CN107058263A

CN107058263A - 一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法

Info

Publication number: CN107058263A
Application number: CN201710057606.2A
Authority: CN
Inventors: 牛丹丹; 叶秀云
Original assignee: FUDA BIOTECH Co Ltd
Current assignee: FUDA BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-01-26
Also published as: CN107058263B

Abstract

本发明提供了一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法。根据大麦β‑淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因，并通过非高保真的DNA聚合酶在低退火温度下（45~50℃）对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC‑bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，筛选获得了最适作用温度显著提高的β‑淀粉酶的重组菌。获得重组β‑淀粉酶的最适作用温度为65℃，最适作用pH为5.0，最高酶活力达280 U/mL。

Description

一种新型β-淀粉酶的高效制备方法

技术领域

本发明提供了一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，属于基因工程、发酵工程领域。

背景技术

植物来源的β-淀粉酶活性高，耐热性好、应用pH范围更广，目前工业上应用的β-淀粉酶大多还是通过植物提取获得的β-淀粉酶。从植物中提取β-淀粉酶目前主要有水提和油提两种方法，其中油提法(甘油)与水提法相比，具有提取时间短、酶的保存时间长等优点，但成本较高，生产中常采用水提法提取β-淀粉酶。目前商品化推广比较成功的β-淀粉酶为Genencor杜邦公司生产的麦芽β-淀粉酶，是采用典型的大麦提取工艺制造方法制得。但由于β-淀粉酶在大麦中中的含量较低，提取成本偏高，且所有这些酶制剂提取物都或多或少含有其它无关淀粉水解酶，如α-淀粉酶、糖化酶等，影响其使用效果（麦芽糖浆中含有较高浓度的葡萄糖）。

微生物发酵生产的β-淀粉酶不受季节、原料等影响，可实现自动化控制批量生产，使生产出的β-淀粉酶性能稳定、均一，是β-淀粉酶产业化制造的最佳选择之一。但是由于微生物发酵生产的β-淀粉酶活性相对较低，耐热性差，产酶水平太低以及其最适作用温度偏低，一直未能实现工业化生产。国内外很早就通过物理、化学方法诱变提高产酶活力和热稳定性及改变菌种的发酵条件来提高酶活力，然而已有的微生物来源β-淀粉酶生产离工业化还有较大距离。特别是在β-淀粉酶高产菌株的构建和β-淀粉酶耐热性能等催化特征改良方面仍不成熟。

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种甲醇营养型酵母表达系统，是一种相对较成熟的真核蛋白表达体系，被广泛用于各种外源蛋白的表达。毕赤酵母中含有强有力的AOX1启动子，像大肠杆菌一样能够调控表达外源蛋白，同时作为一种真核表达系统，外源基因是通过质粒线性化后整合到自身基因组上，得到的重组菌遗传稳定性好；可以对蛋白进行恰当的翻译后，对其进行加工与修饰，促进蛋白正确折叠，因此比原核表达的蛋白更能贴近天然状态，并维持蛋白稳定的天然构象，从而使表达出的蛋白具有生物活性，而且活性较高，这对于蛋白高效表达有着十分重要的作用；不仅如此，由于分泌信号肽α-Factor的存在，重组毕赤酵母表达的外源蛋白绝大部分可分泌到胞外，且自身分泌的内源蛋白少，使得外源蛋白分离纯化简便。与酿酒酵母相比，毕赤酵母表达的蛋白糖基化程度低，不会产生过度糖基化，因此对于蛋白的临床应用具有很大优势。除此之外，在应用毕赤酵母表达外源蛋白时操作简单、营养要求低、周期短、易于培养，高密度发酵技术成熟，便于工业化生产。

本发明利用分子克隆技术实施大麦β-淀粉酶在毕赤酵母中的异源表达并通过简单易行碱基突变新方法获得了耐热性能大幅度提高的新型β-淀粉酶变异体，并将该变异体在毕赤酵母中的高效表达，获得耐热型β-淀粉酶高效制造新技术。

