CN108949724B

CN108949724B - 一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用

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Publication number: CN108949724B
Application number: CN201810913512.5A
Authority: CN
Inventors: 田康明; 牛丹丹; 王正祥; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: CN108949724A

Abstract

本发明属于基因工程和酶制剂技术领域，具体涉及一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用。所述葡糖淀粉酶发酵液酶活可达90000‑120000U/mL，最适作用pH为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃，具有与乳酸单体生产菌种生长和产酸条件吻合的特征，可以在同步糖化同步产乳酸的过程中高效发挥催化作用。

Description

一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用

技术领域：

本发明属于基因工程和酶制剂技术领域，具体涉及一种新型葡糖淀粉酶及其基因与在同步糖化发酵乳酸单体中的应用。

背景技术：

淀粉在液化酶的作用下，由高分子状态(淀粉颗粒)转变为较低分子状态(糊精)，变为流动性较好的淀粉液化液。α-淀粉酶是作为淀粉液化的主体酶，能于淀粉分子内部任意切开α-1,4糖苷键，而不能切开α-1,6糖苷键，也不能水解相邻分支点的α-1,4糖苷键。α-淀粉酶水解直链淀粉一般分两步进行，首先任意切开α-1,4糖苷键，使直链淀粉迅速水解成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子量的麦芽寡糖，然后再将麦芽三糖和麦芽寡糖缓缓水解成麦芽糖和葡萄糖。上述形成的淀粉液化液经葡糖淀粉酶进一步水解形成葡萄糖用于葡萄糖的制备或其他产品的发酵生产。

工业生产用α-淀粉酶均不耐酸，当pH低于4.5时，活力基本消失，通常pH值为5.0-8.0之间较稳定，最适pH值为5.5-6.0。而目前商品化的葡糖淀粉酶的最适作用pH为4.5，因此需要在制糖过程中大量添加盐酸等pH调节剂。另外，上述制糖过程形成的葡萄糖浆直接用于发酵生产时，由于大宗微生物发酵pH主要集中在7.0左右，导致发酵过程需要再次添加碱性pH调节剂使得pH适宜微生物生长。在同步糖化同步发酵产品的工艺过程中这一矛盾更为明显。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明建立了一种最适作用pH接近中性，最适作用温度40℃左右的葡糖淀粉酶的高效制备方法，并形成了以淀粉液化液为原料同步糖化高效制备聚合级乳酸单体的技术。

本发明所要提供的技术方案之一，是一种新型葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶最适作用pH为6.5，最适作用温度为40-45℃，可用于同步糖化同步发酵工艺；

优选地，所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉(Aspergillus niger)CICIM F0215菌株(保存于江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示，其编码基因为glaF，核苷酸序列如序列表SEQID NO.21所示；

优选地，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，其编码基因为glaFs056，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示；

所述glaFs056编码的葡糖淀粉酶发酵液酶活可达90000-120000U/mL，最适作用pH为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃；优选最适作用pH为6.0～7.0，最适作用温度为40～45℃；更优选地最适作用pH为6.5，最适作用温度为40℃；

进一步地，上述葡糖淀粉酶基因的获得方式既可以是以来源微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，更可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成。

本发明提供的技术方案二，是表达上述葡糖淀粉酶的重组菌；

所述重组菌的表达宿主菌可以是米根霉、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、大肠杆菌等；

所述重组菌的表达宿主优选毕赤酵母GS115，表达载体优选质粒pPIC9K；

本发明提供的技术方案三，是上述新型葡糖淀粉酶的制备方法，具体如下：

(1)接种：按照2-15％(V/V)接种量接种方案二所述的重组菌，发酵培养基中添加微量元素后开始发酵，发酵温度为28-40℃，pH维持4.0-8.0，DO维持20％以上；

(2)菌体生长阶段：发酵培养基中含1-5％(质量体积比)的甘油可以用于菌体生长约10-28h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段；

(3))补料生长阶段：流加10-60％甘油(每升甘油中事先添加了5-20mL微量元素母液)，初始流加速度为1.0-8.0mL/min，当DO低于20％时停止流加；待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态0.5-3.0h，然后进入诱导产酶阶段；

(4)诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了5-20mL微量元素母液)；初始流加速率为1.0-4.5mL/min；当DO低于20％时停止流加；待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至2.5-8.0mL/min；1-5h后流加甲醇速率提高至5.0-15.5mL/min，诱导70-120h后发酵结束；

(5)发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液后制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品；

优选地，发酵培养基组成为：磷酸(85％)26.70mL/L，CaSO₄·2H₂O 1.18g/L，K₂SO₄18.20g/L，MgSO₄ 7.27g/L，KOH 4.13g/L，甘油10.00-50.00g/L，其余为水；

