WO2005019458A1 - アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法 - Google Patents

アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法 Download PDF

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WO2005019458A1
WO2005019458A1 PCT/JP2004/011461 JP2004011461W WO2005019458A1 WO 2005019458 A1 WO2005019458 A1 WO 2005019458A1 JP 2004011461 W JP2004011461 W JP 2004011461W WO 2005019458 A1 WO2005019458 A1 WO 2005019458A1
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acyl
coa oxidase
dna
amino acid
acid sequence
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PCT/JP2004/011461
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French (fr)
Inventor
Mikio Bakke
Naoki Kajiyama
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Kikkoman Corporation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03006—Acyl-CoA oxidase (1.3.3.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

Definitions

  • Asinole CoA oxidase its gene, recombinant DNA and method for producing Asinole CoA oxidase
  • the present invention relates to an acyl-CoA oxidase excellent in stability to an SH reagent, a gene thereof, a recombinant DNA, and a method for producing an acyl-CoA oxidase excellent in stability to an SH reagent.
  • Acil CoA oxidase is an enzyme that oxidizes acyl coenzyme A (acyl CoA) and converts it to trans_2,3-dehydroacylcoenzyme A (enoyl CoA) and hydrogen peroxide. Involved in beta-oxidation of fatty acids in peroxisomes. This enzyme is known to exist widely in mammals, plants, microorganisms and the like.
  • mammal-derived products include rat-derived products (see Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 482 (1995)) and mouse-derived products (see Eur. J. Biochem. 267, 1254 (2000)). ) And from humans (see Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 1113 (1994)).
  • Examples of plant-derived plants include those derived from Cabochia (see J. Biol. Chem. 273, 8301 (1998)), those derived from Yuri (see l. Biol. Chem. 261 and 8570 (1986)), those derived from Arabidopsis, and the like. ing.
  • Microbial sources include Candida lipolytics (Yarrowia lipolytics) (see Japanese Patent Publication No. 59-15625, J. Biochem. 88, 1481 (1980)), and Candida tropic alis (Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 108 (1979)), from Candid a maltosa (see Nucleic Acids Res. 16, 365 (1988)), from Macrophomina phaseoli (see Japanese Patent Publication No. 58-40466), from Cladosporium resinae, from Aspergillus candidus ( From the genus Monascus (see Japanese Patent Publication No. 58-40466), from Saccharomyces cerevisiae (see the Japanese Patent Publication No.
  • the industrial utility of this enzyme includes, for example, the measurement of free fatty acids and the use of fatty acids.
  • a first reagent containing coenzyme A (CoA), adenosine triphosphate (ATP), and acyl-CoA synthase is added to the free fatty acids in the serum to generate asinole CoA.
  • a second reagent containing acyl-CoA oxidase is added to this, acido-CoA is oxidized to generate hydrogen peroxide.
  • peroxidase and a color reagent coexist in the second reagent, the color is generated by the generated hydrogen peroxide.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an asinole CoA oxidase which can be used for various uses, particularly for clinical diagnosis, and has excellent stability in the presence of an SH reagent.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that an acyl-CoA oxidase force S derived from Arthroba cter ureaf aciens (IFO 12140) can solve the above-mentioned problems. Completed the invention.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and having an asinole CoA oxidase activity
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and which has an acyl-CoA oxidase activity
  • a method for producing acyl-CoA oxidase comprising culturing the transformant or transductant according to item (7) in a medium and collecting acyl-CoA oxidase from the culture.
  • an asinole CoA oxidase having excellent stability in the presence of an SH reagent is provided.
  • the acyl-CoA oxidase of the present invention which has excellent stability in the coexistence of the SH reagent, can be advantageously used in a measurement kit as a diagnostic enzyme, etc., and is industrially useful.
  • Asyl-CoA oxidase is widely distributed in nature, and the gene of the enzyme can be cloned from various animals, plants, microorganisms and the like, and the biological resources thereof are not particularly limited.
  • microorganisms more specifically Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140).
  • the desired acyl-CoA oxidase gene can be cloned from a chromosomal gene or DNA synthesized from mRNA using reverse transcriptase.
  • any method can be used.
  • a mixed base primer is prepared based on the amino acid sequence analysis results of the isolated acyl-CoA oxidase or the base sequence or amino acid sequence of the known asinole-CoA oxidase, and the polymerase chain reaction ( The target gene or a part thereof can be cloned by performing PCR.
  • Southern blot analysis is performed on chromosomal genes treated with restriction enzymes, a group of gene fragments having the target gene fragment is isolated, and inserted into a vector to transform Escherichia coli or the like, thereby screening the target gene or self-flying.
  • a method of performing inverse PCR using the thus-gated sample as type III can also be used.
  • amino acid sequence of the polypeptide translated by the gene having the obtained nucleotide sequence is determined.
  • This amino acid sequence 1J is as represented by SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the amino acid sequence thus determined is the asinole CoA oxidase gene of the present invention.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence encoding amino acid sequence conferring amino acid oxidase activity. All oxidase genes are included in the present invention.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and the asinole CoA oxidase gene encodes an amino acid sequence that brings about acyl CoA oxidase activity.
  • a site-specific mutagenesis method which is a well-known technique for generating a point mutation or a deletion mutation in a gene; selectively cleaving the gene, and then selecting the selected nucleotide. And gene addition; and oligonucleotide mutagenesis.
  • the stringent condition is a condition in which only a specific hybrid is selectively formed and a signal is detected, but a non-specific hybrid is not formed. Such conditions vary slightly depending on the individual species, but are usually determined by hybridization. Can be easily determined by only considering a few salt concentrations or temperatures during washing
  • the hybridization was performed using the DIG Easy Hyb reagent (Roche's Diagnostics Inc.). At 37 42 ° C. Wash with 0.5 X SSC, 0.1% SDS twice, for 15 minutes. The washing temperature is at least 45 ° C, preferably at least 52 ° C, more preferably at least 57 ° C. DNAs that hybridize under such conditions are highly likely to encode peptides having acyl-CoA oxidase activity, but also include those having mutations that cause loss of acyl-CoA oxidase activity.
  • amino acid sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is included in the present invention.
  • the gene arrangement 1J having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also included in the present invention.
  • acyl CoA oxidase gene having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 was inserted into pACO-A300, and was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (Tsukuba-Higashi 1-chome, Ibaraki Prefecture). No. 1 No. 1 Central No. 6) was deposited internationally on August 21, 2003 (Original Deposit) under the provisions of the Budapest Treaty, and given the accession number FERM BP—08456.
