TWI801327B - 生物生產甲基丙烯酸之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的方法，其包含以下步驟：(a)藉由氧化酶之作用將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸及/或其衍生物。
本發明亦延伸至經改造以適用於實施該方法之步驟的微生物。

Description

生物生產甲基丙烯酸之方法
本發明係關於用於生物生產甲基丙烯酸及其衍生物的方法。特別地，該方法係關於使用特定的酵素性轉換以透過甲基丙烯醯基輔酶A自異丁醯基輔酶A形成甲基丙烯酸，以及自其生產的聚合物或共聚物。
丙烯酸與其等之烷基酯(特別是甲基丙烯酸(MAA)與其之甲酯，甲基丙烯酸甲酯(MMA))於化學工業中係重要的單體。其等之主要應用係在用於形形色色應用的塑膠之生產。最重要的聚合作用應用係聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)之鑄製、模製或擠製以生產高透光塑膠。此外，許多共聚物被使用；重要的共聚物係甲基丙烯酸甲酯及甲基丙烯酸乙酯與α-甲基苯乙烯、丙烯酸乙酯及丙烯酸丁酯的共聚物。此外，藉由簡單的轉酯作用反應，MMA可被轉變成其他酯，諸如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、等等。
目前，MMA(及MAA)係藉由一些化學程序生產，該等程序之一係成功的「α方法」，藉其MMA係藉由與甲醛行無水反應自酯(丙酸甲酯)獲得。於α方法中，丙酸甲酯係藉由乙烯之羰基化作用生產。此 乙烯原料係衍生自化石燃料。最近，對於化學工業而言亦自永續性生質原料開源已變得所欲。因此，代替使用α方法來製造MMA的替代性生質途徑會是有益的。
因此，本發明之目標之一係滿足上述問題，並提供用於生產甲基丙烯酸的生物方法或部分生物方法方法。
令人意外地，本案之發明人已發現一應用一先前未被考慮用於以工業上可應用的水平形成甲基丙烯酸的新穎酵素受質組合的方法，藉此提供了一種生產關鍵單體(諸如MMA)的新穎且可行的基於生物的途徑。
咸已知異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯醯基輔酶A的氧化反應在纈胺酸降解I途徑中天然發生，且實行此轉換的酵素已於一些細胞中觀察到。於此等系統中，該轉換典型地使用醯基輔酶A脫氫酶酵素，其需要相對應的電子運輸系統以將受質之氧化反應與泛醌(其接著被再生)之還原反應偶聯在一起。
WO201438216描述了一種自微生物生產甲基丙烯酸的方法以及使用醇醯基轉移酶產生酯的甲基丙烯醯基輔酶A轉換。該文件顯示小量的2-側氧基異戊酸變成異丁醯基輔酶A之轉換與異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯醯基輔酶A之轉換。其亦討論活體內自甲基丙烯醯基輔酶A的甲基丙烯酸之理論性生產但此未成功地生產。
然而，於WO201438216中，活體內生產甲基丙烯酸之唯一實施例使用衍生自Rhodococcus erythropolis的醯基輔酶A脫氫酶，其係於相同屬之宿主(赤球菌屬(Rhodococcus)細菌)中重組地表現的。嘗試去於 不同的宿主生物體中異源表現在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中發現的類似醯基輔酶A脫氫酶的其他實施例並未生產甲基丙烯酸。於宿主生物體中異源醯基輔酶A脫氫酶之上調或表現很難達成且尚未被報導過。
因此，本發明之進一步目標係提供甲基丙烯酸之生產之改善。
在已知的代謝途徑中，並無甲基丙烯酸之生產於其中發生者(無論是呈產物或呈中間物)。已知醯基輔酶A硫酯酶酵素會催化結構上相關的受質之水解作用，然而此等酵素傾向於具有非常窄的受質專一性，且尚未被針對甲基丙烯醯基輔酶A之水解作用之催化測試或不會催化該作用。此外，該等確實具有廣大的受質專一性的更罕見變化在生物系統(諸如表現宿主細胞)中很可能是個問題，而此係導因於必要細胞硫酯之偏離目標的水解作用。再次地，沒有任何已知者會催化甲基丙烯醯基輔酶A之水解作用。因此，此等酵素目前為止尚未被證實對於用於涉及甲基丙烯酸之生物生產的工業應用而言是可行的。
因此，本發明之進一步目標係解決上述問題並提供甲基丙烯醯基輔酶A變成甲基丙烯酸的可行酵素性轉換，其可用於工業方法且可獨立於任何作用在將異丁醯基輔酶A轉變成甲基丙烯醯基輔酶A的酵素來使用。
根據本發明之第一方面，提供了生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的方法，其包含以下步驟： (a)藉由氧化酶之作用將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸及/或其衍生物。
根據本發明之第二方面，提供了生產甲基丙烯酸的方法，其包含以下步驟：(a)將異丁醯基輔酶A轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由硫酯酶之作用將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸，該硫酯酶適當地為4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)、轉移酶、合成酶、及/或磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶。
較佳地，於本發明之第二方面之方法中，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由硫酯酶，更佳地為4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)，適當地屬於EC群組3.1.2.23者之作用轉變成甲基丙烯酸。最佳地，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由來自關節桿菌屬(Arthrobacter)物種菌株SU的4HBT的醯基輔酶A硫酯酶之作用轉變成甲基丙烯酸。
有益地，本發明之方法提供進一步的生物途徑以生產關鍵化學品甲基丙烯酸與其之已知的衍生物，減低了對化石燃料的工業依賴性且增加了永續性。
該方法使可再生的原料可藉由微生物發酵被簡單地轉換成異丁醯基輔酶A，且催化步驟(a)與(b)的酵素之共表現會對MAA提供直接微生物發酵途徑。
更進一步，該等方法使用用於步驟(a)或(b)的酵素，其等先前並未被考慮用於生產甲基丙烯酸且未在天然存在的纈胺酸途徑中發現。 特別地，用於步驟(a)的酵素起作用以將異丁醯基輔酶A轉變成甲基丙烯醯基輔酶A而不需要聯結的電子運輸系統，且用於步驟(b)的酵素對甲基丙烯醯基輔酶A有高度受質專一性以避免此中間物在宿主生物體中增長的問題。因此，於步驟(a)或(b)中的酵素之任一者可被單獨使用以部分改善化學程序以形成甲基丙烯酸或以改善生物方法以形成甲基丙烯酸。替代性地，步驟(a)與(b)之酵素兩者可被一起始用以形成以工業上可應用的水平製造甲基丙烯酸的獨立生物方法，且其於異源宿主生物體中係有功能的。
酵素
在本發明之前後文中，「生物地」意謂使用生物催化劑。較佳地，該生物催化劑係酵素，但可包含任何衍生自生物來源的催化性結構。
在本發明之前後文中，「化學地」意謂使用除了使用生物催化劑(諸如酵素)以外的化學方法。
關於第一方面，步驟(b)可生物地或化學地(較佳為生物地)實施。
關於第二方面，步驟(a)可生物地或化學地(較佳為生物地)實施。
較佳地，步驟(a)與步驟(b)係使用一或多種酵素酵素性地實施，其中該等酵素係作為生物催化劑起作用。
較佳地，該氧化酶係在CH-CH鍵上作用的氧化酶(屬於EC編號1.3.x.x)，更佳係使用氧作為電子接受體在CH-CH鍵上起作用的氧化酶(屬於EC編號EC 1.3.3.x)。又更佳地，該氧化酶係醯基輔酶A氧化酶(適 當地屬於EC編號EC 1.3.3.6)。更佳地，該醯基輔酶A氧化酶係選自以下酵素之任一者：來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4、來自煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)的短鏈醯基輔酶A氧化酶、來自綠豆(Vigna radiata)的過氧化體醯基輔酶A氧化酶、來自念珠菌屬(Candida)物種的醯基輔酶A氧化酶與來自熱帶念珠菌(Candida tropicalis)的醯基輔酶A氧化酶4。最佳地，該醯基輔酶A氧化酶係來自阿拉伯芥的ACX4。
替代性地，異丁醯基輔酶A可藉由氧化還原酶(適當地屬於EC群組編號1.X.X.X)之作用被轉變成甲基丙烯醯基輔酶A。較佳地，該氧化還原酶係在電子供體之CH-CH基團上作用的氧化還原酶(適當地屬於EC群組1.3.X.X)。更佳地，該在供體之CH-CH基團上起作用的氧化還原酶係FAD依賴性氧化還原酶，又更佳地該氧化還原酶係屬於EC群組1.3.8.X的輔酶A脫氫酶。又更佳地，該氧化還原酶係短鏈醯基輔酶A脫氫酶(適當地屬於EC群組1.3.8.1)、異戊醯基輔酶A脫氫酶(適當地屬於EC群組1.3.8.4)、2-甲基-分支鏈醯基輔酶A脫氫酶(適當地屬於EC群組1.3.8.5)或醯基輔酶A脫氫酶(適當地屬於EC群組1.3.8.-，諸如異丁醯基輔酶A脫氫酶)。最佳地，該氧化還原酶係選自以下酵素之任一者：來自戀臭假單孢菌(Pseudomonas putida)的短鏈/支鏈醯基輔酶A脫氫酶、來自智慧人(Homo sapiens)的異丁醯基輔酶A脫氫酶、來自阿拉伯芥的異戊醯基輔酶A脫氫酶。
輔酶A脫氫酶酵素一般會需要聯結的電子運輸系統以將受質之氧化反應與泛醌(其接著再生)之還原反應偶聯在一起。如此電子運輸系統由電子轉移黃素蛋白(ETF)與電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶 (ETFQO)組成。ETF必須與該醯基輔酶A脫氫酶酵素及ETFQO相容。因此，於其中使用了醯基輔酶A脫氫酶的具體態樣中，較佳係利用以下再生系統之一：
在一個具體態樣中，異丁醯基輔酶A係使用宿主微生物轉變成甲基丙烯醯基輔酶A，該宿主微生物包含內源性輔酶A脫氫酶(其對異丁醯基輔酶A有活性)和與其聯結的電子運輸系統，諸如在(例如)戀臭假單孢菌的例子中。
在第二個具體態樣中，異丁醯基輔酶A係在宿主生物體中轉變成甲基丙烯醯基輔酶A，其係藉由異源的輔酶A脫氫酶酵素之作用，該輔酶A脫氫酶酵素伴隨著來自相同生物體的電子運輸系統之蛋白質作為為異源的輔酶A脫氫酶。例如，來自智慧人、戀臭假單孢菌、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、或來自阿拉伯芥的輔酶A脫氫酶與電子運輸系統組份，所有皆在大腸桿菌(Escherichia coli)(或另一個宿主生物體)中表現。
在第三個具體態樣中，異丁醯基輔酶A係在宿主生物體中轉變成甲基丙烯醯基輔酶A，其係藉由異源的輔酶A脫氫酶酵素之作用，該異源的輔酶A脫氫酶酵素伴隨著亦來自不同的微生物的電子運輸系統組份，藉其該等組份彼此相容且與該輔酶A脫氫酶相容。例如，來自智慧人的輔酶A脫氫酶與與野猪(Sus scrofa)之電子轉移黃素蛋白相容，而野猪之電子轉移黃素蛋白則與來自球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶相容。替代性地，由於阿拉伯芥之ETF-泛醌氧化還原酶與球形紅細菌之ETF-泛醌氧化還原酶具有良好的序列同源性，阿拉伯芥之異戊醯基輔酶A脫氫酶與ETF可與來自球形紅細菌的ETF-泛醌 氧化還原酶形成功能性系統以用於異丁醯基輔酶A之氧化反應。最後，來自脫氮副球菌的ETF與ETF-泛醌氧化還原酶被預期會與來自另一來源的異丁醯基輔酶A脫氫酶(諸如智慧人的)或來自不同生物體的同源物相容，而此係導因於脫氮副球菌ETF與人類與豬ETF之類似性。
較佳地，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由硫酯水解酶(亦稱為硫酯酶)(適當地屬於EC群組3.1.2.X)之作用轉變成甲基丙烯酸。又更佳地，該酵素係醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.20)、3-羥基異丁醯基輔酶A水解酶(適當地屬於EC群組3.1.2.4)、ADP依賴性醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.18)、4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.23)、或屬於EC群組3.1.2.-的硫酯酶(諸如(例如)柳醯基輔酶A硫酯酶)。更佳地，該硫酯酶係選自以下酵素之任一者：來自關節桿菌屬物種菌株SU的4HBT、來自球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)的4HBT、來自假單孢菌屬(Pseudomonas)物種菌株CBS-3的4HBT、來自大腸桿菌的EntH、來自大腸桿菌的YciA、來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的YciA、來自大腸桿菌的TesA或來自大腸桿菌的TesB、來自結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的FcoT。又更佳地，該硫酯酶係醯基輔酶A硫酯酶。又更佳地，該硫酯酶係4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.23)。最佳地，該醯基輔酶A硫酯酶係來自關節桿菌屬物種菌株SU的4HBT。
因此，在一個具體態樣中，異丁醯基輔酶A可藉由該氧化酶之作用被轉變成甲基丙烯醯基輔酶A且甲基丙烯醯基輔酶A可藉由4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.23)(更佳係來自關節 桿菌屬物種菌株SU的醯基輔酶A硫酯酶4HBT)之作用被轉變成甲基丙烯酸。
在一個具體態樣中，異丁醯基輔酶A可藉由醯基輔酶A氧化酶(適當地屬於EC群組編號1.3.3.6)(更佳係來自阿拉伯芥的ACX4)之作用被轉變成甲基丙烯醯基輔酶A，且甲基丙烯醯基輔酶A可藉由4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(適當地屬於EC群組3.1.2.23)(更佳係來自關節桿菌屬物種菌株SU的醯基輔酶A硫酯酶4HBT)之作用被轉變成甲基丙烯酸。
替代性地，甲基丙烯醯基輔酶A可藉由以下酵素性途徑之一之作用被轉變成甲基丙烯酸：
