JPH01181799A - 塩素イオン定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素法による塩素イオンの定量用試薬に係り
、特に共存する妨害イオンの影響を回避した塩素イオン
定量用試薬に関する。

〔従来の技術〕

生体試料、例えば血清、尿、髄液中のイオンの定量法と
して、現在、電量滴定および電極法が繁用されている。

しかし、電量滴定法は生化学自動分析装置への組み込み
が困難であり、電極法はイオン特異性の点で問題がある
。そこで、次のような酵素法が存在する。

この酵素法は、例えばＥ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍ、　４１　。

Ｐ１７１／−１８０（１９７４）、で示されるように、
哺乳類由来のアミラーゼと、カルシウムイオンとの親和
性が塩素イオンにより変化する性質を利用した方法であ
る。酵素法による塩素イオンの測定原理は、次のようで
ある。

塩素イオン非存在下にブタすい臓のα−アミラーゼを、
エチレンジアミン四酢酸（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）等のカルシ
ウムイオンと錯体を形成する錯体形成試薬（カルシウム
キレータ）および微量のカルシウムイオン共存させると
、ブタすい臓α−アミラーゼは分子内カルシウムイオン
を放出して、非活性のα−アミラーゼに変化する。本状
態に、血清等の試料を添加すると、試料中の塩素イオン
濃度に応じて、非活性アミラーゼがカルシウムイオンと
再結合して、活性型に変化する。変化した活性型のα−
アミラーゼを、α−アミラーゼ活性測定用試薬で測定し
、塩素イオン濃度に換算する。

この酵素法は、電極法に比ベイオン特異性が高く、生化
学自動分析装置への適用も可能な測定法にある。次の第
１表に、電極法と酵素法のイオンの特異性を、塩素イオ
ンに対する感度を１００％として示す。

第１表 上記第１表に示されるように、酵素法では電極法に比ベ
イオン特異性が優れていることがわかる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来の酵素法では、亜硝酸イオンと硝酸イオンの影
響の回避についての配慮がなされておらず、選択性の面
で問題が残されていた。すなわち、本発明者らが鋭意検
討したところ、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンが存在す
ると、イオン特異性が劣化することを見い出した。すな
わち、前記第１表かられかるように、亜硝酸イオンで１
０．３％、硝酸イオンで９．８％の値を示しており、こ
れらのイオンの影響を回避する配慮がなされていないこ
とがわかった。

本発明は、かかる問題点を解決するために、硝酸イオン
、亜硝酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い塩
素イオン定量用試薬を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明は、カルシウムイオ
ンと錯体を形成する錯体形成試薬と、アミラーゼと、カ
ルシウムイオンと、を備えた塩素イオン定量用試薬であ
って、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解する試薬が
含有されてなることを特徴とする塩素イオン定量用試薬
である。

上記本発明において、カルシウムイオンと錯体を形成す
る錯体形成試薬としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ
、Ｎ、Ｎ、Ｎ’−テトラ酢酸、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸、イミノ四酢酸、ジアミノプロパン四酢酸な
どが用いられる。

また、アミラーゼ活性測定用試薬としては、通常のα−
アミラーゼ活性測定法において公知慣用の試薬である。

例えば、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−アルドペンタオ
シド、２−クロル−４−二トルフェニルーβ−Ｄ−マル
トペンタオシド、２−クロル−４−ニトロフェニル−β
−Ｄ−マルトヘプタオシドなどがある。

アミラーゼとしては、各種アミラーゼ、例えばα−アミ
ラーゼ、β−アミラーゼ等を用いることができる。

また、本発明において、硝酸イオンおよび亜硝酸イオン
を分解する物質としては、例えば硝酸レダクターゼ、亜
硝酸レダクターゼ等の酵素を用いることができる。この
他に、無機、有機の各種の分解物質を用いることもでき
る。酵素を用いて亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解
する場合には、基質特異性があり、他のイオンに影響を
与えないという利点が存在する。