  • acyl-CoA oxidase gene obtained as described above was transformed into a DNA sequence IJ (The Operon, p. 227, Cold) containing an expression region such as a promoter, an operator and a ribosome binding site derived from Escherichia coli ratatosupoperon. (See Spring Harbor Laboratory, 1980), and the resulting recombinant DNA is used to transduce, for example, Escherichia coli or the like, to obtain a high-strain of Asinole CoA oxidase.
  • IJ The Operon, p. 227, Cold
  • an expression region such as a promoter, an operator and a ribosome binding site derived from Escherichia coli ratatosupoperon.
  • the vector DNA to be used may be any vector DNA, for example, plasmid DNA or Bataterio phage DNA.
  • pUTE500K which is a pBR type vector described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-205861, or pUTE300K 'shown in item (6) of Example 1 obtained by improving this to a pUC type can be used.
  • Escherichia coli K-12 preferably Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo), DH5a (manufactured by Takara Shuzo) or the like is transformed or transduced into each of the strains. Get.
  • Acinole-CoA oxidase using the transformant or transductant having the ability to produce acyl-CoA oxidase obtained as described above, for example, a strain belonging to the genus Etscherichia, the following method is used. You can do it. In order to culture the above microorganisms, they may be cultured by a usual solid culture method, but it is preferable to culture by using a liquid culture method as much as possible.
  • the medium for culturing the microorganism may be, for example, a phosphate extract containing one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, or a leachate of soybean or wheat koji.
  • a phosphate extract containing one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, or a leachate of soybean or wheat koji.
  • One or more inorganic salts such as potassium hydrogen, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate, and manganese sulfate were added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins, etc. were appropriately added. Things are used.
  • the initial pH of the medium is suitably adjusted, for example, to 7-9.
  • the cultivation is preferably carried out, for example, at 30 to 42 ° C, preferably around 37 ° C for 6 to 24 hours by aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture, or the like.
  • an ordinary enzyme collecting means can be used to collect acyl-CoA oxidase from the culture.
  • the cells are separated from the culture by, for example, filtration, centrifugation, etc., and washed. It is preferable to collect acyl-CoA oxidase from the cells. In this case, the cells can be used as they are. A method of destroying the cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, and a dynamyl, and a method using a cell wall lysing enzyme such as lysozyme. It is preferable to collect Asinole CoA oxidase from the cells by a method of lysing the cell wall or a method of extracting the enzyme from the cells using a surfactant such as Triton X-100.
  • a surfactant such as Triton X-100.
  • acyl-CoA oxidase In order to isolate acyl-CoA oxidase from the thus obtained crude enzyme solution, a method generally used for enzyme purification can be used. For example, it is preferable to perform an appropriate combination of ammonium sulfate salting-out, organic solvent precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, electrophoresis, and the like.
  • the "SH reagent" of the present invention refers to a reagent that reacts with an SH group, and is also referred to as a thiol reagent or a sulfhydryl reagent.
  • a thiol reagent or a sulfhydryl reagent.
  • maleimide derivatives such as N-ethylmaleimide (NEM), acetic acid, acetic acid amide, p-mercuribenzoic acid (PMB), 5,5'_dithiobis (2_nitroamyl) Benzoic acid) (DTNB) and the like.
  • the term "excellent in stability to SH reagent" of the present invention means that under the reaction conditions described in the activity measurement method and the stability measurement method described below, pH7. 5 means that the residual activity ratio after treatment at 37 ° C. for 4 hours remains at least 40%, preferably at least 60%, of the activity before treatment.
  • Asinole CoA oxidase which has excellent stability to SH reagents, is extremely useful in industry because the storage stability of enzyme-containing products coexisting with SH reagents is remarkably improved.
  • acyl-CoA oxidase Various methods can be used for measuring the activity and stability of the acyl-CoA oxidase. As an example, the method for measuring the activity and the stability of the acyl-CoA oxidase used in the present invention are described below. The measuring method will be described.
  • Each of the acyl CoA oxidases was adjusted to a concentration of about 10 U / ml in 200 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0. ImM FAD, and 200 mM phosphate containing 0. ImM FAD and 20 mM NEM was added to each enzyme solution. Add an equal amount of potassium buffer ( ⁇ 7.5) to each, and adjust the NEM concentration to 10 mM. Leave this enzyme solution (about 5 UZml) at 37 ° C for 4 hours. Measure the enzyme activity of the sample before and after storage, and evaluate the stability by determining the residual activity ratio.
  • Example 1 Cloning of acyl-CoA oxidase gene (l) Preparation of chromosomal DNA of Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140) Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140) was added to LB agar medium (1% (W / V) of noctotryptone, 0.5% of yeast extract (W / V), NaCl 0.5% (W / V) and agar 1.4% (W / V)] and cultured at 37 ° C. The cells grown on the surface of the medium were collected. Use the G NOME DNA Isolation Kit (Funakoshi) to protect 100 g of chromosomal DNA from the cells.
  • the sense primer is 5'-TTYGCNATGACNGARATHGGNCAYGG-3 '(SEQ ID NO: 3; 26mer, A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, H is adenine, cytosine or thymine, N represents adenine, cytosine, guanine or thymine, R represents adenine or guanine, Y represents thymine or cytosine, and the corresponding amino acid sequence: Phe Ala Met Thr Glu II e Gly His Gly (SEQ ID NO: 4)), anti
  • the sense primer is 5'-TGYTGCATNARN ACNGTRTTRTCNCCYTC-3 '(SEQ ID NO: 5; 29mer, corresponding amino acid sequence IJ: G1 u Gly Asp Asn Thr Val Leu Met Gin Gin (SEQ ID NO: 6)), about 0.9 kbp
  • the corresponding gene fragment was amplified
  • the amplified DNA fragment was recovered from the gel after 1% agarose gel electrophoresis, and incorporated into pT7Blue T Vector (Takara Shuzo) to obtain a recombinant plasmid.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter).
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter
  • the DNA fragment (841 bp) had a nucleotide sequence at both ends that correctly encoded the amino acid sequence of the peptide used for PCR primer design.
  • known amino acid sequences are deduced from the determined base system IJ. And homology with the internal amino acid sequence of Asinole CoA oxidase. Therefore, it was found that the obtained amplified DNA fragment was a part (partial gene) of the acyl-CoA oxidase gene of the present invention.
