JP3348215B2 - キシリトールの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換えDNA技術に関する。特に本発明は、
キシロース還元酵素の遺伝子およびキシリトール脱水素
酵素の遺伝子を導入した新規な組換え酵母株に関する。
キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株は、キシロ
ースをキシリトールに還元することができ、その結果キ
シリトールをin vivoで製造することができる。両遺伝
子が導入された酵母株は、上記２種の酵素を発現するこ
とができる。これらの菌から生産されたキシロース還元
酵素は、酵素を用いるキシリトールのin vitroな製造方
法で使用できる。
キシロース還元酵素の遺伝子およびキシリトール脱水素
酵素の遺伝子を導入した新規な組換え酵母株に関する。
キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株は、キシロ
ースをキシリトールに還元することができ、その結果キ
シリトールをin vivoで製造することができる。両遺伝
子が導入された酵母株は、上記２種の酵素を発現するこ
とができる。これらの菌から生産されたキシロース還元
酵素は、酵素を用いるキシリトールのin vitroな製造方
法で使用できる。
発明の背景 キシロースの資化 キシロースは天然に遍く存在する。キシロースはリグ
ノセルロース系素材の40％を構成し得る（Ladischら198
3）。発酵によってキシロースは、液体燃料または化学
原料として使用されるエタノールに変換できる。キシロ
ースは、酵素の作用によってまたは発酵の副産物とし
て、虫歯を減少させる特性を有する天然甘味料として将
来有望なキシリトールに変換できる。またキシリトール
は糖尿病疾患にも使用できる。人間の消費に供するキシ
リトールの製造には、製造方法に一般安全性承認（Gene
rally Recognized as Safe）生物が包含されることが重
要である。
ノセルロース系素材の40％を構成し得る（Ladischら198
3）。発酵によってキシロースは、液体燃料または化学
原料として使用されるエタノールに変換できる。キシロ
ースは、酵素の作用によってまたは発酵の副産物とし
て、虫歯を減少させる特性を有する天然甘味料として将
来有望なキシリトールに変換できる。またキシリトール
は糖尿病疾患にも使用できる。人間の消費に供するキシ
リトールの製造には、製造方法に一般安全性承認（Gene
rally Recognized as Safe）生物が包含されることが重
要である。
天然キシロースを資化するものとして、バクテリア、
酵母、菌類がある。すべての生物において、キシロース
はキシルロースに変換され、キシルロースはキシルロキ
ナーゼによってキシロース−５−リン酸に変換される。
そして、キシロース−５−リン酸はペントースリン酸回
路を経てエムデン−マイヤーホフ経路（解糖系）に入
る。
酵母、菌類がある。すべての生物において、キシロース
はキシルロースに変換され、キシルロースはキシルロキ
ナーゼによってキシロース−５−リン酸に変換される。
そして、キシロース−５−リン酸はペントースリン酸回
路を経てエムデン−マイヤーホフ経路（解糖系）に入
る。
大腸菌（Escherichia coli）、バシラス種（Bacillus
sp.）、ストレプトミセス（Streptmyces sp.）、及び
アクチノプラネス（Actinoplanes sp.）のようなバクテ
リアは、キシロース異性化酵素によって、キシロースを
直接キシルロースに変換する。これらのバクテリアはキ
シリトールをキシロース資化の中間生成物としては生産
しない。発酵によりキシロースをエタノールにするこれ
らのバクテリアは、同時に多くの副産物を生産するの
で、収率が低い（SkoogとHahn−Ｈgerdal,1988）。ピ
ヒア スティピティス（Pichia stipitis）、カンジダ
シェハテ（Candida shehatae）およびパキソレン タ
ノフィラス（Pachysolen tannophilus）等のキシロース
資化酵母において、この反応は二段階で行われる。最初
に、キシロース還元酵素によって、キシロースがキシリ
トールに還元され、次にキシリトールがキシリトール脱
水素酵素によって酸化されキシルロースになる。
sp.）、ストレプトミセス（Streptmyces sp.）、及び
アクチノプラネス（Actinoplanes sp.）のようなバクテ
リアは、キシロース異性化酵素によって、キシロースを
直接キシルロースに変換する。これらのバクテリアはキ
シリトールをキシロース資化の中間生成物としては生産
しない。発酵によりキシロースをエタノールにするこれ
らのバクテリアは、同時に多くの副産物を生産するの
で、収率が低い（SkoogとHahn−Ｈgerdal,1988）。ピ
ヒア スティピティス（Pichia stipitis）、カンジダ
シェハテ（Candida shehatae）およびパキソレン タ
ノフィラス（Pachysolen tannophilus）等のキシロース
資化酵母において、この反応は二段階で行われる。最初
に、キシロース還元酵素によって、キシロースがキシリ
トールに還元され、次にキシリトールがキシリトール脱
水素酵素によって酸化されキシルロースになる。
ピヒア スティピティス、カンジダ シェハテおよび
パキソレン タノフィラス等のキシロース資化酵母は純
粋なキシロース溶液を発酵し、高収率且つ良好な生産性
を示す（Sliningerら1987;Priorら1989）。しかしなが
ら、それらの酵母は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前
処理し、酸で加水分解した麦藁等の、菌にとって不利で
あるような未処理の原料中では通常生存できない（Lind
ｎとHahn−Ｈgerdal 1989）。ひとつの例外はパキ
ソレン タノフィラスで、このような環境に対応して、
主としてキシリトールおよびグリセロールを生産する。
このような原料をピヒア スティピティス種カンジダ
シェハテおよびパキソレン タノフィラス等のキシロー
ス資化酵母によって効率的に発酵させるために、これら
の原料にイオン交換樹脂（ClarkとMackie 1984）または
水蒸気蒸留（Yuら1987）といった費用のかかる前処理を
加えなくてはならない。
パキソレン タノフィラス等のキシロース資化酵母は純
粋なキシロース溶液を発酵し、高収率且つ良好な生産性
を示す（Sliningerら1987;Priorら1989）。しかしなが
ら、それらの酵母は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前
処理し、酸で加水分解した麦藁等の、菌にとって不利で
あるような未処理の原料中では通常生存できない（Lind
ｎとHahn−Ｈgerdal 1989）。ひとつの例外はパキ
ソレン タノフィラスで、このような環境に対応して、
主としてキシリトールおよびグリセロールを生産する。
このような原料をピヒア スティピティス種カンジダ
シェハテおよびパキソレン タノフィラス等のキシロー
ス資化酵母によって効率的に発酵させるために、これら
の原料にイオン交換樹脂（ClarkとMackie 1984）または
水蒸気蒸留（Yuら1987）といった費用のかかる前処理を
加えなくてはならない。
パン酵母サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前処
理し、酸で加水分解した麦藁を発酵し、エタノールにす
る（LindｎとHahn−Ｈgerdal,1989）。サッカロミ
セス セレビシエはキシロースを効率的に資化できない
し、キシロースを単独炭素源として生育することはでき
ない。しかしながら、サッカロミセス セレビシエはキ
シロースをキシルロースに変換するバクテリア由来キシ
ロース異性化酵素存在下で、純粋なキシロース溶液（Ha
hn−Ｈgerdalら1986）のみならず未処理の原料（Lind
ｎとHahn−Ｈgerdal,1989a,b）も発酵し、ヘキソー
ス発酵で得られるのと同等な収率および生産性で、エタ
ノールを生産する。同様の結果がシゾサッカロミセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）でも得られた（L
astickら1989）。このように、サッカロミセス セレビ
シエおよびシゾサッカロミセス ポンベは機能的なキシ
ロキナーゼを有している。また、サッカロミセス セレ
ビシエはキシロースを資化することも知られている（Ba
ttら1986;van Zylら1989;SenacとHahn−Ｈgerdal 199
0）。
s cerevisiae）は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前処
理し、酸で加水分解した麦藁を発酵し、エタノールにす
る（LindｎとHahn−Ｈgerdal,1989）。サッカロミ
セス セレビシエはキシロースを効率的に資化できない
し、キシロースを単独炭素源として生育することはでき
ない。しかしながら、サッカロミセス セレビシエはキ
シロースをキシルロースに変換するバクテリア由来キシ
ロース異性化酵素存在下で、純粋なキシロース溶液（Ha
hn−Ｈgerdalら1986）のみならず未処理の原料（Lind
ｎとHahn−Ｈgerdal,1989a,b）も発酵し、ヘキソー
ス発酵で得られるのと同等な収率および生産性で、エタ
ノールを生産する。同様の結果がシゾサッカロミセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）でも得られた（L
astickら1989）。このように、サッカロミセス セレビ
シエおよびシゾサッカロミセス ポンベは機能的なキシ
ロキナーゼを有している。また、サッカロミセス セレ
ビシエはキシロースを資化することも知られている（Ba
ttら1986;van Zylら1989;SenacとHahn−Ｈgerdal 199
0）。
ゴング（Gong,1985）はキシロース発酵酵母変異株を
用いてエタノールを直接Ｄ−キシロースから得る方法を
開示した。ゴングによると、本来Ｄ−キシロースを資化
することができる親酵母株（たとえば、カンジダ種、ま
たはサッカロミセスセレビシエ）を選別し、例として紫
外線照射して変異を誘発した。しかしながら、なぜキシ
ロースを資化できる変異種が得られるかについて、参考
となる説明はされていない。さらにゴングは、キシロー
ス発酵の効率を上げる為に、遺伝子工学技術によって新
規なコード配列および／または調節遺伝子配列を該菌に
導入することはなかった。
用いてエタノールを直接Ｄ−キシロースから得る方法を
開示した。ゴングによると、本来Ｄ−キシロースを資化
することができる親酵母株（たとえば、カンジダ種、ま
たはサッカロミセスセレビシエ）を選別し、例として紫
外線照射して変異を誘発した。しかしながら、なぜキシ
ロースを資化できる変異種が得られるかについて、参考
となる説明はされていない。さらにゴングは、キシロー
ス発酵の効率を上げる為に、遺伝子工学技術によって新
規なコード配列および／または調節遺伝子配列を該菌に
導入することはなかった。
キシリトールは現在、工業的にヘミセルロースの加水
分解物の化学的還元によって製造されている。この方法
では大きな問題として、還元段階で使用される高価な触
媒の毒性と、最終生成物から単離が困難な副産物が生成
することである。
分解物の化学的還元によって製造されている。この方法
では大きな問題として、還元段階で使用される高価な触
媒の毒性と、最終生成物から単離が困難な副産物が生成
することである。
文献には純粋なキシロースからキシリトールを製造す
るための微生物学的方法の例が多くみられる（例えば、
大西および鈴木、1966;Barbosaら1988）。この方法にお
いて、最良の生産菌は特にカンジダ種に属している酵母
である。またエンテロバクター（Enterobacter）（吉武
ら、1973a）およびコリネバクテリウム（Corynebacteri
um）種（吉武ら、1973b）等のバクテリア、およびペニ
シリウム クリソゲナム（Pennicillium Chrysogenum）
（ChiangとKnight 1960）等のある種のカビも純粋なキ
シロースからキシリトールを生産する。
るための微生物学的方法の例が多くみられる（例えば、
大西および鈴木、1966;Barbosaら1988）。この方法にお
