JPS62190099A - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、面漬、血球、尿等に含まれるスーパーオキシ
ドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略称する。）活性Ａｌ
１１定法に関する。

〔発明の背景〕

自然界に於て、微生物、植物、高等動物など好気的生物
は、分子状酸素をイ１効に利用して生命維持に不可欠な
エネルギーを効率よく得ているが、同時に種々の活性酸
素が生成し、これが生体にさまざまな害を及ぼすことが
知られている。例えば活性酸素の１つであるスーパーオ
キシドアニオン　（以下、０２′とする。）は炎症、発
癌、泡化、また、核酸・酵素・脂質などの変性の原因と
なるなど、広範囲にわたり生体にとって有害である。

ＳＯＤは好気的生物のすべてに佇遍的に存在し１．超酸
化物不均化酵素ともよばれ、生体内の０蚤の不均化反応
、即ち、２０２”　＋　２Ｈ＋→０２＋Ｈ２Ｏ２を触媒
する酵素であり、生体を酸素毒性から守っている。

赤血球、白血球２組織切片中のＳＯＤ活性測定と臨抹的
意義に関する報告は多いが、血清中のＳＯＤについては
蛋白成分をはじめ種々の成分が５ＯＤ３１１１定植に影
響を及ぼす為、未だ充分な検討はなされていない。現在
行われているＳＯＤ活性Ａ１１１定法は、いずれの方法
も０２を発生させる系とＯｌを検出する系とから構成さ
れ、ＳＯＤが０２７の不均化を促進することによってば
の生成呈が減少するのを利用したものである。

ＳＯＤ活性Ａ１１１定法に於ける０紬発生系には、超酸
化化合物、例えば超酸化カリウムにより０りを生成させ
る系や還元型補酵素と電子伝達体の反応により０２７を
生成させる系等もあるが、現在、主としてキサンチンに
キサンチンオキシダーゼを作用させる方法が一般に用い
られている。この反応を次に示す。

キサンチンオキシダーゼ キサンチン＋０２　＋　Ｎ２０ 尿酸＋２）！”＋　０２！’ また、ＯＩの検出系には、０２’の還元作用を利用した
ニトロテトラゾリウムブルー（以下、Ｎ０２−ＴＢと略
称する。）法、チトクロームＣ法、０紬酸化作用を利用
したエピネフリン法、ピロガロール法、６−ヒドロキシ
ドーパミン法などがある。

これらＳＯＤ活性測定法の原理を、０２°の発生系にキ
サンチン、キサンチンオキシダーゼを用い、０２？の検
出系にＮ０２−ＴＢ法を用いた方法を例にとり下式に示
す。

即ち、０２７発生系に於て、例えばキサンチンオキシダ
ーゼはキサンチンと分子状酸素（０２）　との反応を触
媒し、０２？を生じるが、この系にＳＯＤが存在すると
、０２７の不均化が促進され生じた０りは０２とＨ２Ｏ
２とになる。ここに生成する０りはチトクロームＣ、Ｎ
０２−Ｔ　Ｂなどを二元赤発色させ、又、エピネフリン
、ピロガロール、６−ヒトロキシドーノくミンなどを酸
化・発色させる性質を有するので、この性質を利用して
試薬盲検４ｔｉに対する検体吸光度の減少を４１１１定
しＳＯＤ活性値を求めている。従って、これらの方法は
いずれも試薬盲検値が高い為測定粘度が悪く、また、測
定範囲も狭いなどの欠点をイｆしている。

かかる状況に於て、本発明者らは０２？を基質とするＳ
ＯＤ活性の測定法について鋭意研究を重ね、電子伝達体
の共存下、０りにＳＯＤが作用して生ずるＨ２Ｏ２を７
呈することによりＳＯＤ活性が測定し得ることを見出し
、先に特許出願している　（特願昭６０−４０５２８号
）、また、更にそれを改良した試薬盲検４ｔｔの変動が
なく且つ感度及び検量線の直線性に優れたＳＯＤ活性測
定法についても特許出願している　（特願昭Ｅ１０−１
４４１８８号、特願昭８０−２８５２５７号）。

