CN100381559C - 一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 - Google Patents
一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100381559C CN100381559C CNB200510028752XA CN200510028752A CN100381559C CN 100381559 C CN100381559 C CN 100381559C CN B200510028752X A CNB200510028752X A CN B200510028752XA CN 200510028752 A CN200510028752 A CN 200510028752A CN 100381559 C CN100381559 C CN 100381559C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant plasmid
- gene
- recombinant
- plasmid
- pmmzy03
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
本发明公开了一种表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株,该菌株转化有重组质粒pMMZY03,该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子,并含有D-氨基酸氧化酶基因,组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。本发明还公开了所述表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法。与现有已知的D-氨基酸氧化酶生产菌株相比较,本发明的菌株具有生产时间缩短的优势,且避免了发酵过程中甲醇诱导的难控制因素。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程菌和微生物发酵领域,具体地说,是关于一种表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母菌株及其构建方法。
背景技术
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase,DAO,EC 1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类,它催化D型氨基酸氧化脱氨反应,生成相应的酮酸和氨,并伴随着一分子氧还原,而释放出过氧化氢。在两步酶法生产7-氨基酸头孢烷酸(7-ACA)工艺中,DAO用于转化头孢菌素C(CPC)的第一步反应。
巴斯德毕赤酵母已经成为一种主要的真核微生物表达系统(Cregg JM.,Vedvick TS.,Raschke WC.Bio/Technology.11:905-910,1993)。毕赤酵母可以高密度发酵,毕赤酵母表达系统中整合质粒常用的启动子是醇氧化酶启动子(Alcohol oxidasel promoter,PAOX1)和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,PGAP)。
甲醇诱导型毕赤酵母菌能够表达三角酵母来源的DAO(Yu J,Yang S,Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18:291-297,2002),但是,诱导型毕赤酵母菌在发酵过程中需要添加甲醇诱导,且诱导过程的条件控制比较复杂,此外,发酵时间相对也比较长,酶活力达到最高点通常需要40小时左右。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有表达D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇诱导型毕赤酵母菌的上述缺点和不足,从而提供一种表达DAO的组成型毕赤酵母基因工程菌株。
本发明的另一个目的在于提供一种上述表达DAO的组成型毕赤酵母表达菌株的构建方法。
本发明的表达DAO的组成型毕赤酵母表达菌株转化有重组质粒pMMZY03,该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子,并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
本发明的组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法包括以下步骤:
A、酶切质粒质粒pPIC3.5k,回收含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因的片段;酶切质粒pGAPZA,回收含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因的片段;连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP;
B、重组质粒pPICGAP酶切线性化后与带有组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO)片段用T4连接酶相连接,得到重组质粒pMMZY03;
C、将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌中,构建成表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株。
与现有技术中已知的DAO生产菌株相比,本发明的带组氨酸纯化标签的重组DAO的表达菌株达到相同发酵单位所需的发酵时间大为缩短(约为1/3),并且不需要甲醇诱导。因此在生产中具有非常明显的优势,例如时间短、能耗低、发酵过程控制相对简单等。
新构建的整合载体启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因。与商品化的相同类型载体相比较,载体中含有组氨醇脱氢酶基因(HIS4),同时避免了高价格抗生素Zeocin使用。
附图说明
图1为在组成型毕赤酵母中表达重组三角酵母DAO的整合质粒pMMZY03的构建流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中,DNA片段连接、质粒的制备,化学转化导入宿主菌,克隆均参照《分子克隆》(Sambrook,J.,Fritsch,E.P.,Maniatis,T.(2001)“Molecular Cloning:A LaboratoryManual 3rd ed,”Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。
本发明所构建的表达DAO的组成型巴斯德毕赤酵母菌株MMZY03已于2005年8月9日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCTCC M 205088。
实施例1、质粒构建
1、材料:
质粒pPIC3.5k:Invitrogen公司产品,大小为9.0kb,含有卡那霉素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因,组氨醇脱氢酶基因,启动子是醇氧化酶基因,并具有多个限制性酶切位点。
质粒pGAPZA:Invitrogen公司产品,大小为2.9kb,含有Zeocin抗性基因,启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因,并具有多个限制性酶切位点。
质粒pLHB-3:按照Liu HB等(Liu HB.,Jiang WH.,Yang YL.Cloning,Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15:337-342,1999)的方法构建,大小为6.4kb,含有带组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO),卡那霉素抗性基因,启动子是T7 lac。
2、方法:
如图1所示,质粒pPIC3.5k用EcoR I单酶切,再用Bgl II部分酶切,割胶回收大小约8.0kb的基因片段,该片段含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因;质粒pGAPZA用EcoR I和Bgl II双酶切后胶回收约0.5kb的基因片段,该片段含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因;T4连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP,该重组质粒启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因,含有组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。
