双基因共表达质粒、构建方法和应用
本发明涉及分子生物学,具体的说是基因间共表达调控序列、DNA重组和质粒转化合适的宿主细胞等基因工程学,以及通过基因工程学方法重组的双基因共表达质粒的用途。
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)是半合成头孢类抗生素的母核,在临床医药的生产中具有重要的应用价值。使用生物转化法取代传统的化学法裂解头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)生产7-ACA的工艺路线,由于具有反应条件温和,不接触有毒有害化学药品和溶剂,无环境污染等优点,其研究一直受到产业界与学术界的共同重视。生物转化CPC生成7-ACA的过程,分为一步酶法与两步酶法两种(见图1),其中一步酶法,即用CPC酰化酶催化CPC脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链,直接生成产物7-ACA的方法,步骤简单,可使反应一步完成,是生产中最理想的工艺路线。然而,四十余年来,从自然界中分离得到的催化该反应的CPC酰化酶,活力均十分低,远不能达到工业化生产的要求,尚无工业化应用的可能。两步酶法,是指使用不同微生物来源的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO)和戊二酰-7-氨基酸头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase,GA)分两步对CPC进行转化,最终生成7-ACA。首先,CPC被DAO酶促氧化脱氨,生成相应的α-酮基-己二酰-7ACA(α-keto-adipyl-7-aminocephalosporanic acid,AKA-7ACA)和H2O2,AKA-7ACA再在H2O2的作用下非酶促氧化脱羧,生成戊二酰-7-ACA(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid,GL-7ACA)。而后,经GA催化,水解GL-7ACA的戊二酰基侧链生成7-ACA。该法在当前7-ACA的工业生产中,是切实可行的工艺路线。然而如图所示,因微生物中的过氧化氢酶对H2O2的破坏活性而对转化反应产生干扰。
早在1994年,魏中荻等设计了利用产DAO的三角酵母和产GA的基因工程菌细胞在同一反应器内直接转化CPC为7-ACA的酶法转化过程(CN专利申请号94112285.9),但需使用叠氮化钠等有毒物质抑制过氧化氢酶活力。随着GL-7ACA酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)先后被克隆(杨蕴刘等,生物工程学报,1991;刘洪波等,生物工程学报,15(3),337-342,1999),以及适合应用于CPC转化反应的基因工程宿主菌E.coli MMR204和E.coli D11的成功构建(CN 98110964.0,1998年;CN 98122876.3,1998年),利用产双酶的基因工程菌细胞,直接转化CPC为7-ACA已成为可能。将两菌二次发酵变为单菌一次发酵,并使双反应罐的两步酶反应在单一反应罐中一步完成,达到简化产酶菌的发酵和酶促转化工艺之目的。
本发明的目的之一是提供一种同时含D-氨基酸氧化酶基因和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的双基因共表达质粒。
本发明的目的之二是提供上述共表达质粒的构建方法。
本发明的目的之三是提供上述共表达质粒的用途。
本发明的双基因共表达质粒是一种包含戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)的质粒,结构如下所示:
,式中,n=0或1,P=0或Not I,R=EcoR I或HindIII;(daao-acy)
m两个基因相连接的顺序及其多变体可以按多聚体形式存在于质粒中,其中m=1-3。
当n=0,P=Not I,R=EcoR I时,所述重组质粒为pMSS,结构式是
,该质粒转化大肠杆菌后可得到含双基因共表达质粒的菌种,该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其简称为CGMCC,保藏号为No.0533,分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli);当n=1,P=0,R=HindIII时,所述重组质粒为pMSTO,结构式是
,该质粒转化大肠杆菌可得到含双基因共表达质粒的菌种,该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其简称为CGMCC,保藏号为No.0534,分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
上述重组质粒转化的宿主菌可以是大肠杆菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11等。
本发明采用基因重组的方法,使戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下,获得双基因共表达质粒,该双基因共表达质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌后,接种于培养基并经生长培养,可同时表达DAO与GA的活力。下面通过六个方面对本发明内容进行详细阐述,即重组质粒pMSS与pMSTO的构建、表达方法及其应用于对CPC的转化。