  • the sense primer 5'-AGATCACCGATTGG CTTTGCCTGGG-3 '(sequence) was designed based on the nucleotide sequence information of the 5' end of the acyl CoA oxidase derived from Corynebacterium sp. 2-3-1. No. 9; 25 mer) and antisense primer 5, -GGCCGTTGTGGCAATGCTGGCGAC GT-3 '(SEQ ID NO: 10; 26 mer) prepared based on the gene sequence of item (2), amplified DNA (Approximately 0.6 kb P).
  • the amplified DNA fragment was recovered from the gel after 1% agarose gel electrophoresis, and incorporated into pT7Blue T Vector (Takara Shuzo) to obtain a recombinant plasmid.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter).
  • the amino acid sequence deduced from the determined nucleotide sequence showed high homology with the internal amino acid sequence of known Acinole CoA oxidase.
  • a methionine was present 10 amino acids after the stop codon upstream of the deduced amino acid sequence, indicating that ATG encoding this methionine is 5% of the gene encoding the present acyl-CoA oxidase. 'Presumed to be terminal.
  • the plasmid gene obtained in item (2) was used as a type II, and the primer used in item (2) was used to prepare a PCR Dig labeling mix (Roche's diagnostic). The PCR-amplified DNA was used in the presence. PCR reaction conditions were the same as in (2) above.
  • Smal-digested chromosomal DNA 10 / ig was separated by 1.0% agarose gel electrophoresis, and an agarose gel at a position corresponding to a size of about 2.5 kbp was cut out.
  • a DNA fragment was extracted and purified from the gel using GENE CLEAN II (Funakoshi), and the DNA fragment was incorporated into a Smal-treated pUC19 Vector (Takara Shuzo) to obtain a recombinant plasmid.
  • sense primer 5'-CAGACCTGGATGTCTACGTCACCTT-3 '(SEQ ID NO: 11; 25 mer) prepared based on the partial gene sequence of (2) and the gene sequence of pUC19 Vector PCR was performed using the thus obtained antisense primer 5′-GGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 12; 25 mer).
  • Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo)
  • amplified DNA about 1. Okbp
  • the amplified DNA fragment was recovered from the gel after 1% agarose gel electrophoresis, and incorporated into pT7Blue T Vector (Takara Shuzo) to obtain a recombinant plasmid. ⁇ in the plasmid
  • the base sequence of the input DNA was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter).
  • the amino acid sequence deduced from the determined nucleotide sequence was found to have high homology with the internal amino acid sequence of the known Asinole CoA oxidase, indicating that TAG, a stop codon, was contained.
  • 193 bp of nucleotide sequence information was obtained up to the 3 ′ end and downstream of the 3 ′ end of the gene encoding acyl-CoA oxidase.
  • an oligonucleotide containing the 5'-end or the 3'-end of the acyl-CoA oxidase gene (total oligonucleotide of 30 bases, complementary strand at the 3'-end) was designed.
  • An Ndel site was incorporated into this primer, and the product amplified by PCR was digested with Ndel to obtain a coding region.
  • 5′-ACAGAAGGAAGGCATATGACAG AAGTAGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 13; 30 mer) and 5, _GGCGTTTGTAACCATATGCTAGCGGGACTT-3 ′ (SEQ ID NO: 14; 30 mer) were synthesized as antisense primers.
  • amplified DNA (about 2. lkbp) was obtained, which was digested with Ndel to obtain DNA in a region encoding acyl-CoA oxidase.
  • the obtained DNA was ligated to a DNA sequence containing expression regions such as a promoter, an operator and a ribosome binding site derived from Escherichia coli ratatosupoperon and the like (The Operon, p. 227, Cold Spring Harbor Laboratory, PUTE500K '(described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-205861) carrying the pBR-type vector PUTE300K, which had been modified into a pUC system, was obtained to obtain a recombinant plasmid DNA pACO_A300.
  • DM Morrison's method Method (Methods in Enzymology, 68, p. 326-331, 1979) E.
  • coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed with the recombinant plasmid DNA pACO_A300. , obtained transformant, E. coli. coli) JM109 and (P AC_ ⁇ -A300) It was.
  • the recombinant plasmid pACO-A300 was extracted from the cells using QIAGEN tip-100 (manufactured by QIAGEN) and purified to obtain 100 ⁇ g of the recombinant plasmid.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system C EQ2000 (manufactured by Beckman Coulter). By performing PCR of multiple lots using chromosomal DNA as type II, no errors were confirmed.
  • the nucleotide sequence of the determined acyl-CoA oxidase gene is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the polypeptide translated from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the ORF of the acyl-CoA oxidase gene inserted into pACII_A300 was found to be 2109 bp, consisting of 703 amino acids.
  • PAC ⁇ _A300 was transferred to the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST, Tsukuba, Higashi 1-chome 1-1, Chuo No. 6) under the provisions of the Budapest Treaty on August 21, 2003. Deposit No.) and the deposit number FERM BP-08456.
  • E. coli Escherichia coli
  • pAC ⁇ _A300 The obtained Escherichia coli (E. coli) jM109 (pAC ⁇ _A300) was added to an LB_IPTG_amp medium [batatotryptone 1% (W / V), yeast extract 0.5% (W / V), NaCl 0.5] % (W / V), isopropynole jS-D-thiogalatatopyranoside (ImM) and ampicillin (50 ⁇ g / ml)] at 37 ° C with shaking for 10 hours. The measured value was 0.2 U / ml.
  • Example 2 Method for producing acyl-CoA oxidase
  • E. coli JM109 (pAC-1A300) was cultured in a 50 ml medium according to the method of item (6) in Example 1 to produce acyl-CoA oxidase.
  • Purified acyl-CoA oxidase solution was obtained from the main culture solution by the method described in Japanese Patent Publication No. 58-146466.
  • 0. 200 mM containing ImM FAD Adjust the concentration to about lOUZml with potassium phosphate buffer (PH7.5), and add equal amounts of 200 mM potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.5) containing 0. ImM FAD and 20 mM NEM to each enzyme solution. The concentration of NEM was 10 mM.
  • an acyl CoA oxidase having excellent stability in the presence of an SH reagent is provided.
  • the acyl-CoA oxidase of the present invention which has excellent stability in the coexistence of the SH reagent, can be advantageously used in a measurement kit as a diagnostic enzyme or the like, and is industrially useful.
  • FIG. 1 is a graph showing the stability of the acyl-CoA oxidase of the present invention to NEM.