发明内容

本发明为一种新型β-淀粉酶的高效制备方法。

本发明通过NCBI公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因，克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaP，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，并通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-bbaP。对该重组酵母进行摇瓶发酵，在0.5%(v/v)甲醇诱导条件下发酵120 h，分泌表达β-淀粉酶酶活水平为70~80 U/mL的。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃，最适作用pH为5.0。

通过采用非高保真的DNA聚合酶在低退火温度下（45~50℃）对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，并通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，获得了最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组菌。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为65℃，最适作用pH为5.0。对该重组酵母GS-bbaPT29进行摇瓶发酵，15 L小试发酵和30m³大罐发酵生产。65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280 U/mL。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，包括如下具体步骤：

（1）β-淀粉酶基因的获得：通过NCBI公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因；

（2）克隆：将步骤（1）所得bbaP基因克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaP；

（3）易错PCR：采用非高保真的DNA聚合酶在45~50℃低退火温度下对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT；

（4）表达：将步骤（3）所得新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达；

（5）耐热新型β-淀粉酶的筛选：通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，再通过摇瓶发酵和酶活测定获得最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组酵母GS-bbaPT29；

（6）耐热新型β-淀粉酶的发酵生产：发酵培养，分离纯化得到耐热新型β-淀粉酶。

其中，步骤（4）所述巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达、分泌β-淀粉酶的毕赤酵母基因工程菌株，其染色体DNA上整合一条耐热新型β-淀粉酶编码基因。

步骤（5）所述的重组酵母GS-bbaPT29的耐热新型β-淀粉酶编码基因如SEQ IDNo.1所示。

所述步骤（6）的发酵条件为：30m³大罐发酵生产，发酵培养基为BSM培养基，每升BSM培养基中加入12mL微量元素PTM1母液，发酵温度为30℃，pH维持5.0；DO维持20%以上；流加甲醇诱导产酶70~96h后发酵结束；按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280 U/mL。

本发明的显著优点

1、本发明获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法具有易实施、易获得、催化活性高效等特点。

2、本发明获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法可以为筛选高活性β-淀粉酶、耐酸或耐碱β-淀粉酶、耐热或低温β-淀粉酶等提供丰富的可筛选基因文库。

3、本发明基于毕赤酵母高效表达系统的新工艺有助于β-淀粉酶工业生产中的高效制备。

4、本发明的工业化生产过程使用的为无机盐全合成培养基，分泌表达的β-淀粉酶产品易于分离纯化和成品制备。

5、本发明的重组蛋白为工业酶制剂β-淀粉酶，进一步为大宗工业酶制剂，如淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、RNA酶等，但不局限于上述酶制剂。

附图说明

图1：pPIC-bbaPT质粒构建示意图；

图2：鉴定平板筛选产酶菌株；

图3：15 L发酵体系下耐热型β-淀粉酶高产菌株GS-bbaPT29产酶进程。

具体实施方式：

为了实现上述目的，本发明采用的实验方法如下：

1、培养基配置

大肠杆菌培养基LB培养基，培养条件200 r/min，37℃；酵母培养基YPD培养基，富集培养基BMGY，诱导培养基BMMY，培养条件230 r/min，28~30℃；酵母筛选固体培养基MD，培养条件28~30℃。

大肠杆菌培养基：0.5% (w/v )酵母提取物，1% (w/v)胰蛋白陈，1% (w/v) NaCl，pH为7.4。固体培养基则另加2% (w/v)琼脂粉。用于转化子筛选时，待灭菌冷却后另加入终浓度100 μg/mL的Amp。

毕赤酵母培养基：10×YNB (13.4%酵母氮源碱，含硫酸铵且不含氨基酸)：134 gYNB于1000 mL水中，加热至YNB完全溶解后冷却，过滤除菌；

500×B (0.02% w/v生物素)：20 mg生物素，溶解于100 mL水中，过滤除菌；

10×D(20% w/v葡萄糖)：200 g D-葡萄糖，于1000 mL水中进行溶解，115℃高压灭菌15min；

10×M(5%vol甲醇)：5 mL甲醇加入到95 mL水中混匀；

10×G(10%vol甘油)：100 mL甘油加入到900 mL水中混匀；

1 mol/L磷酸钾缓冲液：配制1mol/L K₂HPO₄和1 mol/LKH₂PO₄母液，准确量取132 mL1mol/L K₂HPO₄和868 mL 1 mol/LKH₂PO₄混匀，调整pH值为6.0±0.1(pH值用磷酸或KOH调节)；

