CN114921487A

CN114921487A - 一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法

Info

Publication number: CN114921487A
Application number: CN202210673650.7A
Authority: CN
Inventors: 游锡火; 王玉万; 薛栋升; 夏胜; 曾徐浩; 蒋慧; 胡燕; 梁大明; 田美华; 姜本荣; 齐义清; 沈力
Original assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Current assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN114921487B

Abstract

本发明公开了一种重组表达载体，包括pPIC9K‑amy载体和pGAPZA‑PDI载体，其中，pPIC9K‑amy载体由α‑淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA‑PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成以所述引物构建重组毕赤酵母菌株，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α‑淀粉酶的毕赤酵母菌。

Description

一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵技术领域，更具体地说是涉及一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法。

背景技术

淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能量需求的60％～80％。幼龄动物消化系统发育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。

目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采用食品加工、化纤，印染等工业用酶。中温α-淀粉酶是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为70～80℃，pH值5.0以下失活严重。动物生理环境温度一般为37～42℃，胃内pH值较低，中温淀粉酶在动物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温度比中温淀粉酶要低20～30℃，因此，研究开发低温淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。

饲用淀粉酶应具备以下几个条件:在动物体温(37～42℃)的温度条件下能发挥高的活性；最适pH值与消化道内食糜的pH相一致；对淀粉有高的酶解效率(内切酶)；具有良好的稳定性(在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性)。

α-淀粉酶最适温度为35℃左右，与饲用淀粉酶标准相似，如果能通过发酵工程策略，将表达α-淀粉酶的基因转化至菌种中，提高毕赤酵母外源蛋白表达量，则可以提高专用α-淀粉酶的产量。

因此，如何构建一种重组表达载体、高效表达α-淀粉酶的毕赤酵母菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组表达载体、应用、重组菌株和发酵方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组表达载体，包括pPIC9K-amy载体和pGAPZA-PDI载体，其中，pPIC9K-amy载体由α-淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA-PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，过程为：将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株。

作为上述技术方案优选的技术方案，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中的过程为：以SEQ ID NO.6所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为引物，扩增低温α-淀粉酶的目的基因amy，构建表达载体pPIC9K-amy，将载体线性化后，整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建了重组菌株。

作为上述技术方案优选的技术方案，将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中的过程为：以SEQ ID NO.8所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述序列为引物，扩增伴侣因子PDI的目的基因，构建表达载体pGAPZA-PDI，将载体线性化后，整合到重组菌株中。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种毕赤酵母菌株，所述菌株由上述任一所述的构建方法构建得到。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护任一所述的构建方法构建得到的毕赤酵母在产饲用低温α-淀粉酶中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，过程包括：将任一得到的毕赤酵母菌株活化，制成种子液，接种到BMGY培养基中，30℃、250rpm培养20h，离心收集菌体，接种到BMGY诱导培养基中，于30℃、250rpm诱导培养120h取样检测相关指标，并每隔24h添加2％(V/V)甲醇，将发酵液离心后，去除菌体沉淀，发酵液即为低温α-淀粉酶。

作为与上述技术方案优选的技术方案，1L BMGY生长培养基包括：1％酵母粉、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％(V/V)甘油，10％PBS pH 6.0缓冲溶液；

1L BMMY诱导培养基包括：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，10％PBS缓冲溶液。

综上所述，本发明达到的技术效果是：本发明主要采用共表达分子伴侣策略提高低温α-淀粉酶在毕赤酵母中的分泌表达水平，相对于初始的基因工程菌GS115-amy而言，本发明的基因工程菌株GS115-amy-PDI在摇瓶发酵时酶活提高了1.73倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pPIC9K-amy载体图谱。

图2附图为本发明pGAPZA-PDI载体图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

GS115菌株购自北京百奥莱博科技有限公司；质粒购自丰晖生物。

琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核酸染料4S Green、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、甘油、二硫苏糖醇、考马斯亮蓝G250、无水乙醇、冰醋酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N，N-四甲基乙二胺、蔗糖、甘油、均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨苄青霉素、博莱霉素、G418购自赛国生物科技有限责任公司；酵母提取物、蛋白胨、甲醇、核酸Marker、蛋白Marker购自赛默飞世尔科技公司；一般化学试剂氯化钠，山梨醇购自国药集团有限公司。2xTaq Plus PCR MasterMix试剂盒、质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