优选地，发酵培养基中添加0.2-1.2％体积百分比的微量元素母液；

所述微量元素母液为PTM1母液，组成为：CuSO₄·5H₂O 6.00g/L,NaI 0.08g/L,MnSO₄ ·H₂O 3.00g/L,NaMoO₄·2H₂O 0.20g/L,H₃BO₃ 0.02g/L,CoCl₂ 0.50g/L,ZnCl₂20.00g/L,FeSO₄ ·7H₂O 65.00g/L,生物素0.2g/L,硫酸5.0mL/L，其余为水；

本发明提供的技术方案四，是上述新型葡糖淀粉酶的应用。

优选地，上述葡糖淀粉酶可以在10～300m³发酵体系下用于淀粉液化液为原料和同步糖化并被聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸生产菌种代谢利用高效制备乳酸单体。

有益效果：

1、本发明中所使用的葡糖淀粉酶其催化属性(最适作用pH为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃)具有与乳酸单体生产菌种生长和产酸条件吻合的特征，可以在同步糖化同步产乳酸的过程中高效发挥催化作用。

2、本发明中所建立的葡萄淀粉酶制备方法具备大体量发酵体系下高效制备的特征，可以满足工业化乳酸单体生产体系淀粉液化液预糖化和乳酸发酵过程同步糖化的需要。所形成的同步糖化同步发酵生产乳酸单体的工艺，具备工艺简单，操作稳定等特点，可以大大降低操作难度，节约经济成本。可以实现10m³到200m³及更大规模的聚合级乳酸单体的高效制备过程。

附图说明：

图1本发明glaFs056编码葡糖淀粉酶与原始葡糖淀粉酶最适pH测定曲线；

图2本发明glaFs056编码葡糖淀粉酶与原始葡糖淀粉酶最适温度测定曲线；

图3本发明glaFs056编码葡糖淀粉酶pH稳定性曲线；

图4本发明glaFs056编码葡糖淀粉酶温度稳定性曲线。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明涉及的具体方法有：

基因的获得技术：(1)采用Thermofisher公司的

Plus RNA纯化系统将

试剂的裂解能力与

RNA小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的RNA提取技术相结合，快速分离提取黑曲霉总RNA。

(2)在逆转录酶试剂盒

Reverse Transcriptase Assay Kit的作用下合成cDNA，以上述cDNA为模板PCR扩增获得葡糖淀粉酶的编码基因gla。

(3)上述获得的葡糖淀粉酶的编码基因克隆入pPIC9K质粒的SnaBI/EcoRI位点中获得重组质粒pPIC-gla。

(4)将重组质粒pPIC-gla线性化后电击转化的方式在毕赤酵母GS115中整合表达，并通过组氨酸营养缺陷型筛选和G418抗性筛选获得阳性转化子。

(5)将上述获得的阳性转化子采用Thermofisher(Invitrogen)公司提供的毕赤酵母操作手册阳性转化子发酵验证方法制备酶液。测定酶液中的葡糖淀粉酶酶活并进一步确认其酶学性质。

(6)以上述获得酶学特性最接近葡糖淀粉酶glaF的氨基酸序列为依据，参考毕赤酵母的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的SmaI和BamHI位点同时不形成新的上述两个酶切位点，并通过全基因合成的方式获得酶活最优的相关葡糖淀粉酶编码基因。

(7)以上述全合成的基因片段为模板采用通用长引物和低温易错PCR的组合方式获得全新的基因片段。并筛选获得最适作用温度接近40～45℃，最适作用pH接近7.0的新型葡糖淀粉酶编码基因，命名为glaFs056。

(8)葡糖淀粉酶的制备所用发酵培养基为BSM无机盐培养基，组成如下：

成分	1L添加量(g)
		磷酸(85％)	26.70mL
CaSO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	1.18
		K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	18.20
MgSO<sub>4</sub>	7.27
		KOH	4.13
甘油	10.00—50.00

(9)发酵过程中所使用的微量元素母液为PTM1母液，组成如下：

成分	1L添加量(g)
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	6.00
NaI	0.08
		MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	3.00
NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.20
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.02
CoCl<sub>2</sub>	0.50
		ZnCl<sub>2</sub>	20.00
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	65.00
		生物素	0.2
硫酸	6.0mL

实施例1待筛选葡糖淀粉酶基因的功能验证

以黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)为出发菌株进行培养，收集菌体。采用TRNzol总RNA提取试剂提取它们的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA。

分别以染色体DNA或第一链cDNA为模板，使用引物(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:14；相邻的两个为一对上下游引物)进行PCR扩增出葡萄糖淀粉酶的编码基因glaA、glaB、glaC、glaD、glaE、glaF和glaG。

PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，61℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物与质粒pPIC9K分别用SnaB I和Avr II(或Not I)进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escheriachia coli JM109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。

毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将构建成功的7个重组质粒pPIC9K-glaA、pPIC9K-glaB、pPIC9K-glaC、pPIC9K-glaD、pPIC9K-glaE、pPIC9K-glaF和pPIC9K-glaG用SacI或Sal I进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化Pichia pastoris GS115，均匀涂布于MD平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/mL的YPD/G418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对这7株重组菌进行命名GLAa、GLAb、GLAc、GLAd、GLAe、GLAf和GLAg。采用毕赤酵母表达操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的葡糖淀粉酶酶液。葡糖淀粉酶的酶活测定及定义参考国标《GB 1886.174-2016》进行。

