はないが、好ましい具体例として
は例えばＶＯ3 -、ＶＯ4 3- 等の五価のバナジウムを含
むものが挙げられる。実際にこれを試薬中に添加する場
合には、バナジン酸そのものを用いてもよいが、例えば
リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属類の
塩やアンモニウム塩などの塩の形にして用いたほうが溶
解性等の点においてより好ましい。
ン酸、安息香酸などの芳香族カルボン酸、界面活性剤、
アラニン、セリンなどのアミノ酸、マンニトールなどの
糖類、ポリエチレングリコールなどのポリオール類、Ｎ
ａＣｌなどの塩類、アルブミンなどの蛋白質などを適宜
に添加することができる。この発明の請求項２の測定用
試薬に酸化剤として用いるバナジン酸イオンとしては、
その種類に特段の制限はないが、好ましい具体例として
は例えばＶＯ3 -、ＶＯ4 3- 等の五価のバナジウムを含
むものが挙げられる。実際にこれを試薬中に添加する場
合には、バナジン酸そのものを用いてもよいが、例えば
リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属類の
塩やアンモニウム塩などの塩の形にして用いたほうが溶
解性等の点においてより好ましい。
【００１７】また、この発明の請求項２の測定用試薬に
酸化剤として用いる三価のマンガンイオンとしては、酢
酸マンガン（III)等の通常の三価のマンガン塩だけでな
く、例えばアセチルアセトン、エチレンジアミン四酢酸
等のキレート剤とキレートを形成しているものを使用す
ることができる。バナジン酸イオンおよびマンガンイオ
ンの使用濃度としては、試料中のビリルビンを酸化する
ことのできる濃度であれば特に限定されるものではない
が、通常は０．１〜５０μｇイオン／ｍｌ、好ましくは
０．５〜１０μｇイオン／ｍｌの範囲とすることができ
る。
酸化剤として用いる三価のマンガンイオンとしては、酢
酸マンガン（III)等の通常の三価のマンガン塩だけでな
く、例えばアセチルアセトン、エチレンジアミン四酢酸
等のキレート剤とキレートを形成しているものを使用す
ることができる。バナジン酸イオンおよびマンガンイオ
ンの使用濃度としては、試料中のビリルビンを酸化する
ことのできる濃度であれば特に限定されるものではない
が、通常は０．１〜５０μｇイオン／ｍｌ、好ましくは
０．５〜１０μｇイオン／ｍｌの範囲とすることができ
る。
【００１８】この発明の請求項２の測定用試薬において
は、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン
類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価ア
ミン類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢ値が
１５以上の非イオン性界面活性剤等を用いることができ
る。これらの反応抑制剤の種類については、直接型ビリ
ルビンの測定に影響を及ぼさないものであれば特に制限
なく使用することができるが、それぞれについて好まし
い具体例を挙げれば以下のとおりである。すなわち、ヒ
ドラジン類としては、例えばヒドラジン、フェニルヒド
ラジンまたはこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩等）；ヒ
ドロキシルアミン類としては、例えばヒドロキシルアミ
ン、フェニルヒドロキシルアミンまたはこれらの鉱酸塩
（塩酸塩、硫酸塩等）；オキシム類としては、例えばア
セトキシム、ジアセチルモノオキシム、サリチルアルド
キシム等；脂肪族多価アミン類としては、例えばテトラ
エチレンペンタミン、ヘキサメチレンテトラミン、トリ
エチレンテトラミン等；フェノール類としては、例えば
フェノール、ｐ−クロルフェノール、ｐ−アセトアミド
フェノール、４−クロル−１−ナフトール、β−ナフト
ール等；水溶性高分子としては、例えばポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン等；そして、ＨＬＢ値が
１５以上の非イオン性界面活性剤等としては、例えばエ
マルゲン−１２３ｐ（ポリオキシエチレンラウリルエー
テル、花王（株）社商品名）、エマルゲン−９５０（ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王（株）
社商品名）、エマルゲン−９８５（ポリオキシエチレン
ノニルフェニルエーテル、花王（株）社商品名）、トリ
トンＸ−４０５（ポリオキシエチレンイソオクチルフェ
ニルエーテル、ロームアンドハース社商品名）等であ
る。これらの反応抑制剤は、単独でも間接型ビリルビン
の酸化抑制作用を有しているが、２種以上を組み合わせ
ることにより効果が高まることもあるので、状況に合わ
せて適宜選択して使用することができる。また、これら
反応抑制剤の使用濃度は、試料中の間接型ビリルビンの
酸化を抑制することのできる濃度であれば特に限定され
ることはなく、また使用する抑制剤の種類によっても異
なるが、通常は、０．０１〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲と
すればよい。
は、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン
類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価ア
ミン類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢ値が
１５以上の非イオン性界面活性剤等を用いることができ
る。これらの反応抑制剤の種類については、直接型ビリ
ルビンの測定に影響を及ぼさないものであれば特に制限
なく使用することができるが、それぞれについて好まし
い具体例を挙げれば以下のとおりである。すなわち、ヒ
ドラジン類としては、例えばヒドラジン、フェニルヒド
ラジンまたはこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩等）；ヒ
ドロキシルアミン類としては、例えばヒドロキシルアミ
ン、フェニルヒドロキシルアミンまたはこれらの鉱酸塩
（塩酸塩、硫酸塩等）；オキシム類としては、例えばア
セトキシム、ジアセチルモノオキシム、サリチルアルド
キシム等；脂肪族多価アミン類としては、例えばテトラ
エチレンペンタミン、ヘキサメチレンテトラミン、トリ
エチレンテトラミン等；フェノール類としては、例えば
フェノール、ｐ−クロルフェノール、ｐ−アセトアミド
フェノール、４−クロル−１−ナフトール、β−ナフト
ール等；水溶性高分子としては、例えばポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン等；そして、ＨＬＢ値が
１５以上の非イオン性界面活性剤等としては、例えばエ
マルゲン−１２３ｐ（ポリオキシエチレンラウリルエー
テル、花王（株）社商品名）、エマルゲン−９５０（ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王（株）
社商品名）、エマルゲン−９８５（ポリオキシエチレン
ノニルフェニルエーテル、花王（株）社商品名）、トリ
トンＸ−４０５（ポリオキシエチレンイソオクチルフェ
ニルエーテル、ロームアンドハース社商品名）等であ
る。これらの反応抑制剤は、単独でも間接型ビリルビン
の酸化抑制作用を有しているが、２種以上を組み合わせ
ることにより効果が高まることもあるので、状況に合わ
せて適宜選択して使用することができる。また、これら
反応抑制剤の使用濃度は、試料中の間接型ビリルビンの
酸化を抑制することのできる濃度であれば特に限定され
ることはなく、また使用する抑制剤の種類によっても異
なるが、通常は、０．０１〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲と
すればよい。
【００１９】さらに、この発明の請求項２の測定用試薬
においては、その測定試液中にキレート剤を共存させる
と、試薬盲検値が低下して分析精度が向上し、試液の安
定化が図れるとともに、ビリルビンの酸化反応が促進さ
れる。このような目的で使用するキレート剤の好ましい
具体例としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シクロヘキサンジ
アミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五
酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン
三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、トリエチレンテトライミン