〔実施例〕

本実施例は、試料溶液中、例えば血清試料に含まれてい
る硝酸イオン、亜硝酸イオンを酵素によって分解する。

硝酸イオンを分解するものとしては硝酸レダクターゼで
あり、亜硝酸イオンを分解する酵素は亜硝酸レダクター
ゼである。

硝酸レダクターゼと硝酸との酵素反応を以下に示す。

ＮＡＤ　（Ｐ）　”十亜硝酸十Ｈ，０ ＮＡＤＰ”十亜硝酸十Ｈ，０ ＮＡＤ”十亜硝酸十Ｈ，０ フェリシロクロム＋亜硝酸塩 一方、亜硝酸レダクターゼと亜硝酸との反応を次に示す
。

３ＮＡＤ　（Ｐ）　”＋ＮＨ４ＯＨ＋Ｈ，０−酸化窒素
十Ｈ，Ｏ＋受容体 一酸化窒素十Ｈ，Ｏ＋２酸化型シトクロムＣ本実施例で
は、上記酵素反応を利用して亜硝酸イオンおよび硝酸イ
オンを分解することができる。

次に、本発明に係る塩素イオン定量用試薬の具体的な組
成について説明する。

本例では、塩素イオン定量時の妨害成分となる硝酸イオ
ン、亜硝酸イオンを分解するために、硝酸レダクターゼ
、亜硝酸レダクターゼおよびＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを使用し
た。また、α−アミラーゼ測定用試薬として、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびニークロル−４
−二トロフェニルーβ−Ｄ−マルトヘプタオシドも使用
した。試薬は第１試薬と第２試薬から構成される。

（１）第１試薬 第１試薬は次の組成からなる。

エチレンジアミン四酢酸カルシウム１５ｍｇおよびエチ
レンジアミン西酢酸ニナトリウム１．１ｇを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液１００＋＋１２に加え、５％水酸化ナトリウ
ム水溶液を用いてｐＨを７．０に調整した。この溶液を
溶液Ａとする。その後、α−グルコシダグーＩＩＫ単位
（Ｕ）、β−グルコシダーゼ３００Ｕ、ブタすい臓α−
アミラーゼ２ＫＵ、硝酸レダクターゼ２００Ｕ、亜硝酸
レダクターゼ２００Ｕ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈｏ、６ｍＭを
加え、第１試薬とした。

（２）第２試薬 第２試薬の組成は次のものからなる。

２−クロル−４−ニドフェニル−β−Ｄ−マルトヘプタ
オシド１．０ｇを、前記第１試薬で説明した溶液Ａ　１
００ａＱに溶解し、第２試薬とした。

次に、塩素イオン測定について説明する。

（３）　　キャリブレーション 標準溶液として、０，４０．８０，１２０，１６０．２
００ｍＭの各食塩水を調整した。それぞれ、６μΩに対
し、第１試薬３２０μ２．第２試薬８０μ２を加え、３
７℃で主波長４０５＋＋ｓ＋、副波長４８０ｍにおける
経時的な吸光度の上昇を、日立７１５０型自動分析装置
で測定し、キャリブレーションを行った。

経時的な吸光度の上昇は、塩素イオンの濃度に比例して
生じる。

第１図に、自動分析装置の操作手順を示す。

本実施例に係る試薬を用いての塩素イオンの測定は、第
１図で示された工程に従って行われる。

第１図に示すように、サンプル分注後、第１試薬を添加
、撹拌し、数分間反応させたのち、第２試薬を添加、撹
拌し、さらに反応させる。第１試薬添加後から測定終了
までの間の反応液の吸光度を、数１０秒間隔で測定し、
分析法に応じたタイミングの吸光度を用いて、塩素イオ
ンの定量を行う。

（４）硝酸イオン添加による影響 試料としてコントロール血清に硝酸ナトリウム溶液を添
加した溶液を用いた。コントロール血清は、指定量の半
量の蒸留水で溶解した。これを溶液Ｂとする。硝酸ナト
リウム１．７ｇを１００ａＱの蒸留水で溶解し、２００
ｍＭ硝酸イオンを調整した。これを溶液Ｃとする。溶液
Ｃを適宜希釈し、４０．８０，１２０，１６０，２００
ｍＭ硝酸ナトリウム溶液を調整し、それぞれを溶液Ｂと
１：１の割合で混合した。このときの塩素イオンの定量
結果を、従来試薬（（１）の第１試薬より硝酸レダクタ
ーゼ、亜硝酸レダクターゼ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを除去し
たもの、第２試薬は（２）と同じ）での定量結果と共に
、第２図に示す。第２図に示すように、従来法では、試
料中の硝酸イオンの濃度が高濃度になると、塩素イオン
の定量結果も高く測定されていたが、本法によれば、硝
酸イオンの影響が完全に回避できた。