7种葡糖淀粉酶的酶学特性汇总于表1。

表1重组毕赤酵母中7种葡糖淀粉酶的酶学特性比较

菌株	酶活(U/mL)	最适作用温度	最适作用pH
				GLAa	2005	60	4.0
GLAb	2756	60	4.5
				GLAc	4642	40	5.0
GLAd	3195	60	4.0
				GLAe	3218	40	6.0
GLAf	3684	45	6.5
				GLAg	2356	50	5.5

基于该葡糖淀粉酶后续将应用于乳酸发酵，其阶段温度维持42～45℃，pH维持7.0的控制要求，选择菌株GLAf中的glaF基因作为后续出发酶蛋白进行酶学特性的人工进化的基础。

实施例2新型葡糖淀粉酶基因的筛选文库的建立及新型葡糖淀粉酶重组菌的获得

以实施例1中筛选获得的glaF核酸序列(SEQ ID NO.20所示)为基础序列，参考毕赤酵母的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中不形成SnaB I，AvrII和Not I等酶切位点，并委托上海生工或华大基因等公司通过全基因合成的方式获得葡糖淀粉酶编码基因glaFs(SEQ ID NO.19所示)。

以上述glaFs基因中相对保守序列中的部分碱基串联组成长引物(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；上游引物引入SnaB I，Avr II和Not I位点，下游引物引入EcoRI位点)，短时PCR条件下[95℃10min；30×(94℃30s；56℃1min；72℃0.1～2s)；68℃10min]扩增获得目的条带。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用SnaB I和Avr II(或Not I)进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escheriachia coli JM109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。获得重组质粒pK-glaFsX(“X”代表转化子的编号)。获得重组质粒在大肠杆菌JM109中保存。作为葡糖淀粉酶基因文库用于分泌表达型新型葡糖淀粉酶编码基因的筛选。

毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将构建成功的重组质粒pK-glaFsX(“X”代表转化子的编号)用Sac I或Sal I进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化Pichia pastoris GS115，均匀涂布于MD平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/mL的YPD/G418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对重组菌进行命名。

采用毕赤酵母操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的葡糖淀粉酶酶液。通过测定酶液中葡糖淀粉酶酶活水平选择出最优的转化子。筛选酶活显著提高的转化子及酶活水平见表2。其中编号为GLAFs056的重组菌产酶水平较出发菌株提高了162.62％，作为最优重组菌用于后续酶液制备和应用。对重组菌株GLAFs056中的葡糖淀粉酶基因进行测序，如SEQ ID NO.18所示，并命名为glaFs056基因，该基因对应的氨基酸需如SEQ ID NO.17所示。

表2转化子及酶活水平

实施例3 25L发酵体系下新型葡糖淀粉酶的制备方法

甘油管接种重组菌GLAFs056至YPD平板，30℃培养40h；单菌落接种YPD液体培养基，250mL三角瓶装液量30mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体YPD)，500mL三角瓶装液量100mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，OD₆₀₀测定为10时，停止培养用于发酵罐接种；

发酵罐准备：按照11L初始装液量配制发酵培养基(BSM，含甘油40g/L)，氨水调节pH至5.0，搅拌充分后，121℃30min灭菌，同时准备补料瓶等，并配制50％甘油5.5L用于补料；

接种：按照10％接种量接种，将131.59mL微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0，DO维持20％以上；

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段；

补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mLPTM1母液)，初始流加速度为4.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段；

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mLPTM1母液)，初始流加速率为1.8mL/min；当DO低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至4.3mL/min；2h后流加甲醇速率提高至8.5mL/min，诱导90h后发酵结束，经测定葡糖淀粉酶发酵液酶活为105000U/mL。

发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液后添加5％食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。

实施例4 300m³发酵体系下新型葡糖淀粉酶的制备方法

将实施例3中工艺调整为300m³发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种；

菌体生长阶段：发酵培养基中含5％的甘油可以用于菌体生长约28h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段；

补料生长阶段：流加60％甘油(每升甘油中事先添加了15mL PTM1母液)，初始流加速度为8.0mL/min，当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态2h，然后进入诱导产酶阶段；

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了15mL PTM1母液)，初始流加速率为3.6mL/min；当DO低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至7.3mL/min；2h后流加甲醇速率提高至10.9mL/min，诱导75h后发酵结束，发酵结束后发酵液酶活力为118000U/mL；

发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液10倍后添加辅助制剂(每吨成品添加NaCl 25kg，糊精10kg，苯甲酸钠0.25kg，尼铂金乙脂和尼铂金丙脂各0.25kg)后精滤制备葡糖淀粉酶液体成品。