质粒pPICGAP用EcoR I线性化后再用Klenow补平,胶回收得到约8.5kb大小的片段;质粒pLHB-3用Nco I和Hind III双酶切后再用Klenow补平,得到约1.2kb的HDAO基因片段;T4连接酶连接两个基因片段,得到重组质粒pMMZY03,该重组质粒启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因,含有重组D-氨基酸氧化酶基因,组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。
实施例2、质粒扩增
质粒pMMZY03采用常规的化学转化法《参考分子克隆》转化至至大肠杆菌宿主菌DH5α(Takara),挑取单个转化子接种到LB液体培养基(1%蛋白胨,0.5%酵母膏,1%氯化钠)中,在37℃培养扩增pMMZY03质粒。
实施例3、质粒转化
参考《分子克隆》,采用碱裂解法从实施例2的大肠杆菌抽提扩增的质粒pMMZY03,抽提的质粒选用BspE I单酶切线性化,乙醇沉淀回收线性化质粒约10μg,与毕赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受态细胞80μl混合后转入电转化杯中,冰浴中放置5min,同时准备一份不添加线性化质粒pMMZY03的感受态细胞作为阴性对照。采用Bio-Rad电转化仪器,电转化参数设置是1.5KV、25μF、200Ω,电击时间4.6ms,电击转化后立即加入1ml冰浴的山梨醇。电击转化产物涂在MD平板(1.34%YNB,4×10-5%生物素,1%葡萄糖,2%琼脂糖)上,放置28℃培养,2-3天后MD平板上长出转化子。
实施例4、转化子筛选
从MD平板上挑取10个转化子接种至YPD培养基(2%蛋白胨,1%酵母膏,2%葡萄糖)中,培养温度为30℃,摇床转速为280rpm,培养至24h时取样测定DAO活力。
一个酶活力单位(U)的DAO定义:37℃,pH8.5条件下,每分钟氧化脱氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法测定DAO活力(Nilsson.K.,Mosbach.K.,Appl.Biochem.Biotechnol.,6:293-308,1981),具体如下:
待测样品中加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸钠缓冲液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液,在37℃浴中振荡反应30min,加入10%的三氯乙酸终止反应。将终止液稀释10倍后加入0.2%的2,4-二硝基苯肼饱和溶液,混匀静置10min。加入3mol/L的NaOH溶液,混匀后静置15min,离心后测定A550值。
按照上述方法测定10个转化子在24h的DAO活力,结果如下表1所示:
表1、DAO活力测定
菌株编号 | 时间(hr) | DAO活力(U/L) | 菌株编号 | 时间(hr) | DAO活力(U/L) |
GAP-1 | 24 | 1875 | GAP-6 | 24 | 1570 |
GAP-2 | 24 | 1640 | GAP-7 | 24 | 1302 |
GAP-3 | 24 | 1520 | GAP-8 | 24 | 872 |
GAP-4 | 24 | 2011 | GAP-9 | 24 | 1102 |
GAP-5 | 24 | 950 | GAP-10 | 24 | 1320 |
通过上述测定DAO活力的方法筛选出DAO表达最高的重组菌株,命名为MMZY03。该菌株并已于2005年8月9日提交中国典型培养物保减中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCTCC M 205088。
实施例5、表达DAO活力的比转
以本发明的组成型重组毕赤酵母菌株MMZY03与诱导型重组毕赤酵母菌株在同等条件下进行表达DAO活力的比较,发酵采用YPD培养基(同实施例4),接种量为5%,发酵温度为30℃,溶氧维持在30%左右,发酵过程中用氨水调节pH6.0,从接种时刻算起,每隔1小时取样测定DAO活力,结果如表2所示:
表2、表达DAO活力比较
5 | 8 | 10 | 13 | 15 | 18 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | |
组成型 | 1000 | 2100 | 3200 | 6321 | 6120 | 5800 | 5100 | 5450 | 5050 | 4987 | 4782 | 3864 | 3298 |
诱导型 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3450 | 5832 | 7350 | 6212 | 6008 |
由以上表2的结果可见,本发明的组成型重组毕赤酵母菌株MMZY03(组成型)从接种时间起约13h时发酵单位达到最高,约为6321U/L,相比之下,现有技术中使用的诱导型重组毕赤酵母中DAO发酵单位达到最高需要约40h,所用时间约为本发明的菌株的3倍。可见以本发明的组成型毕赤酵母重组菌株表达D-氨基酸氧化酶,不但可以避免发酵过程中甲醇诱导的难控制因素,而且酶活力达到最高点仅需约13h左右,约为现有甲醇诱导型菌株的1/3,从而大大缩短了发酵时间,减少了能耗,进而降低了生产成本。
Claims (9)
1.一种表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母(P.pastoris)重组菌株,其特征在于,所述菌株转化有重组质粒pMMZY03,该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子,并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
2.如权利要求1所述的组成型毕赤酵母重组菌株,其特征在于,所述重组质粒pMMZY03还具有组氨酸标签。
3.如权利要求1所述的组成型毕赤酵母重组菌株,其特征在于,所述菌株的保藏号CCTCC M 205088。
4.一种组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
A、酶切质粒pPIC3.5k,回收含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因的片段;酶切质粒pGAPZA,回收含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因的片段;连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP;
B、重组质粒pPICGAP酶切线性化后用连接酶与带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段相连接,得到重组质粒pMMZY03;
C、将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌中,构建成表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤A和B中所使用的连接酶为T4连接酶。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤B中所述线性化的重组质粒pPICGAP以及带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段在用连接酶连接前先以Klenow补平。
7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌前还包括将重组质粒pMMZY03导入大肠杆菌进行扩增的步骤。
8.一种重组质粒,其特征在于,所述重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子,并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
9.如权利要求8所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒带有组氨酸标签。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB200510028752XA CN100381559C (zh) | 2005-08-12 | 2005-08-12 | 一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB200510028752XA CN100381559C (zh) | 2005-08-12 | 2005-08-12 | 一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1737112A CN1737112A (zh) | 2006-02-22 |