YPD：10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，加入900 mL水中进行溶解，如制备固体培养基加入20 g琼脂粉；使用时加入100 mL 10×20%葡萄糖，如制G418抗性筛选平板，则待灭菌冷却后另加入终浓度0.5 mg/mL或2 mg/mL的G418；

MD：13.4% w/v YNB，4×10^-5% w/v生物素，2% w/v葡萄糖；

BMGY：1% w/v酵母浸粉，2% w/v蛋白胨，l00 mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1.34% w/vYNB，4×10^-5% w/v生物素，1%vol甘油；

BMMY：1% w/v酵母浸粉，2% w/v蛋白胨，l00 mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1.34% w/vYNB，4×10^-5% w/v生物素，0.5%vol甲醇；

2、毕赤酵母染色体提取和重组质粒提取均参考《工业微生物实验技术手册》（诸葛健,王正祥.北京: 中国轻工业出版社, 1994.）或染色体/质粒提取试剂盒说明书描述方法进行。

3、酶活测定及所需溶液配置：

1% 淀粉缓冲液：准确称量1.10 g淀粉于烧杯中，加入20 mL水进行溶解，将煮沸约50mL蒸馏水快速加入烧杯中搅拌，再将其缓慢煮沸至透明，冷却至室温，加入10 mL 0.2 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液，混匀定容至100 mL。

0.2 moL/L pH 5.5的磷酸缓冲液。甲液：准确称量53.65 g十二水合磷酸氢二钠，加入到800 mL去离子水中，完全溶解后定容到1000 mL；乙液：准确称量27.80 g二水合磷酸二氢钠，加入到800 mL去离子水中，完全溶解后定容到1000 mL；准确量取甲液6.50 mL与乙液93.50 mL，混匀，调整pH值为5.5±0.1(pH值用磷酸或NaOH调节)。

10% pH 5.50的磷酸缓冲液：准确量取0.2 moL/LpH5.50的磷酸缓冲液10 mL，加入90 mL去离子水中，混匀。

DNS试剂：准确称取3,5-二硝基水杨酸1.00 g，苯酚0.2 g，亚硫酸钠0.05 g，氢氧化钠1 g，酒石酸钾钠20 g，于去离子水中加热溶解，冷却至室温后定容至100 mL，储于棕色瓶中，室温放置一周后方可绘制标准曲线。

1 mg/mL的葡萄糖液：准确称取绝干葡萄糖50 mg，用去离子水溶解定容至50 mL。

按标准方法配制pH3.0~8.0 20 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH9.0 20mmol/L Tris-HCl缓冲液、pH10.0~11.0 20 mmol/L碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液；

4、pPIC-bbaPT质粒的构建

pMD-bbaP为含有编码大麦β-淀粉酶的人工全合成基因序列的质粒(详细序列信息见序列附录中的SEQ ID No. 2)，pPIC9K为载体质粒。以pMD-bbaP质粒DNA为模板，以分别添加EcoRI、NotI酶切位点的寡核苷酸序列BBA-F（见序列附录中的SEQ ID No. 3）和BBA-R（见序列附录中的SEQ ID No. 4）为引物，PCR扩增出β-淀粉酶成熟肽基因序列。

PCR扩增条件设定为：95℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，2 min；30个循环；72℃，10 min。

将上述PCR产物进行凝胶电泳，若出现1.46 kb左右单一条带则为所需目的片段，用PCR产物纯化回收试剂盒纯化回收备用。

将pPIC9K和纯化回收的目的基因片段均进行EcoRI/NotI双酶切。

37℃酶切1h后，将酶切产物进行凝胶电泳，并使用纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物，再次进行凝胶电泳确定正确后，将两个纯化回收产物进行连接。