六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸
（ＨＩＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホス
ホン酸、あるいはこれらのアルカリ金属塩（例えばリチ
ウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等）やアンモニウム
塩等を挙げることができる。これらキレート剤の使用濃
度は、ビリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に
限定されないが、通常は、０．０２〜６５ｍＭ、好まし
くは１〜４０ｍＭ、さらに好ましくは１〜２５ｍＭの範
囲とすればよい。
においては、その測定試液中にキレート剤を共存させる
と、試薬盲検値が低下して分析精度が向上し、試液の安
定化が図れるとともに、ビリルビンの酸化反応が促進さ
れる。このような目的で使用するキレート剤の好ましい
具体例としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シクロヘキサンジ
アミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五
酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン
三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、トリエチレンテトライミン
六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸
（ＨＩＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホス
ホン酸、あるいはこれらのアルカリ金属塩（例えばリチ
ウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等）やアンモニウム
塩等を挙げることができる。これらキレート剤の使用濃
度は、ビリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に
限定されないが、通常は、０．０２〜６５ｍＭ、好まし
くは１〜４０ｍＭ、さらに好ましくは１〜２５ｍＭの範
囲とすればよい。
【００２０】次に、この発明の請求項３の測定用試薬に
用いるジアゾ試薬としては、従来法において用いられる
公知のジアゾ試薬、例えば特開昭５６−１２５５５号公
報に開示されている非安定化ジアゾ試薬（スルファニル
酸、ｏ−ジアニシジン、ｐ−クロロアニリン、１，５−
ジクロロアニリン、２，４−ジクロロアニリン、２−メ
トキシ−４−ニトロアニリン、１−アミノアントラキノ
ン、２−ニトロアニリンおよび４−クロロメチルアニリ
ンのジアゾ化誘導体）および安定化ジアゾ試薬（上記非
安定化ジアゾ試薬の四フッ化ホウ酸塩、１，５−ナフタ
レンジスルホン酸塩および塩化亜鉛塩）が使用可能であ
るが、特に、２，４−ジクロルフェニルジアゾニウム−
１，５−ナフタレンジスルホン酸およびその塩類（例え
ばナトリウム塩、カリウム塩等）、ｐ−スルファニルベ
ンゼンジアゾニウム−１，５−ナフタリンスルホン酸お
よびその塩類、パラニトロベンゼンジアゾニウム四フッ
化ホウ酸およびその塩類、ジアゾ化スルファニル酸四フ
ッ化ホウ酸およびその塩類等の安定化ジアゾニウム塩
は、測定操作が簡便となるため、この発明の請求項３の
測定用試薬の用いるジアゾ試薬として有効である。
用いるジアゾ試薬としては、従来法において用いられる
公知のジアゾ試薬、例えば特開昭５６−１２５５５号公
報に開示されている非安定化ジアゾ試薬（スルファニル
酸、ｏ−ジアニシジン、ｐ−クロロアニリン、１，５−
ジクロロアニリン、２，４−ジクロロアニリン、２−メ
トキシ−４−ニトロアニリン、１−アミノアントラキノ
ン、２−ニトロアニリンおよび４−クロロメチルアニリ
ンのジアゾ化誘導体）および安定化ジアゾ試薬（上記非
安定化ジアゾ試薬の四フッ化ホウ酸塩、１，５−ナフタ
レンジスルホン酸塩および塩化亜鉛塩）が使用可能であ
るが、特に、２，４−ジクロルフェニルジアゾニウム−
１，５−ナフタレンジスルホン酸およびその塩類（例え
ばナトリウム塩、カリウム塩等）、ｐ−スルファニルベ
ンゼンジアゾニウム−１，５−ナフタリンスルホン酸お
よびその塩類、パラニトロベンゼンジアゾニウム四フッ
化ホウ酸およびその塩類、ジアゾ化スルファニル酸四フ
ッ化ホウ酸およびその塩類等の安定化ジアゾニウム塩
は、測定操作が簡便となるため、この発明の請求項３の
測定用試薬の用いるジアゾ試薬として有効である。
【００２１】以上の請求項１〜３の各々の測定用試薬に
用いられるその他の試薬類、例えば緩衝剤や防腐剤は、
公知の化学的酸化法やビリルビンオキシダーゼ法等にお
いて使用される例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢
酸、フタル酸等の緩衝剤やパラベン等の防腐剤から必要
に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用
濃度や測定試液のｐＨ等も公知の方法において採用され
ている測定試液のそれに準じて適宜設定することができ
る。
用いられるその他の試薬類、例えば緩衝剤や防腐剤は、
公知の化学的酸化法やビリルビンオキシダーゼ法等にお
いて使用される例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢
酸、フタル酸等の緩衝剤やパラベン等の防腐剤から必要
に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用
濃度や測定試液のｐＨ等も公知の方法において採用され
ている測定試液のそれに準じて適宜設定することができ
る。
【００２２】また、この発明においては、前記成分を適
宜選択して常法により混合することにより、直接型ビリ
ルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例
としては、たとえば第１試薬は、ｐＨ４．７〜６．５に
調整されたフタル酸緩衝液１０〜２００ｍＭ、ポリエチ
レングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテ
エル０．００５〜０．５％、アラニン５〜１００ｍＭ、
ｐ−トルエンスルホン酸１〜１００ｍＭ、ヒト血清アル
ブミン０．００１〜１％、フッ化ナトリウム０．０５〜
２００ｍＭ、Ｎ−アセチルシステイン０．０２〜１０ｍ
Ｍおよびビリルビン０．１〜１０μｇ／ｍｌを含み、第
２試薬は、ビリルビンオキシダーゼ０．００１〜１００
単位／ｍｌおよびｐＨ４．７〜６．５に調整されたフタ
ル酸緩衝液１０〜２００ｍＭを含むことができる。また
市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定用試薬ネ
スコートＤ−ＢＩＬ−ＶＥ（日本商事製）、エクディ
ア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）、Ｄ・ＢＩＬ試薬・Ｃ
「コクサイ」（国際試薬製）などの第１試薬にビリルビ
ン１〜１０μｇ／ｍｌを混合することにより、より正確
な直接型ビリルビン測定用試薬を得ることもできる。
宜選択して常法により混合することにより、直接型ビリ
ルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例
としては、たとえば第１試薬は、ｐＨ４．７〜６．５に
調整されたフタル酸緩衝液１０〜２００ｍＭ、ポリエチ
レングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテ
エル０．００５〜０．５％、アラニン５〜１００ｍＭ、
ｐ−トルエンスルホン酸１〜１００ｍＭ、ヒト血清アル
ブミン０．００１〜１％、フッ化ナトリウム０．０５〜
２００ｍＭ、Ｎ−アセチルシステイン０．０２〜１０ｍ
Ｍおよびビリルビン０．１〜１０μｇ／ｍｌを含み、第
２試薬は、ビリルビンオキシダーゼ０．００１〜１００
単位／ｍｌおよびｐＨ４．７〜６．５に調整されたフタ
ル酸緩衝液１０〜２００ｍＭを含むことができる。また
市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定用試薬ネ
スコートＤ−ＢＩＬ−ＶＥ（日本商事製）、エクディ
ア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）、Ｄ・ＢＩＬ試薬・Ｃ
「コクサイ」（国際試薬製）などの第１試薬にビリルビ