最初の発明は、通常０♂はそれ自体の不均化反応により
次第、にＨ２Ｏ２に変化するが、そこに電子伝達体が存
在すると０１自体の不均化反応によるＨ２Ｏ２生成は起
らず、この系にＳＯＤが存在する場合のみ、その活性量
に比例してＨ２Ｏ２が生成するという！Ｉ警実に基づき
なされたものであり、２番目の発明は、この測定法の反
応系に更にマレイミド又はマレイミド誘導体を共存させ
ると、試薬盲検値の変動がなくなり、且つ感度及び検量
線の直線性も改善されるというものであり、３番目の発
明は、この系に更に臭素イオンを共存させると感度及び
検量線の直締性が更に改善されるというものである。し
かしながら、その後の研究の結果、上記３番１−１の方
法でも検；、ｊ、線の直線性はＳＯＤ活性値約１５０Ｕ
／Ｉａｌまでであり、ＳＯＤの高イ＋Ｃｊを示す試料に
ついては実用上必ずしも満足し得るものではないことが
判明した。

〔発明の目的〕

本発明は、電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導
体、及びカルボニル化合物の共存下、０りにＳＯＤが作
用して生ずるＨ２Ｏ２を定量することにより行う体液中
のＳＯＤ活性の測定法に於て。

検量線の直線性に優れ、且つ検量範囲が極めて広い、精
度の高いＳＯＤ活性泪１定法を提供することを目的とす
る。

〔発明の構成〕

本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカルボ
ニル化合物の存在下、これにＳＯＤが作用して生ずる過
酸化水素を定量することにより行うＳＯＤ活性測定ｖ、
に於て、クエン酸又はその塩の共存下にこれを行うこと
を特徴とするＳＯＤ活性測定Ｖ、である。

即ち、木発すｊは、ＳＯＤが存在する０２？生成系に、
電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカ
ルボニル化合物を共存させ、この系で生成するＨ２Ｏ２
を測定することによってＳＯＤ活性を測定しようとする
際に、０り生成系にｔクエン酸又はその塩を共存させる
と、検量線の直線性が一段と改善され、ＳＯＤ活性値１
５０Ｕ／ｍ以上の高濃度の試料でも精度よ＜　Ａｌ１定
することが可能となるということを、本発明者らが初め
て見出し完成させたものである。

本発明に於けるクエン酸（又はその塩）を他のイ１機酎
耐又はその塩）と置き換えた場合には、本発明の如き効
果は全く得られない。

即ち、例えば、クエン酸と同様に水酸基を有する酸であ
る、乳酸、グリコール醒、酒石酸、リンゴ酸、α−オキ
シ酪酸等のオキシ酎やその他の酢酸、コハク酸、マレイ
ン酸、マロン酸等の有機酸類を用いた場合には無絵加の
場合と殆ど差がなく、ＳＯＤが高濃度の場合には検量線
の直線性が全く得られない、このように、各種有機酸類
の中でクエン酸だけにこのような効果があるということ
は、極めて意外なことである。

本発明に用いられるクエン酸又はその塩の濃度は特に限
定されないが、通常、０♂生成系中、３〜４０ａ＋ｓｏ
ｌ／ｌが好ましく用いられる。

本発明に用いられるクエン酸の塩としては、例えば、ナ
トリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属
１Ｂや、アンモニウム塩、各種有機アミン塩等が挙げら
れる。

本発明に用いられるマレイミド又はマレイミド誘導体と
しては、例えばマレイミド、Ｋ−エチルマレイミド　（
以下ＮＥＭと略称する。　）　Ｎ−（Ｉｌｌ−アクリジ
ニル）マレイミド、　Ｎ−（１−アニリノナフチル−４
）マレイミド、Ｎ−（４−７ニリ／フエニル）マレイミ
ド、Ｎ−（ｐ−（２−ペンズイミタゾリル）フェニルコ
マレイミド、Ｎ−（７−シメチルアミノー４−メチルク
マリニル）マレイミド、Ｎ−（３−フルオランチル）マ
レイミド等や、特開昭５１３−２０４１７１号公報で開
示されているー・般式［！］で表わされるＮ−置換マレ
イミド誘導体など各種のものが使用できるが、なかでも
ＮＥＭが水に対する溶解性が優れているという点で好ま
しく用いられる。