在一個具體態樣中，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由轉移酶(適當地屬於EC群組編號2.X.X.X)之作用轉變成甲基丙烯酸。較佳地，該轉移酶係轉移含硫基團的轉移酶(適當地屬於EC群組編號2.8.X.X)。更佳地，該轉移酶係輔酶A轉移酶(適當地屬於EC群組編號2.8.3.X)。又更佳地，該轉移酶係乙酸酯依賴性醯基輔酶A轉移酶或乙醯乙酸酯依賴性丁醯基輔酶A轉移酶(適當地分別屬於EC群組編號2.8.3.8與2.8.3.9)。最佳地，該轉移酶係選自以下酵素之任一者：來自芽胞梭菌屬(Clostridium)物種SB4的丁醯基輔酶A：乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自Clostridium sticklandii的丁醯基輔酶A：乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自丙酮丁醇芽胞梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824的丁酸酯：乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自大腸桿菌的乙酸酯輔酶A轉移酶ydiF。
用於本文，術語連接酶、合成酶、與合酶係如所屬技術領域中瞭解的可互換地使用。
於第二個具體態樣中，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由以反方向起作用的合成酶(適當地屬於EC群組編號6.X.X.X)之作用轉變成甲基丙烯酸。較佳地，該合成酶係碳-硫鍵形成性合成酶(適當地屬於EC群組編號6.2.X.X)。更佳地，該合成酶係酸-硫醇連接酶(適當地屬於EC群組編號6.2.1.X)。最佳地，該合成酶係可逆性ADP或GDP形成性醯基輔酶A連接酶，諸如GDP形成性琥珀酸輔酶A合成酶(適當地屬於EC群組6.2.1.4)、ADP形成性琥珀酸輔酶A合成酶(屬於EC群組6.2.1.5)、ADP形成性戊二酸輔酶A合成酶(屬於EC 6.2.1.6)、ADP形成性蘋果酸輔酶A合成酶(屬於EC 6.2.1.9)、GDP形成性羧酸輔酶A合成酶(屬於EC 6.2.1.10)、ADP形成性乙酸酯輔酶A合成酶(屬於EC 6.2.1.13)或ADP形成性檸檬酸輔酶A合成酶(屬於EC 6.2.1.18)。
於第三個具體態樣中，甲基丙烯醯基輔酶A係藉由與磷酸轉乙醯基酶或磷酸轉丁醯基酶同類的磷酸轉醯基酶(其屬於EC群組編號EC 2.X.X.X，更佳係EC群組編號EC 2.3.X.X，又更佳係EC 2.3.1.X，最佳係屬於EC群組編號2.3.1.8或2.3.1.19)和短鏈脂肪酸激酶(其屬於EC群組編號EC 2.X.X.X，較佳係EC 2.7.X.X，更佳係EC 2.7.2.X，最佳係屬於EC 2.7.2.1的乙酸酯激酶、屬於EC 2.7.2.6的甲酸激酶、屬於EC 2.7.2.7的丁酸酯激酶、屬於EC 2.7.2.14的支鏈脂肪酸激酶或屬於EC 2.7.2.15的丙酸激酶)之組合作用被轉變成甲基丙烯酸。較佳地，該磷酸轉醯基酶係甲基丙烯醯基輔酶A磷酸轉醯基酶。較佳地，該短鏈脂肪酸激酶係可逆性甲基丙烯酸激酶。最佳地，該磷酸轉醯基酶係選自以下酵素之任一者：來自丙酮丁醇芽胞梭菌ATCC824的磷酸轉丁醯基酶。最佳地，該短鏈脂肪酸激酶係選自以下酵素 之任一者：來自螺旋體MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的丁酸酯激酶、來自酪酸芽胞梭菌(Clostridium butyricum)的丁酸酯激酶。
在本發明之前後文中，術語「其衍生物」意謂直接相關於或包含甲基丙烯醯基輔酶A或甲基丙烯酸的任何化學品，諸如其酯、其醯基鹵化物、其酐、其醯胺、其腈、其內酯、其鹽、其錯合物、其異構物、其寡聚物或聚合物與此等者之另外的任何經取代變體，更佳地，其意謂其酯或鹽。
較佳地，該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。較佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸烷基酯，更佳係甲基丙烯酸低碳數烷基(C1-C20)酯，又更佳係甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，特別是C1-C4烷基酯，諸如甲基丙烯酸甲酯、乙酯或丁酯、或C4-C12烷基酯。最佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯，例如甲基丙烯酸正丁酯。
該甲基丙烯酸酯可自甲基丙烯醯基輔酶A生物地形成，其較佳係藉由屬於EC群組編號EC2.X.X.X的轉移酶酵素，更佳係屬於EC群組編號2.3.X.X的醯基轉移酶，又更佳係屬於EC群組編號EC2.3.1.84的醇醯基轉移酶之作用。
較佳地，當甲基丙烯酸酯係從甲基丙烯醯基輔酶A生物地形成時，該甲基丙烯醯基輔酶A係藉由氧化酶之作用自異丁醯基輔酶A生物地形成。
因此，根據本發明之第三方面，提供了生產甲基丙烯酸酯的方法，其包含以下步驟： (a)藉由氧化酶之作用將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由醇醯基轉移酶之作用將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸酯。
較佳地，該第三方面之氧化酶係在CH-CH鍵上起作用的氧化酶(屬於EC編號1.3.x.x)，更佳係使用氧作為電子接受體在CH-CH鍵上起作用的氧化酶(屬於EC編號EC 1.3.3.X)。又更佳地，該氧化酶係醯基輔酶A氧化酶(適當地屬於EC編號EC 1.3.3.6)。更佳地，該醯基輔酶A氧化酶係選自以下酵素之任一者：來自阿拉伯芥的ACX4、來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶、來自念珠菌屬物種的醯基輔酶A氧化酶與來自熱帶念珠菌的醯基輔酶A氧化酶4。最佳地，該醯基輔酶A氧化酶係來自阿拉伯芥的ACX4。
較佳地，該第三方面之甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸烷基酯，更佳係甲基丙烯酸低碳數烷基(C1-C20)酯，又更佳係甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，特別是C1-C4烷基酯，諸如甲基丙烯酸甲酯、乙酯或丁酯、或C4-C12烷基酯。最佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯，例如甲基丙烯酸正丁酯。
適當地，該醇醯基轉移酶係在醇或酚之存在下起作用，該醇或酚較佳係直鏈或支鏈C1-20未經取代的醇、芳烷基醇或酚，且特佳係C1-8或C1-4烷基醇，諸如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、第二丁醇、第三丁醇、正戊醇、異戊醇、第三戊醇、正己醇、異己醇、2-己醇、二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇；苯甲醇或酚。較佳地， 該醇醯基轉移酶在醇之存在下起作用，該醇更佳係C1-C12醇，更佳係C1至C4或C4-C12醇，又更佳係C4-C12醇類，又更佳係在丁醇之存在下起作用，該丁醇係諸如正丁醇、異丁醇、第二丁醇或第三丁醇。最佳地，該醇醯基轉移酶在正丁醇的存在下起作用。
較佳地，該醇醯基轉移酶係衍生自植物來源，更佳地，該植物係屬於任何選自由以下者所組成的群組的目：薑目(Zingiberales)、薔薇目(Rosales)、杜鵑花目(Ericales)、葫蘆目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)與樟目(Laurales)；又更佳地，該植物係屬於任何選自由以下者所組成的群組的科：芭蕉科(Musaceae)、薔薇科(Rosaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、獼猴桃科(Actinidiaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、番瓜樹科(Caricaceae)與樟科(Lauraceae)；又更佳地，該植物係屬於任何選自由以下者所組成的群組的屬：芭蕉屬(Musa)、草莓屬(Fragaria)、蘋果屬(Malus)、李屬(Prunus)、梨屬(Pyrus)、越橘屬(Vaccinium)、獼猴桃屬(Actinidia)、甜瓜屬(Cucumis)、番木瓜屬(Carica)與酪梨屬(Persea)；又更佳地，該植物係選自由以下者所組成的群組之任一者：香蕉、草莓、蘋果、梅、西洋梨、藍莓、奇異果、甜瓜、木瓜與酪梨。最佳地，該醇醯基轉移酶係衍生自水果來源，諸如蘋果、甜瓜或蕃茄來源，適當地係蘋果來源。
可使用生物組織或其加工產物，例如果、葉、花瓣、莖、種子、果皮、果肉、等等，於其中醇醯基轉移酶存在。替代性地，可使用自此等生物組織萃取的粗酵素液體、經純化酵素、或類似者。替代性地，可分離醇醯基轉移酶之基因，並將其導入宿主微生物中以於其中表現。
使用醇醯基轉移酶以將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙 烯酸酯係於WO2014/038214中充分描述，其揭示內容係以引用方式納入本文中，特別是醇醯基轉移酶基因與其序列以及包含該序列的載體質體。
進一步的方法步驟
視需要地，本發明之第一或第二方面之方法可進一步包含將於步驟(b)中形成的任何甲基丙烯酸轉變成甲基丙烯酸酯的步驟(c)。
較佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸烷基酯，更佳係甲基丙烯酸低碳數烷基(C1-C20)酯，更佳係甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，又更佳係甲基丙烯酸C1-C4或C4-C12烷基酯，最佳係甲基丙烯酸甲酯或乙酯或丁酯。最佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯。
於步驟(c)中形成的甲基丙烯酸酯可係生物地或化學地形成，較佳其等係生物地形成。
視需要地，步驟(c)可使用合適的醇藉由酯化反應化學地實施。於其下酯化可被實現的反應條件變化可能很大。反應於室溫下進行非常慢，但於提高的溫度下進行頗快速。典型地，反應物之一係以化學計量上過量使用以驅動該反應。其他的反應物則被稱為限量試劑。約99%的限量試劑(例如酸、醇或多元醇)可在幾個小時內被轉變成酯。限量試劑典型係不以化學計量上過量存在的試劑，例如用以製造多元醇酯的限量試劑係多元醇。
因為醇與有機酸之酯化係可逆反應，酯化反應通常不會達到完成。然而，超過99%的轉換可藉由移除至少一種酯化產物(典型係水)來達成。若產物之一相較於其他者且相較於試劑係於較低的溫度沸騰，此 移除典型係藉由蒸餾達成。多種從反應區移除所產生的水的蒸餾技法係所屬技術領域中已知的。移除水的一個方法包含在可能形成具有比反應之任一或每個組份之沸點低的沸點的共沸物的液體介質中實行該反應。若該等試劑與所得的酯於大氣壓力下具有高於100℃的沸點，則可簡單地調整反應溫度以移除水且不需要能夠與水形成共沸物的液體介質。此外，可使用共沸添加劑以協助水自反應混合物的蒸餾。可使用惰性材料(諸如環己烷、己烷、苯、甲苯、或二甲苯)作為酯之生產中的共沸添加劑。此外，亦可利用具有較低沸點的反應物作為共沸添加劑。在後者的例子中，用作為共沸添加劑的反應物典型係以地超過該反應需要的化學計量上的量充至反應混合物中。酯化方法(包含該等利用水移除者)可以批次或連續操作模式實施。形形色色的酯化方法係於Kirk-Othmer化學技術百科全書第四版(1994)第9卷pp.762-768中揭示，其完整內容特此以引用方式併入。
習用批次酯化程序包含在反應循環開始時將所有的反應物充入反應器中。於催化性酯化方法中，催化劑典型係在批次達到目標溫度後加至反應混合物中。反應混合物接著可被進一步加熱。反應混合物之溫度升高達直到達到反應混合物之沸點，於該點共沸添加劑(若使用)與水副產物沸騰而離開反應混合物。典型地，頂部的蒸氣被凝結，水被自共沸添加劑分離，且共沸添加劑再循環至反應器容器。反應溫度(且因此反應之速率)係由反應混合物之沸點限制。當亦使用具有較低沸點的反應物作為共沸添加劑時，其之濃度隨著反應進行而逐漸減低。此外，反應物之濃度在反應期間減低，其負面地影響反應速率。因此，反應溫度(且因此反應之速率常數)隨著反應進行而增加，無論是否添加共沸添加劑，特別是 若在反應之過程期間持續熱輸入。
較佳地，步驟(c)係藉由屬於EC群組編號EC 3.1.x.x.在關於酯鍵方面起作用的酯酶或水解酶酵素之作用來生物地實施，更佳地該酵素係屬於EC 3.1.1.X且係涉及酯鍵之切裂與形成之催化的水解酶類酵素。一個微生物酯酶之近期回顧係如下：Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci(2013)2(7)：135-146。
較佳地，該方法進一步包含一或多個生產異丁醯基輔酶A的進一步步驟，更佳係自2-酮異戊酸及/或自異丁酸生產異丁醯基輔酶A。
在一個具體態樣中，該方法進一步包含一或多個自2-酮異戊酸生產異丁醯基輔酶A的進一步步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任一者：
較佳地，該方法進一步包含將2-酮異戊酸轉變成異丁醯基輔酶A的步驟。更佳地，2-酮異戊酸係藉由支鏈酮酸脫氫酶酵素錯合物(由α子單元組份、硫辛醯胺醯基轉移酶組份與硫辛醯胺脫氫酶組份組成)轉變成異丁醯基輔酶A。最佳地，該脫氫酶係選自以下酵素之任一者：來自戀臭假單孢菌的支鏈酮酸脫氫酶(BCKD)，來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的BCKD、來自銅綠假單胞菌的BCKD、來自阿拉伯芥的BCKD、來自天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)的BCKD與來自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的BCKD。
替代性地，2-酮異戊酸變成異丁醯基輔酶A之轉換可藉由氧化還原酶酵素(適當地屬於EC群組1.X.X.X)催化，該氧化還原酶酵素較佳係在供體之醛或側氧基基團上起作用的氧化還原酶(適當地屬於EC群組 1.2.X.X)，更佳係使用鐵-硫蛋白質作為電子接受體在供體之醛或側氧基基團上起作用的氧化還原酶酵素(適當地屬於EC群組1.2.7.X)，最佳係2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶(亦稱為酮纈胺酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶)(適當地屬於EC群組編號1.2.7.7)，其係由α、β、γ與δ次單元組成的四聚物。如此酵素之實例係來自激烈火球菌(Pyrococcus furiosis)的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自火球菌屬(Pyrococcus)物種的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自熱球菌屬(Thermococcus)物種的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自Thermococcus litoralis的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自Thermococcus profundus的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶與來自Methanobacterium thermoautotrophicum的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶。