实施例5 glaFs056编码新型葡糖淀粉酶酶学性质测定

葡糖淀粉酶的酶活测定参考国标《GB 1886.174-2016》进行。

本实施例在不同温度下对比新型葡糖淀粉酶酶活的差异性，并与酶源菌株Aspergillus niger CICIM F0215发酵液不同温度下酶活特性进行对比(如图1，图2)，新型葡糖淀粉酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为6.5。

将本发明所述的新型葡糖淀粉酶分别在不同pH及温度下保存后，在45℃，pH为6.5下测定酶活，发现新型葡糖淀粉酶在乳酸单体发酵过程的对应的温度(40～45℃)和pH(5.5-6.5)条件下稳定性良好(图3和图4所示)。

实施例6—同步糖化同步发酵生产聚合级D-乳酸单体

获得的CGMCC No.11059(ZL201210102731.8)菌种在200m³发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。

发酵前期进行淀粉液化液的预处理，淀粉液化液无需调整pH，温度降至50℃添加实施例4所得葡糖淀粉酶0.3L/吨绝干淀粉，预糖化8h。菌体在25-36℃进行好氧培养至OD₆₀₀值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段0-3h发酵温度为33-39℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％，其中补加实施例4所得葡糖淀粉酶0.2L/吨绝干淀粉，3-6h发酵温度为37-42℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％，6-10h发酵温度为38-45℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，10-16h发酵温度为40-48℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％，其中补加实施例4所得葡糖淀粉酶0.2L/吨绝干淀粉，16-24h发酵温度为45-50℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％。

其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵11-25，磷酸二氢钾3-5，磷酸氢二钠，15-25，氯化钠2-5，MgSO₄ 0.2-0.5，FeSO₄ 0.3-1，FeCl₃ 0.2-1，CoCl₂ 0.3-1，CuCl₂ 0.4-1，Na₂MoO₄0.2-1，H₃BO₃ 0.1-1，MnCl₂ 0.2-1，柠檬酸10-25，硫胺素0.2-1，木糖5-50，甘油5-50，葡萄糖5-50，硫酸1-5，其余为水，pH 6.0-7.5。重复发酵过程5个批次。详细发酵结果见表3。

表3五批次200m³罐发酵生产极高光学纯D-乳酸结果

实施例7—同步糖化同步发酵生产聚合级L-乳酸单体

将实施例6使用的CGMCC No.11059(ZL201210102731.8)菌株更换为CGMCCNo.11060(ZL201210102731.8)菌株，其余条件不变，在200m³发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程按照实施例6进行。重复发酵过程5个批次。详细发酵结果见表4。

表4五批次200m3罐连续转化生产极高光学纯L-乳酸结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用

<130> 1

<141> 2018-08-13

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gtaactagtt tcgttggcaa tatggctga 29

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tgctctagat cagatacgca cgagactaaa gatcaaag 38

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtatccttga gtttctcctc agatgtggc 29

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tgctctagat tacgaaggca ccccctcata ttc 33

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtaatgcagg caattgagca ggcag 25

<210> 6

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<212> DNA

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tgctctagat caaaatgcta gaccgacagc ggaat 35

<210> 7

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gtatataccg aggaatacaa tggctgttac tcc 33

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tgctctagac tagcgtcgat cggggttggt c 31

<210> 9

<211> 22

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gtaaatgtga tttccaagcg cg 22

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tgctctagac taccgccagg tgtcagtcac 30

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gtagatccgg caaacgaata ttgcg 25

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tgctctagat tatctgtcgc cccctccg 28

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gtaagcagtt atgaacttgt ggaaacctgg 30

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

tgctctagat taagccaaca aagcaaaagc aaga 34

<210> 15

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

agcgatatcc gcggatccat gcaggctatc atcgttgttg cttctcctgg acgtgttaat 60

cgctgcacct cttctgctga tcccgccgtt tct 93

<210> 16

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ccggaattct tagaaagcca gaccaacaaa gagatgtcag cagattcagc gatcgggagc 60

agccagggtg cacagataga cggcag 86

<210> 17

<211> 661

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 17

Met Gly Val Asp His Thr Thr Lys Leu Ser Thr Asn Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Glu Ser Val Arg Ile Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Asp Glu Gly Leu Phe

