JPH1014597A - 体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】不活性型α−アミラーゼ、２−クロロ−４
−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−α−マルトシドおよび必要により、マルトオリゴ糖ま
たはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマル
トオリゴ糖および塩化ナトリウムを含有し、かつ、最終
ｐＨが５．５〜６．５に保持されている体液中のカルシ
ムイオン測定用試薬組成物および該試薬組成物を用い
て、体液中のカルシウムイオンを測定する方法。 【効果】α−アミラーゼ活性を利用するカルシウムイオ
ンの測定方法において、体液中のカルシムイオンを低い
値から高値まで幅広く、正確かつ簡便に測定できる測定
方法ならびに該方法に使用する測定用試薬組成物を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は体液中のα−アミラ
ーゼがカルシウムイオンによって活性化されることを利
用した、体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物な
らびに該試薬組成物を使用する測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、臨床検査の分野では、血清または
尿中のカルシウムイオン量の測定が頻繁に行われてい
る。血清または尿中のカルシウムイオン量の測定は、各
種病態の診断において有用な情報をもたらす。例えば、
低カルシウム血症として、低タンパク血症、低リン血
症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機
能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症として
は、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進
症、腎不全等の疾患の診断に用いることができる。

【０００３】体液中のカルシウムイオン測定法として
は、従来から（１）滴定法、（２）比色法、（３）原子
吸光法、（４）炎光光度計法、（５）電極法、（６）酵
素法などが知られている。。しかしながら、従来のこれ
らの方法では、正確かつ簡便にカルシウム量を測定する
ことができなかった。

【０００４】上記（１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレ
ートを用いて、化学的に滴定する方法であるが、煩雑で
ある、実施者により測定値に差異が出る、多量の試料を
短時間に処理できないという欠点を有する。また、上記
（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−ＣＰＣ（オルトク
レゾールフタレインコンプラクソン）を用いる方法は、
汎用の自動分析機に適用できる方法であるが、温度・時
間により吸光度が変化する、マグネシウムイオンの影響
を受ける等の欠点を有する。さらに、上記（３）の原子
吸光法は、試料を希釈することが必要である、手技に熟
練を要する等の欠点を有する。上記（４）の炎光光度計
法も特異性・再現性に欠点を有する。しかも、上記
（５）の電極法は、ｐＨの影響を受ける、機器を一定の
状態に維持することが煩雑である等の欠点を有する。

【０００５】上記（６）の酵素法には、（ａ）ホスホリ
パーゼＤを利用する方法（特開昭62-195297 号公報）、
（ｂ）カルモジュリンを利用する方法（特開昭62-36199
号公報）、（ｃ）α−アミラーゼを利用する方法（特開
平 2-276597 号公報）などがある。上記（ａ）の方法は
基質を均一に調製することが困難であり、反応に時間が
かかる欠点を有する。また、上記（ｂ）の方法は検体を
希釈する(100〜1000倍）ことが必要である。

【０００６】さらに、基質として、２，４−ジクロロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェ
ノル−α−Ｄ−マルトトリオシドなどを使用する上記
（ｃ）の方法では、他のイオンの影響も少なく、汎用の
自動分析機に適用可能ではあるが、内因性のα−グルコ
シダーゼの影響を受ける、あるいは膵臓由来のＰ−アミ
ラーゼと唾液由来のＳ−アミラーゼの基質に対する親和
性が異なるため、基質濃度の至適化が困難である、また
測定範囲が狭く、非常に低い値から高値まで幅広く、正
確に測定することが困難であるという欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、α−
アミラーゼ活性を利用する方法において、体液中のカル
シウムイオンを正確かつ簡便に測定できる測定方法なら
びに該方法に使用する測定用試薬組成物を提供すること
にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は不活
性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガラク
トピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマル
トシドを含むことを特徴とする体液中のカルシウムイオ
ン測定用試薬組成物である。本発明の一実施態様は、不
活性型α−アミラーゼおよび２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マル
トシドを含むことを特徴とする体液中のカルシウムイオ
ン測定用試薬組成物である。