ン１〜１０μｇ／ｍｌを混合することにより、より正確
な直接型ビリルビン測定用試薬を得ることもできる。
【００２３】たとえば以上のようにして得られたこの発
明の試薬を用いて直接型ビリルビンを測定するための方
法は、具体的には以下の通りである。まず、請求項１記
載の直接型ビリルビン測定用試薬の場合には、例えば遊
離ビリルビン等のテトラピロール環を含む緩衝液を第１
試薬とし、これに各種ビリルビンを含む検体（血漿、血
清、尿などの生体液等）を適量加えて溶液とし、分光光
度計のセル室内にて予備加温後、この溶液の特定波長
（４６０ｎｍ付近）における吸光度を測定する（吸光度
１）。これにビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬を
添加し、１〜１０分間反応させて直接型ビリルビンのみ
を酸化させた後、４６０ｎｍ付近における吸光度を再度
測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度
２の値に液量補正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特
定波長における吸光度変化量（Ａ）を求める。次に、既
知濃度の直接型ビリルビンを含む標準物質を同様に測定
し、吸光度変化量（Ｂ）を求める。この吸光度変化量
（Ｂ）から作成した検量線に上記の吸光度変化量（Ａ）
を当てはめることによって試料中の直接型ビリルビン量
を測定することができる。また、吸光度変化量（Ａ）
（Ｂ）から、次式により検体中の直接型ビリルビン含量
を求めることができる。
明の試薬を用いて直接型ビリルビンを測定するための方
法は、具体的には以下の通りである。まず、請求項１記
載の直接型ビリルビン測定用試薬の場合には、例えば遊
離ビリルビン等のテトラピロール環を含む緩衝液を第１
試薬とし、これに各種ビリルビンを含む検体（血漿、血
清、尿などの生体液等）を適量加えて溶液とし、分光光
度計のセル室内にて予備加温後、この溶液の特定波長
（４６０ｎｍ付近）における吸光度を測定する（吸光度
１）。これにビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬を
添加し、１〜１０分間反応させて直接型ビリルビンのみ
を酸化させた後、４６０ｎｍ付近における吸光度を再度
測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度
２の値に液量補正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特
定波長における吸光度変化量（Ａ）を求める。次に、既
知濃度の直接型ビリルビンを含む標準物質を同様に測定
し、吸光度変化量（Ｂ）を求める。この吸光度変化量
（Ｂ）から作成した検量線に上記の吸光度変化量（Ａ）
を当てはめることによって試料中の直接型ビリルビン量
を測定することができる。また、吸光度変化量（Ａ）
（Ｂ）から、次式により検体中の直接型ビリルビン含量
を求めることができる。
【００２４】検体中の直接型ビリルビン濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）＝Ａ／Ｂ×標準物質中の直接型ビリルビン濃度（ｍ
ｇ／ｄｌ） なお、検体量としては０．００５〜０．１ｍｌが好まし
い。特定波長は４６０ｎｍに限定されるものではなく、
４００〜４８０ｎｍの任意の波長を選ぶことができる。
また、第１、第２試薬、検体の液量は適宜変化させるこ
とができる。
ｌ）＝Ａ／Ｂ×標準物質中の直接型ビリルビン濃度（ｍ
ｇ／ｄｌ） なお、検体量としては０．００５〜０．１ｍｌが好まし
い。特定波長は４６０ｎｍに限定されるものではなく、
４００〜４８０ｎｍの任意の波長を選ぶことができる。
また、第１、第２試薬、検体の液量は適宜変化させるこ
とができる。
【００２５】反応は通常の条件下で行い、例えば、反応
温度は２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、反応時
間は１〜３０分、好ましくは３〜１５分間である。請求
項２の測定用試薬を用いた場合にも同様に測定すること
ができる。すなわち、反応抑制剤および必要に応じてキ
レート剤等を含む緩衝液を第１試薬とし、これにビリル
ビンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長（４３０
〜４６０ｎｍ付近）の吸光度を測定する（吸光度１）。
次いで、バナジン酸イオンまたはマンガンイオン、必要
に応じてキレート剤を含む第２試薬を上記溶液に添加し
て２５〜４０℃で、３〜１５分間ビリルビンの酸化反応
を行ったのち、再度特定波長の吸光度を測定する（吸光
度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補
正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特定波長における
吸光度変化量（Ａ）を求める。そして、標準物質を作用
させて求めた吸光度変化量（Ｂ）から作成した検量線ま
たは上記の式に吸光度変化量（Ａ）を当てはめることに
より、試料中の直接型ビリルビン量を測定する。
温度は２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、反応時
間は１〜３０分、好ましくは３〜１５分間である。請求
項２の測定用試薬を用いた場合にも同様に測定すること
ができる。すなわち、反応抑制剤および必要に応じてキ
レート剤等を含む緩衝液を第１試薬とし、これにビリル
ビンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長（４３０
〜４６０ｎｍ付近）の吸光度を測定する（吸光度１）。
次いで、バナジン酸イオンまたはマンガンイオン、必要
に応じてキレート剤を含む第２試薬を上記溶液に添加し
て２５〜４０℃で、３〜１５分間ビリルビンの酸化反応
を行ったのち、再度特定波長の吸光度を測定する（吸光
度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補
正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特定波長における
吸光度変化量（Ａ）を求める。そして、標準物質を作用
させて求めた吸光度変化量（Ｂ）から作成した検量線ま
たは上記の式に吸光度変化量（Ａ）を当てはめることに
より、試料中の直接型ビリルビン量を測定する。
【００２６】さらに、請求項３の測定用試薬を用いた場
合にも同様に、緩衝液を第１試薬とし、これにビリルビ
ンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長（５４０〜
６００ｎｍ付近）の吸光度を測定する（吸光度１）。次
いで、ジアゾニウム塩を含む第２試薬を上記溶液に添加
して２５〜４０℃で、３〜１５分間反応を行ったのち、
再度特定波長の吸光度を測定する（吸光度２）。得られ
た吸光度１および吸光度２の値から吸光度変化量（Ａ）
を求め、事前に測定した吸光度変化量（Ｂ）から試料中
の直接型ビリルビン量を測定する。また、この請求項３
の測定用試薬を用いる方法では、ジアゾニウム塩を含む
溶液を第１試薬とし、これにビリルビンを含む試料を混
合し、２５〜４０℃で、３〜１５分間反応を行ったの
ち、緩衝液を添加し、さらに２５〜４０℃で、３〜１５
分間反応を行い、この溶液の特定波長（５４０〜６６０
ｎｍ付近）の吸光度を測定する。そして、標準物質を作
用させて求めた吸光度から作成した検量線にこの吸光度
を当てはめることにより直接型ビリルビン濃度を測定す
ることもできる。
合にも同様に、緩衝液を第１試薬とし、これにビリルビ
ンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長（５４０〜
６００ｎｍ付近）の吸光度を測定する（吸光度１）。次
いで、ジアゾニウム塩を含む第２試薬を上記溶液に添加
して２５〜４０℃で、３〜１５分間反応を行ったのち、
再度特定波長の吸光度を測定する（吸光度２）。得られ
た吸光度１および吸光度２の値から吸光度変化量（Ａ）
を求め、事前に測定した吸光度変化量（Ｂ）から試料中
の直接型ビリルビン量を測定する。また、この請求項３
の測定用試薬を用いる方法では、ジアゾニウム塩を含む
溶液を第１試薬とし、これにビリルビンを含む試料を混
合し、２５〜４０℃で、３〜１５分間反応を行ったの
ち、緩衝液を添加し、さらに２５〜４０℃で、３〜１５
分間反応を行い、この溶液の特定波長（５４０〜６６０
ｎｍ付近）の吸光度を測定する。そして、標準物質を作
用させて求めた吸光度から作成した検量線にこの吸光度
を当てはめることにより直接型ビリルビン濃度を測定す
ることもできる。