20 25 30

Ile Ile Asp Leu Gln His Met Pro Gly Ser Val Cys Gly Thr Trp Pro

35 40 45

Ala Phe Trp Ser Thr Gly Lys Asn Trp Pro Thr Asp Gly Glu Ile Asp

50 55 60

Ile Ile Glu Gly Val Asn Lys Asn Glu Ala Asn Glu Ile Val Leu His

65 70 75 80

Thr Ser Gly Thr Cys Gln Val Ser Ser Gln Lys Met Ser Gly Thr Leu

85 90 95

Thr Ser Thr Glu Cys Gly Glu Asp Ala Gly Thr Thr Gly Cys Val Val

100 105 110

Glu Gly Thr Gln Gly Ser Ser Gly Thr Pro Phe Asn Glu Asn Gly Gly

115 120 125

Gly Val Tyr Ala Met Gln Trp Thr Asp Glu Phe Leu Lys Phe Trp Phe

130 135 140

Phe Pro Arg Gly Ser Ile Pro Ser Ser Ile Thr Lys Gly Asp Pro Asp

145 150 155 160

Val Ala Ala Phe Gly Thr Pro Met Ala His Met Glu Gly Ser Cys Ser

165 170 175

Ile Ala Glu His Phe Lys Ala Gln Gln Phe Ile Phe Asp Thr Thr Phe

180 185 190

Cys Gly Asp Trp Ala Gly Gly Val Tyr Ser Thr Ser Gly Cys Pro Val

195 200 205

Ser Asp Ser Ser Ser Ser Phe Lys Ser Cys Val Ala Tyr Val Ala Glu

210 215 220

Asn Pro Thr Ala Phe Ala Glu Ser Tyr Trp Glu Ile Asn Tyr Ile Lys

225 230 235 240

Ile Tyr Gln Thr Gly Val Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser His

245 250 255

Val Glu Ser Ala Ala Ser Val Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Arg Glu

260 265 270

Gly Thr Asn Ser Val Val Ala Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ile Ala Val

275 280 285

Thr Ser Thr Ala Asp Ala Glu Thr Ala Thr Thr Met Ala Gly Ala Thr

290 295 300

Thr Val Ala Ala Ser Thr Glu Thr Ser Ala Ala Asp Glu Asn Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ala Ser Thr Ser Thr His Tyr Val Thr Met Thr Thr Thr Ile Cys

325 330 335

Pro Ile Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ser

340 345 350

Ser Glu Ala Thr Glu Ala Ser Asn Ser Glu Gly Ser Pro Ala Ala Ala

355 360 365

Thr Pro Ser Ser Val Thr Gly Ala Ser Ala Glu Ala Asn Glu Ser Glu

370 375 380

Ser Thr Ser Ala Ala Val Thr Thr Pro Ser Thr Ser Thr Gly Ala Ser

385 390 395 400

Ala Glu Ala Asn Gly Ser Glu Ser Ser Ser Ala Ser Glu Ala Gly Ser

405 410 415

Val Ala Gly Ala Thr Pro Ser Ser Val Ser Thr Thr Gly Ala Ser Gly

420 425 430

Glu Ala Asp Ser Ser Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ala Thr Pro Ser Asn

435 440 445

Val Ser Ser Thr Gly Ala Ser Ala Glu Ala Asn Gly Ser Glu Asp Ser

450 455 460

Ser Ala Ser Ser Glu Ala Lys Thr Val Ala Pro Ser Ile Pro Ser Ser

465 470 475 480

Val Thr Gly Ala Ser Ala Glu Ala Asn Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ser

485 490 495

Asn Ala Ala Thr Ala Ser Asn Val Ser Gly Ala Ser Ala Gln Ala Gly

500 505 510

Asp Asn Glu Ser Thr Pro Ala Ser Ala Gly Ala Asn Ala Gly Ser Ser

515 520 525

Ala Ala Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Asn Gly Ser

530 535 540

Glu Gly Ser Ser Ser His Ser Ser Gly Ser Gln Ala Gly Ala His Ser

545 550 555 560

Tyr Gly Ser Val Pro Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Arg Pro Ala Pro

565 570 575

Ser Ser Ser Ser His Ala Phe Ala Thr Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ser

580 585 590

Ser Arg Val Pro Thr Ser Ala Ala Ala Ala Asn Asn Ala Ala Ala Ala

595 600 605

Thr Gln Gly Ser Ser Ala Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ser Ser Gly His

610 615 620

Gly Ser Ser Ser Ala Thr Thr Pro Ser Thr Pro Val Phe Thr Gly Gly

625 630 635 640

Ala Asn Lys Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ser Val Leu Ser Val Leu Ala

