JP2000189196A - 尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬 - Google Patents
尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬Info
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Abstract
広い測定方法及びより安価な試薬を提供する。 【解決手段】 測定方法は、少なくとも２種類の緩衝液
が含まれている液相中で、ｐＨ指示薬の存在下で尿素と
ウレアーゼを反応させて、生成するアンモニアによる液
相のｐＨ変化を光学的に検出する。試薬は、少なくとも
ｐＨ指示薬を含有する少なくとも２種類の緩衝液からな
る第一試薬、及び少なくともウレアーゼを含有する溶液
からなる第二試薬、とからなる。
Description
ともいう）測定方法および尿素窒素測定用試薬に関す
る。
用されている臨床検査薬は、作業効率向上の為、安定な
酵素の開発や、不安定な試薬組成物を安定化するための
各種添加剤、ｐＨ条件が検討され、溶液状態で長期間安
定な測定試薬が開発されている。さらに、定量範囲の拡
大、共存物質による影響の回避、再現性を向上させるこ
とにより再検率を低下させる事は作業効率の向上に欠か
せない。また、低コスト化を目指し、より安価な試薬の
開発が望まれている。
タル酸またはその塩、及び還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨともいう）あるいは還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以
下ＮＡＤＰＨともいう）の存在下に、グルタミン酸脱水
素酵素を作用させ、微量の（内因性）アンモニアを予め
除去する工程と、ウレア−ゼを加え試料中の尿素をアン
モニアに分解し、このアンモニアの生成量に対応するＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ［以下、両者を総じてＮＡＤ
（Ｐ）Ｈともいう］の減少速度を測定する工程（手順）
を順次経て測定されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度から尿
素窒素を求める方法が良く用いられている。この方法は
共存物質の影響が少なく、定量範囲が広く（以下、直線
性ともいう）、同時再現性にも優れている。さらに近
年、長期間安定な試薬や検体由来アンモニアの影響を受
けない試薬が開発されている。
間安定化させるために各種添加剤や精製度の高い原料が
必要になり、製造コストが大きくなる。また、検体由来
アンモニアの影響を受けなくするためには、アンモニア
を消去する反応系が必要となり、これもまた製造コスト
が大きくなる。他の反応系、例えば、ウレアーゼの作用
で生じたアンモニアをベルテロー（Ｂｅｒｔｈｅｌｏ
ｔ）反応で発色させ測定するウレアーゼ−インドフェノ
ール法は、安価ではあるが直線性が悪く、共存物質によ
る影響がある。ウレアーゼの作用で生じたアンモニアに
よるｐＨ上昇をｐＨ指示薬により比色定量するウレアー
ゼ−ｐＨ指示薬法も安価ではあるが直線性が悪い。先行
技術としてウレアーゼ、緩衝剤及び変色域の異なる２種
以上のｐＨ指示薬を含む、尿素濃度の変動の幅の大きい
検体にも有効に使用できる方法があるが（特開平０５−
１６１５００号公報）、ｐＨ指示薬は種類によってｐＨ
による変色域、吸収特性、塩や蛋白による影響が一様で
はなく、検体種、検体中夾雑物により測定値への影響が
みられる。また、直線性を向上させるために脱カルボン
酸反応に於いて、ｐＨ指示薬と緩衝液が同じｐＫａであ
れば定量性よく測定可能であると紹介されている（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８
１，５９−６５（１９８９））。確かに使用する緩衝液
の緩衝能のあるｐＨ域では同じｐＫａのｐＨ指示薬との
組み合わせにより定量性は向上するが、同じｐＫａのｐ
Ｈ指示薬と緩衝液であっても滴定曲線の形状は異なるた
め緩衝能からはずれたｐＨ域では定量性は得られない。
よって、従来からある測定方法では長期間安定で、定量
範囲が広い、より安価な試薬の開発は困難だと思われ
た。従って、本願の目的は、長期間安定で、定量範囲が
広い、より安価なＵＮ測定試薬を供することにある。
２種類の緩衝液が含まれている液相中で、ｐＨ指示薬の
存在下で尿素とウレアーゼを反応させて、生成するアン
モニアによる液相のｐＨ変化を光学的に検出することを
特徴とする尿素窒素の測定方法、に関する。また本発明
は、少なくともｐＨ指示薬を含有する少なくとも２種類
の緩衝液からなる第一試薬、及び少なくともウレアーゼ
を含有する溶液からなる第二試薬とからなる尿素窒素測
定用試薬、にも関する。
定量範囲が広い、より安価なＵＮ測定用試薬を供するた
め鋭意検討した結果、尿素がウレアーゼにより加水分解
されて生じるアンモニア量に依存して変化するｐＨをｐ
Ｈ指示薬由来のシグナルを検出することでＵＮを定量す
るために、尿素とウレアーゼとの反応を２種類以上の緩
衝液中で行い、そこに１種類のｐＨ指示薬を存在させる
ことで、定量的にＵＮを測定することができる方法を確
立した。ｐＨ指示薬と緩衝液の選択はｐＨ指示薬の滴定
曲線（Ｘ軸：アンモニア量、Ｙ軸：吸光度）がアンモニ
ア量に依存して吸光度も定量的に変化するような２種類
以上の緩衝液と１種類のｐＨ指示薬を選択、使用するこ
とにより目的は達成される。
ｐＨ指示薬のｐＫａ付近のｐＨ域で使用する緩衝液の緩
衝能を高く、ｐＫａから離れたｐＨ域で緩衝能を低くす
るような２種類以上の緩衝液を組み合わせることにあ
る。しかし、試薬を構成する成分は、共存物質による影
響を回避するためや、再現性を向上するため、保存安定
性を向上するために各種添加剤を添加するのが一般的で