EcoR I和AvrII、KpnI、Sac I限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司。

实施例1：重组毕赤酵母GS115-amy菌株构建

(1)重组表达质粒pPIC9K-amy载体的构建

根据NCBI处获得的Pseudoalteromonas arcticaα-淀粉酶氨基酸序列SEQ IDNO.5(GenBank：WP_170071014.1)经过毕赤酵母密码子优化得到SEQ ID NO.6所示的基因序列，伴侣因子PDI氨基酸序列SEQ ID NO.7经过毕赤酵母密码子优化得到SEQ ID NO.8所示的基因序列，由擎科生物进行全基因合成连接在pUC57克隆载体上。

上游引物PF1：5’-cggaattcATGACGCAGA AGCAATGGTAT-3’；SEQ ID NO.1；带下划线部分为EcoRI酶切位点；

下游引物PR1：5’-gccctaggGCACTTGGCATAAAAGCAAGC-3’；SEQ ID NO.2；带下划线部分为AvrII酶切位点。

以合成的基因组为模板，用天根生化科技有限公司生产的2xTaq Plus PCRMasterMix试剂盒扩增α-淀粉酶目的基因。PCR反应体系如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入25μL 2xTaq Plus PCR MasterMix，2.5μL(10μM)上游引物PF1，2.5μL(10μM)下游引物PR1，1μL模板，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)94℃预变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)55℃退火30sec，(4)72℃延伸2min，步骤(2)～(4)共进行30个循环。4℃保存PCR产物。PCR结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，凝胶浓度为1％。切胶回收，用天根生化科技有限公司生产的凝胶回收试剂盒处理(过程按说明书进行)，得到PCR扩增产物即α-淀粉酶目的基因，-20℃下保存。

将实验室保存有质粒pPIC9K的大肠杆菌在含Amp的LB培养基进行活化，传代培养，当OD值达到1.0左右时，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取(提取步骤按说明书进行)，获得pPIC9K表达载体，进行下一步酶切反应。

获得α-淀粉酶目的基因和pPIC9K表达载体后，分别在PCR小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶(购自NEB公司的EcoRI和AvrII，使用规格和方法按说明书进行)，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和pPIC9K置于37℃下分别进行双酶切。

α-淀粉酶基因片段双酶切体系：超纯水11μL，EcoRI 1μL，AvrII 1μL，Buffer 3μL，α-淀粉酶目的基因14μL。

pPIC9K双酶切体系：pPIC9K质粒43μL，EcoRI 1μL，AvrII 1μL，Buffer 5μL。

使用EcoRI和AvrII限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入LoadingBuffer终止反应，并根据天根生化科技有限公司生产的胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。

经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过DNA连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的α-淀粉酶和pPIC9K双酶切产物置于同一个PCR小管中，连接反应采用10μL体系：将3μL目的基因酶切产物，1μL pPIC9K质粒酶切产物，1μL T4 DNA连接酶和5μL超纯水混匀，在16℃下连接过夜。将连接产物转化进大肠杆菌扩增测序，将成功连接的质粒命名为pPIC9K-amy，载体图谱见图1。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉。

(2)毕赤酵母GS115感受态的制备

将实验室保存的GS115野生菌接种至10mLYPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h，得到活化后的GS115。取50μL活化后的GS115至100mL YPD培养基中，30℃、200rpm摇瓶培养至菌体浓度OD₆₀₀在1.3-1.5左右，将全部菌液在4℃、5000rpm离心5min，弃上清，加入4℃冰箱预冷的无菌水至终体积30mL，重悬菌体，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；重复操作一次；用4℃预冷的1mol/L的山梨醇25mL重悬菌体，4℃、5000rpm离心5min，去上清，重复操作一次；用1mL、1mol/L山梨醇重悬菌体并分装至EP管中，每管分装80uL，以备下一步实验。

YPD液体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白陈20g/L，葡萄糖20g/L。

(3)重组菌株GS115-amy的构建

将步骤(1)连接成功并提取出的质粒pPIC9K-amy用限制性内切酶Sac I线性化，在步骤(2)制备的80uL酵母感受态细胞中加入线性化的质粒(5-10μg)，转入冰预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置10min后。2000V，5ms电击一次，立即加入0.5mL 1mol/L的冰预冷山梨醇混匀，将其转移至无菌的离心管中，30℃静置2h，加入0.5mL YPD培养基，30℃、50rpm培养2h，得到混合液；将混合液3000rpm离心5min，去掉部分上清，剩余的用移液枪吹打重悬，涂布于MD平板上。30℃静置培养5～7天，待长出菌落后，将含量分别为0.5g/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L的含G418的YPD平板用记号笔划分成小格并编号。用无菌牙签从MD平板上挑取微量重组子到G418含量不同的平板上。30℃静置培养3～5天，每日检查不同G418浓度的YPD平板上重组子的生长情况，根据生长状况挑取多拷贝的菌株。