645 650 655

Phe Ala Leu Leu Ala

660

<210> 18

<211> 1986

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

atgggtgttg accacaccac caaactgtct accaacggtc cgggtcgtga atctgttcgt 60

atcggttcta acaaatacta cgacgaaggt ctgttcatca tcgacctgca gcacatgccg 120

ggttctgttt gcggtacctg gccggctttc tggtctaccg gtaaaaactg gccgaccgac 180

ggtgaaatcg acatcatcga aggtgttaac aaaaacgaag ctaacgaaat cgttctgcac 240

acctctggta cctgccaggt ttcttctcag aaaatgtctg gtaccctgac ctctaccgaa 300

tgcggtgaag acgctggtac caccggttgc gttgttgaag gtacccaggg ttcttctggt 360

accccgttca acgaaaacgg tggtggtgtt tacgctatgc agtggaccga cgaatttctg 420

aaattctggt tcttcccgcg tggttctatc ccgtcttcta tcaccaaagg tgacccggac 480

gttgctgctt tcggtacccc gatggctcac atggaaggtt cttgctctat cgctgaacac 540

ttcaaagctc agcagttcat cttcgacacc accttctgcg gtgactgggc tggtggtgtt 600

tactctacct ctggttgccc ggtttctgac tcttcttctt ctttcaaatc ttgcgttgct 660

tacgttgctg aaaacccgac cgctttcgct gaatcttact gggaaatcaa ctacatcaaa 720

atctaccaga ccggtgttgc tgcttctgct tctgcttctg cttctcacgt tgaatctgct 780

gcttctgttg ctgaaaccat ctctgctgtt cgtgaaggta ccaactctgt tgttgctacc 840

accaccgctg ctaccatcgc tgttacctct accgctgacg ctgaaaccgc taccaccatg 900

gctggtgcta ccaccgttgc tgcttctacc gaaacctctg ctgctgacga aaacggttct 960

tctgcttcta cctctaccca ctacgttacc atgaccacca ccatctgccc gatcgctgaa 1020

tcttcttctg ctgctgctgc tctggctggt ggttcttctg aagctaccga agcttctaac 1080

tctgaaggtt ctccggctgc tgctaccccg tcttctgtta ccggtgcttc tgctgaagct 1140

aacgaatctg aatctacctc tgctgctgtt accaccccgt ctacctctac cggtgcttct 1200

gctgaagcta acggttctga atcttcttct gcttctgaag ctggttctgt tgctggtgct 1260

accccgtctt ctgtttctac caccggtgct tctggtgaag ctgactcttc tgaaggtgct 1320

tctgctgctg ctaccccgtc taacgtttct tctaccggtg cttctgctga agctaacggt 1380

tctgaagact cttctgcttc ttctgaagct aaaaccgttg ctccgtctat cccgtcttct 1440

gttaccggtg cttctgctga agctaacggt aacgactctg cttcttctaa cgctgctacc 1500

gcttctaacg tttctggtgc ttctgctcag gctggtgaca acgaatctac cccggcttct 1560

gctggtgcta acgctggttc ttctgctgct ccgtcttctg tttctggtgc ttctgctgaa 1620

gctaacggtt ctgaaggttc ttcttctcac tcttctggtt ctcaggctgg tgctcactct 1680

tacggttctg ttccgtcttc tgctgctgct tacggtcgtc cggctccgtc ttcttcttct 1740

cacgctttcg ctaccgctcc gtcttctacc ggttcttctc gtgttccgac ctctgctgct 1800

gctgctaaca acgctgctgc tgctacccag ggttcttctg cttctggttc taactctggt 1860

tcttctggtc acggttcttc ttctgctacc accccgtcta ccccggtttt caccggtggt 1920

gctaacaaac tgaccctggg tgcttcttct gttctgtctg ttctggcttt cgctctgctg 1980

gcttaa 1986

<210> 19

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

gtttctttgt ctttctcttc tgacgttgct ttgaacgcta ctgaagctgc tgttttcttg 60

tctgaaagag acgttgctgg tcaaatccca atcaacttcg ttactacttc tgctgtttct 120

ttgagagctg cttgtttcgg tgacaacatc tacgacagag acgctgctgg tagatgtatc 180

tctaacttgt tggttgttgg ttacagaaga ttcttggttg acttgtactg gtcttctgac 240

caaagagact ggatgttctg tccattgtct ttgtctccag acgttccagt tgttactgtt 300

tcttctatct ctccagcttc ttctactact actactgcta ctactactgt tactgctgtt 360

gctagatctt ctggttctgt tttgtacgaa ttgggtccat acagatgttc tttggacttc 420

gacttgtctg acttgatcaa cgttttcaga ggtttcttcc aagcttactc ttctgaattg 480

actgttttca ctagatacat ctctttgaac ttgcacgctg ctggttctgc tacttctcca 540

gacgaaccag cttctactgt tactggttct caattgccaa cttcttctga attcgtttct 600

taccaattcg acgaacactt gtcttcttac atctacactc catcttcttt ggcttctgaa 660

agagctaact tgaaccaatc ttggtaccaa gttgaagacg gttacaagcc aatcactgaa 720

tacttcacta tccacgaaga accaaacggt gaccaatcta ctccagacgg ttggccatgt 780

gttaagtact tgcaattggc tcaagaaaag agattgttga tcgactacgg tactatcgac 840

tctcaattgc aagactacaa cttctcttac atgtctgacg ttatcttccc accaaactac 900

