CN114685632B

CN114685632B - 转录抑制因子121121的应用及提高里氏木霉纤维素酶表达量和酶活的方法

Info

Publication number: CN114685632B
Application number: CN202210563760.8A
Authority: CN
Inventors: 苏小运; 孙先花; 姚斌; 罗会颖; 王晓璐; 秦星; 王苑; 涂涛; 柏映国; 于会民; 黄火清; 张红莲; 王亚茹
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2022-12-16
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114685632A

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及转录抑制因子121121的应用及提高里氏木霉纤维素酶表达量和酶活的方法。本发明的纤维素酶表达相关的转录抑制因子121121对于纤维素酶活性表达具有调节作用，通过构建该基因的敲除质粒，并用其转化宿主菌，在宿主菌中敲除转录抑制因子121121的表达可提高宿主菌的蛋白表达量和纤维素酶酶活。本发明丰富了里氏木霉纤维素酶的转录调控网络，为提高纤维素酶产量，降低纤维素酶成本，实现纤维素有效利用提高了新途径。

Description

转录抑制因子121121的应用及提高里氏木霉纤维素酶表达量和酶活的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及转录抑制因子121121的应用及提高里氏木霉纤维素酶表达量和酶活的方法。

背景技术

丝状真菌里氏木霉具有强大的分泌纤维素酶的能力，其混合发酵液中，纤维二糖水解酶的表达占胞外总分泌蛋白的50%以上。然而，纤维素酶的高成本仍然是纤维素生物炼制的主要瓶颈之一，因此需要继续开发新的方法，以提高纤维素酶的表达，降低应用成本。

在里氏木霉中，纤维素酶的表达受多个调控途径的影响。其中，调控主要发生在转录水平，包括主要激活因子Xyr1、ACE2、ACE3、Vib1和Hap2/3/5，抑制因子Cre1、ACE1、Rce1和Rce2等多个转录因子的协同调控。目前，已经有几篇关于对转录抑制因子敲除提高纤维素酶表达的研究。例如，转录因子cre1是里氏木霉的碳代谢阻遏转录抑制因子，科研学者通过同源重组的方法敲除了里氏木霉EU7-22的转录抑制因子cre1，在诱导或者抑制性碳源培养条件下，内切纤维素酶活性分别提高了1.15倍和7.50倍；在里氏木霉ALKO2221菌株，转录抑制因子ace1的缺失明显提高了纤维素酶的表达，而在里氏木霉C30OExyr1菌株中删除ace1并没有带来任何改善；在里氏木霉TU6-RP菌株敲除rce1，纤维酶的表达略有提高（50%左右）；在野生型菌株QM6a敲除rce2，内切纤维素酶活性提高了约30%。里氏木霉有500多个转录因子，然而，近几十年只发现了几个抑制纤维素酶表达的转录因子。因此，继续挖掘里氏木霉的新型转录因子并对其进行基因工程改造提高纤维素酶的表达，显的尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供里氏木霉纤维的转录抑制因子121121的应用。

本发明的再一目的是提供一种提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法。

根据本发明的提高里氏木霉纤维素酶表达的转录抑制因子121121编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质。

根据本发明的提高里氏木霉纤维素酶表达的转录抑制因子121121的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，包括敲除里氏木霉转录抑制因子121121的步骤。

根据本发明的提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，其中，通过构建里氏木霉转录抑制因子121121的敲除质粒并将其导入里氏木霉中，实现敲除里氏木霉转录抑制因子121121。

根据本发明的提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，其中，里氏木霉转录抑制因子121121的敲除质粒为所述转录抑制因子121121的donor质粒和所述转录抑制因子121121的sgRNA质粒。

根据本发明的具体实施方式，其中，121121的donor质粒包括121121上游同源臂、pCre/Loxp-hph（潮霉素表达盒）和121121下游同源臂；p121121sgRNA质粒包括pdc1P-121121sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1和大肠杆菌基本元件（氨苄编码基因和大肠杆菌复制起始点）。

根据本发明的具体实施方式，将121121上游同源臂、pCre/Loxp-hph（潮霉素表达盒）、下游同源臂通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒p121121 donor。

根据本发明的具体实施方式，将pdc1P-121121sgRNA-pdc1T、TEL基因、pdc1P-cas9-pdc1T和大肠杆菌基本元件通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒P121121sgRNA。