【００２７】その他の測定方法としては、例えば上記の
請求項２の測定用試薬を用いて行う場合には、第１試薬
と試料とを混合した溶液の吸光度を吸光度１とし、第１
試薬と第２試薬とを予め混合したものと試料とを反応さ
せた結果得られる溶液の吸光度を吸光度２として、上記
と同様の操作を行うことによっても、同様に試料中の直
接型ビリルビン濃度を測定することができる。
請求項２の測定用試薬を用いて行う場合には、第１試薬
と試料とを混合した溶液の吸光度を吸光度１とし、第１
試薬と第２試薬とを予め混合したものと試料とを反応さ
せた結果得られる溶液の吸光度を吸光度２として、上記
と同様の操作を行うことによっても、同様に試料中の直
接型ビリルビン濃度を測定することができる。
【００２８】
【作用】以上の通りのこの発明の試薬においては、ビリ
ルビンオキシダーゼ、バナジン酸イオンまたはマンガン
イオン、あるいはジアゾ試薬とともに、テトラピロール
環化合物を共存させているため、ビリルビン含有試料中
の間接型ビリルビンに反応することなく、直接型ビリル
ビンを精度良く測定することが可能となる。
ルビンオキシダーゼ、バナジン酸イオンまたはマンガン
イオン、あるいはジアゾ試薬とともに、テトラピロール
環化合物を共存させているため、ビリルビン含有試料中
の間接型ビリルビンに反応することなく、直接型ビリル
ビンを精度良く測定することが可能となる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。なお、以下の例における吸光度の測
定は、日立７０７０型自動分析装置を用いて行った。試料の調製 試料１：ビリルビン（シグマ）を１００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて溶解したビリルビン溶液、
ウシ血清アルブミン溶液を用いて間接型ビリルビン試料
（牛血清アルブミンを含む０、０．２、０．４、０．
６、０．８、１．０ｍｇ／ｄｌのビリルビン溶液）すな
わち直接型ビリルビン０ｍｇ／ｄｌの試料を調製した。
なお、ウシ血清アルブミン溶液は、ウシ血清アルブミン
（ベーリンガー・マンハイム）を１００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて溶解し、３．２ｇ／ｄｌの
溶液として調製した。
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。なお、以下の例における吸光度の測
定は、日立７０７０型自動分析装置を用いて行った。試料の調製 試料１：ビリルビン（シグマ）を１００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて溶解したビリルビン溶液、
ウシ血清アルブミン溶液を用いて間接型ビリルビン試料
（牛血清アルブミンを含む０、０．２、０．４、０．
６、０．８、１．０ｍｇ／ｄｌのビリルビン溶液）すな
わち直接型ビリルビン０ｍｇ／ｄｌの試料を調製した。
なお、ウシ血清アルブミン溶液は、ウシ血清アルブミン
（ベーリンガー・マンハイム）を１００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて溶解し、３．２ｇ／ｄｌの
溶液として調製した。
【００３０】試料２：上記ビリルビン溶液およびオーソ
リキッドノーマルコントロール血清（オーソダイアグノ
スティック社商品名、以下オーソノーマル）を用い、オ
ーソノーマルにビリルビン無添加の試料を調製した。 試料３：オーソノーマルにビリルビンを０．５ｍｇ／ｄ
ｌ添加して調製した。 試料４：オーソノーマルにビリルビンを１．０ｍｇ／ｄ
ｌ添加して調製した。
リキッドノーマルコントロール血清（オーソダイアグノ
スティック社商品名、以下オーソノーマル）を用い、オ
ーソノーマルにビリルビン無添加の試料を調製した。 試料３：オーソノーマルにビリルビンを０．５ｍｇ／ｄ
ｌ添加して調製した。 試料４：オーソノーマルにビリルビンを１．０ｍｇ／ｄ
ｌ添加して調製した。
【００３１】試料５：ハイベルチェック・ＢＩＬ（国際
試薬社商品名）溶液を生理食塩水で希釈して直接型ビリ
ルビン試料を調製した。試薬の調製 試薬１：その組成が、フタル酸水素カリウム６０ｍＭ
（ｐＨ５．０）、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオ
クチルフェニルエーテル０．０１％、ヒト血清アルブミ
ン０．００２％、ｐ−トルエンスルホン酸４０ｍＭ、Ｎ
−アセチルシステイン２．０ｍＭ、フッ化ナトリウム
２．０ｍＭ、アラニン４０ｍＭ、ビリルビン０．５μｇ
／ｍｌとなるように調製した。
試薬社商品名）溶液を生理食塩水で希釈して直接型ビリ
ルビン試料を調製した。試薬の調製 試薬１：その組成が、フタル酸水素カリウム６０ｍＭ
（ｐＨ５．０）、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオ
クチルフェニルエーテル０．０１％、ヒト血清アルブミ
ン０．００２％、ｐ−トルエンスルホン酸４０ｍＭ、Ｎ
−アセチルシステイン２．０ｍＭ、フッ化ナトリウム
２．０ｍＭ、アラニン４０ｍＭ、ビリルビン０．５μｇ
／ｍｌとなるように調製した。
【００３２】試薬２：試薬１にトラキデルマ属菌株由来
のビリルビンオキシダーゼ（宝酒造）５．０単位／ｍｌ
を添加して調製した。 試薬３：市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定
用試薬ネスコートＤ−ＢＩＬ−ＶＥ（日本商事製）の第
１試薬にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調製した。
のビリルビンオキシダーゼ（宝酒造）５．０単位／ｍｌ
を添加して調製した。 試薬３：市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定
用試薬ネスコートＤ−ＢＩＬ−ＶＥ（日本商事製）の第
１試薬にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調製した。
【００３３】試薬４：ネスコートＤ−ＢＩＬ−ＶＥ（日
本商事製）の第２試薬。 試薬５：エクディア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）の第１
試にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調製した。 試薬６：エクディア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）の第２
試薬。 試薬７：Ｄ・ＢＩＬ試薬・Ｃ「コクサイ」（国際試薬
製）の第１試薬にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調
製した。
本商事製）の第２試薬。 試薬５：エクディア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）の第１
試にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調製した。 試薬６：エクディア’栄研’ＤＢ（栄研化学製）の第２
試薬。 試薬７：Ｄ・ＢＩＬ試薬・Ｃ「コクサイ」（国際試薬
製）の第１試薬にビリルビン５μｇ／ｍｌを添加して調
製した。
【００３４】試薬８：Ｄ・ＢＩＬ試薬・Ｃ「コクサイ」
（国際試薬製）の第２試薬。〔なお試薬４、試薬６、試
薬８にはミロセシウム属菌株由来のビリルビンオキシダ
ーゼ（天野製薬製）が含まれている。〕 試薬９：試薬１からビリルビンを除いて調製した。 試薬１０：試薬３からビリルビンを除いて調製した。
（国際試薬製）の第２試薬。〔なお試薬４、試薬６、試
薬８にはミロセシウム属菌株由来のビリルビンオキシダ
ーゼ（天野製薬製）が含まれている。〕 試薬９：試薬１からビリルビンを除いて調製した。 試薬１０：試薬３からビリルビンを除いて調製した。
【００３５】 試薬１１：試薬５からビリルビンを除いて調製した。 試薬１２：試薬７からビリルビンを除いて調製した。 試薬１３：ｐＨ２．９に調整した１００ｍＭ酒石酸緩衝
液に２０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン、１０ｍＭヒドロ
キシエタンジホスホン酸を添加して調製した。
液に２０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン、１０ｍＭヒドロ
キシエタンジホスホン酸を添加して調製した。
【００３６】試薬１４：試薬１３にビリルビン０．４μ