  • ⁇ is Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140) -derived acyl-CoA oxidase (pAC ⁇ _A300), ⁇ is Arthrobacter sp.-derived acetyl-A-CoA oxidase (Sigma), and ⁇ is Candida sp.-derived acetyl-CoA oxidase (Sigma) The result using is shown.
  • SEQ ID NOs: 3, 5, and 9-14 a synthetic oligonucleotide (wherein H represents A, C, or T, R represents A or G, Y represents T or C, N represents A, Represents C, G or T)

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Abstract

　本発明は、１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７°C，４時間の処理で４０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼを提供する。かかるアシルＣｏＡオキシダーゼはＳＨ試薬共存下において安定性に優れており、有用である。

Description

明 細 書
アシノレ CoAォキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体 DNA及びアシノレ Co Aォキシダーゼの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、 SH試薬に対する安定性が優れたァシル CoAォキシダーゼ、その遺伝 子、組み換え体 DNA及び SH試薬に対する安定性が優れたァシル CoAォキシダー ゼの製造法に関する。
背景技術
[0002] ァシル CoAォキシダーゼは、ァシルコェンザィム A (ァシル CoA)を酸化し、トランス _2,3—デヒドロアシルコェンザィム A (エノィル CoA)及び過酸化水素に変換する酵 素であり、ペルォキシソームにおける脂肪酸の β酸化に関与する。本酵素は、哺乳 動物、植物、微生物等天然に広く存在することが知られている。
[0003] 例えば、哺乳類由来のものとしては、ラット由来（Biochem. Biophys. Res. Com mun. 217, 482 (1995)参照）、マウス由来（Eur. J. Biochem. 267, 1254 (200 0)参照）、ヒ卜由来（Biochem. Biophys. Res. Commun. 198， 1113 (1994)参 照）等の報告がある。
[0004] 植物由来としては、カボチヤ由来 (J. Biol. Chem. 273, 8301 (1998)参照）、キ ユウリ由来 l. Biol. Chem. 261 , 8570 (1986)参照）、シロイヌナズナ由来等が知 られている。
[0005] また微生物由来としては、 Candida lipolytics (Yarrowia lipolytics)由来（特 公昭 59— 15625号公報、 J. Biochem. 88, 1481 (1980)参照）、 Candida tropic alis由来（Biochem. Biophys. Res. Commun. 91 , 108 (1979)参照）、 Candid a maltosa由来 (Nucleic Acids Res. 16, 365 (1988)参照)、 Macrophomina phaseoli由来（特公昭 58-40466号公報参照）、 Cladosporium resinae由来、 Aspergillus candidus由来（特公昭 58-40466号公報参照）、 Monascus属由来 (特公昭 58—40466号公報参照）、 Saccharomyces cerevisiae由来（特公昭 58- 40466号公報参照）、 Arthrobacter属由来（特公昭 58—40466号公報参照）、 Die tyostelium discoideum由来、 Corynebacterium由来（特願 2003— 276393号 明細書参照）等が知られている。これらの酵素のなかにはすでに遺伝子のクローニン グに成功し、組み換え体によって生産されている例もある。
[0006] 本酵素の産業上の有用性としては、例えば、遊離脂肪酸の測定あるいは脂肪酸の
/3酸化系を利用する化学変換が挙げられる。特に臨床診断の分野においては、血 清中の遊離脂肪酸が糖尿病、高脂血症、甲状腺機能亢進症、重症肝障害の診断の 指標とされている。また、近年、遊離脂肪酸がォーファン Gタンパク質受容体の一つ である GPR40に作用して、瞎臓 細胞からのインスリン分泌を促進することが明らか となり、遊離脂肪酸の生体内における機能性に注目が集まっている（Nature 422, 173 (2003)参照）。
[0007] 酵素を用いる遊離脂肪酸の測定方法は、レ、くつか知られている。
[0008] ァシル CoAォキシダーゼを用いる方法は、特異性が高ぐ簡便であることから広く 一般的に用いられている（特公昭 57-29998号公報及び特公昭 57-33955号公報 参照）。
[0009] 本測定は、まず血清中の遊離脂肪酸にコェンザィム A (CoA)、アデノシン 3リン酸（ ATP)及びァシル CoAシンターゼ等を含有する第一試薬を添加し、アシノレ CoAを生 成させる。これにァシル CoAォキシダーゼを含有する第二試薬を添加すると、アシノレ CoAが酸化されて過酸化水素が発生する。第二試薬にペルォキシダーゼと発色試 薬を共存させると、発生する過酸化水素により発色するので、これを測定することによ り遊離脂肪酸を定量できる。以下に反応式を示す。
[化 1] アシノレ C o Aシンターゼ
遊離脂肪酸 + C 0 A + AT P → ァシル C 0 A + P P i + AMP ァシル C o Aォキシダーゼ
ァシル C o A + 02 → エノィル C o A + H 2 0 2
[0010] 本測定では、過剰に添加する CoAが発色を妨害することが知られており、これを回 避するために、第二試薬中に N_ェチルマレイミド（NEM)、ョード酢酸、ョード酢酸 アミド等の SH試薬を共存させ、第二試薬の添加と同時に CoAを失活させる方法が 報告されている（特公昭 57-29998号公報及び特公昭 57-33955号公報参照）。し 力、しながら、同じく第二試薬に処方されるァシル CoAォキシダーゼは、 SH試薬共存 下では安定性が著しく低下するために、長期間使用可能な液状化試薬の調製が困 難であった。そこで、遊離脂肪酸測定用の液状化試薬を開発するために、 SH試薬 に対する安定性の優れたァシル CoAォキシダーゼの開発が強く求められていた。 発明の開示
[0011] 本発明が解決しょうとする課題は、種々の用途、特に臨床診断に用いることのでき る、 SH試薬共存下での安定性の優れたアシノレ CoAォキシダーゼを提供することに める。
[0012] そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意検討を重ねた結果、 Arthroba cter ureaf aciens (IFO 12140)由来のァシル CoAォキシダーゼ力 S、上記課題を 解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
[0013] すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
[0014] (l) lOmMの SH試薬存在下、 pH7. 5において 37°C, 4時間の処理で 40。/。以上 の残存活性を示すことを特徴とするアシノレ CoAォキシダーゼ。
[0015] (2) 10mMの SH試薬存在下、 pH7. 5において 37°C, 4時間の処理で 60。/o以上 の残存活性を示すことを特徴とするアシノレ CoAォキシダーゼ。
[0016] (3)以下の（a)又は（b)のァシル CoAォキシダーゼ。
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、かつアシノレ CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[0017] (4)以下の（a)又は（b)のァシル CoAォキシダーゼをコードする遺伝子。