从转化平板上挑转化子，于LB平板上划线培养，刮取菌体使用Plasmid Mini KitI试剂盒提质粒，并经PstI酶切后进行凝胶电泳，若pPIC-bbaPT质粒构建正确，酶切后凝胶电泳后出现3.96，2.56，1.8，1.24和1.1 kb共5条带。

5、毕赤酵母重组菌株GS-bbaPT的构建

将构建好的载体质粒pPIC-bbaPT用SalI 37℃酶切1 h进行线性化。

线性化的质粒pPIC-bbaPT进行凝胶电泳确认，然后用纯化回收试剂盒纯化并浓缩备用。

（1）取甘油冻存管毕赤酵母细胞GS115于YPD固体平板上划线分离，30℃培养2天，至单菌落长出；采用电击转化的方法将上述线性化的质粒pPIC-bbaPT转入宿主细胞赤酵母细胞GS115中。

（2）电击后快速向电转杯中加入1 mL预冷的1 mol/L的山梨醇溶液，混匀后取200μL到600μL不等涂于MD平板上；

（3）将MD平板正置30 min后到置于30℃恒温培养箱培养2天，至菌落长出；

6、重组酵母GS-bbaPT的基因鉴定

（1）使用酚氯仿抽提法提取酵母转化子的染色体DNA或按Invitrogen公司（http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/invitrogen.html）毕赤酵母遗传操作手册步骤提取酵母转化子的染色体DNA：

（2）以稀释后的基因组为模板，以BBA-F和BBA-R为引物进行PCR扩增。验证目的基因是否整合到酵母的染色体上。

7、营养缺陷型筛选

毕赤酵母菌 GS115在组氨酸脱氢酶位点（his4）发生突变，表现型His-，自身不能合成组氨酸，重组载体 pPIC-bbaPT 经SalI线性化整合到毕赤酵母菌 GS115染色体后，产生His+Mut+表现型，所有表达质粒都有his4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的MD培养基来筛选转化子，即在不含组氨酸的MD平板上重组酵母菌株可以生长，而毕赤酵母原始菌GS115则不能生长。

线性化后的重组载体pPIC-bbaPT与酵母感受态细胞(现制现用)混匀，按照参数电转化后涂布于MD(不含组氨酸)平板，通过MD(不含组氨酸)培养基筛选目的基因整合入酵母染色体的转化子。

8、淀粉透明圈筛选

重组酵母在甲醇诱导下会分泌表达β-淀粉酶，通过将MD平板上长出的重组转化子用灭过菌的牙签点接至含0.5%~1%淀粉与0.04%苔酚蓝的BMMY平板上，30℃培养2d，观察长出的转化子有无淀粉透明圈及透明圈大小，并筛选淀粉透明圈大的转化子进行下一步筛选。

9、高拷贝筛选

筛选高拷贝是为了使菌株能够异源表达更高浓度的蛋白，本研究采用直接G418抗性筛选法：将前两步筛选获得的转化子点至含0.5 mg/mL的G418-YPD平板上，30℃培养2天，将长势良好的菌落点至2 mg/mL的G418-YPD平板，30℃培养2天之后分别挑取三个长势好的转化子，分离纯化后挑单菌落转接种子培养基，进行摇瓶发酵试验。

10、摇瓶条件下重组酵母的诱导表达

按以下步骤进行：

（1）将通过三步筛选获得的单克隆挑至YPD液体培养基中，30℃ 230 r/min培养过夜；

（2）按1%接种量接入BMGY培养基中，250 r/min，30℃摇床培养至OD600值约为2-4；

（3）室温5000 r/min离心5 min，收集菌体，重悬于BMMY培养基中至OD600值为1.0，250r/min，30℃摇床培养120 h；

（4）每隔24 h取样并向发酵摇瓶中加入0.5%vol的甲醇诱导表达。

（5）室温13000 r/min离心2min收集沉淀和上清，将上清-80℃保存备用。

11、重组菌的β-淀粉酶活力测定

耐热型β-淀粉酶活力测定采用DNS法。酶活定义：1 mL酶液或1 g酶粉在pH5.5、60℃的条件下，1 h水解可溶性淀粉产生1 mg 麦芽糖即为一个酶活力单位，以U/mL表示。取9 mL1.10%淀粉缓冲液于试管中，60℃预热5 min，快速加1 mL酶液（立即计时），60℃恒温水浴准确反应30 min后迅速吸取0.5 mL反应液于装有1.5 mL DNS溶液的25 mL具塞比色管中，沸水浴15 min，以流动水迅速冷却，向其中加入10.5 mL蒸馏水，摇匀，用721分光光度计在550nm下比色。空白用蒸馏水代替酶液。