最后挑取稳定整合的重组子，在MM和MD平板上先后划线，30℃静置培养48h。在两种平板上都能正常生长的菌株为Mut⁺(Methanol utilization plus)表型，在MD平板上生长正常，在MM平板上不生长或生长缓慢的菌株为Mut^s(Methanol utilization slow)表型，筛选甲醇利用表型。筛选得到可以用甲醇诱导表达外源α-淀粉酶的工程菌株GS115-amy。

MD平板：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖

MM平板：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；5mL甲醇

实施例2：重组毕赤酵母GS115-amy-PDI菌株构建

(1)重组表达质粒pGAPZA-PDI载体的构建

上游引物PF2：5’-cggaattcATGAAACTACTGTCCCTTGCACT-3’；SEQ ID NO.3；带下划线部分为EcoRI酶切位点；

下游引物PR2：5’-cgggtaccCAATTCATCGTGGTTTTTAGTTTG-3’；SEQ ID NO.4；带下划线部分为KpnI酶切位点。

以合成的基因组为模板，用实施例1中的PCR方法，以引物PF2、PR2扩增得到伴侣因子PDI目的基因。

将实验室保存有质粒pGAPZA的大肠杆菌在含博莱霉素(zeocin)的LB培养基进行活化，传代培养，当OD值达到1.0左右时，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取(提取步骤按说明书进行)，获得pGAPZA表达载体，进行下一步酶切反应。

获得伴侣因子PDI目的基因和pGAPZA表达载体后，按照实施例1中标准的酶切酶连体系进行目的基因与载体的连接，将连接产物转化进大肠杆菌扩增测序，将成功连接的质粒命名为pGAPZA-PDI，载体图谱见图2。

(2)毕赤酵母GS115-amy感受态的制备

将实施例2重组成功的GS115-amy接种至10mLYPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h，得到活化后的GS115-amy。取50μL活化后的GS115-amy至100mL YPD培养基中，30℃、200rpm摇瓶培养至菌体浓度OD₆₀₀在1.3-1.5左右，将全部菌液在4℃、5000rpm离心5min，弃上清，加入4℃冰箱预冷的无菌水至终体积30mL，重悬菌体，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；重复操作一次；用4℃预冷的1mol/L的山梨醇25mL重悬菌体，4℃、5000rpm离心5min，去上清，重复操作一次；用1mL1mol/L山梨醇重悬菌体并分装至EP管中，每管分装80uL，以备下一步实验。

(3)重组菌株GS115-amy-PDI的构建

将实施例2步骤(1)连接成功并提取出的质粒pGAPZA-PDI用限制性内切酶AvrII线性化，往实施例2步骤(2)制备的80uL酵母感受态细胞中加入线性化的质粒(5-10μg)，用电转化的方法将目的基因转化入酵母细胞中，将转化后的混合液培养一段时间后，涂布到含有博来霉素的YPD平板上，以GAP promoter为同源臂，整合到毕赤酵母染色体组上。整合成功的可在含博来霉素的YPD平板上生长。将长出的菌落连续传代后进行PCR鉴定，鉴定成功的为GS115-amy-PDI重组菌株。

实施例3：重组工程菌的发酵

将重组毕赤酵母GS115-amy，GS115-amy-PDI进行活化后，制成种子液，进行下一步发酵实验。

取适量种子液分别接种到含50mL BMGY的250mL锥形瓶中，于30℃、250rpm培养20h，离心收集菌体后，转入含150mL BMMY的500mL锥形瓶中，诱导起始pH为5，培养起始OD_6oo＝l，于30℃、250rpm诱导培养120h取样检测相关指标，并每隔24h添加2％(V/V)甲醇。将发酵液离心后，去除菌体沉淀，发酵液即为酶溶液。

BMGY生长培养基(L)：1％酵母粉、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％(V/V)甘油，10％PBS(pH 6.0)缓冲溶液

BMMY诱导培养基(L)：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，10％PBS(pH6.0)缓冲溶液

实施例4：工程菌产α-淀粉酶的酶活分析

(1)试剂配置

0.05mol/L硫代硫酸钠：将13g Na₂S₂O₃.5H₂O和0.1g无水碳酸钠溶解定容至1000ml

费林试剂：

铜溶液:硫酸铜34.66g溶解在水中，定容至500mL。

酒石酸钾钠碱溶液:酒石酸钾钠173g和氢氧化钠50g溶解在水中，定容至500mL。

使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。

1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)