いて、最良の生産菌は特にカンジダ種に属している酵母
である。またエンテロバクター（Enterobacter）（吉武
ら、1973a）およびコリネバクテリウム（Corynebacteri
um）種（吉武ら、1973b）等のバクテリア、およびペニ
シリウム クリソゲナム（Pennicillium Chrysogenum）
（ChiangとKnight 1960）等のある種のカビも純粋なキ
シロースからキシリトールを生産する。
キシリトール生産の最高収率を記載している微生物学
的方法（Ojamoら1987）では、カンジダ ギリアーモン
ジ（Candida guilliermondii）酵母をキシロース含有培
地で、厳正にコントロールされた通気下で、バッチ式ま
たはフェドバッチ式のどちらかで培養する。キシリトー
ルが収率50〜65％で得られたが、培養培地にフルフルア
ルデヒドを添加することにより76％まで増加した。
的方法（Ojamoら1987）では、カンジダ ギリアーモン
ジ（Candida guilliermondii）酵母をキシロース含有培
地で、厳正にコントロールされた通気下で、バッチ式ま
たはフェドバッチ式のどちらかで培養する。キシリトー
ルが収率50〜65％で得られたが、培養培地にフルフルア
ルデヒドを添加することにより76％まで増加した。
薄膜反応器で90％変換率でキシリトールを生産するた
めに、カンジダ ペリクロサ（Candida pelliculosa）
（キシロース還元酵素含有）、メサノバクテリウム種
（Methanobacterium sp.）（脱水素酵素、F420,NADP,F4
20/NADP酸化還元酵素含有）からの無細胞抽出物をが使
用する（Kitpreechavanich,1985）。コリネバクテリウ
ム種（Corynebacterium sp.）からの無細胞抽出物を使
用すると、グルコン酸−６−リン酸が補助因子の再生に
使用された場合、69％の変換率でキシリトールが得られ
る。
めに、カンジダ ペリクロサ（Candida pelliculosa）
（キシロース還元酵素含有）、メサノバクテリウム種
（Methanobacterium sp.）（脱水素酵素、F420,NADP,F4
20/NADP酸化還元酵素含有）からの無細胞抽出物をが使
用する（Kitpreechavanich,1985）。コリネバクテリウ
ム種（Corynebacterium sp.）からの無細胞抽出物を使
用すると、グルコン酸−６−リン酸が補助因子の再生に
使用された場合、69％の変換率でキシリトールが得られ
る。
バシラス メガテリウム（B.megaterium）由来のグル
コース脱水素酵素はNADPH再生酵素として適切な性質を
有することが知られている（Kulbeら1987）。このよう
に、酵素を用いるキシリトールの製造方法では、グルコ
ースからグルコン酸がキシリトールと同時に製造され
る。酵素と補助因子の保持のためには、限外濾過膜が使
用できる。補助因子の保持のために十分な高分子量を有
するように作製された補助因子（Kulbeら1987）かまた
は負に荷電した限外濾過膜（Kulbeら1989）を使用する
ことにより、補助因子の保持が達成できる。
コース脱水素酵素はNADPH再生酵素として適切な性質を
有することが知られている（Kulbeら1987）。このよう
に、酵素を用いるキシリトールの製造方法では、グルコ
ースからグルコン酸がキシリトールと同時に製造され
る。酵素と補助因子の保持のためには、限外濾過膜が使
用できる。補助因子の保持のために十分な高分子量を有
するように作製された補助因子（Kulbeら1987）かまた
は負に荷電した限外濾過膜（Kulbeら1989）を使用する
ことにより、補助因子の保持が達成できる。
酵素的方法を使用する魅力は、微生物学的方法ならば
使用する微生物の代謝を阻害するような素材を含有す
る、不純なキシロースを使用できることにある。また、
キシリトールの収率は天然の菌株による微生物学的方法
よりも酵素的方法のほうが高い。しかし、大規模生産で
は、現在のところ微生物学的方法の方がより簡易な方法
である。
使用する微生物の代謝を阻害するような素材を含有す
る、不純なキシロースを使用できることにある。また、
キシリトールの収率は天然の菌株による微生物学的方法
よりも酵素的方法のほうが高い。しかし、大規模生産で
は、現在のところ微生物学的方法の方がより簡易な方法
である。
ピヒア スティピティス種、カンジダ シェハテ種お
よびパキソレン タノフィルス種等の天然のキシロース
資化酵母は、いくつかの理由で、エタノール生産および
キシリトール生産に適さない。エタノール発酵において
は原料の前処理をしなければならないので、エタノール
のような安価な最終生産物にしてはコスト高となる。こ
れら上記の種はまた一般安全性承認資格がない。従っ
て、キシロース資化については一般安全性承認資格を有
するパン酵母の使用を基本とすることがもっとも好都合
であろう。
よびパキソレン タノフィルス種等の天然のキシロース
資化酵母は、いくつかの理由で、エタノール生産および
キシリトール生産に適さない。エタノール発酵において
は原料の前処理をしなければならないので、エタノール
のような安価な最終生産物にしてはコスト高となる。こ
れら上記の種はまた一般安全性承認資格がない。従っ
て、キシロース資化については一般安全性承認資格を有
するパン酵母の使用を基本とすることがもっとも好都合
であろう。
キシリトールおよびエタノール生産のために効率的な
キシロース資化菌であるサッカロミセス セレビシエを
作製するために、キシロースをキシリトールとキシルロ
ースに変換する効率的な酵素システムを本酵母に導入す
べきである。キシロースからエタノールを生産する為に
は、大腸菌（Sarthyら1987）バシラス サチリス（B.su
btilis）、およびアクチノプラネス ミズーリエンシス
（Actinoplanes missouriensis）（Amoreら1989）由来
のキシロース異性化酵素遺伝子をクローン化しサッカロ
ミセス セレビシエに導入する。サッカロミセス セレ
ビシエ中で作られるキシロース異性化酵素蛋白質は非常
に活性が低い（バクテリアで生産される酵素の千分の
一）かまたは酵素活性を示さない。このように、バクテ
リア由来の酵素は酵母中では作用しない。サッカロミセ
ス セレビシエに導入できる遺伝子として、もうひとつ
は別の酵母由来のキシロース還元酵素およびキシリトー
ル脱水素酵素をコードする遺伝子が考えられる。ピヒア
スティピティスの酵素は上述した純粋なキシロース溶
液の効率的な資化という観点からみて適した候補であ
る。別の酵母由来の酵素は酵母の中で発現する時、バク
テリア由来の酵素より活性が高いと期待される。さら
に、キシリトールおよびエタノールは同一のシステムで
生産され、このシステムはピヒア スティピティスがキ
シロースを有効に資化し、阻害因子に対する抵抗性とサ
ッカロミセス セレビシエの使用が可能であるという点
を兼ね備えるものである。
キシロース資化菌であるサッカロミセス セレビシエを
作製するために、キシロースをキシリトールとキシルロ
ースに変換する効率的な酵素システムを本酵母に導入す
べきである。キシロースからエタノールを生産する為に
は、大腸菌（Sarthyら1987）バシラス サチリス（B.su
btilis）、およびアクチノプラネス ミズーリエンシス
（Actinoplanes missouriensis）（Amoreら1989）由来
のキシロース異性化酵素遺伝子をクローン化しサッカロ
ミセス セレビシエに導入する。サッカロミセス セレ
ビシエ中で作られるキシロース異性化酵素蛋白質は非常
に活性が低い（バクテリアで生産される酵素の千分の
一）かまたは酵素活性を示さない。このように、バクテ
リア由来の酵素は酵母中では作用しない。サッカロミセ
ス セレビシエに導入できる遺伝子として、もうひとつ
は別の酵母由来のキシロース還元酵素およびキシリトー
ル脱水素酵素をコードする遺伝子が考えられる。ピヒア
スティピティスの酵素は上述した純粋なキシロース溶
液の効率的な資化という観点からみて適した候補であ
る。別の酵母由来の酵素は酵母の中で発現する時、バク
テリア由来の酵素より活性が高いと期待される。さら
に、キシリトールおよびエタノールは同一のシステムで
生産され、このシステムはピヒア スティピティスがキ
シロースを有効に資化し、阻害因子に対する抵抗性とサ
ッカロミセス セレビシエの使用が可能であるという点
を兼ね備えるものである。
発明の要旨 本発明はキシロース還元酵素およびキシリトール脱水
素酵素をコードするそれぞれの遺伝子を有するある種の
酵母からそれらの遺伝子を単離すること、それら遺伝子
の特徴、サッカロミセス セレビシエへの導入、及び該
酵母株中での発現について開示している。
素酵素をコードするそれぞれの遺伝子を有するある種の
酵母からそれらの遺伝子を単離すること、それら遺伝子
の特徴、サッカロミセス セレビシエへの導入、及び該
酵母株中での発現について開示している。
本発明はこのように、キシロース還元酵素およびキシ
リトール脱水素酵素を発現する新規な組換え酵母株を提
供する。
リトール脱水素酵素を発現する新規な組換え酵母株を提
供する。
本発明によると、キシロース還元酵素遺伝子とキシリ
トール脱水素遺伝子を導入した本酵母株はin vivoでキ
シロースからキシリトールに還元を行なうことができ
る。また、キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株
によって生産されるキシロース還元酵素は、キシリトー
ルをin vitroで生産する酵素を用いる製造方法で使用で
きる。
トール脱水素遺伝子を導入した本酵母株はin vivoでキ
シロースからキシリトールに還元を行なうことができ
る。また、キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株
によって生産されるキシロース還元酵素は、キシリトー
ルをin vitroで生産する酵素を用いる製造方法で使用で
きる。
図面の簡単な説明 Fig.1はキシロース還元酵素遺伝子（xrd）をプラスミ
ドpMA91,pRS305にそれぞれ導入して構築したプラスミド
pUA103,pUA107を示す。
ドpMA91,pRS305にそれぞれ導入して構築したプラスミド
pUA103,pUA107を示す。
Fig.2はキシリトール脱水素酵素陽性を示すλgt11ク
ローンのプレート活性分析の結果を示す。
ローンのプレート活性分析の結果を示す。
Fig.3はキシリトール脱水素酵素遺伝子（XDH）を担持
するプラスミドpJHXDH50の図を示す。
するプラスミドpJHXDH50の図を示す。
Fig.4はキシリトール脱水素酵素を生産する組換えサ
ッカロミセス セレビシエ株VTT−Ｃ−91181の、オリジ
ナル形質転換菌プレート（Ａ）および形質転換菌から得
られた単一コロニー（Ｂ）についてのプレート活性分析
の結果を示す。
ッカロミセス セレビシエ株VTT−Ｃ−91181の、オリジ
ナル形質転換菌プレート（Ａ）および形質転換菌から得
られた単一コロニー（Ｂ）についてのプレート活性分析
の結果を示す。
Fig.5はキシロース還元酵素遺伝子をBS＋ベクターに
導入して構築したベクターpJHXR22において、リボソー
ムのコード配列ではさんだキシロース還元酵素遺伝子
の、発現カセットを示す。
導入して構築したベクターpJHXR22において、リボソー
ムのコード配列ではさんだキシロース還元酵素遺伝子
の、発現カセットを示す。
Fig.6は下記プラスミドを有するサッカロミセス セ
レビシエから、およびピヒア スティピティスから生産
されたキシロース還元酵素のウエスタンブロット分析の
結果を示す。
レビシエから、およびピヒア スティピティスから生産
されたキシロース還元酵素のウエスタンブロット分析の
結果を示す。
レーン１ 基準分子量（LMW,ファーマシア社製） レーン２ pRS305, レーン３ pUA107 レーン４ 空きレーン レーン５ pMA91, レーン６ pUA103, レーン７ 精製したキシロース還元酵素 レーン８ LMW レーン９ ピヒア スティピティス レーン2,3,5,6および９のサンプルはフレンチプレスに
より破砕した細胞溶出物 Fig.7は補助因子としてNADHまたはNADPHのどちらかを
使用し、プラスミドpUA103およびpUA107が導入されたサ
ッカロミセス セレビシエ、および、ベクターpRS35ま
たはpMA91を担持するコントロール株のそれぞれのキシ
ロース還元酵素活性を示す。
より破砕した細胞溶出物 Fig.7は補助因子としてNADHまたはNADPHのどちらかを