根据本发明的具体实施方式，敲除该转录抑制因子121121的里氏木霉的方法包括以下步骤：

（1）敲除121121的p121121donor DNA和p121121sgRNA分别用Pac1和I-Ceu1酶切

（2）用步骤（1）得到的质粒载体转化宿主细胞，得到敲除121121的里氏木霉菌株。

根据本发明的具体实施方式，上述敲除质粒载体可以提高里氏木霉的纤维素酶酶活表达。

本发明的纤维素酶表达相关的转录抑制因子121121对于纤维素酶活性表达具有调节作用，通过构建该基因的敲除质粒，并用其转化宿主菌，在宿主菌中敲除转录抑制因子121121的表达可提高宿主菌的蛋白表达量和纤维素酶酶活。本发明丰富了里氏木霉纤维素酶的转录调控网络，为提高纤维素酶产量，降低纤维素酶成本，实现纤维素有效利用提高了新途径。

附图说明

图1 提高纤维素酶表达的转录抑制因子的p121121donor质粒图谱。

图2为提高纤维素酶表达的转录抑制因子的p121121sgRNA质粒图谱。

图3显示转录抑制因子121121在里氏木霉基因组敲除的PCR鉴定结果。

图4显示敲除转录抑制因子121121的里氏木霉菌株蛋白表达的比较。

图5显示敲除转录抑制因子121121的里氏木霉菌株纤维素酶的表达比较。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。本发明所使用的里氏木霉TU-6菌株是尿嘧啶缺陷型突变体，编号ATCC (MYA-256)。

实施例1 转录抑制因子的p121121 donor和p121121sgRNA质粒的构建

（1）构建转录抑制因子p121121 donor质粒

p121121donor质粒包含121121上游同源臂、pCre/Loxp-hph（潮霉素表达盒和大肠杆菌基本复制元件）和121121下游同源臂。以pCre/Loxp-hph质粒为模板，引物Loxp-hphF1/Loxp-hphR1扩增pCre/Loxp-hph部分；以里氏木霉TU-6基因组为模板，引物121121UPF1/121121UPR1扩增1.5 kb长度的121121上游同源臂；引物121121downF1/121121downR1扩增1.5 kb长度的121121下游同源臂。

PCR反应体系包括：2 ng模板、1 µl正向引物、1 µl反向引物、25 µl的2xPCR Mix，双蒸水补足至50 µl。

PCR反应程序为：95℃，5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、3min，34个循环；72℃，10min。

PCR产物进行电泳、回收上述3个片段后，采用同源重组的方法构建干扰质粒载体。转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，平板上长出的大肠菌落做菌落PCR，将PCR鉴定为阳性的大肠菌落送测序，将测序正确的质粒命名为p121121 donor, 如图1。引物如下：

Loxp-hphF1(SEQ ID NO:3)，Loxp-hphR1(SEQ ID NO:4)；

121121UPF1(SEQ ID NO:5)，121121UPR1(SEQ ID NO:6)；

121121DOWNF1(SEQ ID NO:7)，121121DOWNR1(SEQ ID NO:8)。

（2）设计sgRNA序列

优化设计针对转录抑制因子121121的gRNA，该gRNA不发生脱靶现象。最终确定gRNA序列为如SEQ ID NO:9所示。

（3）构建转录抑制因子的p121121sgRNA质粒

p121121sgRNA质粒包括pdc1P-121121sgRNA-pdc1T、TEL序列、 pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌基本元件（氨苄编码基因和大肠杆菌复制起始点）。以pCre/Loxp-hph质粒为模板，扩增大肠杆菌基本元件；以里氏木霉TU-6基因组为模板，扩增pdc1的启动子和终止子，合成121121sgRNA序列部分 (SEQ ID NO:9)，通过体外overlap获得pdc1P-121121sgRNA-pdc1T片段；合成的TEL序列进行扩增；以含Cas9的质粒扩增Cas9片段，与pdc1的启动子和终止子，通过体外overlap获得pdc1P-Cas9-pdc1T片段。电泳、回收的4个片段用同源重组的方法连接。转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，对平板上长出的大肠菌落做菌落PCR，将PCR鉴定为阳性的大肠菌落送测序，将测序正确的质粒命名为p121121 sgRNA质粒, 如图2。