在第二個具體態樣中，該方法進一步包含一或多個自異丁酸生產異丁醯基輔酶A的進一步步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任一者：
較佳地，該方法進一步包含將異丁酸轉變成異丁醯基輔酶A的步驟。
視需要地，異丁酸係藉由連接酶酵素(適當地屬於EC群組編號6.X.X.X)之作用轉變成異丁醯基輔酶A，該連接酶酵素較佳係屬於EC群組6.2.X.X的碳-硫鍵形成性連接酶，更佳係屬於EC群組6.2.1.X的酸-硫醇形成性連接酶，更佳係GDP-形成性、ADP形成性或AMP形成性連接酶，諸如AMP形成性乙酸酯輔酶A連接酶(適當地屬於EC群組6.2.1.1)、丁酸酯輔酶A連接酶(適當地屬於EC群組6.2.1.2)、羧酸輔酶A連接酶(適當 地屬於EC群組6.2.1.10)、ADP形成性乙酸酯輔酶A連接酶(適當地屬於EC群組6.2.1.13)、丙酸酯輔酶A連接酶(適當地屬於EC群組6.2.1.17)或於EC群組6.2.1.-中的酸-硫醇連接酶。最佳地，該連接酶係選自以下酵素之任一者：來自針假單胞菌(pseudomonas chlororaphis)的AcsA、來自多變擬青黴(Paecilomyces varioti)的丁醯基輔酶A合成酶、來自牛心臟粒線體的丁醯基輔酶A合成酶。
在第三個具體態樣中，該方法進一步包含一或多個進一步自異丁酸生產異丁醯基輔酶A的步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任一者：
較佳地，該方法進一步包含將異丁酸轉變成異丁醯基-磷酸酯的步驟，與將異丁醯基-磷酸酯轉變成異丁醯基輔酶A的步驟。
較佳地，該異丁酸係藉由激酶酵素(適當地屬於EC群組編號EC 2.X.X.X)轉變成異丁醯基-磷酸酯，該激酶酵素較佳係屬於EC 2.7.X.X，更佳係屬於EC群組編號EC 2.7.2.X，最佳係乙酸酯激酶(適當地屬於EC群組2.7.2.1)、屬於EC 2.7.2.6的甲酸激酶、屬於EC 2.7.2.7的丁酸酯激酶、屬於EC 2.7.2.14的支鏈脂肪酸激酶或屬於EC 2.7.2.15的丙酸激酶。最佳地，該激酶係選自以下酵素之任一者：來自螺旋體MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自酪酸芽胞梭菌的丁酸酯激酶。
較佳地，該異丁醯基-磷酸酯係藉由轉移酶酵素(屬於EC群組編號2.X.X.X)之作用轉變成異丁醯基輔酶A，更佳係藉由屬於EC群組編號2.3.X.X的醯基轉移酶之作用，又更佳係藉由屬於EC群組編號2.3.1.X轉移除了胺基-醯基基團以外的環狀基團的醯基轉移酶之作用。又更佳者係 磷酸乙醯基轉移酶或磷酸丁醯基轉移酶(分別屬於EC群組編號2.3.1.8與2.3.1.19)。更佳地，該轉移酶係來自丙酮丁醇芽胞梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶或來自枯草芽孢桿菌、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、海棲熱袍菌與克盧維爾氏芽胞梭菌(Clostridium kluyveri)的磷酸乙醯基轉移酶。此等酵素之其他來源包含其他厭氧性細菌，特別是芽胞梭菌屬物種，諸如巴斯德氏固氮芽胞梭菌(Clostridium pasteurianum)或貝季爾林斯基氏芽胞梭菌(Clostridium beijerinckii)。
最佳地，該方法進一步包含藉由合成酶酵素之作用自異丁酸生產異丁醯基輔酶A的步驟，該合成酶酵素較佳係異丁醯基輔酶A合成酶，最佳係來自綠針假單胞菌(P.chloraphis)B23的異丁醯基輔酶A合成酶(AcsA)。
視需要地，如以上關於第一及/或第二及/或第三具體態樣描述的進一步方法步驟之任一者可被組合在一起。
微生物
以上方法之酵素可包含在一或多種微生物內、或以游離於微生物的方式存在，例如呈在反應容器中或留在管柱內的無細胞萃取物或經純化酵素。
較佳地，該方法之生物轉換係於一或多個宿主微生物中實施。更佳地，該一或多種用於實施生物轉換的酵素係包含在一或多種微生物內。
較佳地，該一或多種微生物表現該一或多種對催化相關的步 驟而言所需的酵素。更佳地，該相關的步驟與任何其他酵素性步驟係在一或多種微生物中活體內實施。
根據本發明之第四方面，提供了用於根據第一、第二或第三方面之任一者之方法生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的微生物。
該一或多種微生物可天然地表現該一或多種酵素，或可經基因設計以表現該一或多種酵素、或可表現野生型或經基因設計酵素兩者之組合。如此經基因設計生物體可被描述成重組的生物體。
該一或多種微生物可內源性地或異源性地表現該一或多種酵素或內源性與異源性酵素之組合。
在本發明之前後文中，術語「重組的生物體」意謂經基因改造或設計的生物體，其包含被人工地構築並插入至該生物體中的遺傳物質。該遺傳物質可包含內源性或異源性核酸，其可經或可未經進一步基因改造。
在本發明之前後文中，術語「內源性」意謂衍生自相同生物體物種。
在本發明之前後文中，術語「異源性」意謂衍生自不同生物體物種。
在本發明之前後文中，當關於微生物使用時，術語「經改造以適用於」意謂經基因改造或設計的生物體，如以上所定義的、或一生物體之突變體品系，其(例如)已基於其天然地表現一或多種酵素而挑選。
用於以上方法之任一者的微生物(如以上描述地經基因設計或改造)可選自天然存在的野生型或非天然存在的重組的微生物，例如細 菌、古細菌、酵母菌、真菌、藻類或可應用於發酵方法中的多種其他微生物之任一者。
因此，根據本發明之第五方面，提供了一種重組的微生物，其用於生產甲基丙烯酸的方法，該微生物經改造以適用於實施以下步驟：(a)藉由氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸；其中該重組的微生物係大腸桿菌。
根據本發明之第六方面，提供了一種微生物，其係用於生產甲基丙烯酸的方法，該微生物係藉由一或多種異源性核酸修飾以實施以下步驟：(a)藉由氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸。
根據本發明之第七方面，提供了一種微生物，其經改造以適用於實施以下步驟：(a)藉由氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸及/或其衍生物。
根據本發明之第八方面，提供了一種微生物，其經改造以適用於實施以下步驟：(a)將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與 (b)藉由硫酯酶之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸，該硫酯酶適當地係4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)、轉移酶、合成酶、及/或磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶。
根據本發明之一個進一步方面，提供了一種微生物，其經改造以適用於藉由硫酯酶之表現將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸，該硫酯酶適當地係4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)、轉移酶、合成酶、及/或磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶。
根據本發明之又一個進一步方面，提供了一種微生物，其係藉由編碼一或多種將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸的酵素的一或多個重組的核酸來修飾。
根據本發明之又一個進一步方面，提供了一種微生物，其係藉由編碼另一個將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸酯的酵素的一或多個重組的核酸來修飾。
根據本發明之又一個進一步方面，提供了一種生產甲基丙烯酸的方法，其使用根據該等進一步方面的一或多種酵素。
根據本發明之又一個進一步方面，提供了一種生產甲基丙烯酸酯的方法，其使用根據該等進一步方面的一或多種酵素。
第一、第二或第三方面之方法之進一步較佳的特徵可與以上定義的第四、第五、第六、第七、第八或進一步方面之微生物以任何組合來組合。
在一個具體態樣中，該微生物表現至少以下酵素：(a)(i)醯基輔酶A氧化酶；及/或 (ii)輔酶A脫氫酶；與視需要地以下者之一或多者(b)(i)醯基輔酶A硫酯酶，適當地係4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)；及/或(ii)醯基輔酶A轉移酶；及/或(iii)醯基輔酶A合成酶；及/或(iv)磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶；與視需要地(v)醇醯基轉移酶。
在一個具體態樣中，該微生物表現至少以下酵素：(a)(i)醯基輔酶A氧化酶；與視需要地以下者之一或多者(b)(i)醯基輔酶A硫酯酶；及/或(ii)醯基輔酶A轉移酶；及/或(iii)醯基輔酶A合成酶；及/或(iv)磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶；與視需要地(v)醇醯基轉移酶。
在第四、第五或第八方面之一個具體態樣中，該微生物表現至少以下酵素：(a)(i)醯基輔酶A硫酯酶，適當地係4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)；及/或(ii)醯基輔酶A轉移酶；及/或(iii)醯基輔酶A合成酶；及/或(iv)磷酸轉醯基酶與短鏈脂肪酸激酶；與視需要地以下者之一或多者： (b)(i)醯基輔酶A氧化酶；及/或(ii)醯基輔酶A脫氫酶；與進一步視需要地(c)(i)醇醯基轉移酶。
較佳地，當存在時，該輔酶A脫氫酶係伴隨著相配的電子運輸系統。
在一個較佳的具體態樣中，該微生物表現至少一種以下酵素：(a)醯基輔酶A氧化酶，諸如ACX4；與(b)醯基輔酶A硫酯酶，諸如4HBT。
在一個更佳的具體態樣中，該微生物表現至少一種以下酵素：(a)ACX4，適當地係來自阿拉伯芥；與(b)4HBT，適當地係來自關節桿菌屬物種。
在一些具體態樣中，該微生物係經改造以適用於實施以下步驟：(a)藉由醯基輔酶A氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸C1至C20酯，適當地係甲基丙烯酸C1至C12酯，諸如甲基丙烯酸C1至C4或C4至C12酯。
較佳地，該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸C1至C12，更佳係甲基丙烯酸C1至C12酯，又更佳係甲基丙烯酸C1至C4或C4至C12酯， 最佳係C1至C4甲基丙烯酸酯，適當地甲基丙烯酸丁酯。
於此等具體態樣中，該微生物可係大腸桿菌及/或該醯基輔酶A氧化酶係來自阿拉伯芥的ACX4及/或該醇醯基轉移酶係衍生自如本文中提及的植物來源(例如水果，諸如蘋果)及/或該微生物係重組的微生物。較佳地，該微生物可係大腸桿菌，該醯基輔酶A氧化酶可係來自阿拉伯芥的ACX4，該醇醯基轉移酶可係衍生自蘋果、甜瓜或蕃茄來源且該微生物可係重組的生物體。
較佳地，該微生物表現該較佳的或一些具體態樣之酵素(a)與(b)兩者。
較佳地，該微生物進一步表現以下酵素之一或多者：支鏈酮酸脫氫酶酵素或ADP形成性、GDP形成性、或AMP形成性醯基輔酶A合成酶/合酶/連接酶；或短鏈脂肪酸激酶與磷酸轉醯基酶。
更佳地，該微生物進一步表現以下酵素之一或多者：2-酮異戊酸脫氫酶、異丁酸酯輔酶A連接酶、ADP形成性、GDP形成性或AMP形成性醯基輔酶A合成酶/合酶/連接酶、或短鏈脂肪酸激酶與磷酸轉醯基酶。
最佳地，該微生物進一步表現異丁醯基輔酶A合成酶，特別是來自綠針假單胞菌(Pseudomonas chloraphis)(特別是綠針假單胞菌B23)的AcsA。
關於第四、第六、第七、第八與進一步的方面，較佳該宿主微生物係細菌，合適的細菌之實例包含：屬於艾氏菌屬(Escherichia)、腸內桿菌屬(Enterobacter)、Pantoea、克留氏菌屬(Klebsiella)、鋸桿菌屬(Serratia)、 伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙門氏桿菌屬(Salmonella)、摩根氏菌屬(Morganella)、或類似者的變形菌門(Proteobacteria)的腸內菌、屬於短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或微桿菌屬(Microbacterium)的所謂棒狀桿菌群細菌與屬於脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、氫桿菌屬(Hydrogenobacter)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮根瘤菌屬(Axorhizobium)、固氮菌屬(Azotobacter)、邊蟲屬(Anaplasma)、擬桿菌屬(Bacteroides)、巴東體屬(Bartonella)、博德氏桿菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布氏桿菌屬(Brucella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、莢膜樣菌屬(Calymmatobacterium)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、披衣菌屬(Chlamydia)、親衣原體屬(Chlamydophila)、芽胞梭菌屬、柯克斯氏體屬(Coxiella)、艾利希體屬(Ehrlichia)、腸球菌屬(Enterococcus)、法蘭西斯氏菌屬(Francisella)、細梭菌屬(Fusobacterium)、加德納氏菌(Gardnerella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、螺旋桿菌屬(Helicobacter)、克雷伯氏菌屬(Kelbsiella)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、黴漿菌屬(Mycoplasma)、奈瑟菌屬(Neisseria)、巴斯德氏桿菌屬(Pasteurella)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、吡咯單胞菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、立克次體屬(Rickettsia)、羅卡利馬氏體屬(Rochalimaea)、羅思氏菌屬(Rothia)、志賀桿菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、 鏈球菌屬(Streptococcus)、密螺旋體屬(Treponema)、弧菌屬(Vibrio)、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)、耶氏菌屬(Yersinia)、或類似者的細菌。