1mol/L乙酸钠溶液:三水合乙酸钠溶解在水中，定容至250ml；

1mol/L乙酸溶液:冰乙酸15ml溶解在水中，定容至250ml；

将1mol/L乙酸钠溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，调pH值至5.0。

30％碘化钾溶液：

将碘化钾150g溶解于350ml水中，保存在褐色试剂瓶中。

25％硫酸溶液：硫酸125g溶于373ml水中。

可溶性淀粉溶液(pH值5.0)

称取0.5g的可溶性淀粉，缓慢加入到50ml水中，煮沸5min，冷却后，加入1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH值5.0)5ml，用水定容至100ml。

(2)测定方法

将可溶性淀粉溶液加到100ml三角瓶中，置于35℃恒温水浴中。预热10～15min。加入稀释酶液，准确加热30min后，加入费林试剂使酶失活。将三角烧瓶直接在电炉上加热2min后，立即放在自来水中冷却。随后，加入30％碘化钾溶液和25％硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点T30ml。

空白对照试验:以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T₀，临近终点时，加入1％可溶性淀粉溶液1～2滴，以蓝色消失作为滴定终点。

酶活力单位定义为:1g固体酶粉(或1ml液体酶)，于35℃，pH值5.0条件下，反应30min，反应液中产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位。

淀粉酶活力(U/ml)＝(T₀-T₃₀)×f×1.62×1/10×n

式中:

T₃₀—酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

T₀—空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

f—0.05mol硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数；

1.62—换算系数；

1/10—该分析方法的常数(相当于10mg葡萄糖的还原糖)；

n—样品的稀释倍数。

经多次发酵试验，摇瓶诱导发酵120h后，重组菌GS115-amy的酶活为840U/mL，含伴侣因子的重组菌GS115-amy-PDI的酶活为1450U/mL，相比于不含伴侣因子的，酶活提高了1.73倍左右。

对比例1

除伴侣因子PDI的氨基酸序列为SEQID No.9(D:GAC，N:AAT)编码序列为SEQIDNo.10外，其它同实施例1，测定重组菌GS115-amy的酶活为840U/mL，含伴侣因子的重组菌GS115-amy-PDI的酶活为1050U/mL。

对比例2

除伴侣因子PDI的氨基酸序列为SEQID No.11，编码序列为SEQID No.12外，其它同实例1，测定重组菌GS115-amy的酶活为840U/mL，含伴侣因子的重组菌GS115-amy-PDI的酶活为1159U/mL。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中农华威生物制药（湖北）有限公司

<120> 一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacgcaga agcaatggta t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacttggca taaaagcaag c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaactac tgtcccttgc act 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caattcatcg tggtttttag tttg 24

<210> 5

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Gln Lys Gln Trp Tyr Lys Gly Ala Val Ile Tyr Gln Val Tyr

1 5 10 15

Pro Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Asp Gly Ile Gly Asp Leu Lys

20 25 30

Gly Ile Ile Asn Arg Ile Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Gly Val Asp Ala

35 40 45

Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Lys Asp Phe Gly Tyr

50 55 60

Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Asp Ile Asp Pro Leu Phe Gly Asp Leu Asn

65 70 75 80

Asp Phe Asp Glu Leu Ile Ser Gln Ala His Asp Arg Asn Ile Lys Ile

85 90 95

Ile Ile Asp Gln Val Leu Ser His Thr Ser Asp Gln His Gln Trp Phe

100 105 110

Thr Asp Ser Arg Glu Asn Gln Asn Asn Asp Lys Ala Asp Trp Tyr Val

115 120 125

Trp Ala Glu Ala Lys Asn Asp Gly Thr Ala Pro Asn Asn Trp Leu Ser

130 135 140

Ile Phe Gly Gly Gly Ala Trp Gln Trp Glu Pro Arg Arg Gly Gln Tyr

145 150 155 160

Tyr Leu His Asn Phe Leu Thr Glu Gln Pro Asp Leu Asn Phe His Asn

165 170 175

Pro Asp Val Arg Gln Ala Val Leu Asp Asn Val Glu Phe Trp Leu Lys

180 185 190

Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Asn Phe Cys Tyr His

195 200 205

Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Lys Asp Lys Arg Gln

210 215 220

Gly Arg Gly Phe Ser Glu Asp Asn Pro Tyr Ala Phe Gln Tyr His Tyr

225 230 235 240

Tyr Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Ile Glu Phe Met Gln Asp Ile Arg