实施例2.转录抑制因子121121的敲除

（1）敲除121121的donor DNA和p121121sgRNA转化里氏木霉

将里氏木霉TU-6接种于土豆培养基（PDA）平板上，28 ºC静置培养7 d待其产孢，将孢子刮下并接种于100 ml含有尿嘧啶的PDB培养基中，28ºC、160 rpm振摇培养过夜。目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10 mg/ml的纤维素酶在30ºC消化2-3小时。收集原生质体后，将构建的用于敲除121121的donor DNA和p121121sgRNA分别用Pac1和I-Ceu1酶切，然后转化里氏木霉宿主细胞。

（2） PCR验证转录抑制因子121121在里氏木霉基因组的敲除

挑取单个转化子，接种于含MM-葡萄糖培养基的24孔板，于28℃培养5-7天。提取基因组DNA，验证转录抑制因子121121在里氏木霉基因组的敲除。验证转录抑制因子121121在里氏木霉基因组的敲除。引物验证121121敲除的下游部分，验证引物的F端设计在里氏木霉基因组的121121基因上游250 bp处，R端设计在p121121 donor质粒的大肠杆菌复制起始点处，验证引物序列如下：

引物F(SEQ ID NO:10)，引物R(SEQ ID NO:11)。

如果扩增出约2000 bp大小的片段，则证明该基因被敲除。将PCR产物在1%琼脂糖胶上电泳，结果如图3所示，出现和预期一致的条带。

实施例3.敲除转录抑制因子121121对的蛋白表达的影响

（1）敲除转录抑制因子121121的转化子的摇瓶诱导

将敲除转录抑制因子121121的转化子和出发菌株分别接种2×10⁷孢子于50 mlMM-glucose培养基中，28℃，160 rpm培养2 天。以10%的接种量转接至50 ml MM+2% Avicel培养基中以诱导纤维素酶的表达。从第3天开始，每隔24 h取样，连续取样至6天。

（2）敲除转录抑制因子121121的转化子的蛋白浓度、纤维素酶的测定

蛋白定量用考马斯亮蓝法，加入250 µl 1 × dye reagent染液和10 µl蛋白标品后，室温下反应10分钟后，测定595 nm的吸光值, 结果见图4。在发酵第5天，里氏木霉TU-6的蛋白浓度是0.027 mg/ml, Δ121121菌株（转化子）的蛋白浓度是0.059 mg/ml，提高了1.2倍。

纤维素酶的测定采用羧甲基纤维素钠（1.5 % CMC-Na）作为底物进行测定。用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.05 M、pH 5.0）配制。取适当稀释的酶液100 µl，加入到900 µlCMC-Na底物中，振荡混合均匀，50 ℃水浴保温30 min，反应终止时，向各试管中加入1.5 mlDNS试剂，在沸水中煮5 min，迅速冷却，测定540 nm的吸光度。1 ml液体酶，在50 ℃、pH 5.0的条件下，每小时水解羧甲基纤维素钠，产生1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U），结果见图5在发酵第5天，里氏木霉TU-6的内切纤维素酶酶活为1.42 U/ml, Δ121121菌株（转化子）的内切纤维素酶酶活为2.57 U/ml，提高了0.8倍。

应理解，本申请的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 转录抑制因子121121的应用及提高里氏木霉纤维素酶表达量和酶活的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei )

<400> 2

Met Glu Thr Asn Asn Ser Asp Ser Ser Asn Ile Asn Ser Gln Pro Gln

1 5 10 15

Pro Asp Asn Leu Met Glu Thr Asn Ser Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ser

20 25 30

Lys Asp Ile Pro Ser His Thr Arg Ile Leu Ala Ala Cys Asp Ala Cys

35 40 45

Arg Val Ser Lys Thr Arg Cys Asp Ser Val Arg Pro Thr Cys Ala Lys

50 55 60

Cys Ala Glu Arg Gly Leu Ser Cys Lys Tyr Pro Asp Lys Asp Pro Phe

65 70 75 80

Ser Ile Phe Glu Thr Trp Gly Lys Lys Ile Leu Gly Ala Val Glu Glu

85 90 95

Gln Gly Arg Leu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Gly Gly Arg Asn Gly Leu