〔式中　Ｒ１は水素、ニトロ基、ジ低級アルキルアミノ
基又はＲ３−Ｃ０Ｎ）！−なる基（但し、Ｒ３は低級ア
ルキル基又はフェニル基である。）であり、Ｒ２は水４
；又はニトロ基である。また、マレイミド置換基はベン
ゾイル置換基のオルト又はバラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中０．５＋ｕ＋ｏｌ／１以上であれ
ば有効であるが、通常は２〜４０＋ｕ＋ｏｌ／Ｉの範囲
が好ましく用いられる。

本発明に用いられるカルボニル化合物としては、芳香族
ケトン化合物又は脂肪族ケトン化合物笠が挙げられる。

これらのものを例示すると、芳香族ケトンとしてはベン
ゾフェノン、アセトフェノン、２−ヒドロキシ−４−メ
トキシベンゾフェノン−５−スルホン酸　（以下ＨＭＢ
Ｐと略称する。）。

ベンゾフェノン−２−カルボン酸、３．３’、４．４’
−ベンツフェノンテトラカルポン耐、０−ヒドロキシベ
ンゾフェノン、ｐ−ヒドロキシベンゾフェノン、ベンゾ
フェノン−２，４′−ジカルボン酸、２−ヒドロキシ−
５−メチルベンゾフェノン、２°−ヒドロキシ−５゛−
メチルアセトフェノン、４°−ヒドロキシ−２−メチル
アセトフェノン、４′−ヒドロキシ−３−メチルアセト
フェノン、２°−ヒドロキシ−４−メトキシアセトフェ
ノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシアセトフェノンな
どが挙げられ、又脂肪族ケトンとしてはアセトン、メチ
ルエチルケトン、メチル−ｎ−ブチルケトン、メチルイ
ソブチルケトン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルケトン、メ
チル−ｎ−アミルケトン、メチルイソアミルケトンなど
が挙げられる。使用Ｃ度は反応液中０．５＋ｍｍｏｌ／
１以上であれば有効であるか、通常はｌ　ｍｍｏｌ／ｌ
　〜４０ｍｍｏｌ／ｌの範囲が好ましく用いられる。

本発明の方法に於て用いられる電子伝達体としては、例
えばフェナジンメ）・サルフェ−１（ＰＭＳ）、１−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェー）
　　（１−メトキシＦＭＳ）、９−ジメチルアミノベン
ソーα−フェナゾキソニウムクロリド　（メルドラブル
ー）等が挙げられるがこれらに限定されるものではなく
、これらと同等の作用をイｊする電子伝達体は全て使用
可能である。これらは夫々巾独で用いても２種以上混合
して用いてもかまわない、これら電子伝達体の使用濃度
は特に限定されないが、通常０．００１〜ｌ■Ｘが好ま
しく用いられる。

本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質とし、これ
と電子伝達体、マレイミド又はマレイミド誘導体及びカ
ルボニル化合物からなるＳＯＤ測定系にクエン酸又はそ
の塩を共有させると、検量線の直線性が更に高濃度まで
延びるというものであるが、スーパーオキシドアニオン
を基質とし、これと電子伝達体、マレイミド又はマレイ
ミド誘導体、カルボニル化合物及び臭素イオンからなる
ＳＯＤ測定系にクエン酸又はその塩を共存させても全く
同様の効果が得られる。

ン当量／立〜１０ミリイオン当Ｍ／文が好ましく用いら
れる。臭素イオン源としては、臭素イオンＢ７を解離す
るものであればいずれにてもよいが、通常は無機及び有
機の臭素塩類がより好ましく用いられる。無機臭素塩類
としては、例えば、臭化アンモニウム、臭化ナトリウム
、臭化カリウム、臭化リチウム、臭化マグネシウム等の
塩類や、臭化水素酩をアルカリ性物質で中和したその他
の塩類などが挙げられるが、これらに限定されるもので
はない、また、有機臭素塩類としては、例えば、セチル
トリメチルアンモニウムプロミド、テトラメチルアンモ
ニウムプロミド、セチルジメチルエチルアンモニウムプ
ロミド、及びセチルピリジニウムプロミドなどのカチオ
ン性界面活性剤や、臭化水素酸を有＠１１２基性物質例
えばアミン類等で中和した化合物などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。