ｇ／ｍｌを添加して調製した。 試薬１５：試薬１３にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬１６：試薬１３にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬１７：試薬１３にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬１８：ｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液に８ｍＭ
ヒドロキシエタンジホスホン酸、４ｍＭメタバナジン酸
ナトリウムを添加して調製した。 試薬１９：ｐＨ１．０の６５ｍＭ塩酸。 試薬２０：試薬１９にビリルビン０．４μｇ／ｍｌを添
加して調製した。 試薬２１：試薬１９にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬２２：試薬１９にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２３：試薬１９にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２４：８．１ｍＭスルファニル酸および１．４ｍＭ
亜硝酸ナトリウムからなる試薬を調製した。 試薬２５：５．１ｍＭスルファニル酸および１．４ｍＭ
亜硝酸ナトリウムからなり、アルカリ存在下で青色発色
する試薬を調製した。 試薬２６：試薬２５にビリルビン０．４μｇ／ｍｌを添
加して調製した。 試薬２７：試薬２５にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬２８：試薬２５にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２９：試薬２５にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬３０：ｐＨ１３．５に調整した２２ｍＭ酒石酸緩衝
液。実施例１ 上記の試薬１（０．２８ｍｌ）に試料１（０．０１４ｍ
ｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、４５０ｎｍでサン
プルブランクを最終液量補正して測定した。その後試薬
２（０．０７ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、
４５０ｎｍの吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリ
ルビンを標準として試料中の直接型ビリルビン測定値を
求めた。その結果を図１に示した。比較例１ また、実施例１における試薬１の代わりに試薬９を用い
て同様に測定値を求めた。結果を実施例１とともに図１
に示した。実施例２〜４ 比較例２〜４ 実施例１および比較例１における試薬１、試薬２、試薬
９の代わりに試薬３、試薬４、試薬１０を用いて同様に
測定値を求め、ともに結果を図１に示した（実施例２、
比較例２）。さらに実施例１および比較例１における試
薬１、試薬２、試薬９の代わりに試薬５、試薬６、試薬
１１（実施例３、比較例３）、試薬７、試薬８、試薬１
２（実施例４、比較例４）を用いて同様に測定値を求
め、結果を図２に示した。
ｇ／ｍｌを添加して調製した。 試薬１５：試薬１３にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬１６：試薬１３にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬１７：試薬１３にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬１８：ｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液に８ｍＭ
ヒドロキシエタンジホスホン酸、４ｍＭメタバナジン酸
ナトリウムを添加して調製した。 試薬１９：ｐＨ１．０の６５ｍＭ塩酸。 試薬２０：試薬１９にビリルビン０．４μｇ／ｍｌを添
加して調製した。 試薬２１：試薬１９にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬２２：試薬１９にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２３：試薬１９にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２４：８．１ｍＭスルファニル酸および１．４ｍＭ
亜硝酸ナトリウムからなる試薬を調製した。 試薬２５：５．１ｍＭスルファニル酸および１．４ｍＭ
亜硝酸ナトリウムからなり、アルカリ存在下で青色発色
する試薬を調製した。 試薬２６：試薬２５にビリルビン０．４μｇ／ｍｌを添
加して調製した。 試薬２７：試薬２５にビリルビン４μｇ／ｍｌを添加し
て調製した。 試薬２８：試薬２５にビリルビン２０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬２９：試薬２５にビリルビン４０μｇ／ｍｌを添加
して調製した。 試薬３０：ｐＨ１３．５に調整した２２ｍＭ酒石酸緩衝
液。実施例１ 上記の試薬１（０．２８ｍｌ）に試料１（０．０１４ｍ
ｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、４５０ｎｍでサン
プルブランクを最終液量補正して測定した。その後試薬
２（０．０７ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、
４５０ｎｍの吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリ
ルビンを標準として試料中の直接型ビリルビン測定値を
求めた。その結果を図１に示した。比較例１ また、実施例１における試薬１の代わりに試薬９を用い
て同様に測定値を求めた。結果を実施例１とともに図１
に示した。実施例２〜４ 比較例２〜４ 実施例１および比較例１における試薬１、試薬２、試薬
９の代わりに試薬３、試薬４、試薬１０を用いて同様に
測定値を求め、ともに結果を図１に示した（実施例２、
比較例２）。さらに実施例１および比較例１における試
薬１、試薬２、試薬９の代わりに試薬５、試薬６、試薬
１１（実施例３、比較例３）、試薬７、試薬８、試薬１
２（実施例４、比較例４）を用いて同様に測定値を求
め、結果を図２に示した。
【００３７】以上の結果から、この発明の請求項１の試
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。実施例５〜８ 実施例１〜４の間接型ビリルビン試料（試料１）の代わ
りに試料５の直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定
値を求めた。測定値と試料の希釈率との関係を図３〜図
６に示した（実施例５〜８）。両者の関係はほぼ原点を
通る直線となり、この発明の請求項１の試薬が臨床検査
などの手段として十分な測定範囲を有することがわか
る。実施例９〜１２ 比較例５ 試薬１３（０．２８ｍｌ）に試料２、３または４（０．
０１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、４５０ｎｍ
（副波長５４６ｎｍ）の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬１８（０．０
７ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、４５０ｎｍ
（副波長５４６ｎｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表１に示す（比較例５）。また、
比較例５における試薬１３の代わりに試薬１４〜１７を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例５とともに
表１に示す（実施例９〜１２）。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。実施例５〜８ 実施例１〜４の間接型ビリルビン試料（試料１）の代わ
りに試料５の直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定
値を求めた。測定値と試料の希釈率との関係を図３〜図
６に示した（実施例５〜８）。両者の関係はほぼ原点を
通る直線となり、この発明の請求項１の試薬が臨床検査
などの手段として十分な測定範囲を有することがわか
る。実施例９〜１２ 比較例５ 試薬１３（０．２８ｍｌ）に試料２、３または４（０．
０１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、４５０ｎｍ