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、かつァシル CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[0018] (5)以下の（a)又は（b)の DNA力 なるァシル CoAォキシダーゼ遺伝子。 (a)配列番号 2に示される塩基配列からなる DNA
(b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつァシル CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク 質をコードする DNA
[0019] (6)項目（4)又は（5)記載のァシル CoAォキシダーゼ遺伝子をベクター DNAに揷 入したことを特徴とする組み換え体 DNA。
[0020] (7)項目（6)記載の組み換え体 DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
[0021] (8)項目（7)記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からァシ ル CoAォキシダーゼを採取することを特徴とするァシル CoAォキシダーゼの製造法
[0022] 本発明によれば、 SH試薬共存下において安定性の優れたアシノレ CoAォキシダー ゼが提供される。 SH試薬共存下において安定性の優れた、本発明ァシル CoAォキ シダーゼは、診断用酵素等として測定用キットに有利に利用でき、産業上有用である 発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明を詳細に説明する。本願は、 2003年 8月 25日に出願された日本国 特許出願第 2003— 299607号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明 細書および/または図面に記載される内容を包含する。
[0024] ァシル CoAォキシダーゼは、 自然界に広く分布しており、該酵素の遺伝子は、種々 の動物、植物、微生物等からクローニングが可能であり、その生物資源は、特に限定 されないが、本発明では、例えば、微生物、さらに具体的には Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)力用レ、られる。
[0025] 目的とするァシル CoAォキシダーゼ遺伝子は、染色体遺伝子あるいは mRNAより 逆転写酵素を用いて合成した DNAからクローニングすることができる。クローニング については如何なる方法でもよぐ例えば、単離したァシル CoAォキシダーゼのアミ ノ酸配列解析結果や、既知のアシノレ CoAォキシダーゼの塩基配列又はアミノ酸配列 を基に混合塩基プライマーを作製してポリメラーゼ連鎖反応（以下、 PCRと略称する )を行うことにより目的の遺伝子又はその一部をクローニングすることができる。さらに 、制限酵素処理した染色体遺伝子についてサザンプロット分析を行い、 目的遺伝子 断片を有する遺伝子断片群を単離し、これをベクターに挿入して大腸菌等を形質転 換させて目的遺伝子をスクリーニングする方法あるいはセルフライゲーシヨンさせたも のを铸型としてインバース PCRを行う方法等も用いることができる。
[0026] 次いで、得られた塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチドのァミノ 酸配列を確定する。このアミノ酸配歹 1Jは、配列番号 1で表されるとおりである。このよう にして確定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明のアシノレ CoAォキシダ ーゼ遺伝子である。
[0027] なお、配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されており、かつ、ァシル CoAォキシダーゼ活性をもたらすアミ ノ酸配列をコードするァシル CoAォキシダーゼ遺伝子は、全て本発明に含まれる。
[0028] そして、配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されており、かつァシル CoAォキシダーゼ活性をもたらすァミノ 酸配列をコードするアシノレ CoAォキシダーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でも よぐ例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部 位特定変異誘導法;遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除 去又は付加し、遺伝子を連結する方法;オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられ る。
[0029] これらの DNAは、ァシル CoAォキシダーゼ活性をもたらすポリペプチドをコードし ている蓋然性が高ぐ形質転換体を作製し、活性を有するものを選択することができ る。
[0030] 本発明のアシノレ CoAォキシダーゼ遺伝子と実質的に同一な遺伝子を取得するた めには、配列番号 2の塩基配列を有する DNA若しくはその相補鎖、又はそれらの一 部を含むプローブによりストリンジヱントな条件でハイブリダィゼーシヨンし、ァシル Co Aォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものを選択することができる。 ここでレ、うストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され 、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件である。この ような条件は個々の生物種により若干異なるが、常法によりハイブリダィゼーシヨンと 洗いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易に決定することができる
。このような条件としては、例えば、後記実施例 1の項目（4)において特異的なシグナ ルが観察できることから、ハイブリダィゼーシヨンは、 DIG Easy Hyb試薬（ロシュ'ダ ィァグノステイクス社製）を用レヽて 37 42°Cでー晚行う。洗レヽ fま、 0. 5 X SSC, 0. 1 % SDSを用レ、、 15分間、 2回行う。洗いの温度は、 45°C以上、好ましくは 52°C以上 、更に好ましくは 57°C以上である。このような条件でハイブリダィズするような DNAは 、ァシル CoAォキシダーゼ活性を有するペプチドをコードしている蓋然性が高いが、 ァシル CoAォキシダーゼ活性を失うような変異を有するものも含まれる。そして配列 番号 1で表されるアミノ酸配列の 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0%以上の相同性を有するアミノ酸配列は本発明に含まれることとなる。そして配列 番号 2に示される遺伝子配列の 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0%以上の相同性を有する遺伝子配歹 1Jもまた本発明に含まれることとなる。
[0031] なお、配列番号 2に示される配列を有するァシル CoAォキシダーゼ遺伝子は、 pA CO - A300に挿入されて、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン ター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)にブタペスト条約の規定下で 200 3年 8月 21日付（原寄託）で国際寄託され、受託番号 FERM BP— 08456力 S付与さ れている。
[0032] 上記のようにして得られたァシル CoAォキシダーゼ遺伝子を、大腸菌ラタトースォ ペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現 領域を含む DNA配歹 IJ (The Operon, p. 227, Cold Spring Harbor Laboratory , 1980を参照）を保有するベクター DNAに挿入し、得られた組み換え体 DNAを用 いて、例えば、大腸菌等に形質導入してアシノレ CoAォキシダーゼ高生産株を得る。