本発明に用いられる０２°生成系としては、キサンチン
とキサンチンオキシダーゼとの反応により０５を生成さ
せる系、超酸化化合物（例えば超酸化カリウム）により
０りを生成させる系、又は還元型補酵素と電子伝達体と
の反応により０２°を生成させる系が主として用いられ
るが、その他の方法、例えば還元型フラビンと０２との
反応、低原子価の遷移金属イオンによる０２の還元、０
２の電解還元などにより生成する０２′等も利用できる
ことは勿論である。

酵素反応の液性は中性からアルカリ性であればよいが、
通常ｐＨ７〜ｌＯが好ましく用いられる。

本発明の方法は、ＳＯＤの作用により一定時間内に生成
したＨ２Ｏ２Ｍ　ｔ−ＡｌｔＩ　”Ｕすることによって
酵素活性を求める方法であり、Ｈ２Ｏ２と反応して発色
する発色剤を酵素反応系に存在させ、その呈色の単位時
間当りの吸光度変化量からＳＯＤ活性を求める、いわゆ
るレイト法でも測定可能であるが、又、一定時間酵素反
応させ反応を停止させた後に吸光度を測定する、いわゆ
るエンド法でも測定可能である。一般に、用手法で行う
場合にはエンド法を用いることが多い。エンド法は、所
定時間酵素反応させた後に反応を停止させ生成したＨ２
Ｏ２を定量する方法である為、反応停止剤が必要となる
。この場合、一定時間酵素反応と発色反応を行った後反
応停止剤を加えて反応を停止させ吸光度を測定する方法
でも、又一定時間酵素反応させた後反応停止剤を加えて
酵素反応を停止させると同時に発色反応を行わせる方法
でも可能である。

反応停止剤としては、Ｈ２Ｏ２の定量が通常ペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）と被酸化性呈色試薬とを用いて行われ
たり、４価のチタン化合物と　２−（５−ブロモ−２−
ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロ
ピルアミノ）フェノール又は／及びその塩とから成る試
薬を用いて行われることを考慮すると、液性が中性付近
で且つこれら呈色試薬の発色に影響を４えないような反
応停止剤が要求される。

これらの要求にかなうものとして本発明者らは先の特許
出願（４＋ｆ願昭ＥｉＯ−４０５２８号）に於てデシル
硫酸又はその塩、ドデシル硫酸又はその塩４、及びドデ
シルベンゼンスルホン酸又はその塩から成る群より追ば
れたｉＨ又は２種以上の混合物を反応停止剤として取り
上げ、これらを用いることにより問題点が解決し得るこ
とを見出したが、本発明に於てもこれらの反応停止剤が
停止剤としての効果になんら変りがなく有効に使用し得
ることを確認した。

反応停止剤の濃度は、１．５ｍｍｏｌ／Ｉ以上であれば
充分その機能を発揮するが、通常３〜１００ｍｍｏｌ／
］が好ましく用いられる。又液性は、最終呈色液の油性
が発色反応の至適条件に合うよ”うに自由に選択できる
が、通常はＰＯＤの安定性、被酸化性呈色試薬の安定性
、呈色に適した液性などを考慮してＰＨ４〜９が好まし
く用いられる。