使用し、プラスミドpUA103およびpUA107が導入されたサ
ッカロミセス セレビシエ、および、ベクターpRS35ま
たはpMA91を担持するコントロール株のそれぞれのキシ
ロース還元酵素活性を示す。
Fig.8はキシリトール脱水素酵素遺伝子（XDH）をpKB1
02に導入して構築したプラスミドpJHXDH60を示す。
02に導入して構築したプラスミドpJHXDH60を示す。
発明の詳細な説明 本発明で使用されるキシロース還元酵素（xrd）遺伝
子およびキシリトール脱水素酵素（xdh）遺伝子は、こ
れらの遺伝子を含有するピヒア スティピティス等の酵
母から単離する。またパキソレン タノフィラス、クラ
イベロミセス種（Kluyveromyces spp.）、ペトロミセス
アルベルテンシス（Petromyces albertensis）および
カンジダ種等の他の適切な酵母および菌類も使用でき
る。
子およびキシリトール脱水素酵素（xdh）遺伝子は、こ
れらの遺伝子を含有するピヒア スティピティス等の酵
母から単離する。またパキソレン タノフィラス、クラ
イベロミセス種（Kluyveromyces spp.）、ペトロミセス
アルベルテンシス（Petromyces albertensis）および
カンジダ種等の他の適切な酵母および菌類も使用でき
る。
これらの遺伝子を導入する酵母としては、キシリトー
ル生産のために適切な酵母株ならば何でも使用でき、サ
ッカロミセス セレビシエ酵母株（例えば、DBY746,AH2
2,S150−2BGPY55−15Bα,VTT−Ａ−63015,VTT−Ａ−850
68,VTT−Ｃ−79093）、クライベロミセス種類またはシ
ゾサッカロミセス ポンベ種等の一般安全性承認資格を
有する株が望ましい。遺伝子のこれら酵母への導入は、
例えばこれらの生物体について記載のある公知の方法で
行なうことができる。ここで注目すべきことは、遺伝子
発現の増加または調節を行うために、必要ならば、ピヒ
ア自身にこれらの遺伝子を導入できることである。本発
明の目的にはサッカロミセス セレビシエ種が好まし
い。
ル生産のために適切な酵母株ならば何でも使用でき、サ
ッカロミセス セレビシエ酵母株（例えば、DBY746,AH2
2,S150−2BGPY55−15Bα,VTT−Ａ−63015,VTT−Ａ−850
68,VTT−Ｃ−79093）、クライベロミセス種類またはシ
ゾサッカロミセス ポンベ種等の一般安全性承認資格を
有する株が望ましい。遺伝子のこれら酵母への導入は、
例えばこれらの生物体について記載のある公知の方法で
行なうことができる。ここで注目すべきことは、遺伝子
発現の増加または調節を行うために、必要ならば、ピヒ
ア自身にこれらの遺伝子を導入できることである。本発
明の目的にはサッカロミセス セレビシエ種が好まし
い。
キシロース還元酵素をコードするDNA分子は公知の方
法によってピヒア スティピティスより単離する。好ま
しい態様としては、mRNAから合成したcDNAを、λgt11ベ
クターを用いてクローニングする。キシロース還元酵素
の特異的抗体を用いる免疫学的スクリーニングにより、
陽性クローンを単離し、シークエンスシングするために
BS＋ベクターにサブクローンする。ピヒア スティピテ
ィスのキシロース還元酵素をコードする遺伝子はイント
ロンを全く含んでいないので、サッカロミセス セレビ
シエ中で発現することによっても、クローン化できる。
また、この酵素のアミノ酸配列をもとにして作製したオ
リゴヌクレオチドを使用し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子バンクから単離する方法もある。
法によってピヒア スティピティスより単離する。好ま
しい態様としては、mRNAから合成したcDNAを、λgt11ベ
クターを用いてクローニングする。キシロース還元酵素
の特異的抗体を用いる免疫学的スクリーニングにより、
陽性クローンを単離し、シークエンスシングするために
BS＋ベクターにサブクローンする。ピヒア スティピテ
ィスのキシロース還元酵素をコードする遺伝子はイント
ロンを全く含んでいないので、サッカロミセス セレビ
シエ中で発現することによっても、クローン化できる。
また、この酵素のアミノ酸配列をもとにして作製したオ
リゴヌクレオチドを使用し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子バンクから単離する方法もある。
酵母への導入に適したプラスミドを構築するために、
キシロース還元酵素をコードする遺伝子を、適切な酵母
遺伝子調節領域を含むpMA91（Mellorら,1983）等の適切
な酵母発現ベクターを用いてクローニングする。これら
の調節領域は、例えばPGK1,ADH1,GAL1,GAL10,CUP1,GAP,
CYC1,PHO5等の酵母株の遺伝子から得る。また、キシロ
ース還元酵素をコードするピヒア種の遺伝子の調節領域
は、サッカロミセス セレビシエにおけるキシロース還
元酵素遺伝子の発現に使用できる。キシロース還元酵素
をコードするxrd遺伝子を有するプラスミドは、受容酵
母株に導入されると自己複製できる。キシロース還元酵
素をコードする遺伝子は、また、適切な酵母の調節領域
と共にpRS305等の単独コピー酵母ベクターを用いてクロ
ーニングできる（SikorskiとHieter,1989）。
キシロース還元酵素をコードする遺伝子を、適切な酵母
遺伝子調節領域を含むpMA91（Mellorら,1983）等の適切
な酵母発現ベクターを用いてクローニングする。これら
の調節領域は、例えばPGK1,ADH1,GAL1,GAL10,CUP1,GAP,
CYC1,PHO5等の酵母株の遺伝子から得る。また、キシロ
ース還元酵素をコードするピヒア種の遺伝子の調節領域
は、サッカロミセス セレビシエにおけるキシロース還
元酵素遺伝子の発現に使用できる。キシロース還元酵素
をコードするxrd遺伝子を有するプラスミドは、受容酵
母株に導入されると自己複製できる。キシロース還元酵
素をコードする遺伝子は、また、適切な酵母の調節領域
と共にpRS305等の単独コピー酵母ベクターを用いてクロ
ーニングできる（SikorskiとHieter,1989）。
また、キシロース還元酵素をコードする遺伝子は酵母
の染色体、例えばリボソームRNAの遺伝子座に導入でき
る。この目的のために、プラスミドpIRL9等の適切なプ
ラスミドのリボソーム配列を取り出し、BS＋ベクターを
用いて適宜クローニングする。適切な酵母プロモーター
とターミネーター領域の間に挿入されたキシロース還元
酵素をコードする遺伝子は、前段階で得られた遺伝子を
含有するプラスミドとキシロース還元酵素をコードする
遺伝子を含むハイブリッドベクターから取り出す。この
ようにして得られたリボソーム配列ではさんだプラスミ
ド発現カセットは取り出すことができる。この断片を、
形質導入の適切なマーカーを担持する自己複製型プラス
ミドと共に酵母に導入する。そしてそのプラスミドを、
細胞を無選択条件で培養することで染色体に組み込んだ
xrd遺伝子を含む細胞から除去する。このようにして、
バクテリアのベクター配列等の異種外部DNAを担持しな
い組換え株が得られる。VTT−Ａ−63015等の倍数体の酵
母株を使用すると、キシロース還元酵素遺伝子はPGK1ま
たはADH1遺伝子座等の必須遺伝子座にも導入される。
の染色体、例えばリボソームRNAの遺伝子座に導入でき
る。この目的のために、プラスミドpIRL9等の適切なプ
ラスミドのリボソーム配列を取り出し、BS＋ベクターを
用いて適宜クローニングする。適切な酵母プロモーター
とターミネーター領域の間に挿入されたキシロース還元
酵素をコードする遺伝子は、前段階で得られた遺伝子を
含有するプラスミドとキシロース還元酵素をコードする
遺伝子を含むハイブリッドベクターから取り出す。この
ようにして得られたリボソーム配列ではさんだプラスミ
ド発現カセットは取り出すことができる。この断片を、
形質導入の適切なマーカーを担持する自己複製型プラス
ミドと共に酵母に導入する。そしてそのプラスミドを、
細胞を無選択条件で培養することで染色体に組み込んだ
xrd遺伝子を含む細胞から除去する。このようにして、
バクテリアのベクター配列等の異種外部DNAを担持しな
い組換え株が得られる。VTT−Ａ−63015等の倍数体の酵
母株を使用すると、キシロース還元酵素遺伝子はPGK1ま
たはADH1遺伝子座等の必須遺伝子座にも導入される。
従って、本発明の目的は特定のキシロース還元酵素遺
伝子を提供することにある。xrd遺伝子の配列は、例え
ば２本鎖ジデオキシヌクレオチドシーケンス法（Zagurs
kyら,1986）を使用することによって、その遺伝子を担
持するプラスミドから決定できる。ピヒア スティピテ
ィスのキシロース還元酵素をコードする遺伝子の配列
を、配列表の配列番号２に示す。
伝子を提供することにある。xrd遺伝子の配列は、例え
ば２本鎖ジデオキシヌクレオチドシーケンス法（Zagurs
kyら,1986）を使用することによって、その遺伝子を担
持するプラスミドから決定できる。ピヒア スティピテ
ィスのキシロース還元酵素をコードする遺伝子の配列
を、配列表の配列番号２に示す。
本発明においては、上述したような、自己複製した複
数または単独の複製コピーのプラスミドまたは酵母の染
色体に組み込むことが可能なベクターを用いることが好
ましい。
数または単独の複製コピーのプラスミドまたは酵母の染
色体に組み込むことが可能なベクターを用いることが好
ましい。
本発明においては、キシロース還元酵素をコードする
DNA分子を含み、この酵素を発現することが可能な酵母
株が提供される。
DNA分子を含み、この酵素を発現することが可能な酵母
株が提供される。
また、キシロース還元酵素の製造方法も提供される。
この方法は、 （ａ）キシロース還元酵素をコードするDNA分子を適切
な供与体生物から単離し、 （ｂ）該DNA分子を担持する酵母ベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターを適切な宿主酵母に導入して組
換え宿主株を得、 （ｄ）該キシロース還元酵素が発現できる条件下で該組
換え宿主株を培養し、そして （ｅ）該キシロース還元酵素を回収する ことを包含する。
この方法は、 （ａ）キシロース還元酵素をコードするDNA分子を適切
な供与体生物から単離し、 （ｂ）該DNA分子を担持する酵母ベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターを適切な宿主酵母に導入して組
換え宿主株を得、 （ｄ）該キシロース還元酵素が発現できる条件下で該組
換え宿主株を培養し、そして （ｅ）該キシロース還元酵素を回収する ことを包含する。
一般安全性承認資格を有する生物体由来の酵素はキシ
リトールの酵素的生産に好ましい。ピヒア スティピテ
ィス由来のキシロース還元酵素はチオール保護化学薬品
等の特別な安定剤を使用しなくても、活性は一定であ
り、安定な酵素として優れた特徴を有する。現在、この
酵素の生産は一般安全性承認資格を有する酵母において
可能である。形質転換した酵母細胞を適切な培地で培養
する。培地としては、キシロースが酵素の誘導に必要と
されない時は、本来キシロースを資化する酵母用と同
じ、糖密をベースとする安価な培地が使用される。細胞
内キシロース還元酵素を持つ酵母はフェドバッチ工程で
良好な収率で生産される。
リトールの酵素的生産に好ましい。ピヒア スティピテ
ィス由来のキシロース還元酵素はチオール保護化学薬品
等の特別な安定剤を使用しなくても、活性は一定であ
り、安定な酵素として優れた特徴を有する。現在、この
酵素の生産は一般安全性承認資格を有する酵母において
可能である。形質転換した酵母細胞を適切な培地で培養
する。培地としては、キシロースが酵素の誘導に必要と
されない時は、本来キシロースを資化する酵母用と同
じ、糖密をベースとする安価な培地が使用される。細胞
内キシロース還元酵素を持つ酵母はフェドバッチ工程で
良好な収率で生産される。
生産された酵母を遠心分離等により濃縮、洗浄しそし
てキシロース還元酵素を高圧ホモジナイゼーションまた
はガラスビーズ粉砕法等の細胞破砕法によって溶液中に
遊離させる。濾過または遠心分離によってホモジネート
を精製した後、キシロース還元酵素をさらにクロマトグ
ラフィー法で精製する。キシリトールのin vitro生産の
為に、酵素反応器中で粗ホモジネートまたは精製したキ
シロース還元酵素を、補助因子（NAD/NADHまたはNADP/N