245 250 255

Thr Leu Leu Asn Lys Tyr Pro Gly Thr Val Ser Leu Gly Glu Ile Ser

260 265 270

Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Met Ala Gln Tyr Thr Gln Gly Gly Asp

275 280 285

Lys Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Thr Asn Asp Tyr Ser

290 295 300

Ser Glu Tyr Ile Arg Thr Thr Val Gln Thr Leu Glu Gln Arg Met Thr

305 310 315 320

Glu Gly Trp Pro Cys Trp Ala Phe Ser Asn His Asp Val Glu Arg Val

325 330 335

Ala Ser Arg Trp Ser Glu Asn Gly Glu Ile Asn Pro Gln Gln Cys Lys

340 345 350

Met Leu Thr Ala Leu Leu Ala Ser Leu Arg Gly Ser Val Cys Val Tyr

355 360 365

Gln Gly Glu Glu Leu Gly Leu Gly Glu Ala Ser Val Ala Phe Glu Asp

370 375 380

Leu Gln Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Asn Phe Lys Gly Arg

385 390 395 400

Asp Gly Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Glu Gln Ala Asp Ser Pro His

405 410 415

Ala Gly Phe Ser Asp Val Lys Pro Trp Leu Pro Val Asp Asp Ala His

420 425 430

Lys Gln Gln Ser Val Ala Val Gln Thr Asn Asp Ser Asn Ser Ile Leu

435 440 445

Asn Ala Tyr Arg Glu Phe Met Ala Trp Arg Lys Ser Gln Thr Val Leu

450 455 460

Leu Glu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Glu Thr Pro Glu Pro Val Leu Ala

465 470 475 480

Phe Tyr Arg Thr Leu Gly Pro Gln Lys Met Leu Cys Ile Phe Asn Leu

485 490 495

Ser Ser Gln Gln Thr Ser Ile Asp Met Pro Thr Ser Ile Val Lys Glu

500 505 510

Tyr Asn Glu Leu Ser His His Ser Ala Lys Leu Ser Gln Asp Thr Leu

515 520 525

Thr Leu Glu Pro Phe Ala Cys Phe Tyr Ala Lys Cys

530 535 540

<210> 6

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacgcaga agcaatggta taaaggtgct gtcatttatc aagtttaccc tagatcattt 60

