CN103451114B - 一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其培养方法。所述毕赤酵母工程菌KM1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2013096。本发明的菌株在250mL三角瓶中摇瓶发酵培养和在5L发酵罐中流加发酵培养，α-葡聚糖酶产量分别达到200U/mL和1100U/mL，其产酶能力相对于已报道的产α-葡聚糖酶菌种处于领先水平。且其培养方法简单，产酶能力强，实验重复性好，遗传特性稳定，是一种适合高密度发酵产α-葡聚糖酶的优良菌种。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其培养方法。
背景技术
α-葡聚糖酶（Dextranase，1,6-α-D-glucan-6-glucanohydrolase；EC 3.2.1.11)也被称为右旋糖酐酶，能够随机水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键，终产物包括异麦芽糖、异麦芽三糖和葡萄糖以及痕量的多聚糖。α-葡聚糖酶分为两类，内切α-葡聚糖酶（endodextranases）水解葡聚糖内部的糖苷键；外切α-葡聚糖酶（exodextranases）从葡聚糖的非还原端切割，终产物一般为葡萄糖、异麦芽糖或异麦芽三糖等。反应产物和底物特异性与酶的类型有很大关系。众多微生物都可产α-葡聚糖酶，包括青霉、曲霉、细丽毛壳、镰刀霉菌、申克孢子丝菌、斯达油脂酵母、口腔拟杆菌、嗜热厌氧杆菌、链球菌等[1]。
目前商品化的α-葡聚糖酶主要是通过青霉属（Penicillium）和毛壳属（Chaetomium）等真菌的培养物得到。由于真菌产酶的同时还会产生抗生素和其它有害代谢物，成为α-葡聚糖酶通过FDA（美国食品和药物管理局）认证的一个障碍。与此同时，利用基因工程菌生产外源蛋白也极具发展前景。在α-葡聚糖酶的基因克隆和异源蛋白表达方面，大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统均有报道。大肠杆菌表达系统虽然具有操作方便，培养简易的特点，但是发酵细胞密度不高，获取表达蛋白需要破碎细胞，蛋白容易形成包涵体，给纯化分离，变性复性带来困难。目前α-葡聚糖酶的研究进展主要集中在甲醇诱导型毕赤酵母工程菌产外源α-葡聚糖酶。甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，其中巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris的基因操作相对简单、外源蛋白的超高量表达、易于工业化生产、能够完成真核系统蛋白的蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后的修饰加工过程。毕赤酵母表达载体分为游离型载体和整合型载体两种，目前整合型载体应用较广，其中大部分属于醇氧化酶AOX启动子调控的甲醇诱导型载体，少部分如pGAPZ和pGAPZα属于三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子调控的组成型载体[2, 3]。近年来，Chen等用5L发酵罐培养获得了83.9 U/mL的酶活[4]，Kang HK 等用10L发酵罐取得了134 U/mL的酶活[5]。
近年来，中国酶制剂产业发展速度迅猛，取得了明显进步。但从世界范围内看，基于基因工程和蛋白质工程的高科技成果在酶制剂生产领域中已实现产业化，为酶制剂产业带来了革命性的发展。高新技术的应用进一步拉大了中国酶制剂产业和世界先进水平的差距，尤其体现在国内相关企业研发投入和研发创新能力不足，酶制剂产品结构不合理、应用深度不够，缺少高端酶制剂产品。中国酶制剂产业的下一步快速发展有赖于强有力的自主技术创新体系。利用α-葡聚糖酶制得的酶制剂或添加剂将是一种无毒无害，环境温和友好型的绿色催化制品，该酶在制糖工业、日用品行业、医疗领域具有较好的应用前景。因此，提供一株产α-葡聚糖酶能力处于领先水平的毕赤酵母工程菌，具有实际的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其培养方法。
本发明所采取的技术方案是：
一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌KM1（Pichia Pastoris KM1），已于2013年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013096。
毕赤酵母工程菌KM1在生产α-葡聚糖酶上的应用。
毕赤酵母工程菌KM1的摇瓶发酵培养方法，包括将毕赤酵母工程菌KM1接种至发酵培养基中，28～30℃，转速转速200～250r/min，培养96～120h；所述发酵培养基的组成为：酵母粉8～12g/L，蛋白胨15～25g/L，2～6%(w/v) 甘油。
优选的，所述发酵培养基的组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，5%(w/v) 甘油。
毕赤酵母工程菌KM1的发酵罐流加培养方法，包括如下步骤：
（1）将毕赤酵母工程菌KM1接种至发酵罐中培养，培养条件为：温度25～30℃，pH5.0～7.0，溶氧量大于10%，发酵培养基的组成为：在BSM培养基中加入10～14 mL/L的PTM1微量盐溶液及3～6%(w/v)的甘油；
（2）待甘油含量低于0.3% 时，起始甘油流加，通过甘油流加维持溶氧在10～30%之间进行发酵；
（3）持续培养90～100 h即可。
优选的，所述发酵培养基的组成为：在BSM培养基中加入12 mL/L的PTM1微量盐溶液及5%(w/v)的甘油；
一种酶制剂，其含有保藏编号为CCTCC NO：M 2013096的毕赤酵母工程菌KM1（Pichia Pastoris KM1）的发酵培养物，或者该发酵培养物中的菌体，或者该发酵培养物中的上清液。
本发明的有益效果是：
本发明的菌株在250mL三角瓶中摇瓶发酵培养和在5L发酵罐中流加发酵培养，α-葡聚糖酶产量分别达到200 U/mL 和 1100 U/mL，其产酶能力相对于已报道的产α-葡聚糖酶菌种处于领先水平。且其培养方法简单，产酶能力强，实验重复性好，遗传特性稳定，是一种适合高密度发酵产α-葡聚糖酶的优良菌种。
附图说明
图1为α-葡聚糖酶酶活和酵母湿重变化关系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一株组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建
1. 实验材料
朱黄青霉（Penicillium minioluteum）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 35723。该菌株中含有α-葡聚糖酶基因，其基因序列如GI：3821900 （GenBank登录号）所示。毕赤酵母KM71H 购自Invitrogen 公司。
2. 实验方法
具体步骤如下：
（1）以朱黄青霉（Penicillium minioluteum）基因组DNA 为模板，扩增得到α-葡聚糖酶基因，经酶切，连接，构建得到重组表达质粒pGAPZαA-dex，经测序验证，序列正确。