[0033] 用いられるベクター DNAは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミド DNA若しく はバタテリオファージ DNA等でもよレ、。具体的には、特開平 08—205861号公報記 載の pBR系ベクターである pUTE500K，あるいはこれを pUC系に改良した実施例 1 の項目（6)に示される pUTE300K'等を用いることができる。得られた組み換え体 D NAを用いて、例えば、大腸菌 K一 12、好ましくは大腸菌 JM109 (宝酒造社製）、 DH 5 a (宝酒造社製)等を形質転換又はそれらに形質導入して夫々の菌株を得る。 [0034] 上記のようにして得られたァシル CoAォキシダーゼ生産能を有する形質転換体又 は形質導入体、例えば、エツシェリシァ属に属する菌株を用いてアシノレ CoAォキシ ダーゼを生産するには、下記のようにして行うことができる。上記微生物を培養するに は、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養す るのが好ましい。
[0035] また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉ェキ ス、コーンスティープリカ一あるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等、 1種以上の窒素 源に、リン酸 2水素カリウム，リン酸水素 2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第 2鉄、硫 酸第 2鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の 1種以上を添加し、更に必要により糖 質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
[0036] なお、培地の初発 pHは、例えば、 7— 9に調整するのが適当である。また培養は、 例えば、 30— 42°C、好ましくは 37°C前後で 6— 24時間、通気撹拌深部培養、振とう 培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりァシル C oAォキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
[0037] 培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。こ の菌体からァシル CoAォキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそ のまま用いることもできる力 超音波破碎機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の 破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて 菌体細胞壁を溶解する方法、トリトン X-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素 を抽出する方法等により、菌体からアシノレ CoAォキシダーゼを採取するのが好まし レ、。
[0038] このようにして得られた粗酵素液からァシル CoAォキシダーゼを単離するには、通 常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱 法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電 気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
[0039] 本発明の「SH試薬」とは、 SH基と反応する試薬をいい、チオール試薬、スルフヒド リル試薬ともいう。例えば、 N—ェチルマレイミド（NEM)等のマレイミド誘導体、ョード 酢酸、ョード酢酸アミド、 p_メルクリ安息香酸（PMB)、 5， 5 ' _ジチォビス（2_ニトロ安 息香酸）（DTNB)等が挙げられる。
[0040] また、本発明の「SH試薬に対する安定性が優れた」とは、以下に述べる活性測定 方法及び安定性測定方法に記載した反応条件下で、 10mMの SH試薬の存在下、 pH7. 5において 37°C、 4時間処理した後の残存活性比が処理前の活性に対して 4 0%以上、好ましくは 60%以上残存していることをいう。 SH試薬に対する安定性が優 れたアシノレ CoAォキシダーゼは、 SH試薬を共存させた酵素含有製品等の保存性 が著しく向上するため、産業上極めて有用である。
[0041] ァシル CoAォキシダーゼの活性の測定方法及び安定性の測定方法は、種々の方 法を用いることができ、一例として、以下に、本発明で用いるァシル CoAォキシダー ゼ活性の測定方法及び安定性測定方法について説明する。
[0042] (ァシル CoAォキシダーゼ活性の測定方法）
0. 2M Tris-HClHfn¾ (ρΗ7. 5) 0. 9ml, 0. 1 % ノ ノレミトイノレ CoA溶夜 0. lml、 15mM Toos溶液 0. 04ml, 150U/mlペルォキシダーゼ溶液 0· 04ml 、 1. 76% 4ーァミノアンチピリン溶液 0. 02mlの混合液を 37°Cで 5分間インキュべ ートし、ァシル CoAォキシダーゼサンプルを 0· 05ml添加、混合する。全容 1 · 15ml を 37°Cで 3分間反応させ、反応開始から 3分間の、反応溶液の 555nmにおける吸 光度の変化を分光光度計を用いて測定する。酵素 1Uは、上記測定条件下において 、 1分間あたり 1 μ molの過酸化水素を生成する酵素量とする。
[0043] (NEM安定性測定方法）
各種ァシル CoAォキシダーゼを 0. ImM FADを含む 200mM リン酸カリウム緩 衝液（pH7. 5)にて夫々約 10U/mlの濃度とし、各酵素溶液に 0. ImM FAD及 び 20mM NEMを含む 200mM リン酸カリウム緩衝液（ρΗ7. 5)を夫々等量添カロ し、 NEMの濃度を 10mMとする。本酵素液 (約 5UZml)を 37°Cにて 4時間放置す る。保存前及び保存後のサンプルの酵素活性を測定し、残存活性比を求めることで 安定性を評価する。
実施例
[0044] 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
[0045] 実施例 1：ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子のクローニング (l)Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)染色体 DNAの調製 Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)を LB寒天培地〔ノくクトトリプトン 1 % ( W/V) ,酵母エキス 0· 5% (W/V) , NaCl 0. 5% (W/V)及び寒天 1 · 4% (W /V)〕に接種し、 37°Cで培養した。培地表面に生育した菌体を集菌した。この菌体 より G NOME DNA Isolation Kit (フナコシ社製）を用いて、染色体 DNAを 100 β g守,こ。
[0046] (2)ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得 1
次いで、 日本 DNAデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、各種ァシ ル CoAォキシダーゼのアミノ酸配列の相同性検索を行レ、、相同性が高いアミノ酸配 列部分を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基とした複数個の PCR用プライ マーを作製した。項目（1)で調製した染色体 DNAを铸型とし、 Ex Taq DNAポリメ ラーゼ（宝酒造社製）を用いて PCRを行った。 PCR反応は、 PCRマスターサイクラ一 グラジェント（エツペンドルフ社製）にて、熱変性 94°C, 2分、ァニール 58°C, 30秒、 伸長反応 72°C, 1分の条件下、 30サイクル行った。結果としてセンスプライマーが 5' -TTYGCNATGACNGARATHGGNCAYGG-3 ' (配列番号 3 ; 26 mer, Aは 、アデニン、 Cは、シトシン、 Gは、グァニン、 Tは、チミン、 Hは、アデニン、シトシン又 はチミン、 Nは、アデニン、シトシン、グァニン又はチミン、 Rは、アデニン又はグァニン 、 Yは、チミン又はシトシンを示す。対応するアミノ酸配列： Phe Ala Met Thr Glu II e Gly His Gly (配列番号 4) )、アンチセンスプライマーが 5 '— TGYTGCATNARN ACNGTRTTRTCNCCYTC-3 ' (配列番号 5； 29mer,対応するアミノ酸配歹 IJ : G1 u Gly Asp Asn Thr Val Leu Met Gin Gin (配列番号 6) )であるとき、 0· 9kbp程 度に相当する遺伝子断片が増幅された。