ADPH）、およびグルコース脱水素酵素、フォルメート脱
水素酵素または、十分な安定性があり、キシロース還元
酵素の環境条件を満たし、更に適切な活性特性を備えた
他の酵素等の補助因子再生用酵素と共に反応させる（Bu
ckmann,1979;Wandreyら,1981;1982;Kulbeら,1989）。酵
素および補助因子は、概して限外濾過膜、特に負に荷電
した膜によって反応システム中に保持される。これらの
補助因子はまた、補助因子再生用酵素と共に固定し得る
（Reslowら,1988）。反応混合物を反応器からポンプで
汲み出し、基質および生成物を膜を通じて濾過する。生
成物はクロマトグラフィーまたは結晶化による方法で基
質から単離し、基質は反応器に再循環できる。
てキシロース還元酵素を高圧ホモジナイゼーションまた
はガラスビーズ粉砕法等の細胞破砕法によって溶液中に
遊離させる。濾過または遠心分離によってホモジネート
を精製した後、キシロース還元酵素をさらにクロマトグ
ラフィー法で精製する。キシリトールのin vitro生産の
為に、酵素反応器中で粗ホモジネートまたは精製したキ
シロース還元酵素を、補助因子（NAD/NADHまたはNADP/N
ADPH）、およびグルコース脱水素酵素、フォルメート脱
水素酵素または、十分な安定性があり、キシロース還元
酵素の環境条件を満たし、更に適切な活性特性を備えた
他の酵素等の補助因子再生用酵素と共に反応させる（Bu
ckmann,1979;Wandreyら,1981;1982;Kulbeら,1989）。酵
素および補助因子は、概して限外濾過膜、特に負に荷電
した膜によって反応システム中に保持される。これらの
補助因子はまた、補助因子再生用酵素と共に固定し得る
（Reslowら,1988）。反応混合物を反応器からポンプで
汲み出し、基質および生成物を膜を通じて濾過する。生
成物はクロマトグラフィーまたは結晶化による方法で基
質から単離し、基質は反応器に再循環できる。
更に、本発明はキシリトールの微生物学的な製造方法
にして、 （ａ）キシロース含有培地で、キシロース還元酵素をコ
ードするDNA分子とキシリトール脱水素酵素をコードす
るDNA分子とを担持する組換え酵母株を培養し、 （ｂ）生成するキシリトールを培地から回収することを
含む方法が提供される。
にして、 （ａ）キシロース含有培地で、キシロース還元酵素をコ
ードするDNA分子とキシリトール脱水素酵素をコードす
るDNA分子とを担持する組換え酵母株を培養し、 （ｂ）生成するキシリトールを培地から回収することを
含む方法が提供される。
組換え酵母株による微生物学的なキシリトールの製造
において、補助因子NADPHまたはNADHのin vivo再生はな
んらかの方法で確保しなければならない。酵母がキシリ
トール脱水素酵素遺伝子（以下を参照）を有する場合、
補助因子再生は、代謝中でキシリトールのわずかな流出
を通して行なわれる。この流出は、キシロース還元酵素
およびキシリトール脱水素酵素の相対的な発現の量によ
るか、あるいは酸素転移率によるかあるいはヨードアセ
テート等の酵素阻害剤を培養培地に添加して代謝を制御
することによって、制御できる。また、グルコース、グ
リセロール、リボースまたはエタノール等の、同じく炭
素を持つ物質を添加することで補助因子再生を行なうこ
ともできる。このシステムでは、キシロースからのキシ
リトールの生成が95〜100％の収率で得られる。さら
に、サッカロミセス セレビシエを使用するこのシステ
ムでは、キシリトールはほとんど代謝されない。結果と
して天然のキシリトール産生生物における場合よりも高
収率でキシリトールが得られる。
において、補助因子NADPHまたはNADHのin vivo再生はな
んらかの方法で確保しなければならない。酵母がキシリ
トール脱水素酵素遺伝子（以下を参照）を有する場合、
補助因子再生は、代謝中でキシリトールのわずかな流出
を通して行なわれる。この流出は、キシロース還元酵素
およびキシリトール脱水素酵素の相対的な発現の量によ
るか、あるいは酸素転移率によるかあるいはヨードアセ
テート等の酵素阻害剤を培養培地に添加して代謝を制御
することによって、制御できる。また、グルコース、グ
リセロール、リボースまたはエタノール等の、同じく炭
素を持つ物質を添加することで補助因子再生を行なうこ
ともできる。このシステムでは、キシロースからのキシ
リトールの生成が95〜100％の収率で得られる。さら
に、サッカロミセス セレビシエを使用するこのシステ
ムでは、キシリトールはほとんど代謝されない。結果と
して天然のキシリトール産生生物における場合よりも高
収率でキシリトールが得られる。
本発明の好ましい態様において、ピヒア スティピテ
ィスのxdh遺伝子の単離のために、最初に大腸菌を用い
て、コスミド p3030（Penttiliaら,1984）または別の酵
母ベクター中で染色体遺伝子バンクが作製され、組換え
プラスミドが単離され、酵母中に導入される。xdh遺伝
子は酵母中での発現によって見分けることができ、プレ
ート活性分析によって検出できる。xdh遺伝子のcDNAコ
ピーは大腸菌中で作成されるλgtll cDNA発現ライブラ
リーからプレート活性分析によって、同様に単離され
る。
ィスのxdh遺伝子の単離のために、最初に大腸菌を用い
て、コスミド p3030（Penttiliaら,1984）または別の酵
母ベクター中で染色体遺伝子バンクが作製され、組換え
プラスミドが単離され、酵母中に導入される。xdh遺伝
子は酵母中での発現によって見分けることができ、プレ
ート活性分析によって検出できる。xdh遺伝子のcDNAコ
ピーは大腸菌中で作成されるλgtll cDNA発現ライブラ
リーからプレート活性分析によって、同様に単離され
る。
ピヒア スティピティスからxdh遺伝子を単離する他
の方法としては、次のようなものがある。キシリトール
脱水素酵素を供与体酵母よりクロマトグラフィー法で精
製し、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定する。このキシ
リトール脱水素酵素蛋白のＮ−末端アミノ酸配列をベー
スとしてオリゴヌクレオチドの混合物を合成する。この
オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子バンクのハイブ
リディゼーションに使用するかまたはオリゴdT−プライ
マーと一緒にPCR反応によって、mRNA群からxdhの特異的
配列を増幅するために使用する。その結果得られる遺伝
子またはcDNAをBS＋ベクターまたは同様のベクターを用
いてクローニングし、公知の方法によってxdh遺伝子の
配列を得られる。
の方法としては、次のようなものがある。キシリトール
脱水素酵素を供与体酵母よりクロマトグラフィー法で精
製し、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定する。このキシ
リトール脱水素酵素蛋白のＮ−末端アミノ酸配列をベー
スとしてオリゴヌクレオチドの混合物を合成する。この
オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子バンクのハイブ
リディゼーションに使用するかまたはオリゴdT−プライ
マーと一緒にPCR反応によって、mRNA群からxdhの特異的
配列を増幅するために使用する。その結果得られる遺伝
子またはcDNAをBS＋ベクターまたは同様のベクターを用
いてクローニングし、公知の方法によってxdh遺伝子の
配列を得られる。
xdh遺伝子は酵母中で酵母コスミド p3030（Penttila
ら,1984）を用いてクローン化された染色体のコピーか
ら発現できる。このようなxdh遺伝子を有する酵母にxrd
遺伝子を担持するプラスミドを導入する。
ら,1984）を用いてクローン化された染色体のコピーか
ら発現できる。このようなxdh遺伝子を有する酵母にxrd
遺伝子を担持するプラスミドを導入する。
また、xdh cDNAの全長は、pMA91またはpKB102（Blomq
vistら,1991）等の適切な発現ベクターの酵母遺伝子調
節領域の間に、好ましくは酵母PGK1またはADH1のプロモ
ーターおよびターミネーターの間に挿入することによっ
てクローニングできる。pKB102に構築された発現カセッ
トは、プラスミドから取り出し、複数コピーを自己複製
する酵母ベクターまたは酵母の形質転換用にURA3あるい
はHIS3等の適切なマーカーを担持する単一コピーを自己
複製する酵母ベクターを用いてクローニングできる。そ
してクローンされたプラスミドは、適切な宿主株または
キシロース還元酵素をコードする遺伝子を担持する株に
導入できる。
vistら,1991）等の適切な発現ベクターの酵母遺伝子調
節領域の間に、好ましくは酵母PGK1またはADH1のプロモ
ーターおよびターミネーターの間に挿入することによっ
てクローニングできる。pKB102に構築された発現カセッ
トは、プラスミドから取り出し、複数コピーを自己複製
する酵母ベクターまたは酵母の形質転換用にURA3あるい
はHIS3等の適切なマーカーを担持する単一コピーを自己
複製する酵母ベクターを用いてクローニングできる。そ
してクローンされたプラスミドは、適切な宿主株または
キシロース還元酵素をコードする遺伝子を担持する株に
導入できる。
xdh遺伝子はまた、xrd遺伝子について上述した方法と
同様にして酵母遺伝子に組み込むことができる。
同様にして酵母遺伝子に組み込むことができる。
このように、本発明は、キシロース還元酵素およびキ
シリトール脱水素酵素を共に発現させることができる新
規な酵母株を作製するための方法にして、 （ａ）キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵
素をそれぞれコードするDNA分子を適切な供与体生物か
ら単離し、 （ｂ）それぞれのDNA分子のどちらか一方を担持する酵
母ベクターを構築し、そして （ｃ）両方のベクターを適切な宿主酵母に導入すること
を包含する方法を提供する。
シリトール脱水素酵素を共に発現させることができる新
規な酵母株を作製するための方法にして、 （ａ）キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵
素をそれぞれコードするDNA分子を適切な供与体生物か
ら単離し、 （ｂ）それぞれのDNA分子のどちらか一方を担持する酵
母ベクターを構築し、そして （ｃ）両方のベクターを適切な宿主酵母に導入すること
を包含する方法を提供する。
また、本発明は、活性なキシロース還元酵素およびキ
シリトール脱水素酵素を酵母株中で共に発現させるため
の方法にして、 （ａ）適切な供与体生物より、キシロース還元酵素およ
びキシリトール脱水素酵素をそれぞれコードするDNA分
子を単離し、 （ｂ）それぞれのDNA分子をそれぞれ担持する酵母ベク
ターを構築し、 （ｃ）得られたそれぞれのベクターを適切な宿主酵母に
導入して組換え酵母株を得、 （ｄ）該組換え酵母株を、該組換え酵母株中の各遺伝子
を発現できる培地か、またはキシロース含有培地にて培
養し、そして （ｅ）培地中に産生する各目的生成物を単離精製する ことを包含する方法を提供する。
シリトール脱水素酵素を酵母株中で共に発現させるため
の方法にして、 （ａ）適切な供与体生物より、キシロース還元酵素およ
びキシリトール脱水素酵素をそれぞれコードするDNA分
子を単離し、 （ｂ）それぞれのDNA分子をそれぞれ担持する酵母ベク
ターを構築し、 （ｃ）得られたそれぞれのベクターを適切な宿主酵母に
導入して組換え酵母株を得、 （ｄ）該組換え酵母株を、該組換え酵母株中の各遺伝子
を発現できる培地か、またはキシロース含有培地にて培
養し、そして （ｅ）培地中に産生する各目的生成物を単離精製する ことを包含する方法を提供する。
キシロースの消費および生産物（エタノール、キシリ
トール、酢酸等）の生成は、例えばHPLCで分析する（Ha
hn−Ｈgerdalら,1986;LindｎとHahan−Ｈgerdal,
1989a,b）。
トール、酢酸等）の生成は、例えばHPLCで分析する（Ha
hn−Ｈgerdalら,1986;LindｎとHahan−Ｈgerdal,
1989a,b）。
実施例１ ピヒア スティピティス由来キシロース還元酵素の精
製 ピヒア スティピティスを、１リットル容の発酵器を
用いてキシロース含有培地（0.3％酵母抽出物、0.3％麦
芽抽出物、0.5％ペプトン、1.9％リン酸二水素カリウ
ム、0.3％リン酸水素二アンモニウム、0.1％硫酸マグネ
シウムおよび５％キシロース、pH5）で育生し、対数増