（５）亜硝酸イオン添加による影響 亜硝酸ナトリウム０．３８　ｇを１００ｗｒ２の蒸留水
で溶解し、２００ｍＭ亜硝酸イオン溶液を調整した。（
４）と同様に試料を調整し、本法と従来法で塩素イオン
を定量した。その結果を第３図に示す。（４）と同様、
本法によれば、亜硝酸イオン影響が完全に回避できた。

本発明の塩素イオン定量用試薬により定量可能な塩素イ
オンの濃度は、試料中の濃度として約１０　ｍ　Ｍ〜３
０００ｍＭである。この濃度範囲は、通常血清中の塩素
濃度を測定する際に必要な範囲である７０〜１３０ｍＭ
を十分に担保することができる。本発明試薬によれば、
血液中の塩素イオン濃度を十分定量することができる。

本発明に係る塩素イオン定量用試薬における試薬の各成
分の許容濃度範囲を次に示す。

第１試薬については、次のとおりである。

α−グルコシダーゼ８０〜ｌｌ０ＫＵ／ｆｌ、β−グル
コシダーゼ２．５〜３　ＫｔＪ／　ｕ　＋　α−アミラ
ーゼ２〜２０ＫｔＪ／Ｑ、Ｃａ”０．７５〜４．５ｍ　
Ｍ　／　＋２）ＥＤＴＡ３０〜１００ｍＭ／Ｑ、リン酸
緩衝液ｐＨ７，０，０，１Ｍ／Ｑ、硝酸レダクターゼ２
〜２０ＫＵ／Ｑ、亜硝酸レダクターゼ２〜２０　Ｋ　Ｕ
　／　Ｑ　、　Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｐ　）　Ｈ６〜６０　ｍ
　Ｍ　／　Ｑ　。

第２試薬の成分の含有量としては、例えば次のとおりで
ある。Ｃａ”０．７５〜１．５ｍＭ／Ｑ、Ｅ　Ｄ　Ｔ　
Ａ　３０〜１００　ｍ　Ｍ　／　Ｑ、２−クロル−４ニ
トロフェニル−β−Ｄ−マルトヘプタオシド３　、８〜
７　、５　ｍ　Ｍ　／　Ｑ　。

ナオ、２−クロル−４−二トロフェニルーβ−Ｄ−マル
トヘプタオシドの代わりに、マルトペンタオース２．５
％を用いることもできる。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれば、硝酸イオン、亜
硝酸イオンを分解できるので、硝酸イオン、および亜硝
酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い塩素イオ
ン定量用試薬を提供することができる。したがって、よ
り正確な塩素イオンの定量を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、自動分析装置の測定手順の工程図、第２図は
硝酸イオン添加による塩素イオン測定値の影響を示すグ
ラフ、第３図は亜硝酸イオン添加による塩素イオン測定
値の影響を示すグラフでる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルシウムイオンと錯体を形成する錯体形成試薬
   と、アミラーゼと、カルシウムイオンと、を備えた塩素
   イオン定量用試薬であって、亜硝酸イオンおよび硝酸イ
   オンを分解する試薬が含有されてなることを特徴とする
   塩素イオン定量用試薬。
2. （２）特許請求の範囲第１項において、前記亜硝酸イオ
   ンおよび硝酸イオンを分解する試薬が、硝酸レダクター
   ゼ、亜硝酸レダクターゼであることを特徴とする塩素イ
   オン定量用試薬。
3. （３）特許請求の範囲第１項において、前記錯体形成試
   薬はＥＤＴＡであることを特徴とする塩素イオン定量用
   試薬。
4. （４）特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に
   おいて、前記アミラーゼは哺乳類由来のα−アミラーゼ
   であることを特徴とする塩素イオン定量用試薬。