酶活的计算公式为：U=K×n×2×20×1.9 ( U/mL)

K-----根据标准曲线和OD值计算得出的葡萄糖mg 数；

n-----稀释倍数；

2-----反应30 min换算1h；

20-----将吸取0.5 mL反应液换成10 mL；

1.9-----葡萄糖换算成麦芽糖系数。

12、制糖试验

称取适量麦芽糊精，配置成20%的溶液。调节pH至5.0，预热后按50 U/g (干基)加入β-淀粉酶或按50 U/g (干基)加入β-淀粉酶和0.5 U/g (干基)加入普鲁兰酶，同时采用商品酶β-淀粉酶及真菌α-淀粉酶作为对照，分别按50 U/g (干基)及15 U/g (干基)的加酶量密封，于恒温水浴锅中进行糖化，水浴锅温度维系在55℃，糖化反应50 h。糖化结束后取样，用高效液相色谱进行分析。

13、糖液组分的高压液相色谱分析

将糖化液样本用70%的无水乙醇沉淀预处理，4℃静置4 h后，离心20 min，取上清液用0.45 µm微孔滤膜过滤。

色谱条件：Agilent氨基柱(ZORBAX NH2，4.6×250 mm，5 µm)；示差折光检测器；流动相乙腈:水= 68:32(V/V)；流速0.7 mL/min；柱温室温。麦芽糖标准参照品用纯净水配制成0.5~2.5 mg/mL；以保留时间定性出峰组成，以外标法通过出峰峰面积计算糖液中麦芽糖含量。麦芽糖生成率定义为单位麦芽糊精（绝干）在酶促反应后的麦芽糖生成量，用%(w/w)表示。

具体实施案例如下：

实施例1—β-淀粉酶新基因的合成

按照NCBI公布的大麦β-淀粉酶成熟肽基因碱基序列组成（基因序列信息：GenBank:AF300800.1），结合密码子优化网站http://www.jcat.de提供的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）密码子偏好性数据库进行碱基序列编辑。并采用全基因组合成技术获得密码子优化后的基因片段bbaP，如SEQ ID No.1所示的碱基序列。

实施例2—新型β-淀粉酶基因文库的获得

以实施例1中获得β-淀粉酶基因作为模板克隆获得β-淀粉酶新基因。引物如附录中的BBA-F和BBA-R，低退火温度条件下[95℃ 10min；30×(94℃ 30s; 45~50℃ 1min; 72℃3min）；68℃ 10min]采用低保真的DNA聚合酶扩增获得目的条带bbaPT。将获得的条带克隆入表达载体pPIC9K获得重组质粒pPIC-bbaPT。获得重组质粒在大肠杆菌JM109中保存。作为新型β-淀粉酶基因文库用于后续分泌表达型重组菌的构建和β-淀粉酶高产菌株的筛选。

实施例3—新型β-淀粉酶高产菌株的筛选

将上述重组质粒采用碱裂解法提取制备闭环质粒经SalI线性化后通过电击转化的方法导入宿主菌毕赤酵母GS115中。获得相应的重组菌。并将重组菌涂布β-淀粉酶鉴定平板初步筛选获得透明圈较大的菌株。初筛获得的重组菌接种液体β-淀粉酶筛选培养基30℃好氧培养120 h测定产酶情况。鉴定平板透明圈形成情况和65℃条件下酶活数据见表1。透明圈显著的菌株液体培养后冻藏管-70℃保藏用于后续发酵工艺建立和β-淀粉酶的高效制备。

表1 新型β-淀粉酶重组菌透明圈形成情况

注：+/-，透明圈隐约可以看到但不清晰；+，透明圈清晰但直径小于2 mm；++，透明圈清晰直径大于2 mm小于3 mm；+++，透明圈清晰直径大于3 mm小于5 mm；++++，透明圈清晰直径大于5 mm