[0047] 増幅した DNA断片を 1%ァガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、 pT7Blue T Vector (宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の 揷入 DNAの塩基配列を、マルチキヤピラリー DNA解析システム CEQ2000 (ベック マン ·コールター社製）を用いて決定した。その結果、 DNA断片（841bp)が、 PCR のプライマー設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列を両 端に有していた。また、決定した塩基配歹 IJから推定されるアミノ酸配列中には、既知 のアシノレ CoAォキシダーゼの内部アミノ酸配列と相同性が認められた。従って、得ら れた増幅 DNA断片は、本発明のァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の一部分 (部分遺 伝子)であることが判明した。
[0048] (3)ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得 2
先にクローニングした Corynebacterium sp. 2— 3— 1 (FERM BP— 6183)由来 のァシル CoAォキシダーゼ（特願 2003—276393号明細書；アミノ酸配列を配列番 号 7に、遺伝子の塩基配列を配列番号 8に示す）と部分遺伝子配列の相同性が極め て高かったことから、 Corynebacterium sp. 2—3—1由来のアシノレ CoAォキシダー ゼの遺伝子配列に基づいてプライマーを作製し、項目（1)で調製した染色体 DNA を錡型として PCRを行った。 Ex Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用レ、、熱変 性 94。C, 30秒、ァニーノレ 58°C， 30秒、伸長反応 72。Cの条件下、 30サイクル行った 結果、 Corynebacterium sp. 2—3—1由来ァシル CoAォキシダーゼの 5 '末端側 の塩基配列情報をもとに設計したセンスプライマー 5 ' -AGATCACCGATTGG CTTTGCCTGGG-3' (配列番号 9 ; 25 mer)及び項目（2)の遺伝子配列をもとに 作製したアンチセンスプライマー 5， -GGCCGTTGTGGCAATGCTGGCGAC GT-3' (配列番号 10 ; 26 mer)を用いて PCRを行った場合、増幅 DNA (約 0. 6kb P)を得ることができた。
[0049] 本増幅 DNA断片 1%ァガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、 pT7Blue T Vector (宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿 入 DNAの塩基配列を、マルチキヤピラリー DNA解析システム CEQ2000 (ベックマ ン 'コールター社製）を用いて決定した。決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配 列には、既知のアシノレ CoAォキシダーゼの内部アミノ酸配列と高い相同性が認めら れた。また、推定されたアミノ酸配列の上流側には終止コドンの 10アミノ酸の後にメチ ォニンが存在してレ、たこと力ら、このメチォニンをコードする ATGが本ァシル CoAォ キシダーゼをコードする遺伝子の 5'末端であると推定された。
[0050] (4)Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)染色体 DNAのサザンブロット解析 次に、項目（1)で調製した染色体 DNA2 x gを、制限酵素 Smalを用レ、、 37°Cで 5 時間消化した。得られた制限酵素消化 DNAを 0. 7%ァガロースゲル電気泳動に供 した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜（Hybond_N +、アマシャムファノレ マシアバイオテック社製）に DNAを転写した。ハイブリダィゼーシヨンのプローブとし ては、項目（2)で得られたプラスミド遺伝子を铸型とし、項目（2)で使用したプライマ 一を用いて、 PCR Digラベリングミックス（ロシュ'ダイァグノスティックス社製）存在下 で PCR増幅させたものを使用した。 PCRの反応条件等は、上記（2)と同様に行った
[0051] 上記のナイロン膜を 2 X SSC (0. 3M NaCl、 0. 03Mクェン酸ナトリウム； pH7. 0) で洗浄後、 DIGシステムを用レ、、ユーザーガイド（ロシュ'ダイァグノスティックス社製） に従レ、、ハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーシヨンを行った後のナイ口 ン膜の洗浄は、 0. 1% SDS含有 2 X SSC (15mM NaCl、 1. 5mMクェン酸ナトリウ Λ ; ρΗ7. 0)で室温 ίこて 5分 Γ 、 2回ののち、 0. 1% SDS含有 0. 1 X SSCで 68。Gこ て 15分間、 2回行った。
[0052] その結果、約 2. 5kbpの位置にハイブリダィズしたプローブに由来するシグナルが 認められた。
[0053] (5)ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得 3
上記の結果に基づき、 Smal消化した染色体 DNA10 /i gを 1. 0%ァガロースゲル 電気泳動で分離し、約 2. 5kbpの大きさに相当する位置のァガロースゲルを切り出し た。ゲルから GENE CLEAN II (フナコシ社製）により DNA断片を抽出精製し、該 D NA断片を Smal処理した pUC19 Vector (宝酒造社製）に組み込み、組み換え体 プラスミドを得た。本プラスミドを铸型とし、（2)の部分遺伝子配列をもとに作製したセ ンスプライマー 5'— CAGACCTGGATGTCTACGTCACCTT—3 ' (配列番号 1 1 ; 25 mer)及び pUC19 Vectorの遺伝子配列をもとに作製したアンチセンスプライ マー 5 ' -GGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCT-3 ' (配列番号 12； 25 mer )を用いて PCRを行った。 Ex Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用レ、、熱変性 94°C, 30禾少、ァニーノレ 58°C， 30禾少、 ί申長反応 72。G, 3分の条件下、 30サイクノレ行 つた。結果として増幅 DNA (約 1. Okbp)を得ることができた。
[0054] 本増幅 DNA断片 1%ァガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、 pT7Blue T Vector (宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の揷 入 DNAの塩基配列を、マルチキヤピラリー DNA解析システム CEQ2000 (ベックマ ン 'コールター社製）を用いて決定した。決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配 列には、既知のアシノレ CoAォキシダーゼの内部アミノ酸配列と高い相同性が認めら れ、終止コドンである TAGが含まれていることがわかった。結果として、ァシル CoA ォキシダーゼをコードする遺伝子の 3'末端まで及び 3 '末端より下流側 193bpの塩 基配列情報を得た。
[0055] (6)全長ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子のクローニング及びァシル CoAォキシダー ゼ生産株の取得
先ず、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子 の 5 '末端あるいは 3，末端を含むオリゴヌクレオチド（計 30塩基のオリゴヌクレオチド、 3'末端側は相補鎖）を設計した。このプライマー中に Ndel部位を組み込んでおき、 PCRで増幅した産物を、 Ndelを作用させて消化することにより、コーディング領域が 得られるようにしておいた。すなわち、 5 '— ACAGAAGGAAGGCATATGACAG AAGTAGTG-3 ' (配列番号 13 ; 30 mer)、アンチセンスプライマーとして 5，_GG CGTTTGTAACCATATGCTAGCGGGACTT-3 ' (配列番号 14 ; 30 mer)を 合成した。項目（2)で調製した染色体遺伝子を铸型とし、合成プライマー及び KOD Plusポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、熱変性 94°C, 15秒、ァニール 56°C, 30秒 、伸長反応 68°C, 4分 00秒の条件下、 30サイクル行った。結果として増幅 DNA (約 2. lkbp)が得られ、これを Ndelで消化して、ァシル CoAォキシダーゼをコードする 領域の DNAを得ることができた。