本发明所涉及的研究材料见表1:
表1:菌株与质粒
|
菌株与质粒 |
相关性状 |
来源/文献 |
菌株 |
E.coli MMR204 |
ampC∷KAPA,recAsrl∷Tn10 |
本实验室 |
E.coli D11 |
katE2,katGΔ,ampC∷KAPA,recA-srl∷Tn10 |
本实验室 |
实验用质粒 |
pKKCAIS |
Ampr,acy |
本实验室 |
pET-28b |
Kanr,T7 lac promotor,His-tag sequences |
Novagen |
pJL |
Ampr,trc promotor,daao,acy |
本实验室 |
pALTER-Ex1 |
Tcr,tac promotor |
Promega |
新构造质粒 |
pMST |
Kanr,acy in pET-28b |
本工作 |
pMSS |
Ampr,daao |
本工作 |
pMSTW |
Tcr,acy in pALTER-Ex |
本工作 |
pMSTO |
Ampr,trc promotor,daao,tac promotor,acy |
本工作 |
重组质粒pMSS的构建:
本发明提供一种新的重组质粒pMSS,它是双链环状DNA,长度为8.2kb。它的构建过程如图2所示。我们设计将daao及acy基因重组到一个DNA载体质粒上,以使同一个基因工程菌细胞中同时产生DAO与GA两种酶,使得转化CPC生成7-ACA的两步酶反应能在同一细胞中一步完成。为此,我们利用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别消化含acy基因的质粒pKKCAIS,并将所得acy基因片断与经同样酶切的载体质粒pET28b相连,得到重组质粒pMST。接着再用限制性内切酶NheI和NotI将acy基因片断从pMST上切下,与经SpeI和NotI酶切,含dao基因的重组质粒pJL相连。由于经NheI和SpeI酶切的末端可以互补,经T4DNH连接酶催化的连接反应,acy基因片断被插入到pJL中,并位于daao基因的下游,与daao基因串联,该两基因的转录均处于trc启动子控制之下。
重组质粒pMSTO的构建:
本发明提供一种新的重组质粒pMSTO,它是双链环状DNA,长度为8.3kb,它的构建过程如图3所示。在本工作1项构建所得重组质粒pMSS中,由于acy基因距离trc启动子较远,由trc启动子控制的acy基因的表达可能偏弱。因此,在重组质粒pMSTO的构建设计中,使daao和acy基因分别受各自的启动子所控制。先用NdeI与NotI将acy基因从质粒pMST上切下,与经同样酶切的载体pALTER-Ex1相连,使acy基因插入pALTER-Ex1中tac启动子下游部位。再用HindIII将acy基因连同tac启动子一齐切下,与经同样酶切的受体质粒pJL相连,使tac启动子和acy基因插在daao基因下游,得到重组质粒pMSTO。
重组质粒pMSS、pMSTO在E.coli MMR204中的表达:
分别用pMSS与pMSTO质粒DNA转化E.coli MMR204,转化子经纯化后接种于LB液体培养基(组成成分为胰胨0.5%、酵母粉1.0%、NaCl1%,PH7.0),37℃振摇培养过夜,再以1%接种量移种到装60mlLB的500ml三角瓶中,继续于37℃振摇培养,6hr起每隔两小时取一次样,测定发酵液中的GL-7ACA酰化酶活力及DAO活力。结果显示pMSS与pMSTO在E.coliMMR204为宿主时,均能同时表达DAO与GA活力,培养过程中,两者的产酶趋势略有差异,DAO在12hr左右达到产酶高峰,之后酶活基本保持恒定,而GA活力在24hr左右达到产酶高峰,之后酶活基本不再增加。携带pMSS或pMSTO的E.coli MMR204基因工程菌在LB培养基中,于补加或不补加葡萄糖的条件下培养至36小时测得菌体内DAO和GA活力见表2所示。由表可以看出,于LB中补加葡萄糖,对重组质粒上两酶的表达量有所促进。
表2:pMSS和pMSTO在E.coli MMR204中的表达
菌株 |
GA活力(u/L) |
DAO活力(u/L) |
OD600 |
GA比活(u/L.OD600) |
DAO比活(u/L.OD600) |
MMR204(pMSS) |
LB |
68.41 |
36.20 |
3.18 |
21.48 |
11.37 |
LB补糖* |
182.20 |
76.61 |
7.94 |
22.93 |
9.65 |
MMR204(pMSTO) |
LB |
82.63 |
40.90 |
3.14 |
26.34 |
13.04 |
LB补糖 |
198.46 |
59.60 |
5.92 |
33.52 |
10.06 |
*培养至16小时后,开始向LB培养基中补加葡萄糖。每次补无0.1%,两小时一次,共补5次。
重组质粒pMSS、pMSTO在E.coli D11中的表达:
