JPH06339398A - ナトリウムイオンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 水性媒体中、試料中のナトリウムイオンをβ
−ガラクトシダーゼを用いて定量する方法において、ナ
トリウムイオンに競合する陽イオンの存在下にβ−ガラ
クトシダーゼ反応を行うことを特徴とする方法。 【効果】 定量性及び再現性がよく、簡便にかつ迅速に
ナトリウムイオンを測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ナトリウムイオンに競
合する陽イオンの存在下、β−ガラクトシダーゼを用い
たナトリウムイオンの定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中のナトリウムイオンを化学的
に定量する方法として、ナトリウムイオン量と比例して
活性が増加するβ−ガラクトシダーゼによる反応に、該
酵素反応が過剰のナトリウムで飽和するのを防止するた
め、クリプトフィクス２２１（商標名）を用いる定量法
が知られている〔クリニカルケミストリー，３４巻，２
２９５頁，１９８８年〕。該定量法において、クリプト
フィクス２２１の代わりにリチウムイオンを用いる方法
が開示されているが、リチウムイオン単独を用いた具体
例はない（特表平１−５０３５９６号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】クリプトフィクス２２
１等の二環式クラウンエーテルを用いる方法は、クリプ
テートの解離速度が小さく測定までの予備反応に時間が
かかり、測定操作の簡便さに欠けること、またこのよう
な性質からクリプトフィクス２２１とβ−ガラクトシダ
ーゼをプレインキュベーションさせるため、クリプトフ
ィクス２２１によりβ−ガラクトシダーゼの安定性が損
なわれ低濃度のナトリウムイオンの定量性に欠けるこ
と、反応のｐＨがアルカリ側に限定されること等の問題
があり、より良い方法の開発が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、水性媒体中、
試料中のナトリウムイオンをβ−ガラクトシダーゼを用
いて定量する方法において、ナトリウムイオンに競合す
る陽イオンの存在下にβ−ガラクトシダーゼ反応を行う
ことを特徴とするものである。本発明において、水性媒
体とは、緩衝液、生理食塩水等、水を含有する液体を表
し、緩衝液としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液（以下「トリス−塩酸緩衝液」と
いう。）、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝
液、シュウ酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、
グリシン緩衝液、バルビタ−ル緩衝液又はグッド（ＧＯ
ＯＤ）の緩衝液等があげられる。

【０００５】ナトリウムイオンを含む試料としては、水
性媒体に混和する試料であればどのようなものでもよ
く、全血、細胞等、原子吸光法、炎光光度法等では測定
しにくい生体中の試料についても測定できる。ナトリウ
ムイオンに競合する陽イオンとしては、リチウムイオ
ン、カリウムイオン、ルビジウムイオン又はセシウムイ
オン等のアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンが
あげられる。これらのイオンを単独又は２種以上混合し
て本発明に用いる。本反応に好適なナトリウムイオンに
競合する陽イオンの濃度は、リチウムイオンで１３０ｍ
Ｍ〜０．５Ｍ、カリウムイオンで２０〜２００ｍＭ、セ
シウムイオンで１２０〜５００ｍＭ、ルビジウムイオン
で２０〜５００ｍＭ、アンモニウムイオンで５０〜５０
０ｍＭである。

【０００６】リチウムイオン又はカリウムイオンの供給
源としては、これらのイオンの塩化物塩、硝酸塩、硫酸
塩、水素化ホウ素化合物等があげられる。その他、ルビ
ジウムイオン又はセシウムイオンの供給源としては、こ
れらのイオンの塩化物塩等があげられる。アンモニウム
イオンの供給源としては、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム等があげられる。

【０００７】本発明におけるβ−ガラクトシダーゼとは
酵素番号〔ＥＣ．３．２．１．２３〕に属する酵素であ
ればよく、動物、微生物又は植物から採取したβ−ガラ
クトシダーゼあるいはそれらを遺伝子工学により改変し
製造した酵素が含まれる。β−ガラクトシダーゼの基質
としては、合成品あるいは天然物のいずれでもよく、例
えば、β−Ｄ−ガラクトシド、アリールβ−Ｄ−ガラク
トシド、アルキルβ−Ｄ−ガラクトシド、３，６−ジヒ
ドロキシフルオランβ−Ｄ−ガラクトシド、ニトロフェ
ニルβ−Ｄ−ピラノグリコシド、ニトロフェニルβ−Ｄ
−ガラクトシド、ラクチノール、ラクトース、４−メチ
ルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド等があげられ
る。また、β−ガラクトシダーゼの活性化剤として、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム
等を用いる。