例示性細菌包含選自以下者的物種：大腸桿菌、產酸克留氏菌(Klebsiella oxytoca)、產琥珀酸厭氧螺旋菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產琥珀酸曼哈米亞氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動發酵單孢菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、天藍色鏈黴菌、丙酮丁醇芽胞梭菌、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜熱氫桿菌(Hydrogenobacter thermophilus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)與戀臭假單孢菌。
關於第四、第六、第七、第八與進一步方面，較佳地，該細菌係大腸桿菌。
例示性酵母菌或真菌包含該等屬於以下者：釀母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces)、念珠菌屬、克魯維氏酵母菌屬(Kluyveromyces)、麴菌屬(Aspergillus)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、隱球菌屬(Crytpococcus)、或類似者。例示性酵母菌或真菌物種包含該等選自以下者：啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維氏酵母菌(Kluyveromyces lactis)、Kluyveromyces marxianus、土麴菌(Aspergillus terreus)、黑麴菌(Aspergillus niger)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、或類似者。
第四、第六、第七、第八與進一步方面之任一者之一或多種微生物可被基因改造以增加或減低以上天然或經基因設計的酵素之活性。
較佳地，該微生物係經基因設計以增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產。
增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產可包含藉由使用所屬技術領域中已知的形形色色的基因設計技法來對現存的細胞代謝程序、核酸及/或蛋白質作修飾。增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產亦可包含修飾微生物以在該微生物中表現一或多種異源性基因。此等可包含編碼從基於碳的原料(諸如該等於本文中提出者)到甲基丙烯酸的所欲途徑之酵素的基因，或可包含起作用以直接地或間接地促進在如此途徑中的酵素之功能與表現的其他附屬基因，如於以下詳細討論的。
因此，該微生物可經修飾以表現用於甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產的一或多種基因，且較佳地該微生物係經進一步修飾以增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產。
該可在微生物內表現以使得其經修飾以生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的一或多種基因包含該等編碼以下酵素之任一者者：來自阿拉伯芥的ACX4、來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶、來自熱帶念珠菌的醯基輔酶A氧化酶4、來自念珠菌屬物種的醯基輔酶A氧化酶與具有寬廣的受質範圍的相關氧化酶、來自關節桿菌屬物種的4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶、來自大腸桿菌的YciA、來自流感嗜血桿菌的YciA、來自大腸桿菌的TesA、來自大腸桿菌的TesB、來自球形節桿菌的4HBT、來自假單孢菌屬物種菌株CBS-3的4HBT、來自 大腸桿菌的EntH、來自芽胞梭菌屬物種SB4的丁醯基輔酶A乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自Clostridium sticklandii的丁醯基輔酶A乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自丙酮丁醇芽胞梭菌ATCC824的丁酸酯-乙醯乙酸酯輔酶A轉移酶、來自大腸桿菌的乙酸酯輔酶A轉移酶ydiF、來自丙酮丁醇芽胞梭菌ATCC824的磷酸轉丁醯基酶、來自螺旋體MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌的丁酸酯激酶、來自酪酸芽胞梭菌的丁酸酯激酶、來自戀臭假單孢菌的支鏈醯基輔酶A脫氫酶、來自智慧人的異丁醯基輔酶A脫氫酶、來自阿拉伯芥的異戊醯基輔酶A脫氫酶、來自智慧人的電子轉移黃素蛋白、來自野猪的電子轉移黃素蛋白、來自阿拉伯芥的電子轉移黃素蛋白、來自戀臭假單孢菌的電子轉移黃素蛋白、來自脫氮副球菌的電子轉移黃素蛋白、來自智慧人的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自野猪的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自戀臭假單孢菌的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自阿拉伯芥的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自球形紅細菌的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自脫氮副球菌的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶。
該可在微生物內表現以使得其經修飾以增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產的一或多種基因包含該等編碼以下酵素之任一者：來自針假單胞菌的AcsA；來自枯草芽孢桿菌的bkdA1、bkdA2、bkdB與lpdV；來自戀臭假單孢菌的bkdA1、bkdA2、bkdB與lpdV；來自枯草芽孢桿菌的alsS、來自大腸桿菌的ilvD、來自大腸桿菌的ilvC、來自大腸桿菌的ilvB、來自大腸桿菌的ilvN、來自大腸桿菌的ilvI、來自大腸桿菌的ilvG、來自大腸桿菌的ilvM、來自大腸桿菌的ilvH與具有G14D與S17F突變的來自大腸 桿菌的ilvH、帶有S34G、L48E與R49F突變的來自麩胺酸棒狀桿菌R的ilvC、來自棒狀桿菌屬R的ilvB和ilvN與帶有G156E突變的來自棒狀桿菌屬R的ilvN、以及來自其他生物體的同源物，其帶有類似的突變(如以上描述的)以減輕酵素之反饋抑制並以改變共因子依賴性(在適當的情況下)。
本發明可進一步包含減低或排除一酵素之活性的修飾，該酵素藉由競爭於以上提及的生物合成途徑中的該受質及/或中間物來催化除了甲基丙烯酸及/或其衍生物以外的化合物之合成。如此酵素之實例包含來自大腸桿菌的YciA、TesA、TesB、與該等由fadB、ilvA、panB、leuA、ygaZ、ygaH、aceF、aceE、lpdA、tpiA、pfkA、pfkB、mdh、poxB、ilvE、ldhA與lldD編碼者(於大腸桿菌中)、以及如於本文中描述的其他宿主菌株中的同源物。
本發明可進一步包含減低或排除一酵素之活性的修飾，該酵素代謝甲基丙烯酸及/或其衍生物或代謝於以上提及的生物合成途徑中的中間物。如此與代謝有關的酵素之實例係在大腸桿菌中的天然纈胺酸降解途徑之酵素、或可消耗經設計途徑之硫酯中間物的其他硫酯酶。
本發明可進一步包含減低或排除蛋白質之活性的修飾，該蛋白質涉及移除於以上提及的生物合成途徑中的中間物的其他細胞功能。如此細胞功能之實例可包含儲存機制，諸如液胞儲存(例如於酵母菌中)或能夠儲存代謝物的其他細胞內體(例如細菌微隔間)、細菌周質或運輸機制，諸如能夠輸出代謝物的跨膜泵或孔蛋白。
編碼蛋白質(特別是於根據本發明的微生物中表現的酵素)的基因之核酸之來源可包含(例如)其中所編碼基因產物能夠催化所提及 的反應的任何物種。如此物種包含原核與真核生物體兩者，其包含(但不限於)細菌，包含古細菌與真細菌、與真核生物，包含酵母菌、植物、昆蟲、動物、與哺乳類動物，包含人類。如此來源的例示性物種包含(例如)大腸桿菌、智慧人、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium fredenreichii)、扭脫甲基桿菌(methylobacterium extorquens)、副痢疾桿菌(Shigella flexneri)、腸道沙門氏桿菌(Salmonella enterica)、費氏耶氏菌(Yersinia frederiksenii)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、挪威大鼠(Rattus norvegicus)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)、仙人掌芽孢桿菌(Bacillus cereus)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、Acinetobacter baylyi、不動桿菌屬物種、克盧維爾氏芽胞梭菌、假單孢菌屬物種、嗜熱棲熱菌、銅綠假單胞菌、戀臭假單孢菌、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、丙酮丁醇芽胞梭菌、腸繫膜白念珠球菌(Leuconostoc mesenteroides)、巴氏真桿菌(Eubacterium barkeri)、多毛擬桿菌(Bacteroidescapillosus)、Anaerotruncus colihominis、Natranaerobius thermophilus、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)、阿拉伯芥、麩胺酸棒狀桿菌、野猪、枯草芽孢桿菌、螢光假單胞菌、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、天藍色鏈黴菌、Methylibium petroleiphilum、肉桂地鏈黴菌(Streptomyces cinnamonensis)、阿維鏈黴菌(Streptomyces avermitilis)、Archaeoglobus fulgidus、Haloarcula marismortui、Pyrobaculum aerophilum、啤酒釀母菌、Clostridium cochlearium、假破傷風芽胞梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破傷風芽孢梭菌(Clostridium tetani)、丙二酸鹽陰性檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)、Ralstonia eutropha、小鼠(Mus musculus)、歐洲牛(Bos taurus)、核細梭菌(Fusobacterium nucleatum)、摩根氏摩根氏菌(Morganella morganii)、巴斯德 氏固氮芽胞梭菌、球形紅細菌、自養黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)、丙酸芽孢梭菌(Clostridium propionicum)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、土麴菌、念珠菌屬、Sulfolobus tokodaii、Metallosphaera sedula、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、發酵胺基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、以及於本文中揭示或可以相對應基因的來源生物體獲得的其他例示性物種。
應注意該編碼可於本發明之微生物中表現的酵素的一或多種基因亦包含編碼該酵素之變體的基因，該變體為(例如)包含在多肽序列中取代、刪除、插入或添加一或多個胺基酸且其中該多肽保有未經修飾的酵素之活性的變體酵素。如此變體酵素亦包含當與未經修飾的酵素以及具有經修飾的別位對照組的酵素比較時具有降低的酵素性活性的變體酵素，例如具有G14D與S17F突變的來自大腸桿菌的ilvH、帶有S34G、L48E與R49F突變的來自麩胺酸棒狀桿菌R的ilvC、帶有G156E突變的來自棒狀桿菌屬R的ilvB與ilvN與來自棒狀桿菌屬R的ilvN。
用於構築與測試一蛋白質於非天然存在的甲基丙烯酸生產性微生物中的表現的方法可藉由(例如)所屬技術領域中廣為人知的重組的技法與偵測方法進行。可發現如此方法係於(例如)Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室，紐約(2001)；與Ausubel等人，分子生物學的目前方案，John Wiley and Sons，巴爾的摩，Md.(1999)中描述。
涉及甲基丙烯酸及/或其衍生物或於其形成中的中間物之生 產的途徑的外源核酸序列可使用所屬技術領域中廣為人知的技法穩定地或暫時地導入至微生物細胞中，該等技法包含(但不限於)接合、電穿孔、化學轉形、轉導、轉染、與超音波轉形。
轉形方法之實例可包含以氯化鈣處理接受體微生物以增加DNA之滲透性，並自正處於生長期的細胞製備勝任細胞，接者以DNA轉形。替代性地，可利用以下方法：使DNA-接受體細胞進入原生質體或球形質體(其可輕易地攝取重組的DNA)中，接著將重組的DNA導入至細胞中；該方法已知可應用於枯草芽孢桿菌、放線菌與酵母菌。此外，微生物之轉形亦可藉由電穿孔進行。如此方法係所屬技術領域中廣為人知的。