分别用pMSS与pMSTO质粒DNA转化E.coli D11感受态细胞,转化子经纯化后接种于LB液体培养基,37℃振摇培养过夜,再以1%接种量移种到装60mlLB的500ml三角瓶中,继续振荡培养。36hr时取样,测定它们在补糖与不补糖条件下生产DAO及GA的情况,结果如表3所示。可以看出,pMSS与pMSTO在E.coli D11中均能同时表达DAO与GA活力。通过往LB中补加葡萄糖,可以提高它们表达的两酶活力。而GA活力的提高更为明显。
表3:pMSS和pMSTO在E.coli D11中的表达
菌株 |
GA活力(u/L) |
DAO活力(u/L) |
OD600 |
GA比活(u/L.OD600) |
DAO比活(u/L.OD600) |
D11(pMSS) |
LB |
34.20 |
40.53 |
2.10 |
16.32 |
19.33 |
LB补糖* |
162.22 |
70.85 |
6.50 |
26.80 |
10.90 |
D11(pMSTO) |
LB |
51.13 |
40.64 |
2.19 |
23.32 |
18.54 |
LB补糖 |
250.52 |
75.82 |
6.6 |
37.96 |
11.49 |
*培养至16小时后,开始向LB培养基中补加葡萄糖。每次补充0.1%,两小时一次,共补5次。
携带质粒pMSS或pMSTO同时表达DAO与GA的基因工程菌细胞应用于转化CPC的反应,直接转化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)对CPC的转化:
由于E.coli.MMR204(pMSS)和E.coli MMR204(pMSTO)对CPC的转化的情况基本相同,故仅以E.coli MMR204(pMSTO)为例,来说明E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)对CPC进行转化的情况。将E.coli MMR204(pMSTO)菌体与5ml 10g/L的CPC溶液按实施例5的要求混合并反应。图3是反应进行过程中反应液内残留CPC(%)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相对积累(以反应液中积累AKA-7ACA最多时AKA-7ACA的浓度为100%)随时间的变化图。图6是转化反应进行至220分钟时反应液的HPLC检测图。从图4可以看出,反应体系中产物7-ACA的增加十分缓慢,而反应中间产物酮酸AKA-7ACA在反应体系中不断积累,在整个反应中浓度一直呈上升趋势。反应至220分钟时,7-ACA的生成率仅11.05%。从图5可以看到,转化反应进行至220分钟时,反应液中积累的AKA-7ACA的峰面积很大,而产物7-ACA峰面积较小。出现这种现象的原因乃是由于MMR204染色体上编码过氧化氢酶的基因(katG,katE)表达,产生的过氧化氢酶活性,使得DAO催化CPC氧化脱氨反应中生成的H2O2被破坏,干扰AKA-7ACA的氧化脱羧而堆积,导致进一步转化反应的终止。
E.coli D11(pMSS)或E.coli D11(pMSTO)对CPC的转化:
由于E.coli D11(pMSS)和E.coli D11(pMSTO)对CPC的转化的情况基本相同,故仅以E.coli D11(pMSTO)为例,来说明产双酶菌株对CPC进行酶促转化的情况。将E.coli D11(pMSTO)菌体与5m1 10g/L的CPC溶液按实施例5的要求混合并反应。图5是反应进行时反应液中残留CPC(%)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相对积累(以反应液中积累AKA-7ACA最多时AKA-7ACA的浓度为100%)随时间的变化图。图7是转化反应进行至220分钟时反应液的HPLC检测图。从图5可以看出,由于宿主菌E.coli D11中的过氧化氢酶已被钝化失活,故整个反应进行中只有少量酮酸AKA-7ACA积累,且反应至90分钟时酮酸积累已达饱和,此后不断下降。反应体系中产物7-ACA则随反应的进行不断增加,至240分钟时,CPC已被转化完毕,基本不发生AKA-7ACA积累,7-ACA的生成率可达74.16%。
附图说明:
图1.两步酶法转化CPC生成7-ACA的示意图
图2.重组质粒pMSS的构建流程
图3.重组质粒pMSTO的构建流程
图4.E.coli MMR204(pMSTO)转化CPC过程中CPC残留,GL-7ACA生成率和AKA-7ACA相对积累的变化图
图5.E.coli D11(pMSTO)转化CPC过程中CPC残留,GL-7ACA生成率和AKA-7ACA相对积累的变化图
图6.E.coli MMR204(pMSTO)转化CPC反应进行至220分钟时的HPLC检测图
图7.E.coli D11(pMSTO)转化CPC反应进行至240分钟时的HPLC检测图
本发明提供了两种同时具有D-氨基酸氧化酶基因(daao)和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)的重组质粒pMSS和pMSTO,分别携带这两种质粒的E.coli基因工程菌发酵时,可同时表达DAO与GA的活力。使得同一个基因工程菌细胞中同时产生DAO与GA两种酶,这样转化CPC生成7-ACA的两步酶反应能在同一细胞中一步完成。当用过氧化氢酶基因已被钝化的E.coli D11作为宿主菌构建的一菌双酶工程菌E.coli D11(pMSS)或E.coliD11(pMSTO)进行CPC转化反应时,可使CPC一步转化生成。7-ACA的生成率达到74.16%。综上所述,本发明所使用的酶基因来源广泛,本发明方法构建的双基因共表达质粒适用于工业化生产,简化了工业生产7-ACA的步骤、安全简便、产率高。
