CN1385521A - 高效表达d－氨基酸氧化酶的甲醇酵母,其构建及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于高效表达D－氨基酸氧化酶的甲醇酵母基因工程菌株SIBAS0111,其D－氨基酸氧化酶基因来源于三角酵母Trigonopsis Vriabllis。本发明的特征在于通过重组表达质粒pPIC3.5K－DAAO的构建、转化以及筛选获得高产D－氨基酸氧化酶的重组基因工程菌株。经发酵表达,D－氨基酸氧化酶在发酵液中的表达水平可达23,000U/L。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母基因工程菌株SIBAS0111，其构建方法以及发酵表达。
背景技术
自青霉素发现以来，β-内酰胺类抗生素已经成为临床上最大量、有效的药物之一。但是随着人类日益广泛的使用，细菌的耐药性随之出现并日趋严重。当代对付细菌抗药性的最有力的手段之一就是发展半合成青霉素(SSP)和半合成头孢菌素(SSC)之类的半合成β-内酰胺类抗生素(SSA)。近现代β-内酰胺类抗生素工业生产过程，首先是依靠发酵法生产青霉素G、V和头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)等抗生素；第二步则是由抗生素用化学裂解法或酶法水解生产母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基脱乙酰基烷酸(7-ADCA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)等关键中间体；最后将这些母核和不同的新侧链以化学法或酶法合成系列更具药效的半合成抗生素。40多年来生物催化剂酶法生产6-APA和7-ADCA已经取代传统的化学工艺，充分显示了酶法工艺是一种简便高效、产品质量稳定、安全、对环境无污染的生产工艺。
在生产SSC中，7-ACA是一种很关键的中间体。多年来，SSC主要仰仗化学脱酰即亚胺醚法生产。这种生产方法有着众多的缺陷，如低温、长时间、以及有毒试剂和溶剂等。20多年来人们致力于开发生物转化技术，直接从CPC生物脱酰而成。从而形成了D-氨基酸氧化酶氧化脱氨和GL-7-ADCA酰化酶催化脱酰生产7-ACA的两步酶法。两步酶法合成工艺消除了一些溶剂和重金属的污染，操作简单，脱酰率高。
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase.EC1.4.3.3.DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅基的典型黄素酶，广泛存在于动物和多种微生物中。天然酶蛋白为86kDa的二聚体，对头孢菌素C具有催化活力。哺乳动物的DAAO与辅基FAD结合较松，辅基易丢失而使酶失活；而某些酵母与辅基FAD的结合较强，有较高活性。其中，三角酵母的DAAO是最常用并且最有应用潜力的(Dominguez，A，Yeast 1997，13：1399-1408)。DAAO能够催化D-氨基酸氧化脱氨生成酮酸。头孢菌素C经DAAO催化能够氧化脱氨产生α-酮基己二酰-7ACA，在H2O2存在下，后者易氧化脱羧形成GL-7ACA(Shewale，JG，JBiotechnol.1999，75：11-22)。最后，以GL-7ACA酰化酶催化GL-7ACA脱酰生成7-ACA。
随着基因工程的发展，DAAO基因在大肠杆菌和酵母中克隆和表达已大量出现。产量有改进，不过大肠杆菌的重组产物虽较高，但后处理很难，而酵母的重组产物虽后处理容易，但产量较少。近年，我们建立了甲醇酵母表达系统。甲醇酵母具有特有的AOX1强启动子，并且可以高密度培养，成本低，生产效率高。我们首次选用甲醇酵母克隆和表达三角酵母DAAO，并经过发酵达到了很高的表达水平，为23000U/L。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效表达D-氨基酸氧化酶(DAAO)的重组甲醇酵母工程菌株SIBAS 0111，该菌种属巴斯德毕赤酵母Pichiapstoris.，已于2001年10月29日藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.0649。
本发明的另一个目的在于提供一种构建上述高效表达DAAO的基因工程菌株的方法。
本发明的另一个目的在于提供上述甲醇酵母工程菌的发酵方法，从而可以通过高密度发酵，高效率，低成本地生产DAAO。
本发明所使用的装有去除内含子区域的三角酵母DAAO基因的质粒pAO6蒙西班牙Dominguez教授惠赠。我们以质粒pAO6为模板，用PCR扩增DAAO的基因片段。DAAO基因被首先连到T-载体(pUC18制备而成)上，再借助引物上引入的EcoR I限制性酶切位点和T载体上的Kpn I限制性酶切位点，将DAAO基因克隆到质粒pTRCHISA上，最后利用BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点将DAAO基因克隆到甲醇酵母表达质粒pPIC3.5K上，得到整合质粒pPIC3.5K-DAAO。整合质粒用Sal I限制性内切酶线性化，以电穿孔转化法将其转入甲醇酵母GS115菌株体内，整合质粒pPIC3.5K-DAAO与甲醇酵母的基因组DNA发生同源重组而使DAAO基因的表达盒整合入甲醇酵母的基因组DNA中，用PCR法筛选得到阳性重组菌株，再通过测酶活筛选出高产菌株。