對於在大腸桿菌或其他原核微生物細胞中的外源表現，一些在真核核酸之基因或cDNA中的核酸序列可編碼導向訊號，諸如N端粒線體或其他導向訊號，其可在轉形至原核微生物細胞中之前移除，若此係所欲的。例如，粒線體的前導序列之移除會導致在大腸桿菌中的表現增加(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280：4329-4338(2005))。對於在酵母菌或其他真核微生物細胞中的外源表現，基因可在細胞溶質中表現而不需添加前導序列，或可藉由添加合適的導向序列(諸如對於目標胞器係合適的粒線體導向或分泌訊號)被導向粒線體或其他胞器，或被導向分泌。因此，咸瞭解對核酸序列作適當修飾以移除或包含導向序列可被併入至外源核酸序列中以給予所欲的特性。此外，可使用所屬技術領域中廣為人知的技法以使基因經歷密碼子最佳化以達成在微生物內的蛋白質之最佳化表現。
可構築表現載體以包含一或多個編碼如於本文中例示的生物合成途徑酵素的核酸，其可運作地連接至在該微生物中有功能的表現控 制序列。可應用於本發明之微生物的表現載體包含(例如)質體、質粒、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體與人工染色體，包含可以穩定併入至宿主染色體中的載體與挑選序列或標記。
此外，該表現載體可包含一或多個可挑選的標記基因與適當的表現控制序列。亦可包含可挑選的標記基因，其(例如)提供對抗生素或毒素的抗性、補足營養缺陷、或供應不在培養基中的關鍵性營養物。表現控制序列可包含所屬技術領域中廣為人知的組成型、可誘發性或可抑制性啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子、轉譯訊號與類似者。當欲共表現二或更多個外源的編碼性核酸序列時，可把兩個核酸序列都插入(例如)單一表現載體中或分開的表現載體中。對於單一載體表現，該編碼性核酸可被可運作地連接至一個共同的表現控制序列或連接至不同的表現控制序列，諸如可誘發性啟動子與組成型啟動子。在一些具體態樣中，該載體可具有二或更多個用於共表現多個基因或操縱子的啟動子。在一些具體態樣中，該基因/操縱子可在具有一或多個相對應的啟動子的一或多個不同的載體上表現。
用於轉形的載體可為可於微生物之細胞中獨立自主地複製的載體。可於腸內桿菌科(enterobacteriaceae)細菌(諸如大腸桿菌)之細菌內獨立自主地複製的載體之實例可包含質體載體pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pET20b(+)、pET28b(+)(pET載體可自Novagen獲得)、pLysS(pHSG與pSTV載體可自Takara Bio Inc.獲得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW載體可自Nippon Gene Co.,Ltd.獲得)與以此類推、與其等之衍生物。此外， 用於棒狀桿菌群細菌的載體可包含pAM330(日本專利公開案編號58-67699)、pHM1519(日本專利公開案編號58-77895)、pSFK6(日本專利公開案編號2000-262288)、pVK7(USP2003-0175912A)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(日本專利公開案編號58-192900)、pCG1(日本專利公開案編號57-134500)、pCG2(日本專利公開案編號58-35197)、pCG4、pCG11(日本專利公開案編號57-183799)、pHK4(日本專利公開案編號5-7491)與以此類推。此外，用於酵母菌的載體可包含酵母菌質體，諸如例如用於巴斯德畢赤酵母菌的pD902或pD905、或用於啤酒釀母菌的pD1201、pD1204、pD1205、pD1207、pD1211、pD1214 pD1215、pD1217、pD1218、pD1221、pD1224、pD1225、pD1227、pD1231、pD1234、pD1235、pD1237。亦可使用廣為人知的方法(例如Datensko與Wanner(Datsenko,K.A.與Wanner,B.L.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645))將基因併入宿主染色體中。
酵素之活性之增強可包含增強目標基因之表現，其藉由以具有適當力量的啟動子置換目標基因之表現調節性序列，諸如基因組DNA或質體上的啟動子。例如，thr啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、pL啟動子、tac啟動子、等等係已知為頻繁地使用的啟動子。在微生物(諸如細菌)中具有高表現活性的啟動子之實例可包含延長因子Tu(EF-Tu)基因之啟動子、tuf、編碼共陪伴蛋白GroES/EL、硫氧化還原蛋白還原酶、磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、與類似者的基因之啟動子(WO2006/028063、EP1697525)。強啟動子與用於評估啟動子之強度的方法之實例係所屬技術領域中廣為人知的。
此外，亦可能去取代在一基因之啟動子區域中的數個核苷酸， 使得該啟動子具有適當的強度，如於WO 2000/18935中揭示的。表現調節性序列之取代可(例如)以與在使用溫度敏感性質體的基因取代中相同的方式來進行。可用於大腸桿菌或Pantoea ananatis的具有溫度敏感性複製起始序列的載體之實例可包含(例如)於國際公開案WO 1999/03988中描述的質體pMAN997、其之衍生物、與以此類推。此外，表現調節性序列之取代亦可藉由利用線性DNA的方法進行，該方法諸如使用λ噬菌體之Red重組酶的稱為「Red驅動性併入」的方法(Datsenko,K.A.與Wanner,B.L.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645)、組合Red驅動性併入方法與λ噬菌體切除系統的方法(Cho,E.H.等人2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)(WO2005/010175)、與以此類推。表現調節性序列之修飾可與增加基因複本數組合。
此外，咸已知取代於在核糖體結合位置(RBS)與起始密碼子間的空間中的數個核苷酸(且特別是緊貼起始密碼子的上游的序列)會深刻地影響mRNA可轉譯性。轉譯可藉由修飾此等序列增強。
當目標基因被導入上述的質體或染色體中時，可使用任何啟動子以表現該基因，只要是挑選了在所使用的微生物中有功能的啟動子。該啟動子可為該基因之天然的啟動子、或經修飾的啟動子。基因之表現亦可藉由適當地挑選於所選微生物中功能強有力的啟動子、或藉由接近靠近共通序列的啟動子之-35與-10區域來控制。
涉及代謝或合成途徑的外源核酸序列之轉形、轉導、接合或染色體插入可使用所屬技術領域中廣為人知的方法確認。如此方法包含(例如)萃取質體或染色體DNA接著聚合酶連鎖放大特定目標序列、或限制酶 切位作圖、進一步的核酸分析，諸如mRNA之北方印漬法或聚合酶連鎖反應(PCR)放大、或聚丙烯醯胺凝膠電泳、或酵素性活性測量、或對於基因產物之表現的免疫印漬法、或用於測試所導入的核酸序列或其之相對應基因產物之表現的其他合適的分析方法。所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解該外源核酸係以充足的量表現以生產所欲的基因產物，且會進一步瞭解表現水平可使用所屬技術領域中廣為人知的方法最佳化以獲得充足表現。
視需要地，用於以上本發明之方法之任一者的第四、第六、第七、第八與進一步方面之一或多種微生物可經進一步修飾以減低或排除參與以下細胞功能的酵素或蛋白質之活性：(i)使材料離開甲基丙烯酸生產途徑；及/或(ii)代謝甲基丙烯酸及/或其衍生物。
為了減低或排除上述的酵素或蛋白質之活性，可藉由習用隨機或定點突變誘發或基因設計技法將用於減低或排除酵素或蛋白質之細胞內活性的突變導入至上述的酵素或蛋白質之基因中。突變誘發之實例可包含(例如)X射線或紫外線照射、以誘變劑(諸如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍)處理、分別通過高保真度或易出錯聚合酶連鎖反應的試管內定點或隨機突變誘發、與以此類推。在基因上導入突變的位置可位於編碼該酵素或蛋白質的編碼區域或表現控制區域(諸如啟動子)。基因設計技法之實例可包含基因重組、轉導、細胞融合、基因敲除、與以此類推。
目標酵素或蛋白質之細胞內活性之減低或排除與減低之程度可藉由以下者確認：測量在自候選菌株獲得的細胞萃取物或其經純化餾 分中的酵素或蛋白質活性，並將其與野生型菌株的活性比較、或藉由測量通過完整細胞的目標產物之形成。
用於給予或增強甲基丙烯酸及/或其衍生物生產能力及/或其中間物的其他方法之實例可包含給予對甲基丙烯酸或有機酸類似物、呼吸抑制劑或類似者的抗性與給予對細胞壁合成抑制劑的敏感性。此等方法可包含(例如)藉由使用漸增濃度的毒性物質生長來挑選抗性細胞、給予單氟醋酸抗性、給予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性、使脲酶減弱、給予丙二酸抗性、給予對苯并哌哢或萘醌的抗性、給予HOQNO抗性、給予α-酮丙二酸抗性、給予胍抗性、給予對青黴素的敏感性、與以此類推，如所屬技術領域中已知的。
如此抗性細菌之實例可包含以下菌株：黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)AJ3949 FERM BP-2632；麩胺酸棒狀桿菌AJ11628 FERM P-5736；黃色短桿菌AJ11355 FERM P-5007；麩胺酸棒狀桿菌AJ11368 FERM P-5020；黃色短桿菌AJ11217 FERM P-4318；麩胺酸棒狀桿菌AJ11218 FERM P-4319；黃色短桿菌AJ11564 FERM P-5472；黃色短桿菌AJ11439 FERM P-5136；麩胺酸棒狀桿菌H7684 FERM BP-3004；乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11426 FERM P-5123；麩胺酸棒狀桿菌AJ11440 FERM P-5137；與乳糖發酵短桿菌AJ11796 FERM P-6402。
用於給予或增強甲基丙烯酸及/或其衍生物生產能力及/或其中間物的其他方法可包含給予對下調劑/抑制劑的抗性、給予對上調劑/活化劑的敏感性或減輕對於通過其他化合物的酵素之別位活化的需求。例如，減輕對於通過纈胺酸的來自戀臭假單孢菌的支鏈酮酸脫氫酶之別位活化的 需求、或減輕來自大腸桿菌的的乙醯乳酸合酶之別位抑制。
發酵
因此，以上提及的本發明之方法可藉由培養本發明之第四、第六、第七、第八與進一步方面之微生物來實施，該微生物能夠生產甲基丙烯醯基輔酶A中間物及/或甲基丙烯酸及/或其衍生物，諸如甲基丙烯酸酯，適當地在培養基中。
因此，適當地，本發明之第一、第二或第三方面之方法可進一步包含培養一或多種微生物以生產甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的步驟。
較佳地，該培養係在發酵培養基中發生。
因此，根據本發明之第九方面，提供了一種發酵的方法，其包含在發酵培養基中培養第四、第五、第六、第七、第八或進一步方面之一或多種微生物以生產甲基丙烯酸及/或其衍生物，諸如甲基丙烯酸酯。
甲基丙烯酸及/或其衍生物可存在於發酵培養基中或在微生物之細胞內。
因此，適當地，本發明之第一、第二或第三方面之方法可進一步包含自發酵培養基或自微生物細胞收集甲基丙烯酸及/或於其形成中的中間物及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的步驟。
甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)可藉由如以上描述的分泌甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的微生物存在於發酵培養基中。
甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)可藉由如以上描述的累積甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的微生物存在於微生物之細胞中。
因此，適當地，細胞係藉由所屬技術領域中已知的任何方法(諸如過濾、離心、等等)自發酵培養基移除，且甲基丙烯酸或其鹽及/或甲基丙烯酸酯係藉由所屬技術領域中已知的任何方法(諸如蒸餾、液體-液體萃取、等等)自發酵培養基收集。因此，適當地，本發明之方法可包含自周圍的培養基收集甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的進一步步驟，此可藉由首先藉由過濾或離心自培養基移除細胞並接著藉由蒸餾或液體-液體萃取自經澄清化的培養基萃取甲基丙烯酸及/或其衍生物來實施。
視需要地，收集甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)可進一步包含自細胞釋放甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的步驟，其可藉由所屬技術領域中已知的任何方法進行，較佳地其中細胞被溶胞以釋放所欲的產物，諸如：藉由聲裂法、均質化、酵素性處理、珠粒研磨、滲壓衝擊、冷凍-解凍、酸/鹼處理、噬菌體溶胞、等等，接著為如以上詳述的自發酵培養基收集的類似方法。因此，適當地，本發明之方法可包含自細胞收集甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)的進一步步驟，此可藉由溶胞細胞，並接著過濾細胞殘骸，然後萃取甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)來實施。
適當地，微生物之培養或養殖需要於其上微生物可得到能量並生長的基於碳的原料。因此，較佳地，該微生物係培養在基於碳的原料 漲，且本發明之第一或第二方面之方法可進一步包含培養能夠從基於碳的原料生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的一或多種微生物的步驟。
較佳地，該培養或養殖係於發酵培養基發生，該培養基適當地為圍繞著該微生物的周圍培養基，較佳地該基於碳的原料係存在於該培養基中，視需要地係溶解或懸浮在該培養基中、通過該培養基充泡泡及/或與該培養基混合。因此，較佳地該培養基包含該微生物與基於碳的原料以及任何緩衝劑與鹽。
因此，根據本發明之第十方面，提供了一種發酵培養基，其包含第四、第五、第六、第七、第八或進一步方面之一或多種微生物。
較佳地，該發酵培養基進一步包含甲基丙烯酸及/或其衍生物，諸如甲基丙烯酸酯。
較佳地，該微生物以超過基線速率的速率生產甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)，如以上解釋的，使得較佳地甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)存在於該培養基中的濃度(無論是來自直接分泌者或來自溶胞細胞的)係在高滴定量。
較佳地，存在於該發酵培養基中的甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)之滴定量係至少5mg/L。例如5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155mg/L，較佳係至少大於130mg/L。
較佳地，於甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)係在微生物內累積的具體態樣中，甲基丙烯酸及/或其中間物及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)存在於該細胞中的濃度係至少0.05mM，更佳係至少 0.1mM，更佳係至少1mM，更佳係至少2mM，更佳係至少5mM，更佳係至少10mM。較佳地，甲基丙烯酸或其中間物及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)於細胞中的濃度範圍在10mM至約300mM，更佳係約20mM至約200mM，又更佳係約30mM至約100mM，最佳係約40mM至約70mM之間。
本發明之微生物可以批式、重複批式、分批補料式、重複分批補料式或連續養殖方法養殖或培養。
適當地，該養殖方法於培養基(在本文中亦被稱為周圍培養基或發酵培養基)中發生。較佳地，應用分批補料式或重複分批補料式方法，其中該碳來源及/或氮來源及/或其他化合物被餽料至該養殖方法。更佳地，該碳及/或氮來源被餽料至該養殖方法中。
於其中本發明之微生物被培養的發酵培養基可為適用於討論中的生物體之需要的任何商業上可購得的培養基，其條件為該生物體所需的相關營養物係受限的。該培養可為好氧性或厭氧性，然而在其中利用了氧化酶酵素的本發明之前後文中，該培養較佳係好氧性。
適當地，該發酵培養基含有如以上描述的基於碳的原料、以及氮來源、以及該微生物之生長及/或甲基丙烯酸及/或甲基丙烯酸酯之形成所需的其他化合物。
所屬技術領域中已知的合適的基於碳的原料之實例包含葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精、蔗糖、經水解澱粉、澱粉、木質素、芳香族物、合成氣或其之組份、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、糖蜜與油。較佳地，該基於碳的原料係衍生自生質。亦可使用混合物以及廢棄物，諸如都市廢棄物、食物廢棄物與來自食物加工、林業或農業的木質織維素廢棄物。
所屬技術領域中已知的合適的氮來源之實例包含大豆粉、玉米浸液、酵母菌萃取物、氨、銨鹽、硝酸鹽、尿素、氮氣或其他氮來源。
微生物之生長所需要的其他化合物之實例包含抗生素、抗真菌劑、抗氧化劑、緩衝劑、磷酸鹽、硫酸鹽、鎂鹽、微量元素及/或維生素。
欲加至該培養基中的基於碳的原料與氮來源之總量可基於該微生物之需要及/或該養殖方法之長度而改變。
該培養基中基於碳的原料與氮來源間的比率可變化頗大。
該微生物之生長及/或甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)之生產所需的其他化合物(例如磷酸鹽、硫酸鹽或微量元素)可以可在不同的微生物之類型間(即在真菌、酵母菌與細菌間)變化的量添加。此外，欲加入的其他化合物的量可基於甲基丙烯酸及/或其衍生物(諸如甲基丙烯酸酯)是否形成與係使用哪個途徑形成其等來決定。
典型地，微生物之生長所需的各發酵培養基組份之量係藉由測量在該營養物上的生長量來決定且係對於該培養或養殖方法中使用的基於碳的原料之量作進一步分析，此係因為所形成的生質之量主要會由所使用的基於碳的原料之量、與在任何餵養方法期間加上的營養限制決定。
根據本發明的培養或養殖方法較佳係以工業規模進行。工業規模方法被瞭解成涵蓋在一或多個發酵槽中的培養或養殖方法，該一或多個發酵槽的體積規模係
Figure 105115309-A0305-02-0045-50
0.01m3，較佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-51
0.1m3，較佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-52
0.5m3，較佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-53
5m3，較佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-54
10m3，更佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-55
25m3，更佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-56
50m3，更佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-57
100m3，最佳係
Figure 105115309-A0305-02-0045-58
200m3。
較佳地，本發明之微生物之培養或養殖一般係於生物反應器 中進行。「生物反應器」一般被理解成意謂於其中微生物被工業上地培養的容器。生物反應器可具有任何尺寸、數目與形式，且可包含入口，其用於提供營養物、供生長之用的其他化合物、新鮮培養基、基於碳的原料、氣體之添加物，諸如(但不限於)空氣、氮、氧或二氧化碳。生物反應器亦可包含出口，其用於移除大量的該培養基以自該發酵培養基本身或自該微生物內收集甲基丙烯酸及/或甲基丙烯酸酯。該生物反應器較佳亦具有用於取樣該培養物的出口。該生物反應器一般可被裝配以(例如)藉由攪拌、滾動、搖動、轉動、對培養物通氣泡等等混合該發酵培養基。替代性地，一些連續培養不需要混合，例如使用塞流系統的微反應器系統。生物反應器係所屬技術領域中普通且廣為人知的且實例可於標準教科書中找到，諸如「生物技術：工業微生物學教科書，第二版」(1989)作者：Wulf Cruegar與Annelise Crueger，由Thomas D.Brock翻譯Sinauer Associates,Inc.，Sunderland，MA。
因此，根據本發明之第十一方面，提供了一種生物反應器，其包含第四、第五、第六、第七、第八或進一步方面之一或多種微生物及/或第十方面之發酵培養基。
視需要地，該生物反應器可包含複數種不同的本發明之微生物。
較佳地，該生物反應器僅包含能夠進行本發明之方法的微生物。
更佳地，該生物反應器僅包含相同物種的微生物，使得可自始至終使用相同的培養條件。
生質原料
較佳地，所使用的生質包含高量的碳水化合物，特佳者係是C5或C6糖、基於碳的氣體、或芳香族物之來源的碳水化合物，較佳係C5或C6糖，更佳係葡萄糖，諸如但不限於澱粉、木質素、纖維素、肝醣、阿拉伯木聚糖、幾丁質、或果膠。
替代性地，所使用的生質包含高量的脂肪，特佳係是甘油與脂肪酸(特別是三酸甘油酯)之來源的脂肪或油。合適的三酸甘油酯包含可輕易自植物或動物來源獲得的任何油或脂肪。如此油與脂肪之實例包含：棕櫚油、亞麻仁油、菜籽油、豬油、牛油、鯡魚油、椰子油、蔬菜油、葵花油、篦蔴油、大豆油、橄欖油、可可脂、水牛酪油、鯨脂等等。
該生質可由一或多種不同的生質來源組成。合適的生質來源之實例係如下：未經利用的木頭、能源作物、農業殘餘物、食物廢棄物、都市廢棄物與工業廢棄物或共產物。
未經利用的木頭生質來源可包含但不限於：木片；樹皮；殘枝；圓木；鋸木屑；木丸或木塊。
能源作物生質來源可包含但不限於：短期輪作矮林或林業；非木質草，諸如芒草、麻、柳枝稷、蘆葦或黑麥；農業作物，諸如糖、澱粉或油料作物；或水生植物，諸如微型或大型藻類與雜草。
農業殘餘物可包含但不限於：外稃；禾稈；玉米桿；麵粉；穀粒；禽糞；糞肥；水肥；合成氣；或青貯料。
食物廢棄物可包含但不限於：蔬果皮；殼；外稃；果心；果 核；動物或魚之不可食部分；來自果汁與油萃取的果肉漿；來自釀酒的榖渣或廢啤酒花；家庭廚房廢棄物；豬油或油或脂肪。
工業廢棄物可包含但不限於：未經處理的木頭，包含木丸、經處理的木頭、頁岩氣、組合木材，包含MDF/OSD、木板、紙漿/碎紙/廢紙；紡織品，包含纖維/紗/污水；或下水污泥。
進一步產物
此外，亦設想其他有用的有機化合物(例如甲基丙烯酸之衍生物，諸如其形形色色的酯)之生產。因此，該甲基丙烯酸產物可被酯化以生產其酯。潛在的酯可選自C1-C20烷基酯或C2-C12羥基烷基酯、環氧丙酯、異冰片酯、二甲基胺基乙酯、三丙二醇酯。最佳地，用於形成該酯的醇或烯可衍生自生物來源，例如生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇。較佳的酯係甲基丙烯酸乙酯、正丁酯、異丁酯、羥基甲酯、羥基丙酯或甲酯，最佳係甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸丁酯。
較佳地，甲基丙烯酸係藉由酯化反應轉變成甲基丙烯酸烷基酯或羥基烷基酯。用於如此轉換的合適反應條件係所屬技術領域中廣為人知的且係於WO/2012/069813中結合甲基丙烯酸之生產描述。
根據本發明之第十二方面，提供了一種製備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物的方法，其包含以下步驟：(i)根據本發明之第一、第二或第三方面或進一步方面製備甲基丙烯酸及/或其衍生物；(ii)視需要酯化於(i)中製備的甲基丙烯酸以生產甲基丙烯酸酯； (iii)聚合於(i)中製備的甲基丙烯酸及/或其衍生物及/或(若存在)於(ii)中製備的酯(視需要地與一或多種共單體一起)以生產其聚合物或共聚物。
步驟(i)可包含以上關於第一、第二、第三方面概述的進一步特徵之任一者組合該等第十二方面者。
較佳地，以上(ii)之甲基丙烯酸酯係選自甲基丙烯酸C1-C20烷基酯或C2-C12羥基烷基酯、環氧丙酯、異冰片酯、二甲基胺基乙酯、三丙二醇酯，更佳係乙酯、正丁酯、異丁酯、羥基甲酯、羥基丙酯或甲酯，最佳係甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸丁酯。
因此，根據本發明之一個進一步方面，提供了製備甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物的方法，其包含以下步驟：(i)根據本發明之第三方面或進一步方面製備甲基丙烯酸酯；(ii)聚合於(i)中製備的甲基丙烯酸及/或其衍生物(視需要地與一或多種共單體一起)以生產其聚合物或共聚物。
步驟(i)可包含關於以上第三方面概述的進一步特徵之任一者組合該等第十二方面者。
有益地，如此聚合物會具有相當可觀的部分(若非全部)的衍生自除了化石燃料以外的來源的單體殘餘物。
於任何例子中，較佳的共單體包含(例如)單乙烯性不飽和羧酸與二羧酸與其等之衍生物，諸如酯、醯胺與酐。
特佳的共單體係丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙基丙烯酸酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸第三丁酯、丙烯酸2-乙基 己酯、丙烯酸羥基乙酯、丙烯酸異冰片酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸第三丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羥基乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸環氧丙酯、甲基丙烯酸羥基丙酯、甲基丙烯酸異冰片酯、甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯、二丙烯酸三丙二醇酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、異氰酸酯，包含二異氰酸甲苯酯與二異氰酸p,p′-亞甲基二苯基酯、丙烯腈、丁二烯、丁二烯與苯乙烯(MBS)與ABS，其取決於不是選自在(i)中的酸單體或酯或(ii)中的酯單體與一或多種該等共單體之任何給定共聚化中的以上(i)或(ii)中的甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的單體的以上共單體之任一者。
當然，亦可能去使用不同共單體之混合物。該等共單體本身可以與來自以上(i)或(ii)的單體相同的方法製備或可以不同的方法製備。
根據本發明之第十二方面，提供了從本文之本發明之第十一方面之方法形成的聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)與聚甲基丙烯酸丁酯同元聚合物或共聚物。
實例
本發明現在將參照以下非限制性實例與圖式來闡明，其中：
圖1顯示界定以甲基丙烯醯基輔酶A作為受質來自關節桿菌屬物種SU的經羧基端六組胺酸標記的4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(75μg.ml-1)之動力學特徵的Lineweaver-Burke圖。
圖2顯示界定以異丁醯基輔酶A作為受質來自關節桿菌屬物種SU的經羧基端六組胺酸標記的4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(1mg.ml-1)之動力學特徵的Lineweaver-Burke圖。
圖3顯示標準品異丁醯基輔酶A(主要尖峰位於32.2min且次主要尖峰位於32.9min)、甲基丙烯醯基輔酶A(主要尖峰位於30.8min且次主要尖峰位於31.6min)、甲基丙烯酸(主要尖峰位於13.5mins)與輔酶A(主要尖峰位於11min且次主要尖峰位於12min)之重疊HPLC圖形，其使用HPLC方法以測定關於異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯醯基輔酶A的氧化反應的來自阿拉伯芥的短鏈醯基輔酶A氧化酶(ACX4)之試管內活性。黃素腺嘌呤二核苷酸於27.8min洗提出，且係用作為異丁醯基輔酶A與甲基丙烯醯基輔酶A的內部標準品。
圖4顯示分析混合物之HPLC圖形，該混合物含有ACX4無細胞萃取物、經純化的經羧基端六組胺酸標記的4HBT與黃素腺嘌呤二核苷酸，其等係於HEPES分析緩衝劑，無添加受質，作為陰性對照組。
圖5顯示將ACX4之無細胞萃取物以在含有黃素腺嘌呤二核苷酸的HEPES分析緩衝劑中的異丁醯基輔酶A培養30min後的分析混合物之HPLC分析。
圖6顯示將ACX4之無細胞萃取物以在含有黃素腺嘌呤二核苷酸的HEPES分析緩衝劑中的異丁醯基輔酶A培養30min後(其在藉由酸化停止反應混合物後摻加另外的異丁醯基輔酶A)的分析混合物之HPLC分析。
圖7顯示對於藉由ACX4無細胞萃取物與經純化經羧基端 His標記的4HBT的異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯酸與輔酶A之轉換的酵素偶聯反應之HPLC分析。
圖8顯示pET20b(+)：：4HBT-ACX-AcsA質體，其為一種含有4HBT基因、ACX4基因與AcsA基因的pET20b(+)質體，該等基因皆在單一的T7啟動子之控制下。
圖9顯示藉由大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA的4HBT、ACX4與AcsA之共表現之SDS-PAGE分析。
圖10顯示對異丁酸變成甲基丙烯酸之生物變換與所有相關對照組(誘發後20.5h)之分析進行的HPLC圖形，藉其圖10A顯示對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA之培養物進行的圖，其中未加入異丁酸；圖10B顯示大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)之培養物，其中未加入異丁酸；圖10C顯示異丁酸之5mM標準品之HPLC圖；圖10D顯示大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)之培養物之HPLC圖，該培養物係在重組蛋白表現之誘發後1h以異丁酸(5mM)補充，圖10E顯示異丁酸(5mM)與甲基丙烯酸(200μM)標準品之混合物之HPLC圖且圖10F顯示大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA培養物之HPLC圖，其中在重組蛋白表現之誘發後1h加入異丁酸(5mM)。
圖11顯示在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA培養物中甲基丙烯酸濃度隨時間的改變(底部的線)，該培養物係以異丁酸補充，以及在將異丁酸加至該培養物後該培養物之ln(OD600)隨時間的改變(頂部的的線)。
圖12顯示pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD質體，其為具有編碼來自關節桿菌屬物種菌株SU的4HBT、來自阿拉伯芥的ACX4以及來自戀臭假單孢菌KT2440的bkdA1、bkdA2、bkdB與lpdV基因(所有皆在單一的T7啟動子之控制下)的經密碼子最佳化的基因的pET20b(+)質體。
圖13顯示2-酮異戊酸(5mM)、異丁酸(5mM)與甲基丙烯酸(200μM)標準品之混合物之HPLC分析，藉該等組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率。
圖14顯示大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照菌株之培養物之HPLC分析，藉組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率。
圖15顯示大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD之培養物之HPLC分析，藉其組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率，顯示自葡萄糖的甲基丙烯酸之生產。
圖16顯示摻加另外的0.24mM作準甲基丙烯酸的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD之培養物之樣本之HPLC分析，藉其組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率。
圖17顯示以2-酮異戊酸補充的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照菌株之培養物之HPLC分析，藉其組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈， 以1ml.min-1的流率。
圖18顯示以2-酮異戊酸(5mM)補充的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD之培養物之HPLC分析，藉其組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率，顯示以2-酮異戊酸補充培養基會提高藉由此菌株的甲基丙烯酸生產。
圖19顯示摻加另外的0.24mM作準甲基丙烯酸的以2-酮異戊酸(5mM)補充的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD之培養物之樣本之HPLC分析，藉其組份係藉由等度洗提分離，該洗提使用在以HCl酸化至pH 2.5的50mM KH2PO4中的14%乙腈，以1ml.min-1的流率。
圖20顯示用於在大腸桿菌中的阿拉伯芥ACX4蛋白質之表現的質體pMMA121之結構。
圖21顯示使用自實施例5之重組大腸桿菌生產的阿拉伯芥ACX4蛋白質的自異丁醯基輔酶A的甲基丙烯醯基輔酶A之生產。
圖22顯示含有阿拉伯芥ACX4蛋白質的實施例5之重組大腸桿菌之餾分之SDS-PAGE分析。
圖23顯示用於在重組大腸桿菌中的蘋果AAT(MpAAT1)、來自擬南芥屬(Arabidopsis)的ACX4、與來自銅綠假單胞菌PA01菌株的bkdA1、bkdA2、bkdB與lpdV：BCKAD複合基因之表現的質體pWA008、pMMA133與pMMA134之結構。
圖24顯示藉由重組大腸桿菌生產表現質體pMMA134之培 養物之樣本之HPLC分析的自2-酮異戊酸與丁醇的甲基丙烯酸丁酯之生產。
實施例1：甲基丙烯醯基輔酶A之選擇性水解作用
實施例2：於酵素偶聯反應中的異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯醯基輔酶A之氧化反應與異丁醯基輔酶A變成甲基丙烯酸與輔酶A之試管內轉換。
實施例3：異丁酸變成甲基丙烯酸的全細胞生物變換。
實施例4：經由2-酮異戊酸中間物的自葡萄糖的甲基丙烯酸之全細胞生產。
實施例5：藉由重組大腸桿菌的自2-酮異戊酸的甲基丙烯酸丁酯之全細胞生產
1.1 實施例1至4之材料
列舉了實施例一至四通篇中使用的細菌菌株、以及實驗通篇中使用的生長培養基與瓊脂盤。引子之表列舉了所有於此研究中使用的引子，且質體之表列舉了所有在此研究期間使用與構築的質體。
1.1.1 細菌菌株
使用大腸桿菌JM107作為質體選殖宿主並使用大腸桿菌BL21(DE3)pLysS作為基因表現宿主。
1.1.2 細菌生長培養基與營養瓊脂盤
1.1.2.1 Luria Bertani液態培養基(LB培養基)
凡是提及LB培養基都使用Luria Bertani高鹽培養基(Melford)(25g.L-1)，藉其於1公升中的25g的LB高鹽培養基由來自酪蛋白消化的蛋白腖(10g.L-1)、酵母菌萃取物(5g.L-1)與氯化鈉(10g.L-1)組成。LB培養基往往係以卡本西林(carbenicillin)(50μg.ml-1)、氯黴素(34μg.ml-1)及/或葡萄糖(1% w/v)補充。LB培養基係藉由高壓蒸氣滅菌器無菌化，而於水中的葡萄糖(20% w/v)、於水中的卡本西林(100mg.ml-1)與於乙醇中的氯黴素(34mg.ml-1)之儲備溶液係以過濾無菌化並分開地加入。
1.1.2.2.MSX基本培養基
MSX培養基係藉由於室溫下組合MSA培養基(760ml.L-1)、MSB培養基(200ml.L-1)與12.5%(w/v)葡萄糖儲備溶液(40ml.L-1)來製備。MSB培養基係由NH4Cl(15g.L-1)與MgSO4.7H2O(2.0g.L-1)構成且係藉由高壓蒸氣滅菌器無菌化。MSA培養基係由KH2PO4(7.89g.L-1)構成，在藉由高壓蒸氣滅菌器無菌化MSA前添加vishniac微量元素(2.63ml.L-1)與KOH溶液直到pH達到7.0。Vishniac微量元素係如先前描述地製備(Vishniac W,Santer M.THE THIOBACILLI,.Bacteriological Reviews1957；21(3)：195-213.)，但只使用3.9g.L-1的ZnSO4.7H2O。葡萄糖係使用0.22μm無菌濾器過濾無菌化。MSX培養基有時係以核黃素(1mg.L-1)補充且此係藉由首先將核黃素溶解至MSB培養基中(5mg.L-1)來達成。此溶液接著被過濾無菌化且MSB+ 核黃素溶液接著係以相同的體積與MSA和葡萄糖混合(與用於僅MSX培養基者一樣)以形成以核黃素補充的MSX。MSX與以核黃素補充的MSX兩者皆總以卡本西林(50μg.ml-1)與氯黴素(34μg.ml-1)(如先前對LB培養基描述地製備)補充。
1.1.2.3 Luria Bertani瓊脂盤
Luria Bertani瓊脂盤係使用Luria Bertani高鹽培養基(Melford)(25g.L-1)與瓊脂(20g.L-1)製備。LB與瓊脂混合物係藉由高壓蒸氣滅菌器無菌化並使其在倒盤前於50℃水浴中冷卻1h。LB瓊脂盤往往係以卡本西林(50μg.ml-1)、氯黴素(34μg.ml-1)及/或葡萄糖(1% w/v)補充。卡本西林、氯黴素與葡萄糖儲備溶液係如先前對Luria Bertani液體液態培養基描述地製備並在緊接倒盤前加至LB瓊脂溶液。葡萄糖儲備溶液係在其被加至LB瓊脂前於50℃水浴中預先加溫1h。
1.1.3 引子之表與序列之列表
Figure 105115309-A0305-02-0058-1
SEQ ID NO.1-用於在大腸桿菌中表現的來自關節桿菌屬物種菌株SU的4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)的經密碼子最佳化基因序列。
SEQ ID NO.4-聚合酶連鎖反應之產物，該聚合酶連鎖反應被進行以修飾4HBT基因以使得PCR產物被次選殖至pET20b(+)質體中以形成pET20b(+)：：CtHis-4HBT質體。
SEQ ID NO.5-於pET20b(+)：：CtHis-4HBT質體中編碼經羧基端組胺酸標記的4HBT酵素的基因。
SEQ ID NO.6-用於在大腸桿菌中表現的編碼來自阿拉伯芥的短鏈醯基輔酶A氧化酶(ACX4)的經密碼子最佳化基因。
SEQ ID NO.11-將4HBT與ACX4連接成一個聚核苷酸的重疊延伸聚合酶連鎖反應之產物。
SEQ ID NO.12-用於在大腸桿菌中表現的編碼來自針假單胞菌B23的醯基輔酶A合成酶(AcsA)的經密碼子最佳化基因。
SEQ ID NO.13-在於pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA中的NdeI與XhoI限制位置之間且包含其等的序列。
SEQ ID NO 14-由Biomatik合成的「ppBCKD」聚核苷酸，其含有四個基因，該等基因編碼戀臭假單孢菌KT2440支鏈酮酸脫氫酶之次單元，於pBSK：：ppBCKD質體中遞送。
SEQ ID NO.15-在於pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD質體中的NdeI與XhoI限制位置之間且包含其等的序列
SEQ ID NO.22-含有經修飾的Sse8387I限制位置的pET16b(Sse)表現載體之序列
SEQ ID NO.23-用於在pET16b(Sse)表現載體中表現的編碼來自阿拉伯芥的短鏈醯基輔酶A氧化酶(ACX4)的經密碼子最佳化基因。
SEQ ID NO.24-用於在pET16b(Sse)表現載體中表現的編碼來自蘋果的醇醯基轉移酶(AAT)的經密碼子最佳化基因。
1.1.4 質體之表
Figure 105115309-A0305-02-0061-2
Figure 105115309-A0305-02-0062-3
Figure 105115309-A0305-02-0063-4
Figure 105115309-A0305-02-0064-5
Figure 105115309-A0305-02-0065-6
1.2 實施例1至4之一般方法
1.2.1 質體至大腸桿菌JM107選殖宿主中的轉形。
將質體(1ng)轉形至使用Fermentas TransformAidTM細菌轉形套組以變得勝任的大腸桿菌JM107(50μl)中。將新鮮的經轉形細胞在冰上培養5min，接著將其塗盤在以卡本西林(50ng.μl-1)補充的經預先加溫的LB瓊脂盤上。將盤於37℃下培養16h。
1.2.2 質體之限制酶消化
為了自質體分離基因或聚核苷酸插入物，根據所提供的使用指南使用限制內切核酸酶之Fermentas FastDigest®系列進行了質體之限制酶消化。所有的限制酶消化反應皆於37℃下於水浴中進行3h。
1.2.3.線性表現載體之製備
於含有質體DNA(100ng.μl-1)、Fermentas FastDigest® Green緩衝劑(1X)與Fermentas FastDigest®限制內切核酸酶的限制酶消化反應(100μl)中線性化質體，如以上描述地。藉由瓊脂糖凝膠電泳與凝膠萃取來純化經線性化的載體，而不先以加熱使限制內切核酸酶失活。接著根據所提供的使用指南藉由Antarctic磷酸酶(New England Biolabs)水解經線性化的載體之5’磷酸基。藉由乙醇沈澱來濃縮經去磷酸化的載體，該沈澱需要將3M乙酸鈉，pH 5.2加至樣本中(所加的體積：原始樣本體積之1/10th)接著加入絕對乙醇(所加體積：2X新樣本體積)。於-20℃下培養沈澱混合物過夜。接著以13400rpm於Eppendorf miniSpin F-45-12-11轉子中離心經沈澱的DNA 30min。丟棄上清液並以70%(v/v)乙醇洗滌細胞小丸。接著如之前一樣於相同的轉子中與以相同的速度下離心DNA小丸另外10min。移 除上清液並於通風櫥中風乾DNA小丸20min，然後再懸浮在無核酸酶水(50μl)中。藉由分析性瓊脂糖凝膠電泳測定經線性化的載體之濃度。
1.2.4.瓊脂糖凝膠電泳與膠萃取
藉由瓊脂糖凝膠電泳純化來自質體消化或PCR放大的線性DNA片段。將消化或PCR產物裝載至由瓊脂糖(1%(w/v))、溴化乙錠(1.78μM)、Tris乙酸鹽(4mM)與乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)組成的瓊脂糖凝膠上。對整個凝膠施加每公分凝膠長度7V的電位差以解析聚核苷酸。使用透照器在凝膠上顯像DNA，並以解剖刀切下含有所關注的聚核苷酸的凝膠片。以QIAquick®凝膠萃取套組自凝膠片純化聚核苷酸。藉由分析性瓊脂糖凝膠電泳測定聚核苷酸之濃度。
1.2.5 插入物至經線性化的質體中的連接
在連接反應(20μl)中將基因插入物連接至經線性化的質體中。連接反應係由3：1莫耳比率(對於長度小於3kb的基因插入物)或1：1莫耳比率(對於長度大於3kb的基因插入物)的基因插入物與線性載體(50ng)、以及T4 DNA連接酶(1單位)與T4 DNA連接酶的Fermentas緩衝劑(1X)組成。於室溫下進行連接20min並使用連接混合物(2.5μl)作為質體之來源以用於轉形至大腸桿菌JM107中，其使用Fermentas TransformAid細菌轉形套組進行，如之前。將經轉形的細胞塗盤至以卡本西林補充的經預先加溫的LB瓊脂盤上並於37℃下培養16h。