CN100381559C true CN100381559C (zh) | 2008-04-16 |
Family
ID=36080061
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB200510028752XA Expired - Fee Related CN100381559C (zh) | 2005-08-12 | 2005-08-12 | 一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100381559C (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113322223B (zh) * | 2021-06-03 | 2023-09-12 | 重庆市畜牧科学院 | 富硒酵母基因工程菌及其表面展示系统及其构建方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5948660A (en) * | 1995-03-07 | 1999-09-07 | Pilone; Mirella | DNA fragment encoding D-amino acid oxidase |
CN1371999A (zh) * | 2001-02-28 | 2002-10-02 | 中国科学院上海植物生理研究所 | 双基因共表达质粒、构建方法和应用 |
CN1385521A (zh) * | 2001-11-30 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 高效表达d-氨基酸氧化酶的甲醇酵母,其构建及发酵方法 |
WO2005019458A1 (ja) * | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Kikkoman Corporation | アシルCoAオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体DNA及びアシルCoAオキシダーゼの製造法 |
-
2005
- 2005-08-12 CN CNB200510028752XA patent/CN100381559C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5948660A (en) * | 1995-03-07 | 1999-09-07 | Pilone; Mirella | DNA fragment encoding D-amino acid oxidase |
CN1371999A (zh) * | 2001-02-28 | 2002-10-02 | 中国科学院上海植物生理研究所 | 双基因共表达质粒、构建方法和应用 |
CN1385521A (zh) * | 2001-11-30 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 高效表达d-氨基酸氧化酶的甲醇酵母,其构建及发酵方法 |
WO2005019458A1 (ja) * | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Kikkoman Corporation | アシルCoAオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体DNA及びアシルCoAオキシダーゼの製造法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
D- 氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究. 冯美卿等.中国医药工业杂志,第35卷第7期. 2004 * |
外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略. 聂东宋等.吉首大学学报(自然科学版),第22卷第3期. 2001 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1737112A (zh) | 2006-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tanaka et al. | Ethanol production from starch by a coimmobilized mixed culture system of Aspergillus awamori and Zymomonas mobilis | |
Nakamura et al. | Alcohol fermentation of starch by a genetic recombinant yeast having glucoamylase activity | |
CN107460138A (zh) | 一种产fad依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 | |
Jeong et al. | Ethanol production by co-fermentation of hexose and pentose from food wastes using Saccharomyces coreanus and Pichia stipitis | |
CN106367409A (zh) | 一种同时高产纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶的方法 | |
CN104480083A (zh) | 一种脂肪酶、工程菌及其制备方法 | |
CN100381559C (zh) | 一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法 | |
CN114836495A (zh) | 利用烟酰胺发酵生产nmn的基因工程菌的构建与应用 | |
CN108977422B (zh) | 一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用 | |
Compagno et al. | Fermentation of whey and starch by transformed Saccharomyces cerevisiae cells | |
CN101613707B (zh) | 一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法 | |
CN101878308B (zh) | 由淀粉制备乙醇的方法 | |
US10392624B2 (en) | Gene engineering yeast having saccharification function, method of preparing same, and application of same | |
CN100342002C (zh) | 一种分泌型毕赤酵母菌株及其构建方法 | |
CN115058374B (zh) | 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 | |
CN107236680A (zh) | 一种表达Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 | |
CN108949724B (zh) | 一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用 | |
CN108865914B (zh) | 一种可降解木质纤维素的重组酿酒酵母菌株及其应用 | |
CN103205403A (zh) | 一种生产降解木质素酶的方法 | |
CN111334446B (zh) | 一株耐高温糖化酵母菌株及其应用 | |
CN102168059A (zh) | 一种β-葡聚糖酶的高效制备方法 | |
CN103451114B (zh) | 一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其培养方法 | |
CN103898142A (zh) | 一种硫醇过氧化物酶提高毕赤酵母外源蛋白质表达量的方法 | |
CN114262716B (zh) | 基因重组质粒、基因重组毕赤酵母及秸秆纤维脱胶应用 | |
CN114874961B (zh) | 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080416 Termination date: 20120812 |