ttgacttcta ctgtttctgt ttctttggac tctgacggtt ctgttgacac tggttgtttc 960

tacgactctg gtgctactac tgtttctcaa gctaacaact cttgggctat ctctgactac 1020

atcccaatcc cagaaggttt gtctgaaaac tctactatcg ctgctatgtc tttggttgct 1080

tctaacttga ctgcttgtgg tttgactcca gctttgaaca acactttgtt caaccaaact 1140

gctgacactc acccacaacc atacactgac atctctttgt cttcttcttg ggcttggtct 1200

atcggtcaac cagctaacgc tgactcttct tctgcttctt tctctgctac tgacagatgt 1260

gctgttatcg acttgactaa ctctggtcac tggagagcta tcaactgttc tcaagttaga 1320

tacgctgctt gtagagttgg taacaaccca ttcacttggc aattgtctcc aactccatac 1380

actttcagag acgcttacga ccacggttgt ccagaaaaca cttctatggc tgttccaaga 1440

actggtttgg aaaacactta cttgtaccaa tacttgttga ctagaactga cgttttggac 1500

ccaacttctg ctatcccaaa caagactaag gtttggttga acatgaactg tatcgacgtt 1560

gaatcttgtt gggttactgg tggtccagac caagaatgtc catacgcttc tgacccacaa 1620

caattggaaa gaagaactgt tttggttgct gctatcgctg gtatcgttat ctgtatcatc 1680

gctgctttga ctttgttcgt taagtgtaac gctaacagaa gaaactctag aagaaacaag 1740

agagttatca agggttggga atacgaaggt gttccatctt aa 1782

<210> 20

<211> 509

<212> PRT

<213> 黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株()

<400> 20

Met Phe Cys Pro Leu Ser Leu Ser Pro Asp Val Pro Val Val Thr Val

1 5 10 15

Ser Ser Ile Ser Pro Ala Ser Ser Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr

20 25 30

Val Thr Ala Val Ala Arg Ser Ser Gly Ser Val Leu Tyr Glu Leu Gly

35 40 45

Pro Tyr Arg Cys Ser Leu Asp Phe Asp Leu Ser Asp Leu Ile Asn Val

50 55 60

Phe Arg Gly Phe Phe Gln Ala Tyr Ser Ser Glu Leu Thr Val Phe Thr

65 70 75 80

Arg Tyr Ile Ser Leu Asn Leu His Ala Ala Gly Ser Ala Thr Ser Pro

85 90 95

Asp Glu Pro Ala Ser Thr Val Thr Gly Ser Gln Leu Pro Thr Ser Ser

100 105 110

Glu Phe Val Ser Tyr Gln Phe Asp Glu His Leu Ser Ser Tyr Ile Tyr

115 120 125

Thr Pro Ser Ser Leu Ala Ser Glu Arg Ala Asn Leu Asn Gln Ser Trp

130 135 140

Tyr Gln Val Glu Asp Gly Tyr Lys Pro Ile Thr Glu Tyr Phe Thr Ile

145 150 155 160

His Glu Glu Pro Asn Gly Asp Gln Ser Thr Pro Asp Gly Trp Pro Cys

165 170 175

Val Lys Tyr Leu Gln Leu Ala Gln Glu Lys Arg Leu Leu Ile Asp Tyr

180 185 190

Gly Thr Ile Asp Ser Gln Leu Gln Asp Tyr Asn Phe Ser Tyr Met Ser

195 200 205

Asp Val Ile Phe Pro Pro Asn Tyr Leu Thr Ser Thr Val Ser Val Ser

210 215 220

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Val Asp Thr Gly Cys Phe Tyr Asp Ser Gly

225 230 235 240

Ala Thr Thr Val Ser Gln Ala Asn Asn Ser Trp Ala Ile Ser Asp Tyr

245 250 255

Ile Pro Ile Pro Glu Gly Leu Ser Glu Asn Ser Thr Ile Ala Ala Met

260 265 270

Ser Leu Val Ala Ser Asn Leu Thr Ala Cys Gly Leu Thr Pro Ala Leu

275 280 285

Asn Asn Thr Leu Phe Asn Gln Thr Ala Asp Thr His Pro Gln Pro Tyr

290 295 300

Thr Asp Ile Ser Leu Ser Ser Ser Trp Ala Trp Ser Ile Gly Gln Pro

305 310 315 320

Ala Asn Ala Asp Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ala Thr Asp Arg Cys

325 330 335

Ala Val Ile Asp Leu Thr Asn Ser Gly His Trp Arg Ala Ile Asn Cys

340 345 350

Ser Gln Val Arg Tyr Ala Ala Cys Arg Val Gly Asn Asn Pro Phe Thr

355 360 365

Trp Gln Leu Ser Pro Thr Pro Tyr Thr Phe Arg Asp Ala Tyr Asp His

370 375 380

Gly Cys Pro Glu Asn Thr Ser Met Ala Val Pro Arg Thr Gly Leu Glu

385 390 395 400

Asn Thr Tyr Leu Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Arg Thr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Pro Thr Ser Ala Ile Pro Asn Lys Thr Lys Val Trp Leu Asn Met Asn

420 425 430

Cys Ile Asp Val Glu Ser Cys Trp Val Thr Gly Gly Pro Asp Gln Glu

435 440 445

Cys Pro Tyr Ala Ser Asp Pro Gln Gln Leu Glu Arg Arg Thr Val Leu

450 455 460

Val Ala Ala Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ile Ile Ala Ala Leu Thr