[0056] 得られた DNAを、大腸菌ラタトースォペロン等に由来するプロモーター、オペレー ター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含む DNA配歹 lj (The Operon, p. 2 27, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980を参照）を保有する pBR系ベクター PUTE500K' (特開平 08—205861号公報記載）を pUC系に改良した PUTE300K ，の Ndel部位に揷入し、組み換え体プラスミド DNA pACO_A300を得た。 D. M. Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68， p. 326—331， 1979) ίこ従レヽ、 組み換え体プラスミド DNA pACO_A300を用いて大腸菌（E. coli)JM109 (宝酒 造社製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌 . coli)JM109 (PAC〇-A300)を得 た。菌体より QIAGEN tip-100 (キアゲン社製）を用いて組み換え体プラスミド pA CO-A300を抽出して精製し、組み換え体プラスミドを 100 μ g得た。
[0057] 該プラスミド中の挿入 DNAの塩基配列を、マルチキヤピラリー DNA解析システム C EQ2000 (ベックマン'コールター社製）を用いて決定した。染色体 DNAを铸型とし た複数ロットの PCRを行うことにより、 errorが入っていないことを確認した。決定した ァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号 2に、また、該 DNA配列か ら翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号 1に夫々示した。 pAC〇_A300 に揷入されているァシル CoAォキシダーゼ遺伝子の ORFは、 2109bp、 703ァミノ 酸からなっていることが判明した。なお、 pAC〇_A300は、独立行政法人産業技術 総合研究所 特許生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) にブタペスト条約の規定下で 2003年 8月 21日付 (原寄託）で国際寄託され、受託番 号 FERM BP—08456が付与されている。
[0058] 得られた大腸菌（E. coli)jM109 (pAC〇_A300)を、 LB_IPTG_amp培地〔バタ トトリプトン 1 % (W/V) ,酵母エキス 0· 5% (W/V) , NaCl 0. 5% (W/V) ,イソ プロピノレー jS—D—チォガラタトピラノシド（ImM)及びアンピシリン（50 μ g/ml)〕に て 37°Cで 10時間振とう培養した後、アシノレ CoAォキシダーゼ活性を測定したところ 、 0. 2U/mlであった。
[0059] 実施例 2：ァシル CoAォキシダーゼの製造法
大腸菌 . coli)JM109 (pAC〇一 A300)を実施例 1の項目（6)の方法にて 50ml の培地で培養し、ァシル CoAォキシダーゼを生産させた。本培養液から、特公昭 58 一 40466号公報記載の方法により、精製ァシル CoAォキシダーゼ溶液を得た。
[0060] 実施例 3：ァシル CoAォキシダーゼの NEMに対する安定性の評価
実施例 2にて調製した組み換えァシル CoAォキシダーゼ及び市販の精製 Arthro bacter sp. 由来ァシル CoAォキシダーゼ（Sigma社）及び Candida sp. 由来ァシ ル CoAォキシダーゼ（Sigma社）を夫々 0. ImM FADを含む 200mM リン酸カリ ゥム緩衝液（PH7. 5)にて約 lOUZmlの濃度とし、各酵素溶液に 0. ImM FAD及 び 20mM NEMを含む 200mM リン酸カリウム緩衝液（ρΗ7. 5)を夫々等量添カロ し、 NEMの濃度を 10mMとした。本酵素液（約 5U/ml)を 37°Cにて放置し、保存 前及び保存後のサンプルの酵素活性を測定して残存活性比を求めることで安定性 を評価した。図 1に示したとおり、 Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)由来 ァシル CoAォキシダーゼは、市販の 2種のァシル CoAォキシダーゼより NEM共存 下での安定性が高ぐ 4時間放置後も約 65%の残存活性が認められた。
[0061] 本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考と して本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0062] 本発明によれば、 SH試薬共存下において安定性の優れたァシル CoAォキシダー ゼが提供される。 SH試薬共存下において安定性の優れた、本発明ァシル CoAォキ シダーゼは、診断用酵素等として測定用キットに有利に利用でき、産業上有用である 図面の簡単な説明
[0063] [図 1]図 1は、本発明ァシル CoAォキシダーゼの NEMに対する安定性を示すグラフ である。〇は Arthrobacter ureaf aciens (IFO 12140)由来ァシル CoAォキシダ ーゼ（pAC〇_A300)、△は Arthrobacter sp. 由来ァシル CoAォキシダーゼ（Si gma社）、口は Candida sp. 由来ァシル CoAォキシダーゼ（Sigma社）を用いた結 果を示す。
配列表フリーテキスト
[0064] 配列番号 3、 5及び 9一 14 :合成オリゴヌクレオチド（式中、 Hは A、 C又は Tを表し、 Rは A又は Gを表し、 Yは T又は Cを表し、 Nは A、 C、 G又は Tを表す）
配列番号 4及び 6：ペプチド

Claims

請求の範囲
[1] 10mMの SH試薬存在下、 pH7. 5において 37°C, 4時間の処理で 40。/。以上の残 存活性を示すことを特徴とするァシル CoAォキシダーゼ。
[2] 10mMの SH試薬存在下、 pH7. 5において 37°C, 4時間の処理で 60。/。以上の残 存活性を示すことを特徴とするァシル CoAォキシダーゼ。
[3] 以下の（a)又は（b)のァシル CoAォキシダーゼ。
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、かつァシル CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[4] 以下の（a)又は（b)のァシル CoAォキシダーゼをコードする遺伝子。
(a)配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、かつァシル CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[5] 以下の（a)又は（b)の DNA力 なるァシル CoAォキシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号 2に示される塩基配列からなる DNA
(b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつアシノレ CoAォキシダーゼ活性を有するタンパク 質をコードする DNA
[6] 請求項 4又は 5記載のァシル CoAォキシダーゼ遺伝子をベクター DNAに揷入した ことを特徴とする組み換え体 DNA。
[7] 請求項 6記載の組み換え体 DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
[8] 請求項 7記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物か
oAォキシダーゼを採取することを特徴とするァシル CoAォキシダーゼの製造法。
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