JPH07231795A - 直接型ビリルビン測定用試薬 - Google Patents
直接型ビリルビン測定用試薬Info
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- JPH07231795A JPH07231795A JP6264197A JP26419794A JPH07231795A JP H07231795 A JPH07231795 A JP H07231795A JP 6264197 A JP6264197 A JP 6264197A JP 26419794 A JP26419794 A JP 26419794A JP H07231795 A JPH07231795 A JP H07231795A
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Abstract
ゾニウム塩を反応させて直接型ビリルビンの変化を光学
的に測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダ
ーゼ、酸化剤またはジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させる。 【効果】 閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕
著に増大することが知られている直接型ビリルビンを間
接型ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨
床検査その他において有用である。
Description
リルビンの測定用試薬に関するものである。
黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁
中にもっとも多く存在することが知られている。また、
生体液中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリ
ルビンとに大別される。溶血性貧血、溶血性黄疸などの
病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸など
の病態では直接型ビリルビン量が増大することから、こ
れらビリルビンの分別定量は臨床診断などにおいて重要
な位置を占めている。実際、従来より臨床検査などで測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接型ビリルビン
であり、直接型ビリルビンの正確な定量は臨床検査など
においては不可欠になっている。
しては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなど
の酸化酵素を利用する方法、バナジン酸イオンまたは三
価のマンガンイオン等の酸化剤を利用する方法などが挙
げられる。このうちジアゾ試薬を用いる方法について
は、使用するジアゾ化反応促進剤の種類と、生成するア
ゾビリルビンの定量方法の違いにより、種々のものが報
告されている。例えば、代表的なものとしては、マロイ
およびエヴェリン(Malloy &Evelyn) による試薬〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal
of Biological Chemistry) 、第119巻、第481頁
(1937年)〕などがある。
定量する方法には、逆相HPLCカラムを使用して各種
ビリルビンをリン酸緩衝液およびイソプロパノールのグ
ラジエントによって溶出、分析するラウフ(Lauff) らの
方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(Journal
of Chromatography) 、第226巻、第391頁(19
81年)〕などがある。
用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン
自体のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前後
の吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。
この場合、反応条件を種々変えることにより、直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化させることができる。この
方法において使用される試薬としては、例えばビリルビ
ンオキシダーゼを用いる試薬〔クリニカル・ケミストリ
ー(Clinical Chemistry)、第20巻、第783頁(19
74年)〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いる試薬(特公昭6
2−33880号公報)がある。さらに、pH、緩衝
液、界面活性剤の選定によって、直接型ビリルビンのみ
にビリルビンオキシダーゼが働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定用試薬も提案されている。このような
直接型ビリルビン測定用試薬としては、例えばpH9〜
11の範囲の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用
させて直接型ビリルビンを定量する試薬(特公平5−6