实施例4—15 L发酵体系下GS-bbaPT29菌种制备β-淀粉酶

将表1中酶活最高的重组菌GS-bbaPT29接种到YPD种子培养基培养到对数生长期，进一步在15 L发酵罐中进行发酵实验。具体操作如下：甘油管接种YPD平板，30℃培养40 h；单菌落接种YPD液体培养基，250 mL三角瓶装液量30 mL，30℃培养温度下200 r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5 mL上述菌悬液接种二级种子培养基（液体YPD），500 mL三角瓶装液量100 mL，30℃培养温度下200 r/min摇床培养16 h，OD600测定为10时，600 mL用于发酵罐接种；

发酵罐准备：按照11 L初始装液量配制发酵培养基（BSM），氨水调节pH至5.0，搅拌充分后，121℃ 30 min灭菌。同时准备补料瓶等。并配制50%甘油5.5 L用于补料。

接种：接种时，将600 mL种子悬液和131.59 mL 微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0。DO维持20%以上。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4%vol的甘油可以用于菌体生长约20 h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。补料生长阶段：流加50%vol甘油（每升甘油中事先添加了12 mL微量元素母液）。初始流加速度为3.0~9.0 mL/min。当DO低于20%时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1 h，然后进入诱导产酶阶段。诱导产酶阶段：流加甲醇（每升甲醇中添加12 mL微量元素母液）。初始流加速率为1.2~3.6mL/min。当DO低于20%时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6~7.3 mL/min。2h后流加甲醇速率提高至7.3~10.9 mL/min。诱导70~96h后发酵结束。按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，酶活力为247~270 U/mL；其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

实施例5: 在30 m³体系下菌种GS-bbaPT29发酵制备β-淀粉酶

将实施例4的工艺调整为30 m³发酵体系对应的比例。分别完成种子培养，1 L种子液接种15 L一级种子罐，培养12 h后移种3 m³二级种子罐，继续培养12 h后移种30 m³主发酵罐，发酵培养基初始装液量为20 m³培养菌体。诱导产酶70～96 h后发酵结束酶活为280 U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备普鲁兰酶液体成品，或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型普鲁兰酶酶成品，成品酶活为1000～1300 U/g。

将实施例5的工艺调整为30 m3发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。诱导70~96 h后发酵结束。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品。或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型β-淀粉酶成品。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建福大百特生物科技有限公司

<120> 一种新型β-淀粉酶的高效制备方法

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 重组酵母GS-bbaPT29的耐热新型β-淀粉酶编码基因