caagatagta ataacgacgg tattggagat ttaaaaggta taattaacag aattgactac 120

attaagtcct tgggtgtcga tgctatctgg atttccccat tcttcaagtc tccaatgaag 180

gatttcggtt atgacatctc agactatcga gatattgatc cattgtttgg cgatttgaac 240

gatttcgatg aacttatctc tcaagctcat gacagaaaca ttaaaattat catcgaccaa 300

gttctatccc ataccagtga ccagcatcag tggttcactg actccagaga aaaccaaaat 360

aacgataaag ctgattggta cgtttgggcc gaagctaaga acgatggaac tgctcctaat 420

aactggttgt ctattttcgg tggtggtgct tggcaatggg agccaagaag aggacaatac 480

taccttcaca acttcttgac agaacaaccc gatcttaatt tccataaccc cgacgtaagg 540

caagcagttc tagacaatgt cgagttctgg ctgaagaaag gagtagacgg ttttaggttg 600

gatgctatta acttttgtta ccacgatgca cagttgaggg ataaccctgc aaagccaaaa 660

gataaaagac agggtagagg tttctctgaa gacaatccat acgcctttca gtaccattac 720

tataacaaca ctcagccaga gaacatcgaa tttatgcagg acatccgaac tcttttgaat 780

aaatacccag gaactgtgtc cttgggtgag atttcttctg aagactcctt agctactatg 840

gcacagtaca ctcaaggtgg cgataaattg catatgggat actcatttga attgttgact 900

aatgattact cctcagagta cattagaact actgtacaaa ctttggaaca acgtatgact 960

gagggatggc catgttgggc tttttcaaat catgacgttg aaagagttgc ttctaggtgg 1020

tctgagaacg gtgaaattaa cccacaacag tgtaagatgt taactgcttt gctagcttct 1080

ttaagaggtt ccgtttgcgt gtaccaaggt gaagaattgg gtttgggtga ggcctctgtt 1140

gcttttgaag atcttcagga tccatacgga attacttttt ggccaaattt caagggcaga 1200

gacggttgta gaactcctat gccatgggag caggctgact caccacacgc tggtttctca 1260

gacgtcaaac cctggttgcc agtggatgat gctcataaac agcaatcagt tgccgtccaa 1320

actaatgact ctaactccat ccttaacgct tatcgtgaat ttatggcttg gcgtaaatcc 1380

cagacagtcc ttttagaggg tgacatagag ttcattgaaa ccccagaacc tgttcttgct 1440

ttttatagaa ctttaggacc tcaaaagatg ctgtgtatat tcaatttgtc atcacaacag 1500

acatctattg atatgcctac atcaattgtg aaggagtata acgagttatc ccaccattct 1560

gccaagttat cccaggacac cctgactctt gagcccttcg cctgcttcta tgcaaaatgt 1620

taa 1623

<210> 7

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Leu Leu Ser Leu Ala Leu Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Asp

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Thr Pro Lys Asp Asp Val Ile Gln Leu Asn Ala Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Asp Val Val Phe Asn Ser Asn Tyr Ser Ser Val Val Glu Phe

35 40 45

Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Asn Leu Lys Asn Pro Phe Lys

50 55 60

Lys Ala Ala Ala Val Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Ala Ala Ile Ala

65 70 75 80

Cys Leu Ala Ala Glu Ala Lys Lys Leu Cys Ser Asp Tyr Arg Ile Gln

85 90 95

Gly Phe Pro Thr Ile Met Val Phe Arg Pro Pro Lys Phe Asp Pro Thr

100 105 110

Ser Ser Thr Asn Arg Arg Ser Gly Ala His Ala Asn Glu Val Tyr Ser

115 120 125

Gly Ala Arg Asp Thr Lys Ser Ile Val Glu Phe Gly Val Ser Arg Ile

130 135 140

Lys Asn Tyr Val Lys Arg Val Ser Pro Asn Asn Ile Asn Gln Thr Leu

145 150 155 160

Gly Asn Ser Glu Lys Thr Gln Leu Leu Leu Val Thr Asp Lys Ala Lys

165 170 175

Pro Ser Ala Leu Ile Lys Ser Ile Ala Leu Asp Phe Leu Asn Asp Ile

180 185 190

Glu Ser Phe Tyr Tyr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Lys Lys Ala Leu Thr

195 200 205

Thr Arg Leu Glu Glu Tyr Gln Gln Ser Phe Ser Gly Glu Ser Ile Thr

210 215 220

Ser Pro Ser Ile Leu Val Leu His Glu Asn Glu Ile His Ile Phe Asp

225 230 235 240

Gly Lys Leu Asp Lys Leu Ser Ile Ser Lys Phe Leu Ala Glu Phe Ser

245 250 255

Thr Pro Leu Glu Gly Pro Leu Ser Lys Arg Gly Lys Phe Leu Glu His

260 265 270

Ile Arg Arg Gly Ile Lys Pro Gly Arg Lys Ala Lys Lys Gly Lys Lys

275 280 285

Gly Lys Gln Thr Lys Asn His Asp Glu Leu

290 295

<210> 8

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaatagttgt tatccctggc tttgctggta tctctggtta gtgccgatac tttctataca 60

ccaaaggatg atgttataca acttaacgca tacaacttta aggacgttgt gtttaactct 120

aactattctt ctgtcgttga gttttatgct ccctggtgtg gacactgcca gaacttgaaa 180

aatccattca aaaaagctgc cgccgtttca aaagattact tgcaggttgc tgccattgca 240

tgtcttgctg ctgaggctaa gaaactgtgt tctgactacc gtatacaagg atttccaacc 300

attatggttt tcagaccacc taaatttgac cctacttctt caactaatag aaggtctggc 360

gctcatgcta acgaagttta ttctggagca agagacacaa aatccattgt tgaatttgga 420

gtttctagaa tcaagaatta tgttaagaga gtatctccta acaacattaa ccagacacta 480

ggtaattctg aaaagactca gttgcttcta gttacagata aagcaaaacc ttctgcccta 540

ataaagtcaa tcgccctaga tttcctgaac gatattgaaa gtttttacta cccatttaat 600

gataaaacta aaaaagcact gactactcgt ttagaagaat atcagcagtc cttctctggt 660

gaatcaatca catctcccag tattttggtg ctgcacgaaa atgagattca tatttttgat 720

ggtaagttag ataagttgtc tatctcaaag ttcttggctg agttttctac cccactagaa 780

ggtccattat ctaagagagg aaaatttctt gagcatatac gaagaggaat aaaaccaggc 840

aggaaggcta agaagggtaa gaagggtaag cagacaaaga atcatgacga actttaa 897

<210> 9

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Lys Leu Leu Ser Leu Ala Leu Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Asp