【０００９】また、本発明は、体液中のカルシウムイオ
ンに、不活性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−
Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を
有するマルトシドを含むカルシウムイオン測定用試薬組
成物を作用させ、生成する発色性化合物を測定すること
を特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方法であ
る。本発明の一実施態様は体液中のカルシウムイオンに
不活性型α−アミラーゼおよび２−クロロ−４−ニトロ
フェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マ
ルトシドを含むカルシウム測定用試薬組成物を作用さ
せ、生成する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定
することを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定
方法である。

【００１０】

【発明の実施態様】本発明に用いる体液とは、血清、唾
液、膵液などの各種体液を意味する。また、α−アミラ
ーゼとは、微生物、植物または動物のいずれの起源のも
のも用いることができるが、好適には動物起源のもので
あり、例えばブタ膵由来のα−アミラーゼが例示され
る。しかしながら、本発明に用いるα−アミラーゼは脱
塩されて、不活性型であることが必要である。不活性型
α−アミラーゼは、体液中のカルシウムイオンを得て、
活性型α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼ基質と反
応する。脱塩方法としては、透析、限外濾過、イオン交
換、カラム除去などの方法がある。α−アミラーゼが脱
塩されて不活性型でないと、ブランク反応が大きくなる
ため、体液中のカルシウムイオン測定において、正確
性、精密性に欠けることとなる。不活性型α−アミラー
ゼの使用量は、試薬組成物中、好ましくは１〜１０００
Ｕ／ｍｌである。

【００１１】本発明に用いるα−アミラーゼ基質は、非
還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元
末端に発色基を有するマルトシドであり、β−Ｄ−ガラ
クトピラノシル基は非還元末端グルコースの４位および
／または６位に結合するものである。発色基としては、
ｐ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニル
などの基が挙げられる。その結合様式は、α−型、β−
型があるが、本発明においては、α−型が好ましい。そ
の一例として、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドがあ
る。該化合物の製造法は特開平 8-67691号公報、特開平
8-67692号公報などに記載される。

【００１２】本発明では上記基質の他に、必要により、
マルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色
基が結合したマルトオリゴ糖を使用する。マルトオリゴ
糖としては、例えばマルトース、マルトペンタース、マ
ルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコー
ス数が２〜７のマルトオリゴ糖が挙げられる。還元末端
グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖として
は、例えば２，４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルト
トリオシド、２，４−ジクロロフェニル（αまたはβ）
−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル
−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られる。

【００１３】本発明の基質の１つである２−クロロ−４
−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−α−マルトシドは、従来の基質である２−クロロ−４
−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドに比べ
て、追随酵素不要であり、また、４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシドと比較して、α−アミラーゼ
による糖転移反応が生じないという利点を有する。さら
に本発明の上記基質は内因性のα−グルコシダーゼの影
響を受けない、Ｐ−アミラーゼ、Ｓ−アミラーゼの該基
質に対する親和性がほぼ同等であるため、基質濃度の至
適化が容易であるという利点も有する。該基質の濃度
は、試薬組成物中、０．１〜５０ｍＭで好適に用いられ
る。

【００１４】本発明では試薬組成物の最終ｐＨを５．５
〜６．５に保持することによって、α−アミラーゼの糖
分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を広げること
が可能となる。ｐＨが５．５未満あるいは６．５以上の
場合は、カルシウムイオンに対する広範囲の定量性を得
ることができない。試薬最終ｐＨを５．５〜６．５に保
持する方法は公知の方法であれば、何ら限定されるもの
ではないが、一般的には緩衝剤が用いられる。用いる緩
衝剤としては、例えばグッド緩衝剤、トリス緩衝剤、リ
ン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は１０〜５００ｍＭの
濃度で好適に用いられる。