殖期後期に回収した。湿重量30gの細胞ペーストを凍結
圧縮（Ｘ−press）により粉砕し、加速度1,500gで10分
間遠心分離して無細胞抽出物を得た。
製 ピヒア スティピティスを、１リットル容の発酵器を
用いてキシロース含有培地（0.3％酵母抽出物、0.3％麦
芽抽出物、0.5％ペプトン、1.9％リン酸二水素カリウ
ム、0.3％リン酸水素二アンモニウム、0.1％硫酸マグネ
シウムおよび５％キシロース、pH5）で育生し、対数増
殖期後期に回収した。湿重量30gの細胞ペーストを凍結
圧縮（Ｘ−press）により粉砕し、加速度1,500gで10分
間遠心分離して無細胞抽出物を得た。
粗抽出物を２倍に濃縮して、137mlのセファデックス
Ｇ−200（ファーマシア社製、ウプサラ市、スウェーデ
ン）カラムに入れた。流速毎時6mlで蛋白が溶出し、キ
シロース還元酵素活性を示す分画9mlをプールした。
Ｇ−200（ファーマシア社製、ウプサラ市、スウェーデ
ン）カラムに入れた。流速毎時6mlで蛋白が溶出し、キ
シロース還元酵素活性を示す分画9mlをプールした。
プールした分画をpH6の0.02Mリン酸アンモニウム緩衝
液で平衡化した37mlのDEAE−セファロース（ファーマシ
ア社製）カラムに入れた。0.02Mのリン酸アンモニウム
緩衝液中において、流速毎分12mlで、250mlの０〜0.5M
の塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて溶離した。キシロ
ース還元酵素活性を示す分画6mlをプールし、1mlに濃縮
した。濃縮したサンプル1mlを、pH6の0.02Mのリン酸ア
ンモニウム緩衝液で平衡化した1mlのHPLACカラム｛ciba
cron blue F36−A;パーストープ バイオリティカ（Pre
storp Biolytica）社製、ルンド市、スウェーデン｝に
入れた。キシロース還元酵素の溶出は、リン酸アンモニ
ウム緩衝液中において、流速毎分1mlで、０〜2M塩化ナ
トリウムの濃度勾配を用いて行なった。キシロース還元
酵素活性を示す分画6mlをプールし、４℃で一晩透析し
た。
液で平衡化した37mlのDEAE−セファロース（ファーマシ
ア社製）カラムに入れた。0.02Mのリン酸アンモニウム
緩衝液中において、流速毎分12mlで、250mlの０〜0.5M
の塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて溶離した。キシロ
ース還元酵素活性を示す分画6mlをプールし、1mlに濃縮
した。濃縮したサンプル1mlを、pH6の0.02Mのリン酸ア
ンモニウム緩衝液で平衡化した1mlのHPLACカラム｛ciba
cron blue F36−A;パーストープ バイオリティカ（Pre
storp Biolytica）社製、ルンド市、スウェーデン｝に
入れた。キシロース還元酵素の溶出は、リン酸アンモニ
ウム緩衝液中において、流速毎分1mlで、０〜2M塩化ナ
トリウムの濃度勾配を用いて行なった。キシロース還元
酵素活性を示す分画6mlをプールし、４℃で一晩透析し
た。
精製度および分子量は、SDSポリアクリルアミドゲル
（T 8.8〜21.3％、C 2.6％）濃度勾配電気泳動（Laemml
i,1970）および無変性ポリアクリルアミドゲル（ファー
マシア社製プリメイドゲル、4/30）濃度勾配電気泳動
（ファーマシア社製垂直電気泳動システム）で分析し
た。この場合ファーマシア社製の低分子量、高分子量標
準を使用した。25％メタノールおよび10％酢酸中に溶解
した0.1％クーマシー ブルーＲ−250（シグマ社製）で
ゲル染色を行った。SDSポリアクリルアミドゲルおよび
無変性ポリアクリルアミドゲルにおいて、HPLAC後のキ
シロース還元酵素分画が単一バンドとして現われた（デ
ータは無表示）。ザイモグラム技術によるキシロース還
元酵素の特異染色でも、無変性ポリアクリルアミドゲル
における単一バンドがキシロース還元酵素のものである
ことがわかった（データは無表示）。SDSポリアクリル
アミドゲル（図６参照）および無変性ポリアクリルアミ
ドゲルにおけるサブユニットの推定分子量は38,000±10
00、本体蛋白質の推定分子量は76,000±1000であった。
（T 8.8〜21.3％、C 2.6％）濃度勾配電気泳動（Laemml
i,1970）および無変性ポリアクリルアミドゲル（ファー
マシア社製プリメイドゲル、4/30）濃度勾配電気泳動
（ファーマシア社製垂直電気泳動システム）で分析し
た。この場合ファーマシア社製の低分子量、高分子量標
準を使用した。25％メタノールおよび10％酢酸中に溶解
した0.1％クーマシー ブルーＲ−250（シグマ社製）で
ゲル染色を行った。SDSポリアクリルアミドゲルおよび
無変性ポリアクリルアミドゲルにおいて、HPLAC後のキ
シロース還元酵素分画が単一バンドとして現われた（デ
ータは無表示）。ザイモグラム技術によるキシロース還
元酵素の特異染色でも、無変性ポリアクリルアミドゲル
における単一バンドがキシロース還元酵素のものである
ことがわかった（データは無表示）。SDSポリアクリル
アミドゲル（図６参照）および無変性ポリアクリルアミ
ドゲルにおけるサブユニットの推定分子量は38,000±10
00、本体蛋白質の推定分子量は76,000±1000であった。
精製した酵素はポリクローナル抗体の作製および酵素
のＮ−末端アミノ酸配列を作製するために使用した｛マ
ーク バウマン（Marc Bauman）医科化学教室、ヘルシ
ンキ大学｝（配列番号１）。
のＮ−末端アミノ酸配列を作製するために使用した｛マ
ーク バウマン（Marc Bauman）医科化学教室、ヘルシ
ンキ大学｝（配列番号１）。
実施例２ ピヒア スティピティス由来のキシロース還元酵素をコ
ードする遺伝子のクローニング １リットルのピヒア スティピティス培養物をキシロ
ース含有培地で培養し（実施例１参照）、対数増殖期後
期に回収した。回収した細胞はザイモラーゼでスフェロ
プラストにし、チオシアン酸グアニジウム溶液60mlに懸
濁して、RNAをキルグインら（Chirgwinら,1979）の方法
によって単離した。次に、RNAをオリゴ（dt）セルロー
スアフィニティクロマトグラフィーカラムに通した。溶
出緩衝液のイオン強度を低下させることによって、Poly
（Ａ＋）mRNAを溶出した。アマーシャム（Amersham）社
製cDNA合成キットを使用しcDNAをmRNAから合成し、cDNA
クローニングキットと、λgtllベクターを用いてクロー
ニングした。３〜４時間生育した後、プラークをイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）に浸析した
ニトロセルロース膜にレプリカ平板法で移し取り、一晩
培養した。キシロース還元酵素に対するラビットの抗血
清およびアルカリフォスフォターゼと結合した山羊の抗
ラビット抗体を用いて、組換えベクター（YoungとDavie
s,1983）の免疫的スクリーニングを上記ニトロセルロー
ス膜を用いて行なった。陽性のクローンをシャーレから
釣菌し、ベクター特異プライマーを使用し、挿入したDN
AをPCR法（ＧssowとClackson,1989）で増幅した。得
られたDNA断片について制限酵素分析し、さらにBamH I
で切断後、その切断片をBamH Iで切断したBS＋ベクター
｛ストラテジーン（Stratagene）社製｝を用いてクロー
ニングした。最長のcDNAクローンpJHXR20について２本
鎖ジデオキシヌクレオチド法（Zagurskyら,1986）によ
るシークエンシングを行なった。
ードする遺伝子のクローニング １リットルのピヒア スティピティス培養物をキシロ
ース含有培地で培養し（実施例１参照）、対数増殖期後
期に回収した。回収した細胞はザイモラーゼでスフェロ
プラストにし、チオシアン酸グアニジウム溶液60mlに懸
濁して、RNAをキルグインら（Chirgwinら,1979）の方法
によって単離した。次に、RNAをオリゴ（dt）セルロー
スアフィニティクロマトグラフィーカラムに通した。溶
出緩衝液のイオン強度を低下させることによって、Poly
（Ａ＋）mRNAを溶出した。アマーシャム（Amersham）社
製cDNA合成キットを使用しcDNAをmRNAから合成し、cDNA
クローニングキットと、λgtllベクターを用いてクロー
ニングした。３〜４時間生育した後、プラークをイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）に浸析した
ニトロセルロース膜にレプリカ平板法で移し取り、一晩
培養した。キシロース還元酵素に対するラビットの抗血
清およびアルカリフォスフォターゼと結合した山羊の抗
ラビット抗体を用いて、組換えベクター（YoungとDavie
s,1983）の免疫的スクリーニングを上記ニトロセルロー
ス膜を用いて行なった。陽性のクローンをシャーレから
釣菌し、ベクター特異プライマーを使用し、挿入したDN
AをPCR法（ＧssowとClackson,1989）で増幅した。得
られたDNA断片について制限酵素分析し、さらにBamH I
で切断後、その切断片をBamH Iで切断したBS＋ベクター
｛ストラテジーン（Stratagene）社製｝を用いてクロー
ニングした。最長のcDNAクローンpJHXR20について２本
鎖ジデオキシヌクレオチド法（Zagurskyら,1986）によ
るシークエンシングを行なった。
キシロース還元酵素をコードするcDNAの全長がクロー
ニングされたかの検証はキシロース還元酵素蛋白質のＮ
−末端アミノ酸配列とシークエンシングした遺伝子（配
列番号１および２）を比較することで行った。
ニングされたかの検証はキシロース還元酵素蛋白質のＮ
−末端アミノ酸配列とシークエンシングした遺伝子（配
列番号１および２）を比較することで行った。
xrd遺伝子の複製染色体コピーは、コード領域の5'末
端（GCGGATCCTCTAGAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGG）に対
応し、コード領域の3'末端（TTGGATCCTCTAGATTAGACGAAG
ATAGGAATCTTGTCCC）にそれぞれ対応し、且つ、それぞれ
BamH IおよびXba I制限部位を有する各プライマーを使
用し、ピヒア スティピティスCBS−6054（Priorら、19
89）から単離した全染色体DNA（Cryerら、1979）のPCR
反応によって得た。PCR反応物を、BamH Iで分解し、プ
ラスミドpMA91（Mellorら、1983）のBgl II部位に挿入
してpUA103を得た（図１参照）。染色体コピーのDNA配
列をプラスミドのpJHXR20のcDNA配列と比較した結果、
イントロンを有さないことが判った。
端（GCGGATCCTCTAGAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGG）に対
応し、コード領域の3'末端（TTGGATCCTCTAGATTAGACGAAG
ATAGGAATCTTGTCCC）にそれぞれ対応し、且つ、それぞれ
BamH IおよびXba I制限部位を有する各プライマーを使
用し、ピヒア スティピティスCBS−6054（Priorら、19
89）から単離した全染色体DNA（Cryerら、1979）のPCR
反応によって得た。PCR反応物を、BamH Iで分解し、プ
ラスミドpMA91（Mellorら、1983）のBgl II部位に挿入
してpUA103を得た（図１参照）。染色体コピーのDNA配
列をプラスミドのpJHXR20のcDNA配列と比較した結果、
イントロンを有さないことが判った。
実施例３ ピヒア スティピティス由来のキシリトール脱水素酵素
の精製 ピヒア スティピティスを（実施例１）に記載のキシ
ロース含有培地で育生し、湿重量30gの細胞ペーストを
凍結圧縮（Ｘ−press）により粉砕し、加速度1,500g
で、10分間遠心分離して無細胞抽出物を得た。
の精製 ピヒア スティピティスを（実施例１）に記載のキシ
ロース含有培地で育生し、湿重量30gの細胞ペーストを
凍結圧縮（Ｘ−press）により粉砕し、加速度1,500g
で、10分間遠心分離して無細胞抽出物を得た。
遠心分離した無細胞抽出物を３倍に濃縮し、25％グリ
セロール、1mM DTT、1mM EDTAを含むpH6の0.05Mリン酸
アンモニウム緩衝液で平衡化した137mlのセファロース6
Bカラム中において流速毎時6mlで、上記濃縮物5mlをゲ
ル濾過した。SmileyとBolen（1982）による方法で測定