本发明通过以下实施例作进一步阐述,但并不限制本发明的范围。
实施例1
重组质粒pMSS构建的实验步骤
本实施例中涉及的酶切、连接,或受态细胞制备、电击转化等分子生物学方法均参考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,1989,CSHL Press.步骤1.用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒pKKCAIS进行完全酶切,用华舜公司的胶回收试剂盒回收pKKCAIS酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤2.用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒pET28b。酶反应结束后分别用酚,酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液,以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA,DNA重溶于重蒸水中。步骤3.混合由步骤1得到的acy基因片断及步骤2得到的线性化pET28b载体DNA,加入T4 DNA连接酶,于16℃反应12小时。步骤4.将步骤3的连接混合液经酚,酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后,加入1/3体积,7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA,重溶于5ul重蒸水中。用lul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞,在含50ug/ml卡那霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定,确定转化菌的质粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片断,该质粒命名为pMST。步骤5.用限制性内切酶NheI和NotI对质粒pMST进行完全酶切,用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMST酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤6.用限制性内切酶SpeI和NotI消化质粒pJL。酶反应结束后分别用酚,酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液,以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA,DNA重溶于重蒸水中。步骤7.由于NheI与SpeI酶切后产生的粘性末端可以匹配。故混合步骤5得到的acy基因片断和步骤6得到的线性化pJL载体质粒DNA,加入T4 DNA连接酶,于16℃反应12小时。步骤8.将步骤7的连接混合液经酚,酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后,加入1/3体积,7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA,重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA溶液电击转化E.coli JM109的感受态细胞,在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定,确定转化菌的质粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片断,该质粒命名为pMSS。
实施例2
重组质粒pMSS的构建的实验步骤
本实施例中涉及的酶切、连接,或受态细胞制备、电击转化等分子生物学方法均参考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,1989,CSHL Press.步骤1.用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒pKKCAIS进行完全酶切,用华舜公司的胶回收试剂盒回收pKKCAIS酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤2.用限制性内切酶NotI和NdeI对实施例1,步骤4所得质粒pMST进行完全酶切,用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMST酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤3.用限制性内切酶NotI和NdeI消化质粒pALTER-Ex1。酶反应结束后分别用酚,酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液,以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA,DNA重溶于重蒸水中。