8240号公報)、陰イオン性界面活性剤を含有するp
H5〜6の酸性緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作
用させて直接型ビリルビンを定量する試薬(特公平5−
9066号公報)、pH3.5〜4.5の緩衝液中でビ
リルビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを
定量する試薬(特公昭61−44000号公報)、pH
2.0〜3.3のフェロシアン化カリウムおよび/また
はフェリシアン化カリウムを含有する緩衝液中でビリル
ビンオキシダーゼを作用させて直接型ビリルビンを定量
する試薬(特開平1−5499号公報)などがある。
作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビ
ン自体のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前
後の吸光度変化量によりビリルビンを測定するものであ
る。この場合も、反応条件を種々変えることにより、直
接型ビリルビンのみを特異的に酸化させることができ
る。この方法において使用される試薬としては、例えば
バナジン酸イオンを用いる試薬〔臨床化学、第22巻、
第116頁(1993年)〕がある。さらに、間接型ビ
リルビンの反応抑制剤、緩衝液等の選定によって、直接
型ビリルビンのみに酸化剤が働く条件を設定した直接型
ビリルビンの測定試薬も提案されている。このような直
接型ビリルビン測定試薬としては、例えば酸化剤として
バナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオンを用い、
間接型ビリルビンの反応抑制剤としてヒドラジン類、ヒ
ドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン
類、フェノール類、水溶性高分子およびHLB値が15
以上の非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれた1
種以上の化合物を使用して、直接型ビリルビンを定量す
る試薬(特開平5−18978号公報)がある。
体クロマトグラフィーによって直接型ビリルビンを分画
定量する従来の方法は、十分な分別性を有しているが、
高価で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこ
と、一度に多数検体を処理できないなどの問題がある。
素を作用させて直接型ビリルビンを定量する方法は、光
学的測定という特長を有し、簡便かつ比較的精度の高い
方法であるが、ビリルビンの分別性が十分でないために
直接型ビリルビンに対する反応が完全でなく、あるい
は、直接型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビ
ンにも反応してしまうという問題がある。また、この試
薬はビリルビンオキシダーゼの至適pH範囲外のpHで
測定を行わなければならないため、必然的に大量の酵素
が必要となり測定に要する費用が高くなるという問題点
もある。そこで、この発明の発明者らはフッ素化合物お
よび/または還元剤を含有させて直接型ビリルビンへの
特異性を向上させた、至適pH範囲内のpHで測定する
ことができる直接型ビリルビン測定試薬を提案している
(特開平5−276992号公報)。ただし、この試薬
の場合にも、ビリルビンの分別性は完全とはいえない。
は三価のマンガンイオンを利用した試薬による測定法
は、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類
などの間接型ビリルビン反応抑制剤を添加しても、直接
型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビンにも反
応してしまい、分別定量が不十分であるという問題を有
している。
ゾ化反応の反応促進剤を含有するか否かによって直接型
ビリルビンと間接型ビリルビンを分別測定しているが、
その分別性は、酸化酵素や酸化剤を利用した試薬による
測定法と同様に、実際上不十分であるという問題があ
る。特にこの分別性の不十分さは、アルブミン含量の低
い検体あるいはサリチル酸などの薬剤を含む検体につい
て顕著である。
上の通りの事情に鑑みて、従来の直接型ビリルビン測定
用試薬におけるこれらの問題点を解決するための検討を
進めた結果、ビリルビンオキシダーゼによって直接型ビ
リルビンのみを特異的に酸化する直接型ビリルビン測定
用試薬、酸化剤によって直接型ビリルビンのみを特異的
に酸化する直接型ビリルビン測定用試薬、およびジアゾ
ニウム塩を作用させて直接型ビリルビンをアゾビリルビ
ンに変化させる直接型ビリルビン測定用試薬において、
テトラピロール環化合物を共存させることにより、ビリ
ルビン含有試料中の間接型ビリルビンに反応することな
く、直接型ビリルビンを精度良く測定できることを見い
出し、この発明を完成するに至った。
ダーゼを反応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に
測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダーゼ
とともに、テトラピロール環化合物を共存させることを
特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬(請求項1)を
提供する。また、この発明は、酸化剤を反応させて直接
型ビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬であ
って、酸化剤とともに、テトラピロール環化合物を共存
させることを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬
(請求項2)を提供する。
応させて直接型ビリルビンの変化を光学的に測定するた
めの試薬であって、ジアゾニウム塩とともに、テトラピ
ロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビ
リルビン測定用試薬(請求項3)をも提供する。この発
明の直接型ビリルビン測定用試薬は、テトラピロール環
を有する化合物を含む緩衝液(第1試薬)と、使用時に
この第1試薬と混合する第2試薬とからなる2試薬系の
ものでもよく、あるいはまた、全ての組成を予め混合し
た1試薬系であってもよい。2試薬系とした場合の第2
試薬は、請求項1の測定用試薬においてはビリルビンオ
キシダーゼを含む試薬、請求項2の測定用試薬において
は酸化剤を含む試薬、そして、請求項3の測定用試薬に
おいてはジアゾニウム塩を含む試薬である。
特に限定はないが、例えば、ビリルビン、ビリベルジ
ン、ウロビリノーゲンなどを単独でまたは組合せて支障
なく使用できるが、なかでもビリルビンを使用すること
が好ましい。その濃度は0.01μg/ml〜100μ
g/ml、好ましくは0.4μg/ml〜40μg/m
lである。テトラピロール環化合物の濃度が前記範囲の
下限未満であると、直接型ビリルビンを酸化する際に間
接型ビリルビンまでも酸化されてしまい、好ましくな
い。 この発明の請求項1の測定用試薬に使用するビリ
ルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属
またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が
挙げられ、その必要量は0.001〜200単位/m
l、好ましくは0.005〜20単位/mlである。
は使用する酵素の安定性、活性の面で有利となるpH
3.0〜6.5までの間に緩衝能を持つものであれば良
く、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リン
ゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナ
トリウム緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は20
〜500mM、好ましくは30〜300mMである。
ン酸、安息香酸などの芳香族カルボン酸、界面活性剤、
アラニン、セリンなどのアミノ酸、マンニトールなどの
糖類、ポリエチレングリコールなどのポリオール類、N
aClなどの塩類、アルブミンなどの蛋白質などを適宜
に添加することができる。この発明の請求項2の測定用
試薬に酸化剤として用いるバナジン酸イオンとしては、
その種類に特段の制限はないが、好ましい具体例として
は例えばVO3 -、VO4 3- 等の五価のバナジウムを含
むものが挙げられる。実際にこれを試薬中に添加する場
合には、バナジン酸そのものを用いてもよいが、例えば
リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属類の
塩やアンモニウム塩などの塩の形にして用いたほうが溶
解性等の点においてより好ましい。
酸化剤として用いる三価のマンガンイオンとしては、酢
酸マンガン(III)等の通常の三価のマンガン塩だけでな
く、例えばアセチルアセトン、エチレンジアミン四酢酸
等のキレート剤とキレートを形成しているものを使用す
ることができる。バナジン酸イオンおよびマンガンイオ
ンの使用濃度としては、試料中のビリルビンを酸化する
ことのできる濃度であれば特に限定されるものではない
が、通常は0.1〜50μgイオン/ml、好ましくは
0.5〜10μgイオン/mlの範囲とすることができ
る。
は、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン
類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価ア
ミン類、フェノール類、水溶性高分子およびHLB値が
15以上の非イオン性界面活性剤等を用いることができ
る。これらの反応抑制剤の種類については、直接型ビリ
ルビンの測定に影響を及ぼさないものであれば特に制限
なく使用することができるが、それぞれについて好まし
い具体例を挙げれば以下のとおりである。すなわち、ヒ
ドラジン類としては、例えばヒドラジン、フェニルヒド
ラジンまたはこれらの鉱酸塩(塩酸塩、硫酸塩等);ヒ
ドロキシルアミン類としては、例えばヒドロキシルアミ
ン、フェニルヒドロキシルアミンまたはこれらの鉱酸塩
(塩酸塩、硫酸塩等);オキシム類としては、例えばア
セトキシム、ジアセチルモノオキシム、サリチルアルド
キシム等;脂肪族多価アミン類としては、例えばテトラ
エチレンペンタミン、ヘキサメチレンテトラミン、トリ
エチレンテトラミン等;フェノール類としては、例えば
フェノール、p−クロルフェノール、p−アセトアミド
フェノール、4−クロル−1−ナフトール、β−ナフト
ール等;水溶性高分子としては、例えばポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン等;そして、HLB値が
15以上の非イオン性界面活性剤等としては、例えばエ
マルゲン−123p(ポリオキシエチレンラウリルエー
テル、花王(株)社商品名)、エマルゲン−950(ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王(株)
社商品名)、エマルゲン−985(ポリオキシエチレン
ノニルフェニルエーテル、花王(株)社商品名)、トリ
トンX−405(ポリオキシエチレンイソオクチルフェ
ニルエーテル、ロームアンドハース社商品名)等であ
る。これらの反応抑制剤は、単独でも間接型ビリルビン
の酸化抑制作用を有しているが、2種以上を組み合わせ
ることにより効果が高まることもあるので、状況に合わ
せて適宜選択して使用することができる。また、これら
反応抑制剤の使用濃度は、試料中の間接型ビリルビンの
酸化を抑制することのできる濃度であれば特に限定され
ることはなく、また使用する抑制剤の種類によっても異
なるが、通常は、0.01〜10%(W/V)の範囲と
すればよい。
においては、その測定試液中にキレート剤を共存させる
と、試薬盲検値が低下して分析精度が向上し、試液の安
定化が図れるとともに、ビリルビンの酸化反応が促進さ
れる。このような目的で使用するキレート剤の好ましい
具体例としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(ED
TA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シクロヘキサンジ
アミン四酢酸(CyDTA)、ジエチレントリアミン五
酢酸(DTPA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン
三酢酸(EDTA−OH)、トリエチレンテトライミン
六酢酸(TTHA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸
(HIDA)、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジホス
ホン酸、あるいはこれらのアルカリ金属塩(例えばリチ
ウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等)やアンモニウム
塩等を挙げることができる。これらキレート剤の使用濃
度は、ビリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に
限定されないが、通常は、0.02〜65mM、好まし
くは1〜40mM、さらに好ましくは1〜25mMの範
囲とすればよい。
用いるジアゾ試薬としては、従来法において用いられる
公知のジアゾ試薬、例えば特開昭56−12555号公
報に開示されている非安定化ジアゾ試薬(スルファニル
酸、o−ジアニシジン、p−クロロアニリン、1,5−
ジクロロアニリン、2,4−ジクロロアニリン、2−メ
トキシ−4−ニトロアニリン、1−アミノアントラキノ
ン、2−ニトロアニリンおよび4−クロロメチルアニリ
ンのジアゾ化誘導体)および安定化ジアゾ試薬(上記非
安定化ジアゾ試薬の四フッ化ホウ酸塩、1,5−ナフタ
レンジスルホン酸塩および塩化亜鉛塩)が使用可能であ
るが、特に、2,4−ジクロルフェニルジアゾニウム−
1,5−ナフタレンジスルホン酸およびその塩類(例え
ばナトリウム塩、カリウム塩等)、p−スルファニルベ
ンゼンジアゾニウム−1,5−ナフタリンスルホン酸お
よびその塩類、パラニトロベンゼンジアゾニウム四フッ
化ホウ酸およびその塩類、ジアゾ化スルファニル酸四フ
ッ化ホウ酸およびその塩類等の安定化ジアゾニウム塩
は、測定操作が簡便となるため、この発明の請求項3の
測定用試薬の用いるジアゾ試薬として有効である。
用いられるその他の試薬類、例えば緩衝剤や防腐剤は、
公知の化学的酸化法やビリルビンオキシダーゼ法等にお
いて使用される例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢
酸、フタル酸等の緩衝剤やパラベン等の防腐剤から必要
に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用
濃度や測定試液のpH等も公知の方法において採用され
ている測定試液のそれに準じて適宜設定することができ
る。
宜選択して常法により混合することにより、直接型ビリ
ルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例
としては、たとえば第1試薬は、pH4.7〜6.5に
調整されたフタル酸緩衝液10〜200mM、ポリエチ
レングリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテ
エル0.005〜0.5%、アラニン5〜100mM、
p−トルエンスルホン酸1〜100mM、ヒト血清アル
ブミン0.001〜1%、フッ化ナトリウム0.05〜
200mM、N−アセチルシステイン0.02〜10m
Mおよびビリルビン0.1〜10μg/mlを含み、第
2試薬は、ビリルビンオキシダーゼ0.001〜100
単位/mlおよびpH4.7〜6.5に調整されたフタ
ル酸緩衝液10〜200mMを含むことができる。また
市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定用試薬ネ
スコートD−BIL−VE(日本商事製)、エクディ
ア’栄研’DB(栄研化学製)、D・BIL試薬・C
「コクサイ」(国際試薬製)などの第1試薬にビリルビ
ン1〜10μg/mlを混合することにより、より正確
な直接型ビリルビン測定用試薬を得ることもできる。
明の試薬を用いて直接型ビリルビンを測定するための方
法は、具体的には以下の通りである。まず、請求項1記
載の直接型ビリルビン測定用試薬の場合には、例えば遊
離ビリルビン等のテトラピロール環を含む緩衝液を第1
試薬とし、これに各種ビリルビンを含む検体(血漿、血
清、尿などの生体液等)を適量加えて溶液とし、分光光
度計のセル室内にて予備加温後、この溶液の特定波長
(460nm付近)における吸光度を測定する(吸光度
1)。これにビリルビンオキシダーゼを含む第2試薬を
添加し、1〜10分間反応させて直接型ビリルビンのみ
を酸化させた後、460nm付近における吸光度を再度
測定する(吸光度2)。得られた吸光度1および吸光度
2の値に液量補正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特
定波長における吸光度変化量(A)を求める。次に、既
知濃度の直接型ビリルビンを含む標準物質を同様に測定
し、吸光度変化量(B)を求める。この吸光度変化量
(B)から作成した検量線に上記の吸光度変化量(A)
を当てはめることによって試料中の直接型ビリルビン量
を測定することができる。また、吸光度変化量(A)
(B)から、次式により検体中の直接型ビリルビン含量
を求めることができる。
l)=A/B×標準物質中の直接型ビリルビン濃度(m
g/dl) なお、検体量としては0.005〜0.1mlが好まし
い。特定波長は460nmに限定されるものではなく、
400〜480nmの任意の波長を選ぶことができる。
また、第1、第2試薬、検体の液量は適宜変化させるこ
とができる。
温度は25〜45℃、好ましくは35〜40℃、反応時
間は1〜30分、好ましくは3〜15分間である。請求
項2の測定用試薬を用いた場合にも同様に測定すること
ができる。すなわち、反応抑制剤および必要に応じてキ
レート剤等を含む緩衝液を第1試薬とし、これにビリル
ビンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長(430
〜460nm付近)の吸光度を測定する(吸光度1)。
次いで、バナジン酸イオンまたはマンガンイオン、必要
に応じてキレート剤を含む第2試薬を上記溶液に添加し
て25〜40℃で、3〜15分間ビリルビンの酸化反応
を行ったのち、再度特定波長の吸光度を測定する(吸光
度2)。得られた吸光度1および吸光度2の値に液量補
正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特定波長における
吸光度変化量(A)を求める。そして、標準物質を作用
させて求めた吸光度変化量(B)から作成した検量線ま
たは上記の式に吸光度変化量(A)を当てはめることに
より、試料中の直接型ビリルビン量を測定する。
合にも同様に、緩衝液を第1試薬とし、これにビリルビ
ンを含む試料を混合し、この溶液の特定波長(540〜
600nm付近)の吸光度を測定する(吸光度1)。次
いで、ジアゾニウム塩を含む第2試薬を上記溶液に添加
して25〜40℃で、3〜15分間反応を行ったのち、
再度特定波長の吸光度を測定する(吸光度2)。得られ
た吸光度1および吸光度2の値から吸光度変化量(A)
を求め、事前に測定した吸光度変化量(B)から試料中
の直接型ビリルビン量を測定する。また、この請求項3
の測定用試薬を用いる方法では、ジアゾニウム塩を含む
溶液を第1試薬とし、これにビリルビンを含む試料を混
合し、25〜40℃で、3〜15分間反応を行ったの
ち、緩衝液を添加し、さらに25〜40℃で、3〜15
分間反応を行い、この溶液の特定波長(540〜660
nm付近)の吸光度を測定する。そして、標準物質を作
用させて求めた吸光度から作成した検量線にこの吸光度
を当てはめることにより直接型ビリルビン濃度を測定す
ることもできる。
請求項2の測定用試薬を用いて行う場合には、第1試薬
と試料とを混合した溶液の吸光度を吸光度1とし、第1
試薬と第2試薬とを予め混合したものと試料とを反応さ
せた結果得られる溶液の吸光度を吸光度2として、上記
と同様の操作を行うことによっても、同様に試料中の直
接型ビリルビン濃度を測定することができる。
ルビンオキシダーゼ、バナジン酸イオンまたはマンガン
イオン、あるいはジアゾ試薬とともに、テトラピロール
環化合物を共存させているため、ビリルビン含有試料中
の間接型ビリルビンに反応することなく、直接型ビリル
ビンを精度良く測定することが可能となる。
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。なお、以下の例における吸光度の測
定は、日立7070型自動分析装置を用いて行った。試料の調製 試料1:ビリルビン(シグマ)を100mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0)にて溶解したビリルビン溶液、
ウシ血清アルブミン溶液を用いて間接型ビリルビン試料
(牛血清アルブミンを含む0、0.2、0.4、0.
6、0.8、1.0mg/dlのビリルビン溶液)すな
わち直接型ビリルビン0mg/dlの試料を調製した。
なお、ウシ血清アルブミン溶液は、ウシ血清アルブミン
(ベーリンガー・マンハイム)を100mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.5)にて溶解し、3.2g/dlの
溶液として調製した。
リキッドノーマルコントロール血清(オーソダイアグノ
スティック社商品名、以下オーソノーマル)を用い、オ
ーソノーマルにビリルビン無添加の試料を調製した。 試料3:オーソノーマルにビリルビンを0.5mg/d
l添加して調製した。 試料4:オーソノーマルにビリルビンを1.0mg/d
l添加して調製した。
試薬社商品名)溶液を生理食塩水で希釈して直接型ビリ
ルビン試料を調製した。試薬の調製 試薬1:その組成が、フタル酸水素カリウム60mM
(pH5.0)、ポリエチレングリコール−p−イソオ
クチルフェニルエーテル0.01%、ヒト血清アルブミ
ン0.002%、p−トルエンスルホン酸40mM、N
−アセチルシステイン2.0mM、フッ化ナトリウム
2.0mM、アラニン40mM、ビリルビン0.5μg
/mlとなるように調製した。
のビリルビンオキシダーゼ(宝酒造)5.0単位/ml
を添加して調製した。 試薬3:市販の体外診断用医薬品直接型ビリルビン測定
用試薬ネスコートD−BIL−VE(日本商事製)の第
1試薬にビリルビン5μg/mlを添加して調製した。
本商事製)の第2試薬。 試薬5:エクディア’栄研’DB(栄研化学製)の第1
試にビリルビン5μg/mlを添加して調製した。 試薬6:エクディア’栄研’DB(栄研化学製)の第2
試薬。 試薬7:D・BIL試薬・C「コクサイ」(国際試薬
製)の第1試薬にビリルビン5μg/mlを添加して調
製した。
(国際試薬製)の第2試薬。〔なお試薬4、試薬6、試
薬8にはミロセシウム属菌株由来のビリルビンオキシダ
ーゼ(天野製薬製)が含まれている。〕 試薬9:試薬1からビリルビンを除いて調製した。 試薬10:試薬3からビリルビンを除いて調製した。
液に20mM塩酸ヒドロキシルアミン、10mMヒドロ
キシエタンジホスホン酸を添加して調製した。
g/mlを添加して調製した。 試薬15:試薬13にビリルビン4μg/mlを添加し
て調製した。 試薬16:試薬13にビリルビン20μg/mlを添加
して調製した。 試薬17:試薬13にビリルビン40μg/mlを添加
して調製した。 試薬18:pH7.0に調整したリン酸緩衝液に8mM
ヒドロキシエタンジホスホン酸、4mMメタバナジン酸
ナトリウムを添加して調製した。 試薬19:pH1.0の65mM塩酸。 試薬20:試薬19にビリルビン0.4μg/mlを添
加して調製した。 試薬21:試薬19にビリルビン4μg/mlを添加し
て調製した。 試薬22:試薬19にビリルビン20μg/mlを添加
して調製した。 試薬23:試薬19にビリルビン40μg/mlを添加
して調製した。 試薬24:8.1mMスルファニル酸および1.4mM
亜硝酸ナトリウムからなる試薬を調製した。 試薬25:5.1mMスルファニル酸および1.4mM
亜硝酸ナトリウムからなり、アルカリ存在下で青色発色
する試薬を調製した。 試薬26:試薬25にビリルビン0.4μg/mlを添
加して調製した。 試薬27:試薬25にビリルビン4μg/mlを添加し
て調製した。 試薬28:試薬25にビリルビン20μg/mlを添加
して調製した。 試薬29:試薬25にビリルビン40μg/mlを添加
して調製した。 試薬30:pH13.5に調整した22mM酒石酸緩衝
液。実施例1 上記の試薬1(0.28ml)に試料1(0.014m
l)を加え、37℃で5分間加温し、450nmでサン
プルブランクを最終液量補正して測定した。その後試薬
2(0.07ml)を加え、37℃で5分間反応させ、
450nmの吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリ
ルビンを標準として試料中の直接型ビリルビン測定値を
求めた。その結果を図1に示した。比較例1 また、実施例1における試薬1の代わりに試薬9を用い
て同様に測定値を求めた。結果を実施例1とともに図1
に示した。実施例2〜4 比較例2〜4 実施例1および比較例1における試薬1、試薬2、試薬
9の代わりに試薬3、試薬4、試薬10を用いて同様に
測定値を求め、ともに結果を図1に示した(実施例2、
比較例2)。さらに実施例1および比較例1における試
薬1、試薬2、試薬9の代わりに試薬5、試薬6、試薬
11(実施例3、比較例3)、試薬7、試薬8、試薬1
2(実施例4、比較例4)を用いて同様に測定値を求
め、結果を図2に示した。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。実施例5〜8 実施例1〜4の間接型ビリルビン試料(試料1)の代わ
りに試料5の直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定
値を求めた。測定値と試料の希釈率との関係を図3〜図
6に示した(実施例5〜8)。両者の関係はほぼ原点を
通る直線となり、この発明の請求項1の試薬が臨床検査
などの手段として十分な測定範囲を有することがわか
る。実施例9〜12 比較例5 試薬13(0.28ml)に試料2、3または4(0.
01ml)を加え、37℃で5分間加温し、450nm
(副波長546nm)の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬18(0.0
7ml)を加え、37℃で5分間反応させ、450nm
(副波長546nm)の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表1に示す(比較例5)。また、
比較例5における試薬13の代わりに試薬14〜17を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例5とともに
表1に示す(実施例9〜12)。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
1ml)を加え、37℃で5分間加温し、546nm
(副波長660nm)の吸光度を、サンプルブランクを
最終液量補正して測定した。次いで、試薬24(0.1
5ml)を加え、37℃で5分間反応させ、546nm
(副波長660nm)の吸光度を測定し、濃度既知のジ
タウロビリルビンを標準として試料中の直接型ビリルビ
ン値を求めた。結果を表2に示す(比較例6)。また、
比較例6における試薬19の代わりに試薬20〜23を
用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例6とともに
表2に示す(実施例13〜16)。
薬によれば、間接型ビリルビンはほとんど酸化されない
ことがわかる。
01ml)を加え、37℃で5分間反応させたのち、試
薬30(0.3ml)を加え、さらに37℃で5分間反
応させた。この反応液の600nm(副波長660n
m)の吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリルビン
を標準として試料中の直接型ビリルビン値を求めた。結
果を表3に示す(比較例7)。また、比較例7における
試薬25の代わりに試薬26〜29を用いて同様に測定
値を求めた。結果を比較例7とともに表3に示す(実施
例17〜20)。
薬によれば、別の測定法を用いた場合にも、間接型ビリ
ルビンはほとんど酸化されないことがわかる。
の間接型ビリルビン試料(試料1)の代わりに試料5の
直接型ビリルビン試料を用いて同様に測定値を求めた
(実施例21〜24、実施例25〜28、実施例29〜
32)。測定値と試料の希釈率との関係を図7(実施例
21〜24)、図8(実施例25〜28)図9(実施例
29〜32)に示した。両者の関係はほぼ原点を通る直
線となり、この発明の請求項2〜3の試薬が臨床検査な
どの手段として十分な測定範囲を有することがわかる。
れば、閉塞性黄疸などの患者の生体液中において顕著に
増大することが知られている直接型ビリルビンを間接型
ビリルビンと正確に分別し測定することができ、臨床検
査その他において有用である。
(比較例1および実施例1)またはミロセシウム属(比
較例2および実施例2)菌株由来の酵素を用いたこの発
明の請求項1の試薬による間接型ビリルビンをサンプル
として用いた場合の直接型ビリルビン測定値とサンプル
希釈率の関係を比較例とともに示した図である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項1の試薬によ
る間接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を比較例と
ともに示した図である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項1の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項1の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項1の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
菌株由来の酵素を用いたこの発明の請求項1の試薬によ
る直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場合の直接
型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を示した図
である。
4)による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
8)による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
2)による直接型ビリルビンをサンプルとして用いた場
合の直接型ビリルビン測定値とサンプル希釈率の関係を
示した図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 ビリルビンオキシダーゼを反応させて直
接型ビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬で
あって、ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロ
ール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリ
ルビン測定用試薬。 - 【請求項2】 酸化剤を反応させて直接型ビリルビンの
変化を光学的に測定するための試薬であって、酸化剤と
ともに、テトラピロール環化合物を共存させることを特
徴とする直接型ビリルビン測定用試薬。 - 【請求項3】 ジアゾニウム塩を反応させて直接型ビリ
ルビンの変化を光学的に測定するための試薬であって、
ジアゾニウム塩とともに、テトラピロール環化合物を共
存させることを特徴とする直接型ビリルビン測定用試
薬。 - 【請求項4】 テトラピロール環化合物がビリルビンで
ある請求項1、2または3記載の直接型ビリルビン測定
用試薬。
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- 1994-12-28 US US08/365,158 patent/US5599661A/en not_active Expired - Lifetime
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