したキシリトール脱水素酵素活性を示す分画をプール
し、25％グリセロール、1mMのDTT、1mMのEDTAを含むpH
6、0.05Mのリン酸アンモニウム緩衝液で平衡化した37ml
イオン交換クロマトグラフカラム（DEAE−セファロー
ス）に入れた。キシリトール脱水素酵素含有分画は、流
速毎分12mlで、250mlの０〜0.5M塩化ナトリウム濃度勾
配で溶出して、貯えられた。一部精製した酵素はポリア
クリルアミドゲルを通し、PVD膜上にブロットした。キ
シリトール脱水素酵素に対応するバンドを切り出し、Ｎ
−末端アミノ酸配列を直接膜から決定した。
セロール、1mM DTT、1mM EDTAを含むpH6の0.05Mリン酸
アンモニウム緩衝液で平衡化した137mlのセファロース6
Bカラム中において流速毎時6mlで、上記濃縮物5mlをゲ
ル濾過した。SmileyとBolen（1982）による方法で測定
したキシリトール脱水素酵素活性を示す分画をプール
し、25％グリセロール、1mMのDTT、1mMのEDTAを含むpH
6、0.05Mのリン酸アンモニウム緩衝液で平衡化した37ml
イオン交換クロマトグラフカラム（DEAE−セファロー
ス）に入れた。キシリトール脱水素酵素含有分画は、流
速毎分12mlで、250mlの０〜0.5M塩化ナトリウム濃度勾
配で溶出して、貯えられた。一部精製した酵素はポリア
クリルアミドゲルを通し、PVD膜上にブロットした。キ
シリトール脱水素酵素に対応するバンドを切り出し、Ｎ
−末端アミノ酸配列を直接膜から決定した。
実施例４ キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子のクローニ
ングおよびサッカロミセス セレビシエ種中での発現 実施例２で記載し、得られたと同様のλgt11のcDNAラ
イブラリーを育生し、プラークをイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド（IPTG）に浸析したニトロセルロー
ス膜上にレプリカ平板法で移し取り、３時間培養した。
その膜を10mlのザイモグラム溶液｛0.1M、pH7のリン酸
緩衝液、1.5mM NAD、0.25mMのニトロブルー テトラゾ
リウム（Nitroblue tetrazolium）、65μＭフェナジン
メトスルフェート、0.4Mキシリトール｝に浸析すること
で、特異的なキシリトール脱水素酵素活性（ザイモグラ
ム）のスクリーニングを行った。陽性のクローン（図
２）をシャーレから釣菌し、ふたつのクローンが挿入さ
れたDNAをベクターに特異的なプライマー（5'−GGTGGCG
ACGACTCCTGGAGCCCG、5'−TTGACACCAGACCAACTGGTAATG）
を用いて、PCR法（ＧssowとClackson,1989）で増幅し
た。得られた同じ長さのDNA断片は、切断酵素および不
切断酵素を制限酵素分析で調べ、BamH Iで切断後、BamH
Iで切断されたベクターpSP72（Promega）にさらにクロ
ーニングした。プラスミドpJHXDH50は最長cDNAクローン
を担持する（図３）。xdh遺伝子の染色体コピーをクロ
ーニングするために、染色体DNAをピヒア スティピテ
ィスCBS−6054株（Priorら、1989）から単離し（Cryer
ら、1979）、Sau3Aで部分的に切断した。部分分解したD
NAをショ糖密度勾配遠心分離法（15〜40％）で35〜45キ
ロベースサイズの断片に分画精製し、その断片をBamH I
で切断したp3030酵母コスミドベクター（Penttilら、
1984）｝に繋ぎあわせた。繋ぎ合わせた分子をアマーシ
ャム社製｛Amersham Ltd.,（英国）｝のin vitroパッケ
ージキットを用いてλ粒子にパッケージし、大腸菌HB10
1（Maniatisら、1982）に導入した。組換えコスミドDNA
は得られた約15000の貯蔵遺伝子バンクのクローンから
単離し、サッカロミセス セレビシエS150−2B（a,his3
−dell,lue2−3,leu2−112,trpl−289,ura3−52,cir+,G
al+）（Baldariら、1987）株中にヒスチジン欠乏完全合
成培地（Sc−his）プレート上でHis陽性形質転換ベクタ
ーをスクリーニングして導入した。ニトロセルロース
フィルター上でその遺伝子バンクのリプリカを取り、フ
ィルターをクロロホルム中で５分間培養することによっ
て、細胞を破壊し、λgt11ライブラリー用に上述したよ
うな活性分析を行った。数個の陽性クローン（H494,H49
5,H496,H497およびVTT−Ｃ−91181株）を得、VTT−Ｃ−
91181（図４）株はさらに研究に供された。
ングおよびサッカロミセス セレビシエ種中での発現 実施例２で記載し、得られたと同様のλgt11のcDNAラ
イブラリーを育生し、プラークをイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド（IPTG）に浸析したニトロセルロー
ス膜上にレプリカ平板法で移し取り、３時間培養した。
その膜を10mlのザイモグラム溶液｛0.1M、pH7のリン酸
緩衝液、1.5mM NAD、0.25mMのニトロブルー テトラゾ
リウム（Nitroblue tetrazolium）、65μＭフェナジン
メトスルフェート、0.4Mキシリトール｝に浸析すること
で、特異的なキシリトール脱水素酵素活性（ザイモグラ
ム）のスクリーニングを行った。陽性のクローン（図
２）をシャーレから釣菌し、ふたつのクローンが挿入さ
れたDNAをベクターに特異的なプライマー（5'−GGTGGCG
ACGACTCCTGGAGCCCG、5'−TTGACACCAGACCAACTGGTAATG）
を用いて、PCR法（ＧssowとClackson,1989）で増幅し
た。得られた同じ長さのDNA断片は、切断酵素および不
切断酵素を制限酵素分析で調べ、BamH Iで切断後、BamH
Iで切断されたベクターpSP72（Promega）にさらにクロ
ーニングした。プラスミドpJHXDH50は最長cDNAクローン
を担持する（図３）。xdh遺伝子の染色体コピーをクロ
ーニングするために、染色体DNAをピヒア スティピテ
ィスCBS−6054株（Priorら、1989）から単離し（Cryer
ら、1979）、Sau3Aで部分的に切断した。部分分解したD
NAをショ糖密度勾配遠心分離法（15〜40％）で35〜45キ
ロベースサイズの断片に分画精製し、その断片をBamH I
で切断したp3030酵母コスミドベクター（Penttilら、
1984）｝に繋ぎあわせた。繋ぎ合わせた分子をアマーシ
ャム社製｛Amersham Ltd.,（英国）｝のin vitroパッケ
ージキットを用いてλ粒子にパッケージし、大腸菌HB10
1（Maniatisら、1982）に導入した。組換えコスミドDNA
は得られた約15000の貯蔵遺伝子バンクのクローンから
単離し、サッカロミセス セレビシエS150−2B（a,his3
−dell,lue2−3,leu2−112,trpl−289,ura3−52,cir+,G
al+）（Baldariら、1987）株中にヒスチジン欠乏完全合
成培地（Sc−his）プレート上でHis陽性形質転換ベクタ
ーをスクリーニングして導入した。ニトロセルロース
フィルター上でその遺伝子バンクのリプリカを取り、フ
ィルターをクロロホルム中で５分間培養することによっ
て、細胞を破壊し、λgt11ライブラリー用に上述したよ
うな活性分析を行った。数個の陽性クローン（H494,H49
5,H496,H497およびVTT−Ｃ−91181株）を得、VTT−Ｃ−
91181（図４）株はさらに研究に供された。
VTT−Ｃ−91181株のキシリトール脱水素酵素活性をフ
レンチプレスで圧縮した25％のグリセロールを含有する
全細胞溶出物でスミレイとボレン（SmileyとBolen,198
2）の方法でテストした。VTT−Ｃ−91181株からDNAを単
離し、DNAを大腸菌DH5αに導入することで、プラスミド
pMW22を救済した。
レンチプレスで圧縮した25％のグリセロールを含有する
全細胞溶出物でスミレイとボレン（SmileyとBolen,198
2）の方法でテストした。VTT−Ｃ−91181株からDNAを単
離し、DNAを大腸菌DH5αに導入することで、プラスミド
pMW22を救済した。
プラスミドpMW22を担持するサッカロミセス セレビ
シエVTT−Ｃ−91181株はブタペスト条約により英国のザ
ナショナル コレクション オブ イースト カルチ
ャー｛The National Collection of Yeast Cultures（N
CYC）｝、菌寄No.2352で1991年３月29日に寄託した。
シエVTT−Ｃ−91181株はブタペスト条約により英国のザ
ナショナル コレクション オブ イースト カルチ
ャー｛The National Collection of Yeast Cultures（N
CYC）｝、菌寄No.2352で1991年３月29日に寄託した。
実施例５ サッカロミセス セレビシエでのキシロース還元酵素の
発現 PGK遺伝子の調節領域を有す、キシロース還元酵素を
コードする遺伝子はプラスミドpUA103（実施例２）から
Hind IIIで取り出し、単一複製ベクターpRS305（Sikors
kiとHieter,1989）のHind III部位にクローニングし
た。酵母PGKプロモーターに対して正の方向にキシロー
ス還元酵素をコードする遺伝子を導入してpUA107（図
１）となったプラスミドを、塩化リチウム法（伊藤ら、
1983）により、Leu陽性の形質転換ベクターを選んでサ
ッカロミセス セレビシエS150−２株（実施例４参照）
およびGPY55−15Bα株（leu2−3,leu2−112,ura3−52,t
rpl−289,his4−519,prbl,cir+）に導入して、それぞれ
新規組換え株サッカロミセスセレビシエH481およびH479
とした。プラスミドpUA103をサッカロミセス セレビシ
エS150−２株、GPY15Bα株に導入してそれぞれH477およ
びH475とした。
発現 PGK遺伝子の調節領域を有す、キシロース還元酵素を
コードする遺伝子はプラスミドpUA103（実施例２）から
Hind IIIで取り出し、単一複製ベクターpRS305（Sikors
kiとHieter,1989）のHind III部位にクローニングし
た。酵母PGKプロモーターに対して正の方向にキシロー
ス還元酵素をコードする遺伝子を導入してpUA107（図
１）となったプラスミドを、塩化リチウム法（伊藤ら、
1983）により、Leu陽性の形質転換ベクターを選んでサ
ッカロミセス セレビシエS150−２株（実施例４参照）
およびGPY55−15Bα株（leu2−3,leu2−112,ura3−52,t
rpl−289,his4−519,prbl,cir+）に導入して、それぞれ
新規組換え株サッカロミセスセレビシエH481およびH479
とした。プラスミドpUA103をサッカロミセス セレビシ
エS150−２株、GPY15Bα株に導入してそれぞれH477およ
びH475とした。
またキシロース還元酵素をコードする遺伝子を酵母染
色体のリボソームRNA遺伝子座に導入した。プラスミド
のpIRL9リボソーム配列をEcoR Iにより取り出し、平滑
末端化し、BS＋ベクターのXbal部位の平滑末端にクロー
ニングしてベクターPJHR21を得た。PGKプロモーターと
ターミネーターとの間に挿入されたキシロース還元酵素
をコードする遺伝子はベクターpUA103からHind III断片
として取り出し、平滑末端化しプラスミドpJHR21のリボ
ソーム配列の平滑末端化したXbal部位にクローニングし
た。その結果得られたプラスミドpJHXR22（図５）か
ら、リボソーム配列ではさんだ発現カセットをBS＋のポ
リリンカー特有の制限酵素部位で切断することで取り出
した。この断片を形質転換のマーカーを有す自己複製プ
ラスミドと一緒に酵母に導入した。上述の酵素活性試験
により、得られた形質導入株のキシロース還元酵素をコ
ードする遺伝子の存在をスクリーニングし、そして導入
のパターンはサザーンブロット分析で調べた。無選択YP
D成長培地で細胞を培養することによって自己複製プラ
スミドをキシロース還元酵素発現カセットを担持する細
胞から除去した。
色体のリボソームRNA遺伝子座に導入した。プラスミド
のpIRL9リボソーム配列をEcoR Iにより取り出し、平滑
末端化し、BS＋ベクターのXbal部位の平滑末端にクロー
ニングしてベクターPJHR21を得た。PGKプロモーターと