【００１５】さらに、本発明の測定試薬組成物には、マ
ルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色基
が結合したマルトオリゴ糖から選ばれる基質を１００〜
２５０ｍＭ含有させ、α−アミラーゼのこれらの基質に
対する糖分解反応を競合させることによっても、カルシ
ウムイオンに対する広範囲の定量性を得ることが可能と
なる。

【００１６】また、カルシウムキレート剤を用いてα−
アミラーゼとカルシウムイオンの結合反応を制御するこ
とによってもカルシウムイオンに対する広範囲の定量性
を得ることが可能となる。カルシウムキレート剤として
は、エチレンジアミン四酢酸およびその塩（ＥＤＴＡな
ど）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴ
Ａ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−
四酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）などが挙げられ、特に
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−四酢酸
４カリウム（ＢＡＰＴＡ）が好ましい。カルシウムキレ
ート剤の濃度は、０．１〜１０ｍＭで、好適に用いられ
る。これらカルシウムイオンに対する広範囲の定量性を
得る方法としては、(1) 試薬ｐＨの調節、(2) マルトオ
リゴ糖の添加、(3) カルシウムキレート剤の添加の３つ
の方法を単独あるいは組み合わせて用いることができ
る。

【００１７】さらに、本発明の測定用試薬組成物には、
アルカリ金属のハロゲン化物、例えば塩化ナトリウム、
塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で添加するこ
とが好ましい。また、必要に応じて、防腐剤、界面活性
剤等をカルシウムの定量性に影響を及ぼさない範囲で使
用することもできる。防腐剤としてはカルシウムを含有
しないものであれば、特に限定されないが、好適にはア
ジ化ナトリウム、抗生物質等が用いられる。界面活性剤
としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰
イオン界面活性剤などを単独であるいは組み合わせて使
用することができる。

【００１８】本発明では、体液中のカルシウムイオンに
不活性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有する
マルトシド、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを
含むカルシウム測定用試薬組成物を作用させ、生成する
２−クロロ−４−ニトロフェノールを吸光度測定する。

【００１９】

【実施例】以下、実施例でもって本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例によって限定されるもの
ではない。実施例１ 下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜
３０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍ
ｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの
吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。 試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル−α−マルトシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ 得られた検量線を図１に示す。

【００２０】実施例２ 下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜
５０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍ
ｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの
吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。 試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル−α−マルトシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ マルトース １５０ｍＭ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ 得られた検量線を図２に示す。

【００２１】比較例１ 下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜
５０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍ
ｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの
吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。 試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ ４０Ｕ／ｍｌ α−グルコシダーゼ（東洋紡績製 AGH-211） ４０Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ（東洋紡績製 BGH-101) １００Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− マルトペンタオシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ 得られた検量線を図２に示す。図２中、●印は本発明の
試薬を用いた場合を示し、○印は比較例の試薬を用いた
場合を示す。図２から明らかなように、２−クロロ−４
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−
マルトシドを基質とする本発明では、５０ｍｇ／ｄｌま
で検量線が直線性を示したのに対し、２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドを基質と
する比較例では、検量線が約１５ｍｇ／ｄｌまでしか直
線性は認められなかった。

【００２２】実施例３ 試薬１（比較例）： ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− マルトトリオシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ マルトース １５０ｍＭ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ 試薬２（本発明）： ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル−α−マルトシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ マルトース １５０ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ） エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ

【００２３】上記組成で得られた試薬を実施例２と同様
にして測定を行った。測定試料を以下に示す。 １．生理食塩水 ２．管理用血清 ３．管理用血清＋１００ＩＵ／ｌα−グルコシダーゼ 測定結果を表１に示す。表１から明らかなように、２−
クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−α−マルトシドを使用する場合、試料へのα−グ
ルコシダーゼ添加の有無で測定値に影響は認められなか
ったが、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マ
ルトトリオシドを使用する比較例では、α−グルコシダ
ーゼの添加によって測定値の上昇が認められた。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例４ （比較例） 試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル−α−マルトシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ マルトース １５０ｍＭ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ

【００２６】（本発明） 試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０） ５０ｍＭ ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの） ４０Ｕ／ｍｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル−α−マルトシド ２ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ マルトース １５０ｍＭ １，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）− エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ） ０．５ｍＭ 上記組成で得られた試薬を実施例１と同様にして測定を
行った。得られた検量線を図３および図４に示す。図３
および図４から明らかなように、ｐＨ６．０の緩衝液を
使用する本発明では、３０ｍｇ／ｄｌまで検量線が直線
性を示したのに対し、ｐＨ７．０の緩衝液を使用する比
較例では、検量線が約１０ｍｇ／ｄｌまでしか直線性は
認められなかった。

【００２７】

【発明の効果】本発明では、体液中のカルシウムイオン
を低い値から高値まで幅広く、正確に測定できる。ま
た、α−グルコシダーゼの存在の有無に係わらす、カル
シウムイオンを正確に測定することができる。さらに本
発明では基質濃度の至適化が容易である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のカルシウムイオン測定用試薬組成物
（マルトースを含まない）を使用して、カルシウムイオ
ンを測定した検量線を示す。

【図２】 本発明のカルシウムイオン測定用試薬組成物
（マルトースを含む）および比較例のカルシウムイオン
測定用試薬組成物を使用して、カルシウムイオンを測定
した検量線を示す。

【図３】 ｐＨ６．０である緩衝液を使用する本発明の
カルシウムイオン測定用試薬組成物を使用して、カルシ
ウムイオンを測定した検量線を示す。

【図４】 ｐＨが７．０である緩衝液を使用するカルシ
ウムイオン測定用試薬組成物を使用して、カルシウムイ
オンを測定した検量線を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不活性型α−アミラーゼおよび非還元末
   端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に
   発色基を有するマルトシドを含むことを特徴とする体液
   中のカルシウムイオン測定用試薬組成物。
2. 【請求項２】 非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシ
   ル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシドが、
   ２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラ
   クトピラノシル−α−マルトシドである請求項１記載の
   体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物。
3. 【請求項３】 ２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ
   −β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの濃度
   が、０．１〜５０ｍＭである請求項２記載の体液中のカ
   ルシウムイオン測定用試薬組成物。
4. 【請求項４】 さらに、マルトオリゴ糖またはその還元
   末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖を
   含有する請求項１記載の体液中のカルシウムイオン測定
   用試薬組成物。
5. 【請求項５】 マルトオリゴ糖またはその還元末端グル
   コースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖の濃度が、
   １００〜２５０ｍＭである請求項４記載の体液中のカル
   シウムイオン測定用試薬組成物。
6. 【請求項６】 試薬組成物の最終ｐＨが５．５〜６．５
   に保持されている請求項１記載の体液中のカルシウムイ
   オン測定用試薬組成物。
7. 【請求項７】 さらに、カルシウムキレート剤を含有す
   る請求項１記載の体液中のカルシウムイオン測定用試薬
   組成物。
8. 【請求項８】 不活性型α−アミラーゼ、２−クロロ−
   ４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
   ル−α−マルトシドおよび必要により、マルトオリゴ糖
   またはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマ
   ルトオリゴ糖および塩化ナトリウムを含有し、かつ、最
   終ｐＨが５．５〜６．５に保持されている体液中のカル
   シウムイオン測定用試薬組成物。
9. 【請求項９】 体液中のカルシウムイオンに、不活性型
   α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピ
   ラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシ
   ドを含むカルシウムイオン測定用試薬組成物を作用さ
   せ、生成する発色性化合物を測定することを特徴とする
   体液中のカルシウムイオンの測定方法。
10. 【請求項１０】 非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノ
    シル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシド
    が、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−
    ガラクトピラノシル−α−マルトシドである請求項９記
    載の体液中のカルシウムイオンの測定方法。