本発明の°ＳＯＤ活性測定法におけるＨ２Ｏ２の定量法
及びＨ２Ｏ２定量用試薬としては、従来性われているＨ
２Ｏ２のいずれの定量法でも、又、従来用いられている
Ｈ２Ｏ２のいずれの定量用試薬でもよく、例えばペルオ
キシダーゼと被酸化性呈色試薬との組合せでＨ２Ｏ２を
定量する方法及びこれに用いる被酸化性呈色試薬その他
の定量用試薬はすべて使用可能である。かかる被酸化性
呈色試薬としては例えば、４−アミノアンチピリン（以
下４−Ａ　Ａ　Ｐと略称する。）と、フェノール系化合
物又はに、Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを組合せた被
酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン　（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組合せ試薬
、２．２°−アミノビス　（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、）リフェニルメタ
ン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、０−トリジ７　Ｆ
、Ａ　ｉ　体、　　ジフェニルアミン誘導体、トリアリ
ルイミダゾール話導体、０−フェニレンジアミン、ロイ
コメチレンブルー誘導体等が挙げられるが、これらに限
定されるものではない。この他、ＰＯＤを用いない方法
として最近開発された４価のチタン化合物と２−（５−
ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ
−スルホプロピルアミノ）フェノール又は／及びその塩
との組合せ試薬を用いる方法等もＨ２Ｏ２の定量法とし
て使用できる。

被酸化性呈色試薬及び酸化発色後のその９色をより安定
化させるには１本発明者らが先の特許出願に於て述べた
ように、β−シクロデキストリン又は／及びその誘導体
、若しくはγ−シクロデキストリン又は／及びその誘導
体を溶液中に共存させればよい。

これらの濃度としてはβ−シクロデキストリンは溶液中
通常０．０１〜１．５重量／容量％、γ−シクロデキス
トリンは０．１〜３重績／容４１％、β−シクロデキス
トリン話導体は０．１〜５重間重合／容量γ−シクロデ
キストリン誘導体は０．１〜５重ｈ１／容ＩＪ、％が夫
々用いられ、又、これら２種以上の化合物を上記濃度で
任意の比率で混合して用いてもよい。

シクロデキストリン誘導体としては例えば、β−ＣＤ（
−ＯＨ）　１９（ＯＮＯ２）２β−ＣＤ（−０８）１９
，２（ＯＲ１４）１）　１．８β−ＣＤ（−０Ｈ）１９
（ＯＳＯ３Ｈ）２β−ＣＤ　（−ＯＨ）　工ｅ　、　５
　（−０−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）　２．５β−ＣＤ（−０
Ｈ）１９．３（−０−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ０３Ｈ）
　１．７β−ＣＤ（−ＯＨ）　ｌＢ、５（−０−ＣＨ２
ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ０３Ｈ）２．５β−ＣＤ（−ＯＨ）　
１８．０（−０−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−９Ｏ３Ｈ）３．
Ｑβ−ＣＤ（−０Ｈ）７　　（−ＱＣ）１３）１４β−
ＣＤ（−ＱＣ）１３）２１ 笠が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の方法をより効果的に実施するには、例えば、キ
サンチンを０．０５〜２０ｍｍｏｌ／Ｉ、電子伝達体、
例えば１−メトキシＦＭＳを０．００１〜１ｍｍｏｌ／
Ｉ。

マレイミド又はマレイミド誘導体２例えばＮＥＭを２〜
４０ｍ＋ｅｏｌ／Ｉ含むｐＨ約７〜ｌＯの緩衝液Ｃｍ１
試液）の一定【、１に、一定量の血清を加え、３７℃に
加温後、キサンチンオキシダーゼの反応液中濃度が１０
〜２０００／Ｉになるようにキサンチンオキシダーゼを
含み、且つクエン酸を３〜４０ｍｍｏｌ／ｌ、カルボニ
ル化合物を１〜４０ｍｍｏｌ／ｌと被酸化性呈色試薬及
び要すればβ−（又は／及びγ−）シクロデキストリン
又は／及びその誘導体とを含むｐＨ７〜１０の緩衝液　
（第２試液）の一定量を加えて３７℃で一定時間酵素反
応させる。その後、反応停止Ｆ剤及びＰ。

Ｄを含む緩衝液　（第３試液）の一定量を加えて酵素反
応を停止させると同時に生成したＨ２Ｏ２と被酸化性呈
色試薬との発色反応を開始させ、３７°Ｃで一定時間反
応させた後呈色度を測定する。第３試液の液性は、最終
呈色液の液性が被酸化性呈色試薬の至適発色液性になる
ように適宜選択すればよい。

また、本発明の方法は、タンパクｇｆ、気泳動法による
ＳＯＤ分画の染色にも利用できる。タンパク電気泳動法
によるＳＯＤ分画の染色法は、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｂｅａ
ｕｃｈａｍｐ、　　Ｉｒｗｉｎ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈら
（Ａｎａ　Ｉ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４４．　２７８〜２８７．１９７
１）により報告されている如く、基ｊ！ｔ（ｏ２°）に
よるニトロテトラゾリウムブルーの還元に基づく支持体
の染色が、ＳＯＤの存在により阻害されてＳＯＤ分画部
分の染色が弱くなることを利用した方法であり、これま
でデンシトメーターによる染色度の７１１１１定は困難
であったが、本発明により、定量的な染色法の開発の可
能性が生まれた。

更にまた、本発明の方法は組織或は細胞内のＳＯＤ活性
の局在を染色し観察する方法としての組織化学染色法へ
の応用も期待できるものである。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。

〔実施例〕

実施例１゜ ［試　薬］ （１）第１試友 キサンチンを０．３ｍｍｏｌ／１．　　ｌ−メトキシＦ
ＭＳを０　、０３ｍｍｏ　ｌ／　Ｉ、ＮＥＭを８＋ｗｍ
ｏｌ／ｌ、の濃度番こなるように、０．０５Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐ）Ｉ　８．０）に溶解した。

（２）　’ｆ”ｙ　２試液 キサンチンオキシダーゼをｅｏｕ／ｉ、４−ＡＡＰを０
．０１％、ＴＯＯＳを０．１％、クエン酸三ナトリウム
・２水和物を１７ｍｍｏｌ／１．　ＨＭ　Ｂ　Ｐを５ａ
＋ｍｏｌ／１の濃度になるように、０．０５Ｍリン酸ａ
！緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した。

（３）第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを７０ｍｍｏｌ／ｌ、ＰＯＤを
５００００／ｆｌの濃度になるように、　０．２Ｍリン
酸−ナトリウム溶液に溶解した。

［試　料］ Ｓ　ｉ　ｇｗａ社製人由来Ｓ　ＯＤ　（Ｐｒｏｄｕｃｔ
　ＮｕｍｂｅｒＳ　７０Ｈ）をイオン交換水で、５０．
　ｔｏｏ、　１５０．２００Ｕ／Ｗｔになるように溶解
し調製した。

［操作法］ 試料　　１００４をとり、第１試液ｉ、ｏｙを加え、３
７°Ｃ恒温槽中３分間加温後、第２試液１．Ｏａｄを加
えて、更に３７°Ｃで２０分間加温した。次いで、第３
試液　２．Ｏｄを加えて混和し、３７℃で５分間加温後
、試ネ；１の代りにイオン交換水を用いて同様に操作し
た試薬盲検を対照として、波長５５５ｎｍの吸光度を測
定した。

比較例１゜ ［試　薬〕 （１）第１試液 実力＆例１の第１試液と同じ。

（２）第２試液 実施例１の第２試液の組成から、クエン酸三ナトリウム
を除いた組成の試液を調製した。

（３）第３試液 実施例１の第３試液と回し。

［試　祠］ 実施例１と同じ。

［操作法」 実施例１と同じ。

比較例２〜１０ ［試　薬］ （１）第１試液 実施例１の：５１試液と同じ。

（２）第２試液 実施例１の第２試液の組成のうち、クエン酸三ナトリウ
ム・２永和物　１７＋＋ｕｅｏｌ／Ｉを各種右ａ酸又は
その鳩（乳酪、グリコール酸、リンゴ酎、酒石酸二ナト
リウム・２水和物、コハク酸、酢酸ナトリウム、安息香
醇ナトリウム、マレイン酸、マロンＭ）　１７ｍｍｏｌ
／Ｉに代えた試液を調製した。

（３）第３試液 実施例１の第３試液と同じ。

［試　　　ネ゛１　］ 実施例１と同じ。

［操作法１ 実施例１と同じ。

実施例１及び比較例１の検量線を第１図に示す（但し、
実施例１の検ｉｉＨ線は−・−で示し、比較例１の検量
線は一×−で示した。）。

第１図より明らかな如く、各ＳＯＤ活性イｆ１に対して
プロットした吸光度を結ぶ検量線は、実施例１ではＳＯ
Ｄ活性値２００υ／ａ／まで原点を通る直線ニナルが、
比較例１ではＳＯＤ活性値＋０００／ａｌ以」二では検
量線が湾曲し、定量性が乏しくなっている。

また、表１に実施例１及び比較例１〜ｌＯの７１１１定
結果を示す。

表１より明らかな如く、クエン酸以外のイｊ機耐酸添加
した場合は無添加と殆ど差はなく、クエン酸のような効
果は全く（１１られなかった。

実施例２゜ ［試　薬］ （１）第１試液 キサンチンを０．３ｍｍｏｌ／１．ｌ−メトキシＦＭＳ
を０．０３ｔ＋ａｏｌ／ｌ、臭化ナトリウムを７ｍｍｏ
ｌ／ｌ、　　ＮＥＭを８＋ｅ＋ｏｏｌ／Ｉの濃度になる
ように、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨｅ、ｏ）に溶
解した。

（２）第２試液 実施例１の第２試液と同じ。

（３）第３試液 実施例１の第３試液と同じ。

［試　料］ 実施例１と同じ。

［操作法］ 実施例１と同じ。

第２図にＳＯＤ活性値（Ｕ／ｍｌりと吸光度との［Ｓｔ
＋係を示す。

第２図より明らかな如く、各ＳＯＤ活性値に対してプロ
ットした吸光度を結ぶ検量線は２００Ｕ／ｄまで原点を
通る直線となり、検量線は良好な定量性を示す。

〔発明の効果〕

以上に詳述した如く、本発明は、体液例えば血・１．′
、等に含まれるＳＯＤ活性を、電子伝達体、マレイミド
又はマレイミド誘導体、カルボニル化合物及びクエン酸
（又はそのＩｔりの存在下、ＳＯＤの作用で０２？から
生成するＨ２Ｏ２を測定することにより求める方法を提
供するものであり、本測定系にクエン酸（又はその塩）
を共存させたことにより、検量線の直線性が一段と数片
され、ＳＯＤ活性値１５０Ｕ／　ａ／以」二の高濃度の
試料でも粘度よく測定できる点に顕著な効果を奏する発
明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び比較例１に於て得られた検量線
を示す（但し、−・−は実施例１の検量線を表わし、−
Ｘ−は比較例１の検ｔＭ線を表わす、）、いずれも横軸
の各ＳＯＤ活性伯（Ｕ／＋ａ／）について得られた吸光
度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
の各ＳＯＤ活性値（Ｕ／ａ／　）について得られた吸光
度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子伝達
   体、マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカルボニル
   化合物の存在下、これにスーパーオキシドジスムターゼ
   （ＳＯＤ）が作用して生ずる過酸化水素を定量すること
   により行うＳＯＤ活性測定法に於て、クエン酸又はその
   塩の共存下にこれを行うことを特徴とするＳＯＤ活性測
   定法。
2. （２）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
   ＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチ
   ルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）、及び９−ジメ
   チルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロリド（
   メルドラブルー）から成る群より選ばれた１種又は２種
   以上である、特許請求の範囲第１項記載の測定法。
3. （３）スーパーオキシドアニオンが、キサンチンとキサ
   ンチンオキシダーゼの組合せ系、超酸化物、又は還元型
   補酵素と電子伝達体の組合せ系から生成される、特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の測定法。
4. （４）酵素反応停止剤を用い、酵素反応を停止させた後
   、或いは停止させると同時に、生成した過酸化水素をペ
   ルオキシダーゼと発色剤を用いて比色定量することによ
   り行う、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記
   載の測定法。
5. （５）酵素反応停止剤として、デシル硫酸又はその塩、
   ドデシル硫酸又はその塩、及びドデシルベンゼンスルホ
   ン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２種以
   上の混合物を用いる、特許請求の範囲第１項〜第４項の
   いずれかに記載の測定法。