所得的高产菌株以基本无机盐、微量元素为主体培养基，在pH5.0-6.5，28-30℃并控制溶氧度的条件下进行发酵。经过甘油生长期、甘油流加期以及甲醇诱导期进行发酵培养。
本发明获得了高效表达DAAO的基因工程菌株SIBAS0111，最高产酶量达到了23000U/L，属国内领先水平。此酶具有发酵条件简单、高效、成本低、无污染等特点，已达到工业生产的要求。
附图说明
图1是本发明的甲醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO的构建流程图；
图2是本发明用PCR方法筛选甲醇酵母阳性重组菌株的电泳图谱，其中1为以质粒pPIC3.5K为模板的PCR产物(220bp)；2为以质粒pPIC3.5K-DAAO为模板的PCR产物(1.48Kb)；3为阳性重组菌株的PCR产物(2.2Kb和1.48Kb)；4为阴性未重组菌株的PCR产物(2.2Kb)；5为以线性pPIC3.5K转化的重组菌株的PCR产物(2.2Kb和220bp)；6为DNA分子量Marker(DL-2000)。
图3是本发明的D-氨基酸氧化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中1为线性空载体pPIC3.5K转化的重组菌株的胞内蛋白；2，3，4：分别为8，10，12小时高产菌株的胞内蛋白；5为低分子量标准蛋白(条带大小分别为：97.400；66.200；43.000；31.000kDa)；
图4是本发明的重组甲醇酵母表达D-氨基酸氧化酶的酶活曲线和菌的生长曲线；
图5是本发明测酶活所需的丙酮酸钠标准曲线。
具体实施方式
实施例1 D-氨基酸氧化酶基因的获得
根据已知三角酵母氧化酶基因5’和3’端序列，设计引物如下：
5’-primer(引入BamH I酶切位点)：
5’-
GGATCCATGGCTAAAATCGTTGT-3’
3’-primer(引入EcoR I酶切位点)：
5’-
GAATTCGTTGTTGATGGGAGGTAA-3’
装有去除内含子区域的三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的质粒pAO6蒙Dominguez教授惠赠。以质粒pAO6为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下，PCR转录合成三角酵母D-氨基酸氧化酶基因，其5’和3’端分别具有BamHI和EcoR I限制性酶切位点。反应条件为：
94℃，30sec 5个循环 94℃，30sec 30个循环94℃5min→→40℃，30sec→→→→ 48℃，30sec→→→→72℃，10min
72℃，75sec 72℃，75sec
PCR产物经1％琼脂糖电泳确证后，采用DNA胶回收试剂盒(Promega产品)最终得到DAAO基因的扩增片段。实施例2 PCR产物的T-载体连接胶回收的PCR产物与T-载体连接，连接反应体系如下：T-载体 1ulPCR产物 10ul5×连接缓冲液 3ulT4 DNA连接酶(1u/ul) 1ul
以上混合物共15ul于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Promega产品)抽提质粒DNA，所得质粒DNA用PCR法鉴定证明重组质粒为T-载体-DAAO。
实施例3 D-氨基酸氧化酶基因重组质粒pTRCHISA-DAAO的构建
将T-载体-DAAO质粒用BamH I单酶切，切出一条大小约1.3Kb的DNA条带，证明D-氨基酸氧化酶基因为反向接入。用Kpn I单酶切，再用EcoR I不完全酶切，1％琼脂糖电泳，DNA胶回收试剂盒回收约1.3Kb的D-氨基酸氧化酶基因片段。回收片段与用相同酶切的pTRCHISA质粒连接，连接反应体系如下：
pTRCHISA(Kpn I，EcoR I切) 1ul
D-氨基酸氧化酶基因片段 3ul
5×连接缓冲液 3ul
T4 DNA连接酶(1u/ul) 1.5ul
H2O 6.5ul
以上混合物共15ul于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒DNA用PCR法鉴定证明重组质粒为pTRCHISA-DAAO。
实施例4 醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO的构建
将重组质粒pTRCHISA-DAAO用BamH I单酶切，而后用EcoR I不完全酶切，1％琼脂糖电泳，DNA胶回收试剂盒回收约1.3Kb的D-氨基酸氧化酶基因片段，再与用相同酶切的pPIC3.5K质粒连接，连接反应体系如下：
pPIC3.5K(BamH I，EcoR I切) 1ul
D-氨基酸氧化酶基因片段 3ul
5×连接缓冲液 3ul
T4 DNA连接酶(1u/ul) 1.5ul