<400> 1

atgttgccat tggacgctgt ttctgttaac aacagattcg aaaagggtga cgaattgaga 60

gctcaattga gaaagttggt tgaagctggt gttgacggtg ttatggttga cgtttggtgg 120

ggtttggttg aaggtaaggg tccaaaggct tgggactggt ctgcttacaa gcaattgttc 180

cgaggggaag gaaaggctgg tttgaagttg caagctatca tgtctttcca ccaatgtggt 240

ggtaacgttg gtgacgctgt taacatccca atcccacaat gggttagaga cgttggtact 300

tgtgacccag acatcttcta cactgacggt cacggtacta gaaacatcga atacttgact 360

ttgggtgttg acaaccaacc attgttccac ggtagatctg ctgttcaaat gtacgctgac 420

tacatgactt ctttcagaga aaacatgaag gaatttttgg acgctggtgt tatcgttgac 480

atcgaagttg gtttgggtcc agctggtgaa atgagatacc catcttaccc acaatctcac 540

ggttggtctt tcccaggtat cggtgaattt atctgttacg acaagtactt gcaagctgac 600

ttcaaggctg ctgctgctgc tgttggtcac ccagaatggg aatttccaaa cgacgttggt 660

caatacaacg acactccaga aagaactcaa ttcttcagag acaacggtac ttacttgtct 720

gaaaagggta gattcttctt ggcttggtac tctaacaact tgatcaagca cggtgacaga 780

atctacaagt ttcagggcaa ggttttcttg ggttacaagg ttcaattggc tatcaagatc 840

tctggtatcc actggtggta caaggttcca tctcacgctg ctgaattgac tgctggttac 900

tacaacttgc acgacagaga cggttacaga actatcgcta gaatgttgaa gagacacaga 960

gcttctatca acttcacttg tgctgaaatg agagactctg aacaatcttc tcaagctatg 1020

tctgctccag aagaattggt tcaacaagtt ttgtctgctg gttggagaga aggtttgaac 1080

gttgcttgtg aaaacgcttt gccaagatac gacccaactg cttacaacac tatcttgaga 1140

aacgctagac cacacggtat caaccaatct ggtccaccag aacacaagtt gttcggtttc 1200

acttacttga gattgtctaa ccaattggtt gaaggtcaaa actacgctaa cttcaagact 1260

ttcgttgaca gaatgcacgc taacttgcca agagacccat acgttgaccc aatggctcca 1320

ttgccaagat ctggtccaga aatctctatc gaaatgatct tgcaagctgc tcaaccaaag 1380

ttgcaaccat tcccattcca agaacacact gacttgccag ttggtccaac tggtggtatg 1440

ggtggtcaag ctgaaggtcc aacttgtggt atgggtggtc aagttaaggg tccaactggt 1500

ggtatgggtg gtcaagctga agacccaact tctggtatgg gtggtgaatt gccagctact 1560

atgtaa 1566

<210> 2

<211> 1566

<212> DNA

<213> pMD-bbaP

<400> 2

atgttgccat tggacgctgt ttctgttaac aacagattcg aaaagggtga cgaattgaga 60

gctcaattga gaaagttggt tgaagctggt gttgacggtg ttatggttga cgtttggtgg 120

ggtttggttg aaggtaaggg tccaaaggct tacgactggt ctgcttacaa gcaattgttc 180

gaattggttc aaaaggctgg tttgaagttg caagctatca tgtctttcca ccaatgtggt 240

ggtaacgttg gtgacgctgt taacatccca atcccacaat gggttagaga cgttggtact 300

tgtgacccag acatcttcta cactgacggt cacggtacta gaaacatcga atacttgact 360

ttgggtgttg acaaccaacc attgttccac ggtagatctg ctgttcaaat gtacgctgac 420

tacatgactt ctttcagaga aaacatgaag gaatttttgg acgctggtgt tatcgttgac 480

atcgaagttg gtttgggtcc agctggtgaa atgagatacc catcttaccc acaatctcac 540

ggttggtctt tcccaggtat cggtgaattt atctgttacg acaagtactt gcaagctgac 600

ttcaaggctg ctgctgctgc tgttggtcac ccagaatggg aatttccaaa cgacgttggt 660

caatacaacg acactccaga aagaactcaa ttcttcagag acaacggtac ttacttgtct 720

gaaaagggta gattcttctt ggcttggtac tctaacaact tgatcaagca cggtgacaga 780

atcttggacg aagctaacaa ggttttcttg ggttacaagg ttcaattggc tatcaagatc 840

tctggtatcc actggtggta caaggttcca tctcacgctg ctgaattgac tgctggttac 900

tacaacttgc acgacagaga cggttacaga actatcgcta gaatgttgaa gagacacaga 960

gcttctatca acttcacttg tgctgaaatg agagactctg aacaatcttc tcaagctatg 1020

tctgctccag aagaattggt tcaacaagtt ttgtctgctg gttggagaga aggtttgaac 1080

gttgcttgtg aaaacgcttt gccaagatac gacccaactg cttacaacac tatcttgaga 1140

aacgctagac cacacggtat caaccaatct ggtccaccag aacacaagtt gttcggtttc 1200

acttacttga gattgtctaa ccaattggtt gaaggtcaaa actacgctaa cttcaagact 1260

ttcgttgaca gaatgcacgc taacttgcca agagacccat acgttgaccc aatggctcca 1320

ttgccaagat ctggtccaga aatctctatc gaaatgatct tgcaagctgc tcaaccaaag 1380

ttgcaaccat tcccattcca agaacacact gacttgccag ttggtccaac tggtggtatg 1440

ggtggtcaag ctgaaggtcc aacttgtggt atgggtggtc aagttaaggg tccaactggt 1500

ggtatgggtg gtcaagctga agacccaact tctggtatgg gtggtgaatt gccagctact 1560

atgtaa 1566

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> BBA-F

<400> 3

cggaattcga caacgtcttc ccagacaag 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> BBA-R