（2）表达载体pGAPZαA-dex 使用AvrII 单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母KM71H，在含有博来霉素（Zeocin）的YPD 平板上筛选得到阳性克隆。
（3）从阳性克隆菌落中挑选出产酶较高的一株，命名为Pichia Pastoris KM1。已于2013年3月21日送交中国典型培养物保藏中心保藏（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2013096。
实施例2
一种制备α-葡聚糖酶的方法（摇瓶发酵培养），其步骤如下：
（1）培养基成分：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L ，3%(w/v) 甘油；
（2）接种：将实施例1 所挑选的毕赤酵母工程菌CCTCC NO：M 2013096接种到上述培养基中培养，培养条件为：250 mL 三角瓶中装液量30 mL，温度30℃，转速200r/min ；
（3）培养96 小时后测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为150 U/mL 。
酶活定义为：1 单位酶活（U/mL）表示为1mL 酶液在pH 为5.0，温度45℃下，1 min 分解α-葡聚糖（dextran）T-2000 产生相当于1μmol 葡萄糖的还原糖量。下同。
实施例3
一种制备α-葡聚糖酶的方法（摇瓶发酵培养），其步骤如下：
（1）培养基成分：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，5%(w/v) 甘油；
（2）接种：将毕赤酵母工程菌CCTCC NO：M 2013096接种到上述培养基中培养，培养条件为：250mL三角瓶中装液量40mL，温度30℃，转速250 r/min；
（3）培养120小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为200 U/mL。
实施例4
一种制备α-葡聚糖酶的方法（发酵罐流加培养），其步骤如下：
（1）培养基成分：在BSM培养基（Invitrogen公司）中加入12 mL/L的PTM1微量盐溶液及5%(w/v)的甘油；
（2）接种：将实施例1 所挑选的毕赤酵母工程菌株KM1接种到上述培养基中培养，培养条件为：温度25～30℃，pH5.0～6.0，溶氧量大于10% ；
（3）待甘油含量低于0.3% 时，起始甘油流加，通过甘油流加维持溶氧在10～20% 之间进行发酵；培养92小时后测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为1100U/mL ；
（4）分离提纯α-葡聚糖酶：采用离心、过滤的方法分离细胞，然后浓缩发酵液、选择适当超滤膜截流、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到α-葡聚糖酶。
为除去发酵过程中产生的泡沫，可以在培养基组成分中添加一定量的消泡剂，如添加0.02% 泡敌。
取实施例4 的发酵液上清，测α-葡聚糖酶酶活和酵母湿重变化关系，测定结果如图1 所示。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
参考文献
[1] Khalikova E, Susi P, Korpela T. Microbial dextran-hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2005, 69 (2):306-325.
[2] Qin X, Qian J, Yao G, et al. GAP promoter library for fine-tuning of gene expression in Pichia pastoris[J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77 (11):3600-3608.
[3] Zhang A-L, Luo J-X, Zhang T-Y, et al. Recent advances on the GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris[J]. Molecular Biology Reports, 2009, 36 (6):1611-1619.
[4] Chen L, Zhou X, Fan W, et al. Expression, purification and characterization of a recombinant Lipomyces starkey dextranase in Pichia pastoris[J]. Protein Expr Purif, 2008, 58 (1):87-93.
[5] Kang HK, Park JY, Ahn JS, et al. Cloning of a gene encoding dextranase from Lipomyces starkeyi and its expression in Pichia pastoris[J]. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19 (2):172-177。
Claims (7)
1.一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌KM1，已于2013年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013096。
2.权利要求1所述的工程菌KM1在生产α-葡聚糖酶上的应用。
3.权利要求1所述的工程菌KM1的摇瓶发酵培养方法，包括将毕赤酵母工程菌KM1接种至发酵培养基中，28～30℃，转速200～250r/min，培养96～120h；所述发酵培养基的组成为：酵母粉8～12g/L，蛋白胨15～25g/L，2～6%(w/v) 甘油。
4.根据权利要求3所述的摇瓶发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，5%(w/v) 甘油。
5.权利要求1所述的工程菌KM1的发酵罐流加培养方法，包括如下步骤：
（1）将毕赤酵母工程菌KM1接种至发酵罐中培养，培养条件为：温度25～30℃，pH5.0～7.0，溶氧量大于10%，发酵培养基的组成为：在BSM培养基中加入10～14 mL/L的PTM1微量盐溶液及3～6%(w/v)的甘油；
（2）待甘油含量低于0.3% 时，起始甘油流加，通过甘油流加维持溶氧在10～30%之间进行发酵；
（3）持续培养90～100 h即可。
6.根据权利要求5所述的发酵罐流加培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：在BSM培养基中加入12 mL/L的PTM1微量盐溶液及5%(w/v)的甘油。
7.一种酶制剂，其含有保藏编号为CCTCC NO：M 2013096的毕赤酵母工程菌KM1的发酵培养物，或者该发酵培养物中的菌体，或者该发酵培养物中的上清液。
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