H2O 6.5ul
以上混合物共15ul于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒DNA用PCR法鉴定出甲醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO。测序结果与报道的基因序列吻合。
实施例5 整合质粒pPIC3.5K-DAAO电转化甲醇酵母GS115细胞
将构建的整合质粒pPIC3.5K-DAAO约10ug用Sal I酶切线性化，乙醇沉淀线性DNA并溶解于10ul无菌水中，同时将空载pPIC3.5K质粒经相同酶切线性化并回收作为对照。接种GS115于50ml YPD培养基(1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，28-30℃培养至OD600为1.3-1.5。5000rpm离心5min，菌体沉淀分别用100ml冷无菌水、20ml冷无菌水和20ml 1mol/L的冷山梨醇各洗一次。每次洗后均在5000rpm离心5min并收集菌体。最后将离心的菌体细胞用200ul 1M冰的山梨醇悬浮，即为电击感受态细胞。将上述线性化DNA分别与80ul GS115电转化细胞混合，采用GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电击转化。电转化条件为：电压1500V，电容50uF，电阻4KΩ。然后立即向电转化杯中加入0.5ml 1mol/L冰浴预冷的山梨醇，悬浮的电转化产物分别移入无菌微量离心管中。取200ul涂布于MD平板。30℃培养直至单菌落出现，再通过MM和MD平板筛选Mut+。
实施例6 PCR方法筛选阳性重组酵母菌株
用牙签挑取单克隆细胞至含10ul水的离心管中；加入5ul 5U/μlLytigase，混匀，30℃处理10分钟；浸液氮1分钟；如下设立PCR反应体系：
10×缓冲液 5ul
MgCl2(2.5mM) 5ul
dNTP(25 mM each) 2ul
5’AOXI Primer(10mM) 2ul
3’AOXI Primer(10mM) 2ul
模板(取5ul样品) 5ul
Taq DNA聚合酶 1ul
无菌水 28ul以上混合物共50ul在下述条件下进行PCR反应：
94℃，1min 30个循环94℃ 5min →→ 55℃，1min →→→→72℃，10min
72℃，2min
取5ul PCR产物进行1％凝胶电泳检测。阳性重组酵母菌株的电泳图谱为2.2Kb和1.48Kb(1.26Kb+220bp)两条带，而阴性非重组菌株则仅有2.2Kb一条带(电泳图谱见图2)，由此筛选出阳性重组菌株。
实施例7 摇瓶中甲醇诱导重组菌株表达DAAO
将50ul重组菌株接种于5mlBMGY(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)中，30℃ 300rpm培养至OD600＝2-6。室温下，4000rpm离心5分钟，去上清，菌体沉淀用10ml BMMY(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)重悬，30℃ 300rpm培养五天。每隔6小时取菌体待测。每24小时补加甲醇使其终浓度为0.5％。
实施例8 DAAO的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
用100ul裂解液(50mM磷酸钾，pH7.4，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)重悬1ml菌体沉淀，并加入100ul酸处理玻璃珠(0.5mm)。振荡30秒，随后冰浴30秒，如此反复8个循环，4℃，12000rpm离心10min，取上清于一新EP管中。加入等体积的2×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，沸水浴煮3min，取40ul上样。SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度为12％。DAAO电泳呈现43kDa一条蛋白带(结果见图3)。
实施例9 DAAO活力测定(Nilsson.K，and Mosbach.K，Appl BiochemBiotechnol，1981，6：293-308)
1.测活时取1ml发酵液于1.5ml EP管中，9000rpm离心5分钟，移去上清，菌体沉淀保存于-20℃冰箱。
2.测活前，用1ml焦磷酸缓冲液(0.05M，pH8.5)重悬菌体，吸取200ul置于50ml离心管中。加入10ml含30％丙酮的焦磷酸缓冲液(0.05M，pH8.5)，置于25℃水浴并轻微振荡30min。
3.4000rpm离心10min，移去上清。菌体沉淀用生理盐水洗涤，离心。
4.用5ml焦磷酸缓冲液重悬菌体，并取0.5ml加入到装有4.5ml D-丙氨酸(50mM)的50ml离心管中，于37℃水浴振荡反应30min(离心管敞口)，用3ml 10％三氯乙酸终止。
5.1ml反应混合液稀释10倍后，取1ml，加入用2M HCl溶液饱和(0.2％)的2，4-二硝基苯肼0.4ml，混匀，静置10分钟。