【０００８】反応液中で減少するβ−ガラクトシダーゼ
の基質量の変化は、前述の例えば、ニトロフェニルβ−
Ｄ−ガラクトシド等の基質の減少を吸光度等で測定する
ことにより求めることができる。反応液中で生成するβ
−ガラクトシダーゼ反応生成物の量は、例えば前述の基
質から、β−ガラクトシダーゼ反応により生成するガラ
クトース、アグリコン部、３，６−ジヒドロキシフルオ
ラン、ニトロフェノール等を比色法、吸光光度法、蛍光
光度法、酸化還元測定法、高速液体クロマトグラフィー
法等で測定することにより求めることができる。また、
該酵素反応をガラクトースデヒドロゲナーゼ等と共役さ
せて、生成する還元型補酵素量を定量してもよい。

【０００９】以下に本発明のナトリウムイオンの定量方
法の好ましい態様について説明する。前記の緩衝液（５
０〜１０００ｍＭ／Ｌ溶液：ｐＨ５．０〜９．５）に、
ナトリウムイオンに競合する陽イオン、マグネシウムイ
オン１〜２０ｍＭ及び試料を加える。該溶液にβ−ガラ
クトシダーゼの基質１〜１２ｍＭ又はβ−ガラクトシダ
ーゼ２００〜７５００単位／Ｌを添加し、８〜５０℃で
１秒間以上予備反応させる。次に、前記においてβ−ガ
ラクトシダーゼを加えた場合はβ−ガラクトシダーゼの
基質１〜１２ｍＭを、またβ−ガラクトトシダーゼの基
質を加えた場合はβ−ガラクトシダーゼ２００〜７５０
０単位／Ｌを加え、８〜５０℃で１秒以上反応させる。
反応液中で減少するβ−ガラクトシダーゼの基質量を前
述の方法により測定するか、又は反応液中で生成するβ
−ガラクトシダーゼ反応生成物の量を前述の方法により
測定し、β−ガラクトシダーゼ反応で消費された基質量
を測定する。当該酵素反応においては、試料中のナトリ
ウムイオン相当量の基質が消費されるので、当該測定法
によりナトリウムイオンの定量を行うことができる。

【００１０】本発明方法を実施する際、反応液の濁りの
発生防止等のため、必要に応じてトリトンＸ−１００等
の界面活性剤を加えることができる。また、必要に応じ
て試料中のアルブミンの影響を低減し、可溶化剤ともな
るウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）を加えることができる。更に、必要に応じ
て、ヒト免疫グロブリン、卵白アルブミン等のタンパク
質、ジメチルスルホキシド等の可溶化剤、ジチオスレイ
トール等の抗酸化剤を加えることができる。

【００１１】また、本発明方法には、２〜３価金属の干
渉を除去し、ナトリウムイオンに競合する陽イオンの効
果を増強するためにエチレンビス（オキシエチレンニト
リロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤を加えることができる。
更に、測定の精度を向上させ、ナトリウムイオンに競合
する陽イオンの効果を増強するために、単環式クラウン
エーテル等のナトリウムイオンの結合剤も加えることが
できる。単環式クラウンエーテルとしては、１８−クラ
ウン−６、Ｎ−〔２−（メトキシ）エチル〕モノアザ−
１５−クラウン−５又はＮ−〔２−（２−メトキシエト
キシ）エチル〕モノアザ−１５−クラウン−５等があげ
られる。単環式クラウンエーテルの濃度は、通常５〜１
００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭである。これら、
キレート剤、結合剤を加えることにより、ナトリウムイ
オンに競合する陽イオンの好適な濃度を低下させること
ができる。

【００１２】本発明に用いたナトリウムイオンに競合す
る陽イオンは、ナトリウムイオンの活量を必要十分に減
少させるため、本発明の定量方法では測定までの予備反
応に時間がかからず、β−ガラクトシダーゼとのプレイ
ンキュベーションの必要がない。そのため、β−ガラク
トシダーゼの安定性を損なうことがなく、酵素が安定な
状態で測定できる。更に、本発明は反応液のｐＨ適用範
囲がクリプトフィクスを用いた反応より広い。従って、
本発明により、定量性がよく、迅速かつ簡便な生体中の
ナトリウムイオンの新規な定量方法が提供される。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例１） （１）ナトリウムイオン検量線用標準液の調製 塩化ナトリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、
反応液中１００ｍＭ〜１８０ｍＭのナトリウムイオン検
量線用標準液を調製した。 （２）ナトリウムイオンの定量 試験管にナトリウムイオン検量線用標準液０．０５ｍＬ
を添加した後、予め３７℃に加温したβ−ガラクトシダ
ーゼ（シグマ社製）１１００単位／Ｌ、ＤＬ−ジチオス
レイトール（シグマ社製）３ｍＭ、硫酸マグネシウム
（シグマ社製）１１．２ｍＭ、塩化リチウム（和光純薬
工業製）２２０又は２６０ｍＭを含む３００ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２．０ｍＬを加えた。これ
に予め３７℃に加温したｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピ
ラノグリコシド（メルク社製）１．５ｍＭを含む蒸留水
１．０ｍＬを加え、攪拌混合させて３７℃で反応させて
１分間に生成するｏ−ニトロフェノールの量を、分光光
度計（ＵＶ３４００日立製）を用いて４２０ｎｍの可視
部の吸収強度から定量した。得られた検量線を図１に示
した。