（副波長５４６ｎｍ）の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬１８（０．０
７ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、４５０ｎｍ
（副波長５４６ｎｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表１に示す（比較例５）。また、
比較例５における試薬１３の代わりに試薬１４〜１７を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例５とともに
表１に示す（実施例９〜１２）。
【００３８】以上の結果から、この発明の請求項２の試
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
【００３９】
【表１】
【００４０】実施例１３〜１６ 比較例６ 試薬１９（０．３ｍｌ）に試料２、３または４（０．０
１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、５４６ｎｍ
（副波長６６０ｎｍ）の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬２４（０．１
５ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍ
（副波長６６０ｎｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表２に示す（比較例６）。また、
比較例６における試薬１９の代わりに試薬２０〜２３を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例６とともに
表２に示す（実施例１３〜１６）。
１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間加温し、５４６ｎｍ
（副波長６６０ｎｍ）の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬２４（０．１
５ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、５４６ｎｍ
（副波長６６０ｎｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表２に示す（比較例６）。また、
比較例６における試薬１９の代わりに試薬２０〜２３を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例６とともに
表２に示す（実施例１３〜１６）。
【００４１】以上の結果から、この発明の請求項３の試
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
【００４２】
【表２】
【００４３】実施例１７〜２０ 比較例７ 試薬２５（０．１５ｍｌ）に試料２、３または４（０．
０１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させたのち、試
薬３０（０．３ｍｌ）を加え、さらに３７℃で５分間反
応させた。この反応液の６００ｎｍ（副波長６６０ｎ
ｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリルビン
を標準として試料中の直接型ビリルビン値を求めた。結
果を表３に示す（比較例７）。また、比較例７における
試薬２５の代わりに試薬２６〜２９を用いて同様に測定
値を求めた。結果を比較例７とともに表３に示す（実施
例１７〜２０）。
０１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させたのち、試
薬３０（０．３ｍｌ）を加え、さらに３７℃で５分間反
応させた。この反応液の６００ｎｍ（副波長６６０ｎ
ｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリルビン
を標準として試料中の直接型ビリルビン値を求めた。結
果を表３に示す（比較例７）。また、比較例７における
試薬２５の代わりに試薬２６〜２９を用いて同様に測定
値を求めた。結果を比較例７とともに表３に示す（実施
例１７〜２０）。
【００４４】以上の結果から、この発明の請求項３の試
薬によれば、別の測定法を用いた場合にも、間接型ビリ
ルビンはほとんど酸化されないことがわかる。
薬によれば、別の測定法を用いた場合にも、間接型ビリ
ルビンはほとんど酸化されないことがわかる。
【００４５】
【表３】
【００４６】実施例２１〜３２ 実施例９〜１２、実施例１３〜１６、実施例１７〜２０
の間接型ビリルビン試料（試料１）の代わりに試料５の
直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定値を求めた
（実施例２１〜２４、実施例２５〜２８、実施例２９〜
３２）。測定値と試料の希釈率との関係を図７（実施例
２１〜２４）、図８（実施例２５〜２８）図９（実施例
２９〜３２）に示した。両者の関係はほぼ原点を通る直
線となり、この発明の請求項２〜３の試薬が臨床検査な
どの手段として十分な測定範囲を有することがわかる。
の間接型ビリルビン試料（試料１）の代わりに試料５の
直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定値を求めた
（実施例２１〜２４、実施例２５〜２８、実施例２９〜
３２）。測定値と試料の希釈率との関係を図７（実施例
２１〜２４）、図８（実施例２５〜２８）図９（実施例
２９〜３２）に示した。両者の関係はほぼ原点を通る直
線となり、この発明の請求項２〜３の試薬が臨床検査な
どの手段として十分な測定範囲を有することがわかる。
【００４７】
【発明の効果】以上詳しく述べたように、この発明によ
れば、閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕著に
増大することが知られている直接型ビリルビンを間接型
ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨床検
査その他において有用である。
れば、閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕著に
増大することが知られている直接型ビリルビンを間接型
ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨床検
査その他において有用である。
【図１】ビリルビンオキシダーゼとしてトラキデルマ属
（比較例１および実施例１）またはミロセシウム属（比
較例２および実施例２）菌株由来の酵素を用いたこの発
明の請求項１の試薬による間接型ビリルビンをサンプル
として用いた場合の直接型ビリルビン測定値とサンプル
希釈率の関係を比較例とともに示した図である。
（比較例１および実施例１）またはミロセシウム属（比
較例２および実施例２）菌株由来の酵素を用いたこの発
明の請求項１の試薬による間接型ビリルビンをサンプル
として用いた場合の直接型ビリルビン測定値とサンプル
希釈率の関係を比較例とともに示した図である。
【図２】ビリルビンオキシダーゼとしてミロセシウム属
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る間接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を比較例と
ともに示した図である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る間接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を比較例と
ともに示した図である。
【図３】ビリルビンオキシダーゼとしてトラキデルマ属
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
【図４】ビリルビンオキシダーゼとしてミロセシウム属
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
【図５】ビリルビンオキシダーゼとしてミロセシウム属
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
【図６】ビリルビンオキシダーゼとしてミロセシウム属
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項１の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
【図７】この発明の請求項２の試薬（実施例２１〜２