100 105 110

His Gln Gln Arg Pro Asp Gln Leu Ala Arg Leu Leu Asp Met Asp Gly

115 120 125

Glu Asn Leu Glu Thr Met Ser Arg Lys Asp Thr Pro Trp Thr Pro Ile

130 135 140

Thr Gly Ser Asp Met Ile Leu Gly Trp Ser Val Phe Pro Gln Glu Arg

145 150 155 160

Pro Val Ser Thr Phe Pro Ala Thr Glu Phe Ala Glu Lys Pro Lys Pro

165 170 175

Ser Asp Leu Glu Val Ser Asn Pro Ser Pro Glu Arg Met Phe Glu Leu

180 185 190

Arg Asp Ile Tyr Met Ser Lys Ile Gln Gly Lys Asn Pro Ile Val Asp

195 200 205

Ala Asp Gln Leu Asp Val His Ile Ala Tyr Val Leu Glu Asn Gly Phe

210 215 220

Gly Trp Thr Ala Thr Ser Cys Leu Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Ala

225 230 235 240

Ala Ala Trp Gly Asn Tyr Pro Asp Asp Glu Arg Arg His Val Glu Thr

245 250 255

His Glu Gln Leu Asp Ile Tyr Pro Arg His Arg Val Thr Met Ala Val

260 265 270

Pro Asp His Arg Met Arg Glu Ser Leu Met Tyr Ile Ala Met Ala Gln

275 280 285

Lys Arg Met Ser Thr Ala Tyr Leu Asp Asp Ser Leu Leu Gly Val Asn

290 295 300

Gly Val Tyr Asp Val Gly Ser Val Gln Ser Glu Ala Phe Arg Trp Glu

305 310 315 320

Asn Ala Thr Ala Lys Ala Arg Arg Asp Glu Val Arg His Glu Leu Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Pro Cys Thr Leu Gln Glu Ser Ser Phe Pro Tyr Ala Leu

340 345 350

Pro Thr Phe Pro Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Ser Arg Val Asp Ala

355 360 365

Arg His Asp Ala Ser Thr Val His Ser Thr Thr Leu Ser Tyr Tyr Tyr

370 375 380

Tyr Leu Ala Glu Ile Ser Leu Arg Arg Leu Leu Asn Arg Thr Arg Ser

385 390 395 400

Ala Ala Thr Val Leu Ser Pro Thr Ile Asp Ser Leu Thr Ala Ala Arg

405 410 415

Leu Ala Glu Thr Met Gln Lys Leu Glu Gly Gln Leu Gln Gln Trp Leu

420 425 430

Asp Cys Leu Pro Leu Ala Leu Arg Phe His Ile Pro Pro Asp Ser His

435 440 445

Pro Ser Pro Glu Glu Pro Glu Leu Val Lys Leu Met Arg Glu Arg Tyr

450 455 460

Ala Glu Val Arg Glu Leu Leu Cys Arg Ala Tyr Leu Tyr Met Cys Leu

465 470 475 480

His Gly Gly Met Arg Leu Thr Arg Ser Gln Ala Glu Thr Phe Gly Ala

485 490 495

Gln Ala Ser Leu Gly Leu Arg Leu Ser Val Tyr Arg Ile Gln Thr Glu

500 505 510

Asn Pro Phe Phe Arg His Pro Gly Ser Trp Gly Ala Cys Arg Val Arg

515 520 525

Phe Asn His Ala Leu Cys Leu Met Ala Ala Tyr Arg Gly Lys Gln Ala

530 535 540

Gly Val Glu Ser Ala Ala His Val Leu Val Pro Pro Met Trp Arg Glu

545 550 555 560

Cys Val Asp Thr Val Gln Glu Arg Leu Glu Thr Trp Ala Asp Gln Gly

565 570 575

Gly Gly Ile Arg Glu Leu Ala Val Leu Leu Asp Trp Leu Lys Lys Leu

580 585 590

<210> 2

<211> 1779

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei )

<400> 2

atggagacaa acaacagcga cagcagcaac atcaactctc aaccacagcc agataatctc 60

atggaaacga atagtagtaa gaagagaaag cgttccaaag acatcccgtc ccacacacgg 120

atcctggctg cctgtgacgc ctgtcgcgtt agcaagacgc ggtgcgactc tgttcgccca 180

acatgtgcaa agtgcgctga gcgcggcctg tcctgcaaat atcctgataa agaccccttc 240

tcaatattcg aaacatgggg caagaagatc ctcggcgcgg tggaagaaca aggtcggctc 300

ctagctgctc tcgcagaggg cggtcgcaat ggcctccacc agcagcgtcc cgaccagctg 360

gctcggctgc tggatatgga cggcgagaac ctggagacca tgtcgcgaaa agacacccct 420

tggaccccga tcacgggctc tgatatgatt ctgggttggt ccgtattccc gcaggaaaga 480

ccagtcagca cgtttccggc gacggaattc gccgagaaac cgaaaccttc tgatcttgag 540

gtgtcgaacc cgtctccaga gcgcatgttt gagctgcggg acatttacat gagcaagata 600

cagggaaaga accctattgt cgatgcagac cagctggatg ttcacatcgc atacgttcta 660

gaaaatggct ttggttggac agctacctcg tgtctagtac tcttggtatt tgctttggca 720

gctgcttggg gcaattatcc cgatgatgag cgccgacacg tagagactca cgaacagctg 780

gatatctatc ccagacatcg ggtgaccatg gctgtgccgg accatcggat gagggagtca 840

ctgatgtaca ttgcaatggc gcagaaacga atgtcgacgg cttatctgga cgattcactg 900

ctcggcgtaa acggcgtcta tgatgtggga agcgtacaat ctgaagcatt ccgatgggaa 960

aacgcaacgg ccaaagcaag aagagacgag gtacgccatg agctgaacgg tctcccgcca 1020

tgcaccctgc aagagtcatc gtttccctat gctcttccta cgtttcctac cattgagagt 1080

tttggacaga gccgcgtgga cgcacgtcac gatgcgtcca cggtgcattc tacgacgctc 1140

tcatactatt actaccttgc cgagatatcc ttgcggcggc tgctcaaccg tacgcgcagc 1200

gccgctaccg ttctctcacc taccatagac tccttaacgg ccgcccgatt ggccgagacg 1260

atgcagaaac tcgagggcca actgcagcag tggctggact gcctgccact agccctaagg 1320

ttccatattc cgcctgactc gcacccttcg ccagaagagc ccgagctggt caagctgatg 1380

cgcgaaagat atgccgaggt acgcgagctg ctgtgccggg cgtacttgta catgtgtctg 1440

catggtggga tgcgcctgac gcgctcacag gcggagacat tcggcgcgca ggcttctctc 1500

ggtttacggc tgagcgtcta ccggatccag accgaaaatc cctttttccg acacccaggg 1560

tcgtggggag cgtgccgggt gcgttttaac cacgccctgt gcctaatggc ggcctaccgg 1620

ggcaagcagg cgggcgttga gtctgcggcg cacgtcttgg ttcctccaat gtggagagag 1680

tgcgtcgaca ctgtccagga gaggctggag acatgggctg accagggagg gggcattcga 1740

gaactggctg tgctgctcga ctggcttaag aagctgtga 1779

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggggtttaa acccaattat tcgt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctttcatcg ctcgaggcta gcat 24

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactcgatgt atttaattaa ctatcaccag tcctgtttca tctc 44

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ataattgggt ttaaaccccc tgtgctctag tgctgttgct gttc 44

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagcctcgag cgatgaaagc ttaagtgtat acagaagtag ca 42

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaattaaat acatcgagtc tgctctgcag 30

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcctagct gctctcgcag 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatatgcta cagtgcaaat agga 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagcttcca gggggaaacg cctg 24

Claims

1.一种提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，其特征在于，所述方法包括敲除里氏木霉转录抑制因子121121的步骤，其中，

所述里氏木霉转录抑制因子121121编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

通过构建所述里氏木霉转录抑制因子121121的敲除质粒并将其导入里氏木霉中，实现敲除所述里氏木霉转录抑制因子121121，所述里氏木霉转录抑制因子121121的敲除质粒为转录抑制因子121121的donor质粒和转录抑制因子121121的sgRNA质粒，所述转录抑制因子121121的sgRNA质粒包括转录抑制因子121121的sgRNA序列，所述转录抑制因子121121的sgRNA序列为5’-GCTCCTAGCTGCTCTCGCAG-3’，

所述里氏木霉为里氏木霉TU-6菌株。

2.根据权利要求1所述的提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，其特征在于，所述里氏木霉转录抑制因子121121的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的方法，其特征在于，所述转录抑制因子121121的donor质粒包括所述转录抑制因子121121的上游同源臂、潮霉素表达盒和所述转录抑制因子121121的下游同源臂。

4.里氏木霉转录抑制因子121121用于提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的应用，其特征在于，通过敲除里氏木霉转录抑制因子121121提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活，其中，

所述里氏木霉为里氏木霉TU-6菌株。

5.根据权利要求4所述的里氏木霉转录抑制因子121121用于提高里氏木霉纤维素酶的表达量和酶活的应用，其特征在于，所述里氏木霉转录抑制因子121121的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。