步骤4.混合由步骤1得到的acy基因片断及步骤3得到的线性化pALTER-Ex1载体DNA,加入T4 DNA连接酶,于16℃反应12小时。步骤5.将步骤4的连接混合液经酚,酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后,加入1/3体积,7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA,重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞,在含25ug/ml四环素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子,抽提DNA并酶切鉴定,确定转化菌株所含质粒DNA中带有2.5kb的外源acy基因片断,该质粒命名为pMSTW。步骤6.用限制性内切酶HindIII对质粒pMSTW进行完全酶切,用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMSTW酶切后产生的前端连有tac启动子的酰化酶基因(acy)片断。步骤7.用限制性内切酶HindIII消化质粒pJL。酶反应结束后分别用酚,酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液,以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA,DNA重溶于重蒸水中。步骤8.混合步骤5得到的带tac启动子的acy基因片断和步骤6得到的线性化pJL质粒DNA,加入T4 DNA连接酶,于16℃反应12小时。步骤9.将步骤7的连接混合液经酚,酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后,加入1/3体积,7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA,重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞,在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定,选取其中pJL获得了插入带tac启动子的外源acy基因片断的重组质粒,该质粒命名为pMSTO。
实施例3
GL-7ACA酰化酶活力测定的实验步骤
本实验步骤参考文献:魏中荻,杨蕴刘,金志坤等,中国专利,公开号1995 CN1104255A
取0.5ml发酵液,4000rpm离心10分钟,弃上清液,并用3ml磷酸缓冲液稀释6倍。然后取0.5ml稀释菌液,于37℃预热10分钟,再加入0.5ml预热底物(5mg/ml GL-7-ACA,用同样磷酸缓冲液现配),37℃水浴反应30分钟。加入3ml终止液和0.5ml显色液。静置30分钟后,于4000rpm离心15分钟。取上清液于415nm测定光吸收值。空白对照则先加终止液,后加底物,其余同上。
酶活力(u/m1)=k×O.D.415×稀释倍数(6倍)/(272×t×D)
k:标准曲线的斜率
t:反应时间30min
D:反应加入菌液的体积0.5ml
272:7-ACA分子量
一个单位的GL-7ACA酰化酶活力定义为特定反应条件下(37℃,0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液)每分钟能转化GL-7ACA生成1μmol 7-ACA的所需酶量。
实施例4
D-氨基酸氧化酶活力测定的实验步骤
本实验步骤参考Aschwini et al,J Biosci 1987,11:137~144
取0.5mld-氨基酸氧化酶基因工程菌发酵液,4,000rpm离心15分钟以收集菌体。再将湿菌体经-20℃冻融,加入5ml用焦磷酸缓冲液(0.1M,pH8.5)配制的50mM DL-甲硫氨酸溶液,于37℃振荡反应30分钟。然后用3ml 10%三氯乙酸终止反应。将反应液于4000rpm离心15分钟,取上清液稀释10倍,再取1ml加入0.4ml 0.2%的2,4-二硝基苯肼,静置10分钟,而后加入1.5ml3N的氢氧化钠,静置15分钟,再离心、取上清液在550nm下测光吸收值,代入用丙酮酸钠制备的标准曲线得出的公式,计算出酶活单位。酶活力(u/ml)=k×O.D550×稀释倍数/t
k:标准曲线的斜率
t:反应时间30min
一个酶活单位的D-氨基酸氧化酶定义为在特定应条件下(37℃,pH8.5)每分钟氧化脱氨生成1μmol酮酸所需酶量。
实施例5
DAO、GA基因工程菌转化CPC的实验步骤
将所构造的DHO、GA工程菌的菌体细胞与10g/L的CPC-Na盐溶液混合,加入1%(wt/vo1)的舒巴坦钠以抑制重组质粒上的氨卞抗性基因编码的β-内酰胺酶对CPC及其衍生物的破坏。于28℃水浴200转/min振荡反应,以5%氨水维持反应液pH7.0。半小时取样一次,用HPLC监测反应进行的程度及反应物、产物浓度的变化。直至CPC转化反应完成。
实施例6
HPLC检测的实验步骤
使用Beckman Gold System HPLC,填料直径5μ,柱容4.6mm×25cm的Ultrasphere ODS反相色谱柱,流速1ml/min,压力1.7~2.2 Kpsi,流动相为7.5%乙腈-15%甲醇-1%乙酸,在245nm的波长下检测CPC及其衍生物。