４）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
４）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
【図８】この発明の請求項３の試薬（実施例２５〜２
８）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
８）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
【図９】この発明の請求項３の試薬（実施例２９〜３
２）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
２）による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
フロントページの続き (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 小島 正美 千葉県香取郡多古町水戸字水戸台1460−６ 株式会社ヤトロン中央研究所内 (72)発明者 鈴木 裕史 千葉県八千代市大和田新田1144番地 株式 会社ヤトロン八千代工場内
Claims (4)
- 【請求項１】 ビリルビンオキシダーゼを反応させて直
接型ビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬で
あって、ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロ
ール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリ
ルビン測定用試薬。 - 【請求項２】 酸化剤を反応させて直接型ビリルビンの
変化を光学的に測定するための試薬であって、酸化剤と
ともに、テトラピロール環化合物を共存させることを特
徴とする直接型ビリルビン測定用試薬。 - 【請求項３】 ジアゾニウム塩を反応させて直接型ビリ
ルビンの変化を光学的に測定するための試薬であって、
ジアゾニウム塩とともに、テトラピロール環化合物を共
存させることを特徴とする直接型ビリルビン測定用試
薬。 - 【請求項４】 テトラピロール環化合物がビリルビンで
ある請求項１、２または３記載の直接型ビリルビン測定
用試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06264197A JP3091094B2 (ja) | 1993-12-28 | 1994-10-27 | 直接型ビリルビン測定用試薬 |
| US08/365,158 US5599661A (en) | 1993-12-28 | 1994-12-28 | Reagent for measuring direct bilirubin |
| DE69434925T DE69434925T2 (de) | 1993-12-28 | 1994-12-28 | Reagens zur Messung von direktem Bilirubin |
| EP94309842A EP0678580B1 (en) | 1993-12-28 | 1994-12-28 | Reagent for measuring direct bilirubin |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33866193 | 1993-12-28 | ||
| JP5-338661 | 1993-12-28 | ||
| JP06264197A JP3091094B2 (ja) | 1993-12-28 | 1994-10-27 | 直接型ビリルビン測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07231795A true JPH07231795A (ja) | 1995-09-05 |
| JP3091094B2 JP3091094B2 (ja) | 2000-09-25 |
Family
ID=26546398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06264197A Expired - Lifetime JP3091094B2 (ja) | 1993-12-28 | 1994-10-27 | 直接型ビリルビン測定用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599661A (ja) |
| EP (1) | EP0678580B1 (ja) |
| JP (1) | JP3091094B2 (ja) |
| DE (1) | DE69434925T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017173011A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | ニプロ株式会社 | 抱合型ビリルビン測定用試薬 |
| JP2020513548A (ja) * | 2016-12-14 | 2020-05-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 試料における干渉物質の決定 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69817449T2 (de) * | 1997-06-06 | 2004-07-01 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von direktem Bilirubin |
| US8012761B2 (en) * | 2006-12-14 | 2011-09-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of formaldehyde in urine samples |
| US7846383B2 (en) * | 2006-12-15 | 2010-12-07 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Lateral flow assay device and absorbent article containing same |
| CN101776692B (zh) * | 2009-01-09 | 2013-07-10 | 上海复星医药（集团）股份有限公司 | 钒酸盐氧化法检测总胆红素试剂盒 |
| WO2016159050A1 (ja) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | 国立大学法人神戸大学 | 血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法 |
| WO2017031284A1 (en) * | 2015-08-18 | 2017-02-23 | Ecolab Usa Inc. | Dispensing device and system for solid chemical cleaning agents |
| CN106404686B (zh) * | 2016-08-27 | 2019-03-29 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种抗肝素的血清总胆红素(钒酸盐氧化法)检测试剂盒 |
| CN111455018B (zh) * | 2020-03-03 | 2023-05-23 | 天津大学 | 含有枯草芽孢杆菌漆酶的直接胆红素检测试剂盒 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3652222A (en) * | 1969-04-07 | 1972-03-28 | American Monitor Corp | Bilirubin assay |
| DE3225331A1 (de) * | 1982-07-07 | 1984-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens |
| JPS59125899A (ja) * | 1982-12-29 | 1984-07-20 | Nippon Shoji Kk | 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 |
| US4600689A (en) * | 1983-11-21 | 1986-07-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Novel bilirubin oxidase, its production and use |