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Thr Pro Lys Asp Asp Val Ile Gln Leu Asn Ala Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Asp Val Val Phe Asn Ser Asn Tyr Ser Ser Val Val Glu Phe

35 40 45

Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Asn Leu Lys Asn Pro Phe Lys

50 55 60

Lys Ala Ala Ala Val Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Ala Ala Ile Asp

65 70 75 80

Cys Asp Ala Ala Glu Asn Lys Lys Leu Cys Ser Asp Tyr Arg Ile Gln

85 90 95

Gly Phe Pro Thr Ile Met Val Phe Arg Pro Pro Lys Phe Asp Pro Thr

100 105 110

Ser Ser Thr Asn Arg Arg Ser Gly Ala His Ala Asn Glu Val Tyr Ser

115 120 125

Gly Ala Arg Asp Thr Lys Ser Ile Val Glu Phe Gly Val Ser Arg Ile

130 135 140

Lys Asn Tyr Val Lys Arg Val Ser Pro Asn Asn Ile Asn Gln Thr Leu

145 150 155 160

Gly Asn Ser Glu Lys Thr Gln Leu Leu Leu Val Thr Asp Lys Ala Lys

165 170 175

Pro Ser Ala Leu Ile Lys Ser Ile Ala Leu Asp Phe Leu Asn Asp Ile

180 185 190

Glu Ser Phe Tyr Tyr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Lys Lys Ala Leu Thr

195 200 205

Thr Arg Leu Glu Glu Tyr Gln Gln Ser Phe Ser Gly Glu Ser Ile Thr

210 215 220

Ser Pro Ser Ile Leu Val Leu His Glu Asn Glu Ile His Ile Phe Asp

225 230 235 240

Gly Lys Leu Asp Lys Leu Ser Ile Ser Lys Phe Leu Ala Glu Phe Ser

245 250 255

Thr Pro Leu Glu Gly Pro Leu Ser Lys Arg Gly Lys Phe Leu Glu His

260 265 270

Ile Arg Arg Gly Ile Lys Pro Gly Arg Lys Ala Lys Lys Gly Lys Lys

275 280 285

Gly Lys Gln Thr Lys Asn His Asp Glu Leu

290 295

<210> 10

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaagttgt tatccctggc tttgctggta tctctggtta gtgccgatac tttctataca 60

ccaaaggatg atgttataca acttaacgca tacaacttta aggacgttgt gtttaactct 120

aactattctt ctgtcgttga gttttatgct ccctggtgtg gacactgcca gaacttgaaa 180

aatccattca aaaaagctgc cgccgtttca aaagattact tgcaggttgc tgccattgac 240

tgtgacgctg ctgagaataa gaaactgtgt tctgactacc gtatacaagg atttccaacc 300

attatggttt tcagaccacc taaatttgac cctacttctt caactaatag aaggtctggc 360

gctcatgcta acgaagttta ttctggagca agagacacaa aatccattgt tgaatttgga 420

gtttctagaa tcaagaatta tgttaagaga gtatctccta acaacattaa ccagacacta 480

ggtaattctg aaaagactca gttgcttcta gttacagata aagcaaaacc ttctgcccta 540

ataaagtcaa tcgccctaga tttcctgaac gatattgaaa gtttttacta cccatttaat 600

gataaaacta aaaaagcact gactactcgt ttagaagaat atcagcagtc cttctctggt 660

gaatcaatca catctcccag tattttggtg ctgcacgaaa atgagattca tatttttgat 720

ggtaagttag ataagttgtc tatctcaaag ttcttggctg agttttctac cccactagaa 780

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aggaaggcta agaagggtaa gaagggtaag cagacaaaga atcatgacga actttaa 897

<210> 11

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Lys Leu Leu Ser Leu Ala Leu Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Asp

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Thr Pro Lys Asp Asp Val Ile Gln Leu Asn Ala Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Asp Val Val Phe Asn Ser Asn Tyr Ser Ser Val Val Glu Phe

35 40 45

Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Asn Leu Lys Asn Pro Phe Lys

50 55 60

Lys Ala Ala Ala Val Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Ala Ala Ile Ala