あり、添加剤の中にはｐＨ指示薬の滴定曲線を変化させ
ることがあるため、これらの添加物が添加された条件で
のｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：アンモニア量、Ｙ軸：
吸光度）がアンモニア量に依存して吸光度も定量的に変
化するように２種類以上の緩衝液を選択する。一般に緩
衝液はｐＨを変動させないように用いるものであって、
緩衝能のないｐＨ域での使用はされない。しかしなが
ら、本願は緩衝能のある領域から、緩衝能の弱い領域ま
での広範囲のｐＨ域も使用することによりｐＨ指示薬の
広範囲な変色域を利用できる。緩衝能の弱いｐＨ域での
呈色測定はｐＨが安定しないため正確な測定ができない
と予想されたが、意外にも緩衝能の弱いｐＨ域も含む広
範囲な測定域で再現性良く測定できることが確認され、
本願を完成するに至った。
しては、ウレアーゼ活性の発現できるｐＨ域で変色する
ｐＨ指示薬であれば良い。例えば、テトラ・ブロム・フ
ェノールブルー、ブロム・フェノールブルー、メチルオ
レンジ、ブロム・クレゾールグリーン、メチルレッド、
クロルフェノールレッド、Ｐ−ニトロフェノール、ブロ
ム・クレゾールパープル、ブロム・チモールブルー、フ
ェノールレッド、クレゾールレッド、クレゾールベンゼ
イン、メタ・クレゾールパープル、プロピル−α−ナフ
トールオレンジ、Ｏ−クレゾールフタレインコンプレク
ソンが好適に使用でき、これらの水溶性を高めるために
塩（塩とはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、塩
酸塩等をいう）や水和物を用いることができるが、これ
らのｐＨ指示薬に限定されるものではない。使用できる
濃度は、反応時や保存中に塩析しない濃度であれば良
く、１０μＭから１０ｍＭが好ましい。
を完成させるために必要な各種添加剤を添加した条件に
おいて、使用するｐＨ指示薬の滴定曲線（Ｘ軸：吸光
度、Ｙ軸：ｐＨ）と同じ形状の滴定曲線（Ｘ軸：酸また
はアルカリ添加量、Ｙ軸：ｐＨ）となるように、２種類
以上の緩衝液を適宜組み合わせて使用すればよい。グッ
ド緩衝液（例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤ
Ａ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯ
ＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、
ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎ
ｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ）、トリエタノ
ールアミンあるいはその塩酸塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン、グリシルグリシン、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等、緩衝液の種類は限定されない。使用できる
濃度は、ウレアーゼの作用で生じたアンモニアによりｐ
Ｈが上昇できる緩衝能を持つ濃度でｐＨ指示薬の滴定曲
線（Ｘ軸：吸光度、Ｙ軸：ｐＨ）と同じ形状の滴定曲線
（Ｘ軸：酸またはアルカリ添加量、Ｙ軸：ｐＨ）となる
ように緩衝液を組み合わせることが必要である。使用で
きる濃度は、反応時や保存中に塩析しない濃度であれば
良く、０．１ｍＭから１００ｍＭが好ましい。
時間内にアンモニアに加水分解できる活性が必要であ
る。使用できる活性濃度は０．０１Ｕ／ｍｌ以上であれ
ば良く、０．１Ｕ／ｍｌから１０Ｕ／ｍｌが好ましい。
ウレアーゼの由来は特に限定されないが、ナタマメやバ
クテリア由来が好適に使用できる。
である第一試薬のｐＨは、中性付近が好ましく、特にｐ
Ｈ６．０から８．０が好ましい。また、検体中の共存物
質による影響を回避する為や、再現性を向上させる為に
各種添加剤を使用することができる。乳び検体による影
響の回避や同時再現性の向上には、非イオン性界面活性
剤が好適に使用できる。使用できる濃度は、０．１％か
ら３．０％が好ましい。ビリルビン検体による影響の回
避にはアルブミンが好適に使用できる。使用できる濃度
は、０．０２％から１．０％が好ましい。溶血検体によ
る影響の回避には、還元剤（例えば、アスコルビン酸、
塩酸ヒドロキシルアミン、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸
カリウム）が好適に使用できる。トリンダー試薬を使用
した測定試薬は、還元剤の添加により測定値への影響が
見られるが、本発明においては還元剤による測定値への
影響を受けないという点で優れている。使用できる濃度
は、０．０１ｍＭ以上で使用でき、０．０２ｍＭから
１．０ｍＭが好ましい。検体中の蛋白による影響は、塩
類（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリ
ウム、硫酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ム）により回避される。使用できる濃度は０．０１Ｍ以
上で使用でき、０．０５Ｍから０．５Ｍが好ましい。
薬のｐＨは中性付近が好ましく、特にｐＨ６．０から
８．０が好ましい。ウレア−ゼを安定化するためにＮ−
アセチルシステイン、アルブミン、キレート剤（例え
ば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴ
Ａ−ＯＨ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＤＨＥＧ、ＩＤＡ、
ＥＤＤＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＮＴＰ、Ｍｅｔｈｙｌ−Ｅ
ＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＴＰＯ、ＮＴＰＯ、
ＢＡＰＴＡ、ＣＮ）、アセトヒドロキサム酸と共存させ
ても良い。
せると、ウレアーゼの作用によってアンモニアが生成さ
れる。このアンモニア量依存的に反応の液相のｐＨが高
くなり、ここにある種のｐＨ指示薬を存在させておけ
ば、このｐＨ指示薬による液相の変色は尿素窒素の量を
反映させるものとなる。従って、この変化を光学的（例
えば、比色法）に検出することで、尿素窒素の含有量を
定量することができる。
る。 （１）試薬１は以下に示す６種類を作製した。 （試薬１−Ａ） ０．０４％ フェノールレッド ２．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花
王株式会社製、商品名エマルゲン４２０）（以下同様） ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７） （試薬１−Ｂ） ０．０４％ フェノールレッド ２．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ６．７） （試薬１−Ｃ：本発明） ０．０４％ フェノールレッド ２．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ
（ｐＨ６．７） （試薬１−Ｄ） ０．１ ｍＭ Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン １．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル ５．０ ｍＭ 塩化カルシウム２水和物 ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む２０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ７．６） （試薬１−Ｅ） ０．１ ｍＭ Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン １．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル ５．０ ｍＭ 塩化カルシウム２水和物 ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む２０ｍＭ ＴＡＰＳＯ（ｐＨ７．６） （試薬１−Ｆ：本発明） ０．１ ｍＭ Ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン １．０ ％ ポリオキシエチレンオレイルエーテル ５．０ ｍＭ 塩化カルシウム２水和物 ０．０５Ｍ 塩化ナトリウム を含む１０ｍＭ ＴＡＰＳＯ、１０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ７．６） （２）試薬２ ０．４ｍｇ／ｍｌ ウレアーゼ（ナタマメ由来、東洋紡
績株式会社）水溶液 （３）検体 尿素を用いて、尿素窒素量が０，５０，１００，２０
０，３００，４００，５００ｍｇ／ｄｌとなるように調
製した各希釈列水溶液。 （４）測定方法 各希釈列水溶液１２μｌに各試薬１を２４０μｌ加え攪
拌し、３７℃、５分間加温した後、それぞれに試薬２を
６０μｌ加え攪拌し、３７℃、５分間加温し、波長５７
０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１及び図２
に示す。図１〜図２において、◇は試薬１−Ａ、□は試
薬１−Ｂ、○は試薬１−Ｃ（本発明）、◆は試薬１−
Ｄ、■は試薬１−Ｅ、そして●は試薬１−Ｆ（本発明）
を用いた場合を示す。
なる試薬１−Ａ（図１内の◇）、試薬１−Ｂ（図１内の
□）、試薬１−Ｄ（図２内の◆）及び試薬１−Ｅ（図２
内の■）を用いた場合では、その検量線は直線性が得ら
れていない。これに対し、本発明の試薬１−Ｃ（図１内
の○）及び試薬１−Ｆ（図２内の●）によれば、少なく
とも尿素窒素濃度が０〜５００ｍｇ／ｄｌまでの間にお
いて、その検量線は原点を通る直線性を示し、尿素窒素
の定量法として用いることができる。
から高値に渡り広い範囲で尿素窒素を定量することがで
きる。また、従来法と比較して高価な酵素を用いず、安
価な試薬を提供することができる。更に、これらの試薬
は液状試薬として長期間安定的に使用できる。本発明は
かかる格段の効果を有するものである。
である。
である。
Claims (2)
- 【請求項１】 少なくとも２種類の緩衝液が含まれてい
る液相中で、ｐＨ指示薬の存在下で尿素とウレアーゼを
反応させて、生成するアンモニアによる液相のｐＨ変化
を光学的に検出することを特徴とする尿素窒素の測定方
法。 - 【請求項２】 少なくともｐＨ指示薬を含有する少なく
とも２種類の緩衝液からなる第一試薬、及び少なくとも
ウレアーゼを含有する溶液からなる第二試薬、とからな
る尿素窒素測定用試薬。
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|---|---|---|---|
| JP37648098A JP4194158B2 (ja) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | 尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬 |
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1998
- 1998-12-25 JP JP37648098A patent/JP4194158B2/ja not_active Expired - Fee Related
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