| US4788153A (en) * | 1986-10-14 | 1988-11-29 | Eastman Kodak Company | Method for the determination of bilirubin and an element useful therein |
| US5112769A (en) * | 1987-09-29 | 1992-05-12 | Modrovich Ivan Endre | Stable single liquid reagent for determination of direct bilirubin in sera and method of forming same |
| JPH0771515B2 (ja) * | 1989-12-18 | 1995-08-02 | 日本商事株式会社 | ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 |
| DE69120373T2 (de) * | 1990-10-30 | 1997-02-06 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Verfahren zum Nachweis von Bilirubin |
| US5278073A (en) * | 1991-05-08 | 1994-01-11 | Streck Laboratories, Inc. | Method of bilirubin assay |
| US5149272A (en) * | 1991-05-30 | 1992-09-22 | Boehringer Mannheim Corporation | Assay for total and direct billirubin |
-
1994
- 1994-10-27 JP JP06264197A patent/JP3091094B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 EP EP94309842A patent/EP0678580B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 US US08/365,158 patent/US5599661A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 DE DE69434925T patent/DE69434925T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017173011A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | ニプロ株式会社 | 抱合型ビリルビン測定用試薬 |
| JP2020513548A (ja) * | 2016-12-14 | 2020-05-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 試料における干渉物質の決定 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69434925D1 (de) | 2007-04-05 |
| JP3091094B2 (ja) | 2000-09-25 |
| EP0678580A3 (en) | 1997-10-22 |
| DE69434925T2 (de) | 2007-10-31 |
| EP0678580A2 (en) | 1995-10-25 |
| EP0678580B1 (en) | 2007-02-21 |
| US5599661A (en) | 1997-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5131955B2 (ja) | プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬 | |
| JP5906604B2 (ja) | 全血検体の成分測定方法 | |
| EP1693462A1 (en) | Method of determining substrate contained in hemoglobin-containing sample | |
| JP3091094B2 (ja) | 直接型ビリルビン測定用試薬 | |
| JP6435605B2 (ja) | 生体成分の測定方法および測定用組成物 | |
| JP2016019498A (ja) | 生体成分の測定方法および測定用組成物 | |
| EP2653551B1 (en) | Method for measuring component to be measured | |
| JP6459268B2 (ja) | 生体成分の測定方法および測定用組成物 | |
| EP0686849B1 (en) | Method for measuring bilirubin | |
| JP4301523B2 (ja) | 糖化タンパク質割合測定方法 | |
| JP2009072136A (ja) | 還元系色素を用いた安定な測定方法、およびその試薬 | |
| JP4489400B2 (ja) | 試薬の安定化方法 | |
| JP2619222B2 (ja) | 血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法 | |
| US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| JP7310282B2 (ja) | 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法 | |
| JP4090266B2 (ja) | 抱合型ビリルビン測定用組成物の安定化方法及び抱合型ビリルビン測定用組成物 | |
| JP3727392B2 (ja) | 抱合ビリルビン測定試薬 | |
| JP4296480B2 (ja) | 検出物質の安定化方法およびその試薬 | |
| JP2000189196A (ja) | 尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬 | |
| JP3260020B2 (ja) | Ｕｉｂｃ測定用試薬 | |
| JP2019176802A (ja) | ロイコ型色素の安定化方法 | |
| JP7314931B2 (ja) | 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法 | |
| JP7314932B2 (ja) | 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法 | |
| JP3690754B2 (ja) | 試料中の成分の定量法 | |
| JP2007289097A (ja) | 総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090721 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090721 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100721 Year of fee payment: 10 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100721 Year of fee payment: 10 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100721 Year of fee payment: 10 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110721 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110721 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120721 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120721 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130721 Year of fee payment: 13 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |