JP2000316600A - 遊離脂肪酸の定量方法及び遊離脂肪酸定量用試薬 - Google Patents
遊離脂肪酸の定量方法及び遊離脂肪酸定量用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】過剰に添加されているＣｏＡの還元作用を妨害
するために試薬中にチオール基封鎖剤を添加することな
く、過剰なＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を受ける
ことなく、長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法を
提供するものである。 【解決手段】酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセ
ターゼを用いる遊離脂肪酸の定量方法であって、試料中
の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ、アデノシン−３−リン
酸およびアシルコエンザイムＡシンセターゼを作用さ
せ、さらに発生する物質に追随酵素を作用させ、最終的
に発生する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび色原体
を用いて発色せしめる遊離脂肪酸の定量方法。
するために試薬中にチオール基封鎖剤を添加することな
く、過剰なＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を受ける
ことなく、長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法を
提供するものである。 【解決手段】酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセ
ターゼを用いる遊離脂肪酸の定量方法であって、試料中
の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ、アデノシン−３−リン
酸およびアシルコエンザイムＡシンセターゼを作用さ
せ、さらに発生する物質に追随酵素を作用させ、最終的
に発生する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび色原体
を用いて発色せしめる遊離脂肪酸の定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な遊離脂肪酸
の定量方法および遊離脂肪酸定量用試薬に関する。
の定量方法および遊離脂肪酸定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清中の遊離脂肪酸の定量は、糖尿病、
甲状腺機能亢進症、重症肝障害、肝硬変などの診断を目
的として実施されている。
甲状腺機能亢進症、重症肝障害、肝硬変などの診断を目
的として実施されている。
【０００３】従来、遊離脂肪酸の定量法としては、有機
溶媒で抽出した遊離脂肪酸をアルカリで中和滴定する方
法、銅錯塩を形成後キレート剤で呈色させる方法が行わ
れてきたが、いずれも有機溶媒の使用による煩雑性、人
体への影響などの欠点があった。また、酵素を用いた方
法として、血清中の遊離脂肪酸にアデノシン−３−リン
酸(以下、ＡＴＰと略する)とコエンザイムＡ(以下、Ｃ
ｏＡと略する)の共存下、アシルＣｏＡシンセターゼを
作用させ、生成するアシルＣｏＡに酸素の共存下、追随
酵素を作用させ最終的に生成する過酸化水素を定量する
ことにより遊離脂肪酸を定量する方法が開発されてい
る。
溶媒で抽出した遊離脂肪酸をアルカリで中和滴定する方
法、銅錯塩を形成後キレート剤で呈色させる方法が行わ
れてきたが、いずれも有機溶媒の使用による煩雑性、人
体への影響などの欠点があった。また、酵素を用いた方
法として、血清中の遊離脂肪酸にアデノシン−３−リン
酸(以下、ＡＴＰと略する)とコエンザイムＡ(以下、Ｃ
ｏＡと略する)の共存下、アシルＣｏＡシンセターゼを
作用させ、生成するアシルＣｏＡに酸素の共存下、追随
酵素を作用させ最終的に生成する過酸化水素を定量する
ことにより遊離脂肪酸を定量する方法が開発されてい
る。
【０００４】過酸化水素を定量する酵素法は、特異性が
高い、簡便であるなどの特徴があり、広く一般に用いら
れている。反応式で示すと、以下の様な方法が挙げられ
る。主反応として アシルＣｏＡシンセターゼ(EC 6.2.1.3) 遊離脂肪酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ ―――――→ アシルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ の反応に続いて、 （ａ）追随酵素としてアシルＣｏＡオキシダーゼを用いる場合 アシルＣｏＡオキシダーゼ アシルＣｏＡ＋Ｏ2 ―――――――――→ エノイルＣｏＡ＋Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7) Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ （ｂ）追随酵素としてピロフォスファターゼおよびピルビン酸オキシダーゼを用 いる場合 ピロフォスファターゼ ＰＰｉ ―――――――→ ２Ｐｉ ピルビン酸オキシダーゼ(EC 1.2.3.3) ２Ｐｉ＋２Ｏ2＋２ピルビン酸――→２アセチルりん酸＋２Ｈ2Ｏ2＋２ＣＯ2 ペルオキシダーゼ Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ （ｃ）追随酵素としてミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキ シダーゼを用いる方法 ミオキナーゼ(EC 2.7.4.3) ＡＭＰ＋ＡＴＰ −―――――――→ ２ＡＤＰ ピルビン酸キナーゼ(EC 2.7.1.40) ２ホスホエノールピルビン酸＋２ＡＤＰ――――→２ピルビン酸＋２ＡＴＰ ピルビン酸オキシダーゼ ２ピルビン酸＋２Ｏ2＋２Ｐｉ――→２アセチルりん酸＋２ＣＯ2＋２Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ
高い、簡便であるなどの特徴があり、広く一般に用いら
れている。反応式で示すと、以下の様な方法が挙げられ
る。主反応として アシルＣｏＡシンセターゼ(EC 6.2.1.3) 遊離脂肪酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ ―――――→ アシルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ の反応に続いて、 （ａ）追随酵素としてアシルＣｏＡオキシダーゼを用いる場合 アシルＣｏＡオキシダーゼ アシルＣｏＡ＋Ｏ2 ―――――――――→ エノイルＣｏＡ＋Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7) Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ （ｂ）追随酵素としてピロフォスファターゼおよびピルビン酸オキシダーゼを用 いる場合 ピロフォスファターゼ ＰＰｉ ―――――――→ ２Ｐｉ ピルビン酸オキシダーゼ(EC 1.2.3.3) ２Ｐｉ＋２Ｏ2＋２ピルビン酸――→２アセチルりん酸＋２Ｈ2Ｏ2＋２ＣＯ2 ペルオキシダーゼ Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ （ｃ）追随酵素としてミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキ シダーゼを用いる方法 ミオキナーゼ(EC 2.7.4.3) ＡＭＰ＋ＡＴＰ −―――――――→ ２ＡＤＰ ピルビン酸キナーゼ(EC 2.7.1.40) ２ホスホエノールピルビン酸＋２ＡＤＰ――――→２ピルビン酸＋２ＡＴＰ ピルビン酸オキシダーゼ ２ピルビン酸＋２Ｏ2＋２Ｐｉ――→２アセチルりん酸＋２ＣＯ2＋２Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ Ｈ2Ｏ2＋色原体 ――――――→ 縮合体(発色)＋Ｈ2Ｏ
【０００５】しかし、この方法の問題点として、過酸化
水素と色素の酸化縮合が、試薬中に過剰に添加されてい
るＣｏＡの還元作用により妨害を受け、十分な発色が起
こらないという欠点が挙げられる。この欠点に対し、試
薬中にヨードアセトアミド、モノヨード酢酸、Ｎ−エチ
ルマレイミド（ＮＥＭ）、Ｎ−４−ジメチルアミノ−
３，５−ジニトロフェニルマレイミド（ＤＤＰＭ）、ベ
ンゾイミダゾイルマレイミド（ＢＩＰＭ）、Ｎ−（９−
アクリジニルマレイミド）（ＮＡＭ）、４−ビニルピリ
ジン、２−ビニルキノリン、９−ビニルアクリジン、
５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮ
Ｂ）、２，２’−ジチオジピリジン（２ＰＤＳ）、４，
４‘−ジチオジピリジン（４ＰＤＳ）、６，６’−ジチ
オニコチン酸（６ＮＤＳ）、チアミンジスルフィド（Ｔ
ＤＳ）などのチオール基封鎖剤を添加してＣｏＡの還元
作用を妨害することで十分な発色が起こることが報告さ
れている(特開昭５６−４５１９９号公報)。チオール基
封鎖剤として、特にＮＥＭは良好な作用を示すため広く
用いられている。
水素と色素の酸化縮合が、試薬中に過剰に添加されてい
るＣｏＡの還元作用により妨害を受け、十分な発色が起
こらないという欠点が挙げられる。この欠点に対し、試
薬中にヨードアセトアミド、モノヨード酢酸、Ｎ−エチ
ルマレイミド（ＮＥＭ）、Ｎ−４−ジメチルアミノ−
３，５−ジニトロフェニルマレイミド（ＤＤＰＭ）、ベ
ンゾイミダゾイルマレイミド（ＢＩＰＭ）、Ｎ−（９−
アクリジニルマレイミド）（ＮＡＭ）、４−ビニルピリ
ジン、２−ビニルキノリン、９−ビニルアクリジン、
５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮ
Ｂ）、２，２’−ジチオジピリジン（２ＰＤＳ）、４，
４‘−ジチオジピリジン（４ＰＤＳ）、６，６’−ジチ
オニコチン酸（６ＮＤＳ）、チアミンジスルフィド（Ｔ
ＤＳ）などのチオール基封鎖剤を添加してＣｏＡの還元
作用を妨害することで十分な発色が起こることが報告さ
れている(特開昭５６−４５１９９号公報)。チオール基
封鎖剤として、特にＮＥＭは良好な作用を示すため広く
用いられている。
【０００６】しかしながら、アシルＣｏＡシンセター
ゼ、追随酵素、特に最も広く用いられているアシルＣｏ
Ａオキシダーゼはいずれも中性付近のｐＨで安定であ
り、一方チオール基封鎖剤、特にＮＥＭは中性付近では
非常に不安定であるといった性質を有する。また、アシ
ルＣｏＡオキシダーゼ蛋白にはシステイン残基を有し、
そのＳＨ基は酵素の立体構造保持にも関与していると推
定されている。したがって、これら酵素とチオール基封
鎖剤を共存させた試液は安定性が不良で、長期使用がで
きない、さらに無調製で長期使用可能な液状試薬化がで
きないなどの問題を有するものである。
ゼ、追随酵素、特に最も広く用いられているアシルＣｏ
Ａオキシダーゼはいずれも中性付近のｐＨで安定であ
り、一方チオール基封鎖剤、特にＮＥＭは中性付近では
非常に不安定であるといった性質を有する。また、アシ
ルＣｏＡオキシダーゼ蛋白にはシステイン残基を有し、
そのＳＨ基は酵素の立体構造保持にも関与していると推
定されている。したがって、これら酵素とチオール基封
鎖剤を共存させた試液は安定性が不良で、長期使用がで
きない、さらに無調製で長期使用可能な液状試薬化がで
きないなどの問題を有するものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、使用可能な
状態で長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法および
遊離脂肪酸定量用試薬を提供することにある。そして、
過剰に添加されているＣｏＡの還元作用を妨害するため
に試薬中にチオール基封鎖剤を添加することなく、過剰
なＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を受けることな
く、長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法を提供す
るものである。
状態で長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法および
遊離脂肪酸定量用試薬を提供することにある。そして、
過剰に添加されているＣｏＡの還元作用を妨害するため
に試薬中にチオール基封鎖剤を添加することなく、過剰
なＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を受けることな
く、長期安定性に優れた遊離脂肪酸の定量方法を提供す
るものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討したところ、酢酸およびア
セチルコエンザイムＡシンセターゼを用いることによ
り、ＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を除去できるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、
本発明は、以下のような構成から成る。 （１）酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセターゼ
を用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方法。 （２）試料中の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ、アデノシ
ン−３−リン酸およびアシルコエンザイムＡシンセター
ゼを作用させ、さらに発生する物質に追随酵素を作用さ
せ、最終的に発生する過酸化水素をペルオキシダーゼお
よび色原体を用いて発色せしめる（１）の遊離脂肪酸の
定量方法。 （３）チオール基封鎖剤を用いない（１）又は（２）の
遊離脂肪酸の定量方法。 （４）酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセターゼ
を含むことを特徴とする遊離脂肪酸定量用試薬。 （５）アシルコエンザイムＡシンセターゼ、発生する物
質に作用する追随酵素、ペルオキシダーゼ及び色原体を
含む（４）の遊離脂肪酸定量用試薬。 （６）追随酵素として （ａ）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ （ｂ）ピロフォスファターゼおよびピルビン酸オキシダ
ーゼ （ｃ）ミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびピルビ
ン酸オキシダーゼ のいずれかの群からなる酵素を含有する（４）又は
（５）の遊離脂肪酸定量用試薬。 （７）チオール基封鎖剤を含まない（４）〜（６）のい
ずれかの遊離脂肪酸定量用試薬。 （８）液状状態である（４）〜（７）のいずれかの遊離
脂肪酸定量用試薬。
を達成するために、鋭意検討したところ、酢酸およびア
セチルコエンザイムＡシンセターゼを用いることによ
り、ＣｏＡのＳＨ基による還元性の妨害を除去できるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、
本発明は、以下のような構成から成る。 （１）酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセターゼ
を用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方法。 （２）試料中の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ、アデノシ
ン−３−リン酸およびアシルコエンザイムＡシンセター
ゼを作用させ、さらに発生する物質に追随酵素を作用さ
せ、最終的に発生する過酸化水素をペルオキシダーゼお
よび色原体を用いて発色せしめる（１）の遊離脂肪酸の
定量方法。 （３）チオール基封鎖剤を用いない（１）又は（２）の
遊離脂肪酸の定量方法。 （４）酢酸およびアセチルコエンザイムＡシンセターゼ
を含むことを特徴とする遊離脂肪酸定量用試薬。 （５）アシルコエンザイムＡシンセターゼ、発生する物
質に作用する追随酵素、ペルオキシダーゼ及び色原体を
含む（４）の遊離脂肪酸定量用試薬。 （６）追随酵素として （ａ）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ （ｂ）ピロフォスファターゼおよびピルビン酸オキシダ
ーゼ （ｃ）ミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびピルビ
ン酸オキシダーゼ のいずれかの群からなる酵素を含有する（４）又は
（５）の遊離脂肪酸定量用試薬。 （７）チオール基封鎖剤を含まない（４）〜（６）のい
ずれかの遊離脂肪酸定量用試薬。 （８）液状状態である（４）〜（７）のいずれかの遊離
脂肪酸定量用試薬。
【０００９】
【発明の実施の形態】アセチルＣｏＡシンセターゼは、
共存するアシルＣｏＡシンセターゼ、アシルＣｏＡオキ
シダーゼなどの追随酵素の安定な中性付近のｐＨ条件下
において安定であり、これを用いることによって、長期
にわたり発色剤の発色を阻害しない高感度の遊離脂肪酸
の定量試薬を得ることができる。
共存するアシルＣｏＡシンセターゼ、アシルＣｏＡオキ
シダーゼなどの追随酵素の安定な中性付近のｐＨ条件下
において安定であり、これを用いることによって、長期
にわたり発色剤の発色を阻害しない高感度の遊離脂肪酸
の定量試薬を得ることができる。
【００１０】アセチルＣｏＡシンセターゼを用いた主反
応で用いられなかったＣｏＡの消去系は式で示すと以下
の通りである。 アセチルＣｏＡシンセターゼ 酢酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ ――――――→ アセチルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
応で用いられなかったＣｏＡの消去系は式で示すと以下
の通りである。 アセチルＣｏＡシンセターゼ 酢酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ ――――――→ アセチルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
【００１１】本発明には、酵素として、アシルＣｏＡシ
ンセターゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼなどの追随酵
素、およびアセチルＣｏＡシンセターゼが用いられる
が、いずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発
明においても中性の緩衝液を用いることが好ましい。緩
衝液としてはＭＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液を
はじめ、リン酸緩衝液など中性付近で緩衝能を有するも
のであれば、特に限定されない。
ンセターゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼなどの追随酵
素、およびアセチルＣｏＡシンセターゼが用いられる
が、いずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発
明においても中性の緩衝液を用いることが好ましい。緩
衝液としてはＭＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液を
はじめ、リン酸緩衝液など中性付近で緩衝能を有するも
のであれば、特に限定されない。
【００１２】本発明に用いられる酵素として、アシルＣ
ｏＡシンセターゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼなどの追
随酵素、アセチルＣｏＡシンセターゼがあるが、いずれ
も由来については何ら限定されるものではなく、市販品
をそのまま用いても、あるいは精製して用いてもよい。
ｏＡシンセターゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼなどの追
随酵素、アセチルＣｏＡシンセターゼがあるが、いずれ
も由来については何ら限定されるものではなく、市販品
をそのまま用いても、あるいは精製して用いてもよい。
【００１３】本発明の方法における遊離脂肪酸定量用試
薬には、必要に応じてその他の添加剤を含有せしめても
よい。該添加剤としては、界面活性剤、安定化剤、防腐
剤、キレート剤、活性化剤などが挙げられる。また、生
体試料中に存在し、測定系に影響を与える還元物質とし
てのアスコルビン酸の影響回避のため、アスコルビン酸
オキシダーゼなどの酵素を含有せしめることも可能であ
る。
薬には、必要に応じてその他の添加剤を含有せしめても
よい。該添加剤としては、界面活性剤、安定化剤、防腐
剤、キレート剤、活性化剤などが挙げられる。また、生
体試料中に存在し、測定系に影響を与える還元物質とし
てのアスコルビン酸の影響回避のため、アスコルビン酸
オキシダーゼなどの酵素を含有せしめることも可能であ
る。
【００１４】本発明においては、色原体の酸化縮合によ
る発色反応を阻害するＣｏＡの還元性を消去するため
に、共存する酵素類の安定なｐＨ条件下において不安定
である、例えば、Ｎ−エチルマレイミドのようなチオー
ル基封鎖剤を含まないことで、調製後試液の長期安定
化、さらには液状試薬化が可能である。
る発色反応を阻害するＣｏＡの還元性を消去するため
に、共存する酵素類の安定なｐＨ条件下において不安定
である、例えば、Ｎ−エチルマレイミドのようなチオー
ル基封鎖剤を含まないことで、調製後試液の長期安定
化、さらには液状試薬化が可能である。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例によって特に限定されるもの
ではない。
が、本発明はこれら実施例によって特に限定されるもの
ではない。
【００１６】実施例１および比較例１ 実施例１として、以下のような組成の試薬Ａ及び試薬Ｂ
を調製した。 試薬Ａ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ ＣｏＡ ０．５ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ アシルＣｏＡシンセターゼ １．５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メトキシアニ リン ２ｍＭ
を調製した。 試薬Ａ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ ＣｏＡ ０．５ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ アシルＣｏＡシンセターゼ １．５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メトキシアニ リン ２ｍＭ
【００１７】 試薬Ｂ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ アシルＣｏＡオキシダーゼ ３Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン １ｍＭ アセチルＣｏＡシンセターゼ ５Ｕ／ｍｌ 酢酸 ０．５ｍＭ
【００１８】比較例１として、以下のような組成の試薬
ａ及び試薬ｂを調製した。 試薬ａ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ ＣｏＡ ０．５ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ アシルＣｏＡシンセターゼ １．５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メトキシアニ リン ２ｍＭ
ａ及び試薬ｂを調製した。 試薬ａ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ ＣｏＡ ０．５ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ アシルＣｏＡシンセターゼ １．５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メトキシアニ リン ２ｍＭ
【００１９】 試薬ｂ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ アシルＣｏＡオキシダーゼ ３Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン １ｍＭ ＮＥＭ １０ｍＭ
【００２０】測定試料として１０００μＥｑ／ｌのオレ
イン酸を用いた。試料０．０５ｍｌに試薬Ａ３ｍｌを加
え３７℃で５分反応させた後、試薬Ｂ１．５ｍｌを添加
して５分後、試薬ブランクを対照として、波長５４６ｎ
ｍの吸光度を測定した。試薬調製直後、７日目、１４日
目、２１日目に同様の操作を行い、測定感度から試薬の
安定性を検討した。この間試薬は１０℃以下の冷蔵保存
とした。また、比較例１として、試薬Ａのかわりに試薬
ａを、試薬Ｂのかわりに試薬ｂを使用して、同様の検討
を行った。以上の結果を図１に示す。
イン酸を用いた。試料０．０５ｍｌに試薬Ａ３ｍｌを加
え３７℃で５分反応させた後、試薬Ｂ１．５ｍｌを添加
して５分後、試薬ブランクを対照として、波長５４６ｎ
ｍの吸光度を測定した。試薬調製直後、７日目、１４日
目、２１日目に同様の操作を行い、測定感度から試薬の
安定性を検討した。この間試薬は１０℃以下の冷蔵保存
とした。また、比較例１として、試薬Ａのかわりに試薬
ａを、試薬Ｂのかわりに試薬ｂを使用して、同様の検討
を行った。以上の結果を図１に示す。
【００２１】実施例１については、長期にわたって余剰
なＣｏＡが消去されることで、色素の酸化縮合が阻害さ
れず、試料の測定感度が安定に保たれていることが示さ
れる。これに比べて、比較例１では、ＮＥＭが不安定で
あり、消去能が低下することで、余剰ＣｏＡによる酸化
縮合の阻害が起こり、試料測定感度が低下していくこと
が示される。また、ＮＥＭにより、アシルＣｏＡオキシ
ダーゼが失活し、測定感度が低下したことも推定でき
る。
なＣｏＡが消去されることで、色素の酸化縮合が阻害さ
れず、試料の測定感度が安定に保たれていることが示さ
れる。これに比べて、比較例１では、ＮＥＭが不安定で
あり、消去能が低下することで、余剰ＣｏＡによる酸化
縮合の阻害が起こり、試料測定感度が低下していくこと
が示される。また、ＮＥＭにより、アシルＣｏＡオキシ
ダーゼが失活し、測定感度が低下したことも推定でき
る。
【００２２】実施例２および比較例２ 実施例１および比較例１と同じ組成から成る遊離脂肪酸
定量試薬をそれぞれ調製した。試料として、１０００μ
Ｅｑ／ｌのオレイン酸水溶液および、人血清３０検体を
使用した。試料０．０５ｍｌに試薬Ａ３ｍｌを加え３７
℃で５分反応させた後、試薬Ｂ１．５ｍｌを添加して５
分後、試薬ブランクを対照として、波長５４６ｎｍの吸
光度を測定した。また、比較例２として、試薬Ａのかわ
りに試薬ａを、試薬Ｂのかわりに試薬ｂを使用して、同
様の検討を行った。１０００μＥｑ／ｌのオレイン酸を
標準として、血清中の遊離脂肪酸量を算出した。
定量試薬をそれぞれ調製した。試料として、１０００μ
Ｅｑ／ｌのオレイン酸水溶液および、人血清３０検体を
使用した。試料０．０５ｍｌに試薬Ａ３ｍｌを加え３７
℃で５分反応させた後、試薬Ｂ１．５ｍｌを添加して５
分後、試薬ブランクを対照として、波長５４６ｎｍの吸
光度を測定した。また、比較例２として、試薬Ａのかわ
りに試薬ａを、試薬Ｂのかわりに試薬ｂを使用して、同
様の検討を行った。１０００μＥｑ／ｌのオレイン酸を
標準として、血清中の遊離脂肪酸量を算出した。
【００２３】比較例２を対照として、定量値の相関関係
を求めた。結果を図２に示す。相関係数０．９９８、回
帰式Ｙ＝１．０２Ｘ−８．５となった。本発明による方
法、すなわち実施例２により、従来の方法すなわち比較
例２と同様に良好に遊離脂肪酸が定量できることが確認
される。
を求めた。結果を図２に示す。相関係数０．９９８、回
帰式Ｙ＝１．０２Ｘ−８．５となった。本発明による方
法、すなわち実施例２により、従来の方法すなわち比較
例２と同様に良好に遊離脂肪酸が定量できることが確認
される。
【００２４】
【発明の効果】上述したように、本発明における遊離脂
肪酸の定量方法は、コエンザイムＡのＳＨ基による還元
性の妨害を受けることなく、正確な遊離脂肪酸の定量を
実現するものである。
肪酸の定量方法は、コエンザイムＡのＳＨ基による還元
性の妨害を受けることなく、正確な遊離脂肪酸の定量を
実現するものである。
【図１】遊離脂肪酸定量用試薬の１０℃における保存安
定性を検討した結果を示す図である。
定性を検討した結果を示す図である。
【図２】本発明における遊離脂肪酸定量用試薬の測定値
の対照との相関性を検討した結果を示す図である。
の対照との相関性を検討した結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 DA02 FB01 FB11 GC12 JA01 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ73 QQ89 QR02 QR03 QR13 QR41 QR42 QR66 QS20 QX01
Claims (8)
- 【請求項１】 酢酸およびアセチルコエンザイムＡシン
セターゼを用いることを特徴とする遊離脂肪酸の定量方
法。 - 【請求項２】 試料中の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ、
アデノシン−３−リン酸およびアシルコエンザイムＡシ
ンセターゼを作用させ、さらに発生する物質に追随酵素
を作用させ、最終的に発生する過酸化水素をペルオキシ
ダーゼおよび色原体を用いて発色せしめる請求項１記載
の遊離脂肪酸の定量方法。 - 【請求項３】 チオール基封鎖剤を用いない請求項１又
は２に記載の遊離脂肪酸の定量方法。 - 【請求項４】 酢酸およびアセチルコエンザイムＡシン
セターゼを含むことを特徴とする遊離脂肪酸定量用試
薬。 - 【請求項５】 アシルコエンザイムＡシンセターゼ、発
生する物質に作用する追随酵素、ペルオキシダーゼ及び
色原体を含む請求項４記載の遊離脂肪酸定量用試薬。 - 【請求項６】 追随酵素として （ａ）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ （ｂ）ピロフォスファターゼおよびピルビン酸オキシダ
ーゼ （ｃ）ミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびピルビ
ン酸オキシダーゼ のいずれかの群からなる酵素を含有する請求項４又は５
に記載の遊離脂肪酸定量用試薬。 - 【請求項７】 チオール基封鎖剤を含まない請求項４〜
６のいずれかに記載の遊離脂肪酸定量用試薬。 - 【請求項８】 液状状態である請求項４〜７のいずれか
に記載の遊離脂肪酸定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11134816A JP2000316600A (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 遊離脂肪酸の定量方法及び遊離脂肪酸定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11134816A JP2000316600A (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 遊離脂肪酸の定量方法及び遊離脂肪酸定量用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000316600A true JP2000316600A (ja) | 2000-11-21 |
Family
ID=15137168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11134816A Pending JP2000316600A (ja) | 1999-05-14 | 1999-05-14 | 遊離脂肪酸の定量方法及び遊離脂肪酸定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000316600A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002051769A (ja) * | 2000-08-11 | 2002-02-19 | Azwell Inc | 遊離脂肪酸の測定に有用な液状試薬 |
| WO2005019458A1 (ja) * | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Kikkoman Corporation | アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法 |
| WO2006061945A1 (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. | プロピオン酸の定量方法 |
| JP2012157349A (ja) * | 2011-01-14 | 2012-08-23 | Niigata Prefecture | 酵母発酵物に含まれる脂肪酸エステルの濃度の簡易測定方法 |
| JP2012231751A (ja) * | 2011-05-02 | 2012-11-29 | Niigata Prefecture | 酵母の取得方法並びに酒類及び食品の製造方法 |
| CN105203472A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-12-30 | 北京万泰德瑞诊断技术有限公司 | 一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒 |
| CN113418877A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-09-21 | 东软威特曼生物科技(南京)有限公司 | 一种游离脂肪酸检测试剂盒及方法 |
| CN113774105A (zh) * | 2021-09-30 | 2021-12-10 | 上海信利健康管理有限公司 | 一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒 |
-
1999
- 1999-05-14 JP JP11134816A patent/JP2000316600A/ja active Pending
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