【００１４】（実施例２）塩化リチウム（和光純薬）濃
度を９０又は１３０ｍＭに代える以外は、実施例１と同
様にしてナトリウムイオンを定量した。得られた検量線
を図２に示した。塩化リチウムは１３０ｍＭの濃度で直
線性を示した。 （実施例３）塩化リチウムの代わりに５０ｍＭの塩化カ
リウムを用い、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピラノグリ
コシドの濃度を１．５又は３ｍＭとする以外は、実施例
１と同様にしてナトリウムイオンを定量した。得られた
検量線を図３に示した。

【００１５】（実施例４）塩化リチウムの代わりに５０
又は１００ｍＭの塩化アンモニウムを用いる以外は、実
施例１と同様にしてナトリウムイオンを定量した。得ら
れた検量線を図４に示した。 （実施例５）塩化リチウムの代わりに１４０又は２７０
ｍＭの塩化セシウムを用いる以外は、実施例１と同様に
してナトリウムイオンを定量した。得られた検量線を図
５に示した。

【００１６】（実施例６）ナトリウムイオン検量線用標
準液の代わりにヒトから得た血清２検体を試料として、
３ｍＭのｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピラノグリコシド
を用いてＨＳＡ１．５ｇ／Ｌを反応液に添加する以外
は、実施例１と同様にしてナトリウムイオン濃度を測定
した。結果を表１に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】表１から明らかなように、本発明方法によ
る測定値と炎光法による測定値が一致した。 （実施例７）塩化リチウムの代わりに１５０ｍＭの塩化
カリウムを用い、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピラノグ
リコシドの濃度を２ｍＭとする以外は、実施例１と同様
にして１５０ｍＭのナトリウムイオン標準液を測定（ｎ
＝１０）したところ、定量値の変動係数（以下「ＣＶ」
という。）は１．５〜２．８％であった。

【００１９】（実施例８）塩化カリウムの濃度を７５ｍ
Ｍとし、塩化カリウムと共に１９ｍＭの１８−クラウン
−６を加える以外は、実施例７と同様にしてナトリウム
イオン定量値のＣＶを測定したところ、０．６３〜０．
８８％であった。 （実施例９）塩化リチウムの濃度を１５０ｍＭとし、塩
化リチウムと共に５０ｍＭのＮ−〔２−（メトキシ）エ
チル〕モノアザ−１５−クラウン−５を加え、ｏ−ニト
ロフェニルβ−Ｄ−ピラノグリコシドの濃度を２ｍＭと
する以外は、実施例１と同様にして１５０ｍＭのナトリ
ウムイオン標準液を測定（ｎ＝１０）したところ、定量
値のＣＶは０．４３〜０．７５％であった。

【００２０】

【発明の効果】本発明により、定量性及び再現性がよ
く、簡便にかつ迅速にナトリウムイオンを測定すること
ができる方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】２２０ｍＭ以上のリチウムイオンによるナトリ
ウムイオンの検量線。

【符号の説明】

−○− リチウムイオン２２０ｍＭ −●− リチウムイオン２６０ｍＭ

【図２】１３０ｍＭ以下のリチウムイオンによるナトリ
ウムイオンの検量線。

【符号の説明】

−○− リチウムイオン９０ｍＭ −●− リチウムイオン１３０ｍＭ

【図３】カリウムイオンによるナトリウムイオンの検量
線。

【符号の説明】

−○− ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピラノグリコシド
１．５ｍＭ −●− ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ピラノグリコシド
３ｍＭ

【図４】アンモニウムイオンによるナトリウムイオンの
検量線。

【符号の説明】

−○− アンモニウムイオン５０ｍＭ −●− アンモニウムイオン１００ｍＭ

【図５】セシウムイオンによるナトリウムイオンの検量
線。

【符号の説明】

−○− セシウムイオン１４０ｍＭ −●− セシウムイオン２７０ｍＭ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性媒体中、試料中のナトリウムイオン
   をβ−ガラクトシダーゼを用いて定量する方法におい
   て、ナトリウムイオンに競合する陽イオンの存在下にβ
   −ガラクトシダーゼ反応を行うことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 ナトリウムイオンに競合する陽イオンが
   カリウムイオン、セシウムイオン及びアンモニウムイオ
   ンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】 更に、単環式クラウンエーテルを共存さ
   せてβ−ガラクトシダーゼ反応を行う請求項２記載の方
   法。
4. 【請求項４】 ナトリウムイオンに競合する陽イオンと
   してリチウムイオンを１３０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で用
   いる請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 更に、単環式クラウンエーテルを共存さ
   せてβ−ガラクトシダーゼ反応を行う請求項４記載の方
   法。