ターミネーターとの間に挿入されたキシロース還元酵素
をコードする遺伝子はベクターpUA103からHind III断片
として取り出し、平滑末端化しプラスミドpJHR21のリボ
ソーム配列の平滑末端化したXbal部位にクローニングし
た。その結果得られたプラスミドpJHXR22（図５）か
ら、リボソーム配列ではさんだ発現カセットをBS＋のポ
リリンカー特有の制限酵素部位で切断することで取り出
した。この断片を形質転換のマーカーを有す自己複製プ
ラスミドと一緒に酵母に導入した。上述の酵素活性試験
により、得られた形質導入株のキシロース還元酵素をコ
ードする遺伝子の存在をスクリーニングし、そして導入
のパターンはサザーンブロット分析で調べた。無選択YP
D成長培地で細胞を培養することによって自己複製プラ
スミドをキシロース還元酵素発現カセットを担持する細
胞から除去した。
形質転換株を最小選択培地で育生し、キシロース還元
酵素の発現をキシロース還元酵素特異的抗体を使用する
ウエスタンブロッティングおよびプロメガのアルカリフ
ォスファターゼ法（図６）およびフレンチプレスで破壊
した酵母細胞の粗抽出物から酵素活性を測定する方法
（SmileyとBolen,1982）で分析した（図７）。
酵素の発現をキシロース還元酵素特異的抗体を使用する
ウエスタンブロッティングおよびプロメガのアルカリフ
ォスファターゼ法（図６）およびフレンチプレスで破壊
した酵母細胞の粗抽出物から酵素活性を測定する方法
（SmileyとBolen,1982）で分析した（図７）。
実施例６ 組換えサッカロミセス セレビシエ由来のキシロース還
元酵素の精製 組換えサッカロミセス セレビシエH477株を1.5リッ
トル容の発酵器を用いて20g/lグルコースを含有するス
クルー（Scleu）培地で培養した。成長を比濁分析で追
跡し、指数関数的増幅期後期に細胞を遠心分離によって
回収し、1.5mMのフェニルメチルフッ化スルホニルを含
有する0.1M、pH7.0のリン酸緩衝液で洗浄し、酵母濃度
が100g（乾燥重量）/lになるよう懸濁した。高圧ホモジ
ナイザー（フレンチプレス）を圧力1000バールで三回通
し、細胞を粉砕した。ホモジネートを30分、加速度1500
0gで遠心分離し、一部浄化した。実施例１でピヒア ス
ティピティスについて記述したように、キシロース還元
酵素を浄化したホモジネートから精製した。
元酵素の精製 組換えサッカロミセス セレビシエH477株を1.5リッ
トル容の発酵器を用いて20g/lグルコースを含有するス
クルー（Scleu）培地で培養した。成長を比濁分析で追
跡し、指数関数的増幅期後期に細胞を遠心分離によって
回収し、1.5mMのフェニルメチルフッ化スルホニルを含
有する0.1M、pH7.0のリン酸緩衝液で洗浄し、酵母濃度
が100g（乾燥重量）/lになるよう懸濁した。高圧ホモジ
ナイザー（フレンチプレス）を圧力1000バールで三回通
し、細胞を粉砕した。ホモジネートを30分、加速度1500
0gで遠心分離し、一部浄化した。実施例１でピヒア ス
ティピティスについて記述したように、キシロース還元
酵素を浄化したホモジネートから精製した。
実施例７ キシリトールのin vitro生産 0.33Mのキシロース、0.33Mのグルコース−６−リン
酸、0.67mMのNADPH、0.1Mのリン酸緩衝液（pH7.0）、1n
kat/mlのキシロース還元酵素活性をもつ精製したキシロ
ース還元酵素（実施例６）またはH475株の希釈粗ホモジ
ネート由来の活性値1nkat/mlキシロース還元酵素、活性
値1nkat/mlのグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含む
反応混合物を20℃で、５時間培養した。サンプルを一定
時間毎に取り出し、ベーリンガー（Boehringer）のキシ
リトールキットを使用しキシリトールを分析した。毎時
0.14g/lを越える一定のキシリトールの生産率が得られ
た。
酸、0.67mMのNADPH、0.1Mのリン酸緩衝液（pH7.0）、1n
kat/mlのキシロース還元酵素活性をもつ精製したキシロ
ース還元酵素（実施例６）またはH475株の希釈粗ホモジ
ネート由来の活性値1nkat/mlキシロース還元酵素、活性
値1nkat/mlのグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含む
反応混合物を20℃で、５時間培養した。サンプルを一定
時間毎に取り出し、ベーリンガー（Boehringer）のキシ
リトールキットを使用しキシリトールを分析した。毎時
0.14g/lを越える一定のキシリトールの生産率が得られ
た。
実施例８ キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素の同
時発現 プラスミドpUA103およびpUA107をxdh遺伝子をプラス
ミドpMW22上に担持するVTT−Ｃ−91181株に導入した。
形質転換株をロイシン、ヒスキジン欠乏完全合成培地
（Sc−leu−his）プレート上で選択して、プレート上に
保存した。キシリトール脱水素酵素活性の保持をプレー
ト活性分析で、キシロース還元酵素活性測定は上述の方
法で確認した。更に研究に供すプラスミドpUA103および
PMW22を担持する両クローンをH492およびH493と名付け
た。
時発現 プラスミドpUA103およびpUA107をxdh遺伝子をプラス
ミドpMW22上に担持するVTT−Ｃ−91181株に導入した。
形質転換株をロイシン、ヒスキジン欠乏完全合成培地
（Sc−leu−his）プレート上で選択して、プレート上に
保存した。キシリトール脱水素酵素活性の保持をプレー
ト活性分析で、キシロース還元酵素活性測定は上述の方
法で確認した。更に研究に供すプラスミドpUA103および
PMW22を担持する両クローンをH492およびH493と名付け
た。
プラスミドpJHXDH50から全長のxdh cDNAを酵母ADHIの
プロモーターとターミネーターの間にあるベクターPKB1
02（Blomqvistら、1991）のHind III部位にクローニン
グした。このクローニングされたプラスミドpJHXDH60
（図８）から発現カセットをBamH Iで取り出し、自己複
製酵母ベクターp3030のBamH I部位にクローンしプラス
ミドpJHXDH70とした。得られたプラスミドをロイシン、
ヒスキジン欠乏完全合成培地プレート上で選択したキシ
ロース還元酵素をコードするH477株（実施例５）に導入
し、サッカロミセス セレビシエのxdh遺伝子の発現を
酵素活性測定（SmileyとBolen,1982）でテストした。
プロモーターとターミネーターの間にあるベクターPKB1
02（Blomqvistら、1991）のHind III部位にクローニン
グした。このクローニングされたプラスミドpJHXDH60
（図８）から発現カセットをBamH Iで取り出し、自己複
製酵母ベクターp3030のBamH I部位にクローンしプラス
ミドpJHXDH70とした。得られたプラスミドをロイシン、
ヒスキジン欠乏完全合成培地プレート上で選択したキシ
ロース還元酵素をコードするH477株（実施例５）に導入
し、サッカロミセス セレビシエのxdh遺伝子の発現を
酵素活性測定（SmileyとBolen,1982）でテストした。
実施例９ 組換えサッカロミセス セレビシエによるin vivoでの
キシリトール製造 H475およびH477酵母株を10g/l酵母抽出物、20g/lバク
トペプトンおよび20g/lグルコース含有培地で1.5リット
ル容の発酵器を用いて培養した。培養温度は30℃であっ
た。pHは4.5〜8.0に制御した。撹拌速度は400rpm、ばっ
気速度を0.5vvmにした。培養ブロスからのサンプルの分
析によってグルコースが消費されると、100ml中に1gの
グルコース、19gのキシロースを含有する溶液の送り込
みが毎分0.09mlの割合で始まった。全培養時間83時間
後、HPLCで分析すると培養ブロスのキシリトール濃度が
12.5g/lであった。これにより、培養に投与されたキシ
ロースからキシリトールが95％を越える収率で得られ
た。ベクターpMA91を担持するコントロール株を使用す
ると、同様の実験で８％未満のキシロースが消費され
た。
キシリトール製造 H475およびH477酵母株を10g/l酵母抽出物、20g/lバク
トペプトンおよび20g/lグルコース含有培地で1.5リット
ル容の発酵器を用いて培養した。培養温度は30℃であっ
た。pHは4.5〜8.0に制御した。撹拌速度は400rpm、ばっ
気速度を0.5vvmにした。培養ブロスからのサンプルの分
析によってグルコースが消費されると、100ml中に1gの
グルコース、19gのキシロースを含有する溶液の送り込
みが毎分0.09mlの割合で始まった。全培養時間83時間
後、HPLCで分析すると培養ブロスのキシリトール濃度が
12.5g/lであった。これにより、培養に投与されたキシ
ロースからキシリトールが95％を越える収率で得られ
た。ベクターpMA91を担持するコントロール株を使用す
ると、同様の実験で８％未満のキシロースが消費され
た。
実施例10 組換えサッカロミセス セレビシエによるキシロース発
酵 実施例９に記載のサッカロミセス セレビシエH492お
よびH493株を20g/lグルコースを含むロイシン、ヒスチ
ジン欠乏完全合成培地で回転振盪器によって培養した。
回転速度は200rpmとした。グルコースと生成したエタノ
ールの両方が消費されると、20g/lのキシロースを含む
ロイシン、ヒスチジン欠乏完全合成培地中での回転振盪
器による発酵の菌接種器として培養ブロスが使用され
た。回転速度は90rpmであった。発酵の間、サンプルを
採取しHPLC（Hahn−Ｈgerdalら、1986;LindenとHahn
−Ｈgerdal,1989a,b）によって分析することによりキ
シロースが消費され、次にエタノールとキシリトールが
生成した。
酵 実施例９に記載のサッカロミセス セレビシエH492お
よびH493株を20g/lグルコースを含むロイシン、ヒスチ
ジン欠乏完全合成培地で回転振盪器によって培養した。
回転速度は200rpmとした。グルコースと生成したエタノ
ールの両方が消費されると、20g/lのキシロースを含む
ロイシン、ヒスチジン欠乏完全合成培地中での回転振盪
器による発酵の菌接種器として培養ブロスが使用され
た。回転速度は90rpmであった。発酵の間、サンプルを
採取しHPLC（Hahn−Ｈgerdalら、1986;LindenとHahn
−Ｈgerdal,1989a,b）によって分析することによりキ
シロースが消費され、次にエタノールとキシリトールが
生成した。
実施例11 組換えサッカロミセス セレビシエによるキシロース含
有原料の発酵 キシロースの代わりに亜硫酸廃液を使用した発酵培地
で実施例10のようにサッカロミセス セレビシエH492お
よびH493株を培養した。キシロースが細胞、エタノール
およびキシリトールに変換した。
有原料の発酵 キシロースの代わりに亜硫酸廃液を使用した発酵培地
で実施例10のようにサッカロミセス セレビシエH492お
よびH493株を培養した。キシロースが細胞、エタノール
およびキシリトールに変換した。
寄託微生物 下記酵母株はブタペスト条約により英国NR4 7UA、ノー
ウィッチ（Norwich）、コロニーレーン（Coloney Lan
e）所在のノーウィッチ研究室、AFRC食品研究所Nationa
l Collection of Yeast Cultures（NCYC）に寄託され
た。
ウィッチ（Norwich）、コロニーレーン（Coloney Lan
e）所在のノーウィッチ研究室、AFRC食品研究所Nationa
l Collection of Yeast Cultures（NCYC）に寄託され
た。
配列 配列番号:1 配列の型：ペプチド 配列の長さ:9個のアミノ酸 トポロジー：直鎖状 起源：ピヒアスティピティスCBS−6054 直接実験情報：蛋白質精製およびＮ−末端シークエンシ
ング 特徴：完全な蛋白質の１番目から９番目のアミノ酸 特質：キシロース還元（NADPH/NADH）酵素のＮ−末端ペ
プチド 配列番号:2 配列の型：蛋白に対応するヌクレオチド 配列の長さ:954塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型:mRNAのcDNA,genomic DNA 起源：ピヒア スティピティス CBS−6054 直接実験情報:cDNAライブラリー genomic DNAからのPCR増幅物 特徴：完全な蛋白質の１〜954番目までの塩基対 特質：生産物のキシロース還元酵素（NADHP/NADH）活性