65 70 75 80

Cys Leu Ala Ala Glu Asn Lys Lys Leu Cys Ser Asp Tyr Arg Ile Gln

85 90 95

Gly Phe Pro Thr Ile Met Val Phe Arg Pro Pro Lys Phe Asp Pro Thr

100 105 110

Ser Ser Thr Asn Arg Arg Ser Gly Ala His Ala Asn Glu Val Tyr Ser

115 120 125

Gly Ala Arg Asp Thr Lys Ser Ile Val Glu Phe Gly Val Ser Arg Ile

130 135 140

Lys Asn Tyr Val Lys Arg Val Ser Pro Asn Asn Ile Asn Gln Thr Leu

145 150 155 160

Gly Asn Ser Glu Lys Thr Gln Leu Leu Leu Val Thr Asp Lys Ala Lys

165 170 175

Pro Ser Ala Leu Ile Lys Ser Ile Ala Leu Asp Phe Leu Asn Asp Ile

180 185 190

Glu Ser Phe Tyr Tyr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Lys Lys Ala Leu Thr

195 200 205

Thr Arg Leu Glu Glu Tyr Gln Gln Ser Phe Ser Gly Glu Ser Ile Thr

210 215 220

Ser Pro Ser Ile Leu Val Leu His Glu Asn Glu Ile His Ile Phe Asp

225 230 235 240

Gly Lys Leu Asp Lys Leu Ser Ile Ser Lys Phe Leu Ala Glu Phe Ser

245 250 255

Thr Pro Leu Glu Gly Pro Leu Ser Lys Arg Gly Lys Phe Leu Glu His

260 265 270

Ile Arg Arg Gly Ile Lys Pro Gly Arg Lys Ala Lys Lys Gly Lys Lys

275 280 285

Gly Lys Gln Thr Lys Asn His Asp Glu Leu

290 295

<210> 12

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatagttgt tatccctggc tttgctggta tctctggtta gtgccgatac tttctataca 60

ccaaaggatg atgttataca acttaacgca tacaacttta aggacgttgt gtttaactct 120

aactattctt ctgtcgttga gttttatgct ccctggtgtg gacactgcca gaacttgaaa 180

aatccattca aaaaagctgc cgccgtttca aaagattact tgcaggttgc tgccattgca 240

tgtcttgctg ctgagaataa gaaactgtgt tctgactacc gtatacaagg atttccaacc 300

attatggttt tcagaccacc taaatttgac cctacttctt caactaatag aaggtctggc 360

gctcatgcta acgaagttta ttctggagca agagacacaa aatccattgt tgaatttgga 420

gtttctagaa tcaagaatta tgttaagaga gtatctccta acaacattaa ccagacacta 480

ggtaattctg aaaagactca gttgcttcta gttacagata aagcaaaacc ttctgcccta 540

ataaagtcaa tcgccctaga tttcctgaac gatattgaaa gtttttacta cccatttaat 600

gataaaacta aaaaagcact gactactcgt ttagaagaat atcagcagtc cttctctggt 660

gaatcaatca catctcccag tattttggtg ctgcacgaaa atgagattca tatttttgat 720

ggtaagttag ataagttgtc tatctcaaag ttcttggctg agttttctac cccactagaa 780

ggtccattat ctaagagagg aaaatttctt gagcatatac gaagaggaat aaaaccaggc 840

aggaaggcta agaagggtaa gaagggtaag cagacaaaga atcatgacga actttaa 897

Claims

1.一种重组表达载体，其特征在于，包括pPIC9K-amy载体和pGAPZA-PDI载体，其中，pPIC9K-amy载体由α-淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA-PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成。

2.权利要求1所述的重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株中的应用。

3.一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，过程为：将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中的过程为：以SEQ ID NO.6所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为引物，扩增低温α-淀粉酶的目的基因amy，构建表达载体pPIC9K-amy，将载体线性化后，整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建了重组菌株。

5.根据权利要求4所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中的过程为：以SEQ ID NO.8所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述序列为引物，扩增伴侣因子PDI的目的基因，构建表达载体pGAPZA-PDI，将载体线性化后，整合到重组菌株中。

6.一种毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株由权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到。

7.权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到的毕赤酵母在产饲用低温α-淀粉酶中的应用。

8.一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，过程包括：将权利要求3-5任一得到的毕赤酵母菌株活化，制成种子液，接种到BMGY培养基中，30℃、250rpm培养20h，离心收集菌体，接种到BMGY诱导培养基中，于30℃、250rpm诱导培养120h取样检测相关指标，并每隔24h添加2％(V/V)甲醇，将发酵液离心后，去除菌体沉淀，发酵液即为低温α-淀粉酶。

9.根据权利要求8所述的一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，1L BMGY生长培养基包括：1％酵母粉、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％(V/V)甘油，10％PBS pH 6.0缓冲溶液；