465 470 475 480

Leu Phe Val Lys Cys Asn Ala Asn Arg Arg Asn Ser Arg Arg Asn Lys

485 490 495

Arg Val Ile Lys Gly Trp Glu Tyr Glu Gly Val Pro Ser

500 505

<210> 21

<211> 1530

<212> DNA

<213> 黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株()

<400> 21

atgttctgcc cgctgtctct gtctccggac gttccggttg ttaccgtttc ttctatctct 60

ccggcttctt ctaccaccac caccgctacc accaccgtta ccgctgttgc tcgttcttct 120

ggttctgttc tgtacgaact gggtccgtac cgttgctctc tggacttcga cctgtctgac 180

ctgatcaacg ttttccgtgg tttcttccag gcttactctt ctgaactgac cgttttcacc 240

cgttacatct ctctgaacct gcacgctgct ggttctgcta cctctccgga cgaaccggct 300

tctaccgtta ccggttctca gctgccgacc tcttctgaat ttgtttctta ccagttcgac 360

gaacacctgt cttcttacat ctacaccccg tcttctctgg cttctgaacg tgctaacctg 420

aaccagtctt ggtaccaggt tgaagacggt tacaaaccga tcaccgaata cttcaccatc 480

cacgaagaac cgaacggtga ccagtctacc ccggacggtt ggccgtgcgt taaatacctg 540

cagctggctc aggaaaaacg tctgctgatc gactacggta ccatcgactc tcagctgcag 600

gactacaact tctcttacat gtctgacgtt atcttcccgc cgaactacct gacctctacc 660

gtttctgttt ctctggactc tgacggttct gttgacaccg gttgcttcta cgactctggt 720

gctaccaccg tttctcaggc taacaactct tgggctatct ctgactacat cccgatcccg 780

gaaggtctgt ctgaaaactc taccatcgct gctatgtctc tggttgcttc taacctgacc 840

gcttgcggtc tgaccccggc tctgaacaac accctgttca accagaccgc tgacacccac 900

ccgcagccgt acaccgacat ctctctgtct tcttcttggg cttggtctat cggtcagccg 960

gctaacgctg actcttcttc tgcttctttc tctgctaccg accgttgcgc tgttatcgac 1020

ctgaccaact ctggtcactg gcgtgctatc aactgctctc aggttcgtta cgctgcttgc 1080

cgtgttggta acaacccgtt cacctggcag ctgtctccga ccccgtacac cttccgtgac 1140

gcttacgacc acggttgccc ggaaaacacc tctatggctg ttccgcgtac cggtctggaa 1200

aacacctacc tgtaccagta cctgctgacc cgtaccgacg ttctggaccc gacctctgct 1260

atcccgaaca aaaccaaagt ttggctgaac atgaactgca tcgacgttga atcttgctgg 1320

gttaccggtg gtccggacca ggaatgcccg tacgcttctg acccgcagca gctggaacgt 1380

cgtaccgttc tggttgctgc tatcgctggt atcgttatct gcatcatcgc tgctctgacc 1440

ctgttcgtta aatgcaacgc taaccgtcgt aactctcgtc gtaacaaacg tgttatcaaa 1500

ggttgggaat acgaaggtgt tccgtcttaa 1530

Claims

1.一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述葡糖淀粉酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示。

2.包含权利要求1所述葡糖淀粉酶的重组菌株。

3.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，表达宿主菌是米根霉、酿酒酵母、毕赤酵母、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。

4.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌的表达宿主为毕赤酵母GS115，表达载体为质粒pPIC9K。

5.权利要求1所述葡糖淀粉酶的发酵制备方法，其特征在于，具体如下：

（1）接种：按照2-15%接种量接种包含所述葡糖淀粉酶的重组菌株，发酵培养基中添加微量元素后开始发酵，发酵温度为28-40℃，pH维持4.0-8.0，DO维持20%以上；

（2）菌体生长阶段：菌体生长约10-28 h后，DO快速上升，随即进入补料生长阶段；

（3））补料生长阶段：流加10-60%甘油，初始流加速度为1.0-8.0 mL/min，当DO低于20%时停止流加；待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态0.5-3.0 h，然后进入诱导产酶阶段；

（4）诱导产酶阶段：流加甲醇；初始流加速率为1.0-4.5 mL/min；当DO低于20%时停止流加；待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至2.5-8.0 mL/min；1-5 h后流加甲醇速率提高至5.0-15.5 mL/min，诱导70-120 h后发酵结束。

6.权利要求5所述葡糖淀粉酶的发酵制备方法，其特征在于，发酵培养基组成为：85%磷酸26.70 mL/L，CaSO₄·2H₂O1.18g/L，K₂SO₄18.20 g/L，MgSO₄7.27 g/L，KOH4.13 g/L，甘油10.00-50.00 g/L，其余为水。

7.权利要求1所述葡糖淀粉酶在10~300 m³发酵体系下以淀粉液化液为原料和同步糖化并被聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸生产菌种代谢利用制备乳酸单体中的应用。

8.权利要求2所述重组菌株在生产权利要求1所述葡糖淀粉酶中的应用。