<400> 4

ttgcggccgc ctattagtcg aatgggtta 29

<210> 5

<211> 521

<212> PRT

<213> 重组菌GS-bbaPT29中bbaPT基因编译蛋白的氨基酸序列

<400> 5

Met Leu Pro Leu Asp Ala Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly

1 5 10 15

Asp Glu Leu Arg Ala Gln Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp

20 25 30

Gly Val Met Val Asp Val Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro

35 40 45

Lys Ala Trp Asp Trp Ser Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Arg Gly Glu Gly

50 55 60

Lys Ala Gly Leu Lys Leu Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly

65 70 75 80

Gly Asn Val Gly Asp Ala Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg

85 90 95

Asp Val Gly Thr Cys Asp Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly

100 105 110

Thr Arg Asn Ile Glu Tyr Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu

115 120 125

Phe His Gly Arg Ser Ala Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser

130 135 140

Phe Arg Glu Asn Met Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp

145 150 155 160

Ile Glu Val Gly Leu Gly Pro Ala Gly Glu Met Arg Tyr Pro Ser Tyr

165 170 175

Pro Gln Ser His Gly Trp Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys

180 185 190

Tyr Asp Lys Tyr Leu Gln Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val

195 200 205

Gly His Pro Glu Trp Glu Phe Pro Asn Asp Val Gly Gln Tyr Asn Asp

210 215 220

Thr Pro Glu Arg Thr Gln Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser

225 230 235 240

Glu Lys Gly Arg Phe Phe Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys

245 250 255

His Gly Asp Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly Lys Val Phe Leu Gly Tyr

260 265 270

Lys Val Gln Leu Ala Ile Lys Ile Ser Gly Ile His Trp Trp Tyr Lys

275 280 285

Val Pro Ser His Ala Ala Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His

290 295 300

Asp Arg Asp Gly Tyr Arg Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg

305 310 315 320

Ala Ser Ile Asn Phe Thr Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Ser

325 330 335

Ser Gln Ala Met Ser Ala Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser

340 345 350

Ala Gly Trp Arg Glu Gly Leu Asn Val Ala Cys Glu Asn Ala Leu Pro

355 360 365

Arg Tyr Asp Pro Thr Ala Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro

370 375 380

His Gly Ile Asn Gln Ser Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe

385 390 395 400

Thr Tyr Leu Arg Leu Ser Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Ala

405 410 415

Asn Phe Lys Thr Phe Val Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp

420 425 430

Pro Tyr Val Asp Pro Met Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile

435 440 445

Ser Ile Glu Met Ile Leu Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Pro Phe

450 455 460

Pro Phe Gln Glu His Thr Asp Leu Pro Val Gly Pro Thr Gly Gly Met

465 470 475 480

Gly Gly Gln Ala Glu Gly Pro Thr Cys Gly Met Gly Gly Gln Val Lys

485 490 495

Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Asp Pro Thr Ser Gly

500 505 510

Met Gly Gly Glu Leu Pro Ala Thr Met

515 520

Claims

1.一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，步骤（4）所述巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达、分泌β-淀粉酶的毕赤酵母基因工程菌株，其染色体DNA上整合一条耐热新型β-淀粉酶编码基因。

3. 根据权利要求1所述的一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的重组酵母GS-bbaPT29的耐热新型β-淀粉酶编码基因如SEQ ID No.1所示。

4. 根据权利要求1所述的一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，所述步骤（6）的发酵条件为：30m³大罐发酵生产，发酵培养基为BSM培养基，每升BSM培养基中加入12mL微量元素PTM1母液，发酵温度为30℃，pH维持5.0；DO维持20%以上；流加甲醇诱导产酶70~96h后发酵结束；按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280 U/mL。