ング 特徴：完全な蛋白質の１番目から９番目のアミノ酸 特質：キシロース還元（NADPH/NADH）酵素のＮ−末端ペ
プチド 配列番号:2 配列の型：蛋白に対応するヌクレオチド 配列の長さ:954塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型:mRNAのcDNA,genomic DNA 起源：ピヒア スティピティス CBS−6054 直接実験情報:cDNAライブラリー genomic DNAからのPCR増幅物 特徴：完全な蛋白質の１〜954番目までの塩基対 特質：生産物のキシロース還元酵素（NADHP/NADH）活性
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オジャモ、ヘイキ フィンランド国、エスポー エスエフ― 02600、キルユリンクヤ ３ デー 25 (72)発明者 ワルフリードソン、マッツ フィンランド国、ルンド エス―222 34、アリンガワーゲン ９エー：504 (72)発明者 アイラクシーネン、ウラ フィンランド国、ヴァンタ エスエフ― 01300、レードキッティー、８ビー 26 (72)発明者 ケラネン シルカ フィンランド国、ヘルシンキ エスエフ ―00240、ラハカマリンカツ ４ビー 12 (72)発明者 ハーンハガデール、バーベル フィンランド国、ルンド エス―223 61、オストラ マーテンスガータン ５ (56)参考文献 Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ．，29（1988）ｐ. 148−154 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，28／29（1991．３．31），ｐ. 327−340 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/18 C12N 9/04 C12N 15/00
Claims (7)
- 【請求項１】キシリトールの製造方法にして、 （ａ）キシロース還元酵素をコードするDNA分子であっ
て、酵母株に導入すると該酵母株にキシロースのキシリ
トールへの還元能を与える第１のDNA分子と、キシロー
ス還元酵素活性の発現において必要とされる補助因子の
再生を高めることを可能とする、キシリトール脱水素酵
素を発現させる第２のDNA分子とによって形質転換され
た組換え酵母株を、キシロース含有培地中で培養し、 （ｂ）生成するキシリトールを培地から回収する ことを包含する方法。 - 【請求項２】該第１のDNA分子が、配列番号２で示され
るアミノ酸配列を本質的に含むポリペプチドまたはその
断片をコードし、該ポリペプチドまたはその断片がキシ
ロース還元酵素活性を呈することを特徴とする、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】該形質転換された組換え酵母株が、サッカ
ロミセスセレビシエ、クライベロミセス種、シゾサッカ
ロミセス ポンベおよびピヒア種からなる群から選ばれ
る種であることを特徴とする、請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項４】該形質転換された組換え酵母株が、プラス
ミドpMW22を担持するサッカロミセス セレビシエNCYC2
352（VTT−Ｃ−91181）株を、図１に示すプラスミドpUA
103を用いて更に形質転換して得られる酵母株であるこ
とを特徴とする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】キシロース還元酵素活性の発現において必
要とされる、NADPHおよびNADHからなる群から選ばれる
補助因子の再生を高めるための、少なくとも１種の付加
的炭素源が該キシロース含有培地中に存在することを特
徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】該付加的炭素源が、エタノール、グルコー
スまたはグリセロールであることを特徴とする、請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】酵素を用いるキシリトールの製造方法にし
て、 （ａ）キシロース還元酵素をコードするDNA分子によっ
て形質転換された組換え酵母株を、該キシロース還元酵
素が発現できる条件下で培養し、 （ｂ）該キシロース還元酵素を回収し、 （ｃ）補助因子再生系を有する反応器中で該キシロース
還元酵素を使用し、 （ｄ）生成するキシリトールを単離・精製する ことを包含する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI901771 | 1990-04-06 | ||
| FI901771A FI901771A (fi) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | Anvaendning av xylos hos hybridjaest. |
| US52777590A | 1990-05-24 | 1990-05-24 | |
| PCT/FI1991/000103 WO1991015588A1 (en) | 1990-04-06 | 1991-04-08 | Recombinant yeasts containing the dna sequences coding for xylose reductase- and xylitol dehydrogenase enzymes |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507843A JPH05507843A (ja) | 1993-11-11 |
| JP3348215B2 true JP3348215B2 (ja) | 2002-11-20 |
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ID=26158731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50690791A Expired - Fee Related JP3348215B2 (ja) | 1990-04-06 | 1991-04-08 | キシリトールの製造方法 |
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| JP (1) | JP3348215B2 (ja) |
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| FI (2) | FI901771A (ja) |
| GR (1) | GR3026489T3 (ja) |
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| FI913197A0 (fi) | 1991-07-01 | 1991-07-01 | Xyrofin Oy | Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol. |
| US7226761B2 (en) | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| EP0672161B1 (en) * | 1992-11-05 | 1999-09-22 | Xyrofin Oy | Recombinant method and host for manufacture of xylitol |
| US6723540B1 (en) | 1992-11-05 | 2004-04-20 | Xyrofin Oy | Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts |
| WO1994010325A1 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-11 | Xyrofin Oy | Recombinant method and host for manufacture of xylitol |
| US5789210A (en) * | 1993-11-08 | 1998-08-04 | Purdue Research Foundation | Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose |
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| CA2398237A1 (en) * | 2000-01-21 | 2001-07-26 | Xyrofin Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| US6894199B2 (en) | 2001-04-27 | 2005-05-17 | Danisco Sweeteners Oy | Process for the production of xylitol |
| FI20011889A (fi) | 2001-09-26 | 2003-03-27 | Xyrofin Oy | Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi |
| US8237014B2 (en) | 2006-02-27 | 2012-08-07 | Edenspace Systems Corporation | Energy crops for improved biofuel feedstocks |
| TWI438274B (zh) * | 2011-06-03 | 2014-05-21 | Inst Nuclear Energy Res Atomic Energy Council | 一種木糖代謝菌之製備方法及該木糖代謝菌 |
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| TWI450963B (zh) * | 2012-09-27 | 2014-09-01 | Far Eastern New Century Corp | 具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法 |
| CN104403956B (zh) * | 2013-09-05 | 2017-06-16 | 中国科学技术大学 | 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用 |
| WO2018112639A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Creatus Biosciences Inc. | Xylitol producing metschnikowia species |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4009676A1 (de) * | 1990-03-26 | 1991-10-02 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Dna-sequenz, umfassend ein fuer xylosereduktase und/oder xylitoldehydrogenase codierendes strukturgen |
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-
1998
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Non-Patent Citations (2)
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| Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９（１９８８）ｐ．１４８−１５４ |
| Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８／２９（１９９１．３．３１），ｐ．３２７−３４０ |
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