6.加入3M的NaOH 1.5ml，摇匀，静置15分钟，4000rpm离心10分钟。取上清，测OD550nm值。
注：
i.酶活定义：
上述条件下，每分钟氧化脱氨生成1umol酮酸所需的酶量定义为1单位(U)DAAO。
ii.酶活计算公式：
酶活(U/L)＝K×OD550nm×M/(T×D)
K：系数(标准曲线的斜率)；M：稀释倍数；T：酶与底物反应时间(分钟)；D：所取菌液体积(L)。
iii.以丙酮酸钠制作标准曲线(见图5)。
实施例10 1升发酵罐中甲醇诱导重组菌株表达DAAO
筛选出的重组菌株接种于3ml的YPD试管，30℃ 300rpm培养过夜。以0.2％-0.5％的接种量接种于50ml BMGY培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mMpH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃ 300rpm培养至OD600＝1.6-1.8。作为种子液接入1升含甘油的基本盐培养液/微量元素(2ml/L)培养基(成份详见表1)的发酵罐中。溶氧度会在一定范围内进行波动，根据具体情况控制合适的溶氧度(％pO2：10-150)，在pH6.0，28-30℃的条件下进行发酵培养。待甘油耗尽，溶氧明显上升并停留在最高值附近。此时开始逐渐滴加甘油(50％ w/v)，并控制滴加速度(15ml/literhr)以保证适当的溶氧(％pO2：10-150)，使菌体生长旺盛生长。经过约5h后，OD600达到100-120，停止滴加甘油，待甘油耗尽，溶氧升高时开始以补料方式流加甲醇(3.5ml/liter hr)以诱导酵母重组菌株大量表达D-氨基酸氧化酶并同时监控溶氧度等参数变化。按时取样待测。放罐时生物量(湿重)达250g/L，DAAO活力最高可达23000U/L。(结果见图4)
| 基本培养基 | |
| 85％磷酸 H3PO4 | 26.7ml 2.3％ |
| 硫酸钙 CaSO4·2H2O | 0.93g 5.0mM |
| 硫酸钾 K2SO4 | 18.2g 100.0mM |
| 七水硫酸镁 MgSO4·7H2O | 14.9g 60.0mM |
| 氢氧化钾 KOH | 4.13g 70.0mM |
| 甘油 glycerol | 40.0g 4.0％ |
| 加水至1L，灭菌 pH4.5 | |
| YNB(10×)(过滤灭菌，后加) | 100ml |
| PTM1微量元素 | |
| 五水硫酸铜 CuSO4·5H2O | 6.0g 8.0mM |
| 碘化钠 NaI | 0.08g 0.5mM |
| 一水硫酸锰 MnSO4·H2O | 3.0g 20.0mM |
| 二水钼酸钠 Na2MoO4·2H2O | 0.2g 0.8mM |
| 硼酸 H3BO3 | 0.02g 0.3mM |
| 氯化钴 CoCl2 | 0.5g 2.0mM |
| 氯化锌 ZnCl2 | 20.0g 51.0mM |
| 七水硫酸亚铁 FeSO4·7H2O | 65.0g 80.0mM |
| 生物素 biotin | 0.2g 0.8mM |
| 硫酸 H2SO4 | 5.0ml |
| 加水至1L，过滤灭菌，室温保存 | |
表1
Claims (3)
1、一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111，其特征在于该菌株的基因组DNA上整合了来源于三角酵母的D-氨基酸氧化酶基因，其保藏编号为CGMCC No.0649。
2、一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111的构建方法，其特征在于构建该菌株的重组DNA的方法包括下列步骤：
一、以装有去除了内含子的三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的质粒pA06为模板，根据D-氨基酸氧化酶基因结构设计5’端和3’端引物，并在引物上引入BamH I及EcoR I酶切位点。
二、以质粒pA06为模板，通过PCR扩增法，借助T-载体及质粒pTRCHISA，构建甲醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO。
三、将整合质粒pPIC3.5K-DAAO用Sal I限制性内切酶线性化，运用电穿孔转化法将D-氨基酸氧化酶基因整合到宿主甲醇酵母GS115细胞的染色体DNA上。
四、整合的重组细胞用PCR法筛选出阳性重组菌株，用酶活力测定法筛选得到高产D-氨基酸氧化酶菌株。
3、一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111的发酵方法，其特征在于该菌株的发酵以基本无机盐、微量元素为主体培养基，pH5.0-6.5，28-30℃并控制溶氧度的条件下进行发酵。经过甘油生长期、甘油流加期以及甲醇诱导期的发酵培养，D-氨基酸氧化酶在细胞内高效表达，酶活达到15,000-25,000U/L。
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