1.2.6 將一聚核苷酸次選殖入表現載體中
為將一聚核苷酸次選殖入新的載體中，首先藉由使用Fermentas TransformAidTM細菌轉形套組將來源載體(1ng)轉形至大腸桿菌JM107中並接著為在瓊脂盤上的5個獨特的菌落之每一者製備以卡本西林補充的LB培養物(5ml)來擴增來源載體。於37℃下伴隨以250rpm搖動培養該5x5ml LB+卡本西林培養物共16h並使用QIAGEN QIAprep® Spin miniprep套組如手冊中描述的自培養物純化出質體。在使用1μl對所欲5’與3’選殖位置之各者而言所需的限制內切核酸酶的限制酶消化反應(20μl)中將所關注的聚核苷酸自各質體製備物消化出。將限制酶消化產物倒在一起並藉由瓊脂糖凝膠電泳與凝膠萃取自來源載體之剩餘物純化要次選殖至新載體的聚核苷酸。建立連接反應以將聚核苷酸插入物連接至具有針對該插入物的互補性黏性端的先前製備的經線性化表現載體中。使用該連接反應(2.5μl)作為用於轉形至大腸桿菌JM107中的質體之來源，如已描述的。藉由以來自轉形體之盤的單一菌落接種LB+卡本西林培養物(100ml)來擴增表現質體，將該培養物於37℃下伴隨以200rpm搖動培養16h，並使用QIAGEN Plamnid MidiPrep套組自培養物純化質體。
1.2.7 具有表現載體的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS之轉形
將表現載體(1ng)轉形至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS表現宿主中。勝任細胞係自Novagen購買，且將冰冷環形質體(1ng)加至冰冷勝任細胞(20μl)。在於42℃下熱休克30s前，在冰上培養轉形混合物5min。於熱休克後，在冰上培養細胞另外2min。將SOC培養基(Novagen)(80μl) 加至該經轉形的細胞並於37℃下伴隨以250rpm搖動培養該細胞60min，然後將之塗盤至以卡本西林(50μg.ml-1)、氯黴素(34μg.ml-1)與葡萄糖(1%，w/v)補充的LB瓊脂盤上。於37℃下將盤培養16h。
1.2.8 分析性瓊脂糖凝膠電泳
藉由分析性瓊脂糖凝膠電泳測定線性DNA均一性與濃度。瓊脂糖凝膠係由瓊脂糖(1%(w/v))、溴化乙錠(1.78μM)、Tris乙酸鹽(4mM)與EDTA(1mM)組成。將固定體積(5μl)的DNA樣本與GeneRulerTM 1kb Plus DNA階梯(Thermo Scientific)(5μl)裝載至凝膠上。為估計樣本之濃度，顯像樣本條帶之強度並與階梯中類似尺寸與已知質量之條帶之強度比較，如GeneRulerTM 1kb Plus DNA階梯之手冊中描述的。
1.2.9 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳
自細胞培養物取樣本(1.5ml)並藉由於5000g下離心10min將細胞沈澱成小丸。將細胞小丸再懸浮於細胞溶胞緩衝劑中，每在取樣本時的細胞培養物之OD600單位使用100μl。細胞溶胞緩衝劑含有磷酸鉀緩衝劑(100mM，pH 7.5)、BugBuster細胞溶胞清潔劑(Merck-Millipore)(1X)、Benzonase核酸酶(Sigma Aldrich)(0.01%，v/v)與蛋白酶抑制劑混合物(Roche)。將經再懸浮的細胞以250rpm搖動培養20min並於4℃下以18,000g離心其20min。使用與用於再懸浮細胞小丸的體積相同的體積將不可溶的餾分再懸浮於磷酸鉀緩衝劑(100mM，pH 7.5)中。可溶的與不可溶的餾分係以1：1的比率與2X Laemmli樣本緩衝劑(Bio-Rad)(其含有β-巰基乙醇(5%，v/v)) 混合。於100℃下將樣本沸騰5min並將其裝載至Bio-Rad AnyKD TGX預鑄凝膠上。於200V下在Tris/甘胺酸/SDS運轉緩衝劑(Bio-Rad)中進行電泳。藉由於室溫下伴隨溫和的攪動(50rpm)將凝膠浸泡在泡泡蒸餾水中5min來洗滌凝膠。移除水並重複洗滌程序再四次。接著藉由於室溫下伴隨溫和的攪動16h浸泡在EZBlueTM凝膠染色試劑(Sigma-Aldrich)中過夜(16h)來染色凝膠。
1.3 實施例1-自甲基丙烯醯基輔酶A的甲基丙烯酸之生產：
在針對對與甲基丙烯醯基輔酶A在結構上相關的受質具有已知活性的硫酯酶作資料庫與文獻搜尋後，來自關節桿菌屬物種菌株SU的酵素4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)(Genbank登錄號AAC80224.1，Uniprot登錄號Q04416，EC編號3.1.2.23)被鑑認為用於甲基丙烯醯基輔酶A之水解的候選者硫酯酶。
將編碼4HBT之胺基酸序列的基因針對在大腸桿菌中表現作密碼子最佳化並由Biomatik Corporation合成，其具有NdeI限制位置併入至其5’端中與NotI限制位置接附至其3’端。
所合成的聚核苷酸(SEQ.ID 1)係於pBMH：：4HBT選殖載體中遞送且4HBT基因插入物被次選殖入先前已線性化的pET20b(+)表現載體中(於NdeI與NotI限制位置)以形成pET20b(+)：：4HBT。接著將新構築的pET20b(+)：：4HBT質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中以形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT。
為表現4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶酵素，將以葡萄糖、 卡本西林與氯黴素補充的LB培養基之起始培養物(20ml)首先以來自以葡萄糖氯黴素與卡本西林補充的LB瓊脂盤的單一菌落的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT接種。將起始培養物於37℃下伴隨以200rpm搖動培養直到該培養物達到1.0的OD600。接著藉由於4℃下於5000g下離心15min收穫細胞並將其用於接種LB培養基之中間培養物(100ml)，其亦以葡萄糖、卡本西林與氯黴素補充。亦於37℃下伴隨以200rpm搖動培養該中間培養物直到1.0的OD600。接著藉由於4℃下於5000g下離心15min收穫在該中間培養物中的細胞，之後將其再懸浮於在2.5L具緩衝板搖動燒瓶中的新鮮的LB培養基(1L)中(再次以葡萄糖、卡本西林與氯黴素補充)。於37℃下伴隨以200rpm搖動培養此培養物直到1.0的OD600並接著藉由添加異丙基-β-D-硫代半乳哌喃糖苷(IPTG)到0.4mM的最終濃度來誘發4HBT之表現。將該培養物在相同的條件下再培養5.5h。將培養物平均地分至三個離心管並接著藉由於4℃下於5000g下離心20min來收穫細胞。藉由SDS-PAGE分析在收穫細胞前取得的培養物之樣本，而該分析顯示該蛋白質為高度可溶的且被良好地表現的。於分析緩衝劑(50ml)(其由2-[4-(2-羥基乙基)哌
Figure 105115309-A0305-02-0071-59
-1-基])乙磺酸(HEPES)(50mM)構成，並以氫氧化鉀調整至pH 7.5)中洗滌每個離心管中的細胞小丸三次。於-80℃下冷凍細胞小丸直到溶胞。對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b、空的pET20b(+)載體陰性對照菌株重複此方法。
為製備4HBT酵素之無細胞萃取物，將先前製備的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT之細胞小丸之一再懸浮於HEPES(50mM，pH 7.5)分析緩衝劑中並於Constant Systems One Shot細胞瓦解儀中溶胞。於 4℃下於18,000g下離心細胞溶胞產物15min並於4℃下於57,750g下離心此之上清液另外60min。藉由以下者洗滌此上清液：使用VivaSpin Viva6 10,000分子量截止離心濃縮器於18℃下於10,000g下離心直到體積減少六倍，接著於HEPES分析緩衝劑中再稀釋六倍並於離心濃縮器中再次將體積減少六倍。來自大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT過度表現培養物的無細胞萃取物之總蛋白質濃度係使用BioRad DC分析套組使用牛血清白蛋白作為蛋白質標準物進行。依循相同的程序以製備來自大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照菌株之細胞小丸的無細胞萃取物。
為了分析4HBT酵素對甲基丙烯醯基輔酶A的活性，首先製備甲基丙烯醯基輔酶A。甲基丙烯醯基輔酶A之合成係藉由輔酶A與甲基丙烯酸酐的反應進行。該反應由在鈉磷酸酯緩衝劑(100mM，pH 8.5)中的輔酶A(20mM)與甲基丙烯酸酐(40mM)組成。在冰上培養該反應30min並每2min漩渦震盪一次且將最終反應混合物以氫氯酸酸化至pH 3.5。藉由以4x10ml水飽和的二乙醚萃取來移除甲基丙烯酸副產物與未反應的甲基丙烯酸酐。藉由逆向高效液相層析法(RP-HPLC)在分析規模管柱(Agilent Zorbax Eclipse XDB C18管柱，4.6mm x 150mM)上純化甲基丙烯醯基輔酶A。將樣本(75μl)注射至C18管柱上，並藉由於0.1%三氟醋酸(TFA)中的線性乙腈梯度(1.8%-13.5%)以1ml.min-1的流率在40min期間洗提。主要尖峰係含甲基丙烯醯基輔酶A的尖峰，並收集含甲基丙烯醯基輔酶A的餾分並倒在一起。藉由旋轉式蒸發(21℃，3kPa)移除乙腈，留下甲基丙烯醯基輔酶A與三氟醋酸之水溶液。藉由氫氧化鈉使此甲基丙烯醯基輔酶A與三氟醋酸之溶液成為pH 7並使用液態氮急速冷凍，然後冷凍乾燥。藉由將 經冷凍乾燥的樣本再溶解於無核酸酶水(10ml)中來移除TFA，並再重複冷凍乾燥-再溶解循環兩次，一次於5ml無核酸酶水中，且最後於1ml無核酸酶水中。藉由於260nm的吸光度以16800M-1.cm-1的莫耳消光係數測定甲基丙烯醯基輔酶A之濃度。
4HBT之粗酵素性分析係於含有無細胞蛋白質萃取物(1mg.ml-1)、甲基丙烯醯基輔酶A(大約100μM)、5’5-二硫基雙-(2-硝基苯甲)酸(DTNB)(500μM)的光析管(1ml)中進行。反應係藉由加入受質起始且係於412nm監視。對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)之無細胞萃取物重複酵素性分析。亦以異丁醯基輔酶A作為受質重複針對過度表現4HBT的菌株與空載體對照組菌株兩者之無細胞萃取物的酵素分析。
4HBT之粗酵素分析顯示4HBT催化了甲基丙烯醯基輔酶A之水解，且展現了相對於異丁醯基輔酶A用甲基丙烯醯基輔酶A作為受質的選擇性。
為了更好地界定4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶之特徵，以His標記該酵素使得其可以純酵素的形式而非以無細胞萃取物之一部份的形式分析。為以His標記該酵素，建立聚合酶連鎖反應。用於以His標記4HBT的正向與逆向引子(HHT.F(SEQ.ID 2)與HHT.R(SEQ.ID 3))被設計成會以(5’-GGA-3’)序列置換來自編碼4HBT的基因的(5’-TAA-3’)停止密碼子並緊接其後導入3’XhoI限制位置。因此，在將PCR產物選殖回pET20b(+)的NdeI與XhoI限制位置之間後，創造出編碼4HBT且有甘胺酸-白胺酸-麩胺酸間隔序列和羧基端六組胺酸(His)標籤的開讀框。
聚合酶連鎖反應混合物含有pET20b(+)：：4HBT質體作為模版 DNA(50pg.μl-1)、KOD DNA聚合酶(1單位)、引子HHT.F(0.4μM)、引子HHT.R(0.4μM)、去氧腺嘌呤核苷三磷酸(dATP)(0.2mM)、去氧胸腺嘧啶核苷三磷酸(dTTP)(0.2mM)、去氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)(0.2mM)、去氧鳥嘌呤核苷三磷酸(dGTP)(0.2mM)、MgCl2(1mM)與KOD DNA聚合酶的Novagen緩衝劑#1(1X)。將PCR混合物裝載至熱循環儀中，熱循環儀被設定成以於94℃下開始3min，接著透過重複30次於94℃下融化30s、於55℃下退火30s、於72℃下延長80s來循環，然後於72℃下結束5min。
藉由瓊脂糖凝膠電泳然後凝膠萃取來純化PCR產物(SEQ.ID 4)，並將其鈍端連接至pJET1.2選殖載體中以形成pJET1.2：：CtHis-4HBT。接著將插入物從pJET1.2：：CtHis-4HBT次選殖至pET20b(+)的NdeI與XhoI限制位置之間以形成pET20b(+)：：CtHis-4HBT。接著以pET20b(+)：CtHis-4HBT轉形大腸桿菌BL21(DE3)pLysS表現宿主以形成經C端六組胺酸標記的4HBT表現宿主，大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：CtHis-4HBT。
接著藉由以下者製備純的經羧基端His標記的4HBT酵素：首先生長大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：CtHis-4HBT之培養物並以與對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT進行者完全相同的方式誘發表現。於表現後5.5h自培養物取得的樣本顯示經羧基端His標記的4HBT酵素亦係非常可溶的且係以高水平表現。藉由將細胞培養物分至三個離心管中並於4℃下於5000g下離心20min來收穫細胞。然而，未洗滌細胞小丸，而是將其直接儲存於-80℃下。藉由將大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：CtHis-4HBT細胞小丸之一再懸浮於用於鎳-sepharose FPLC管柱 的結合緩衝劑(6ml)中來製備經羧基端六組胺酸標記的4HBT之無細胞萃取物。結合緩衝劑係由NaH2PO4(10mM)、Na2HPO4(10mM)、NaCl(500mM)、咪唑(30mM)組成且以HCl調整至pH 7.4。將Benzonase®核酸酶(0.6μl)加至該經再懸浮的細胞，然後於Constant Systems One Shot細胞瓦解儀中將之溶胞。接著藉由於4℃下於18,000g下離心15min澄清化細胞溶胞產物，然後於4℃下於57,750g下離心上清液60min。接著將此上清液裝載至GE Healthcare HisTrapTM FF粗管柱(1ml)上，該管柱經以結合緩衝劑平衡。以五倍管柱體積的結合緩衝劑將未結合的蛋白質自管柱洗下，並以線性咪唑濃度梯度(從30mM至500mM)在20倍管柱體積內洗提以His標記的蛋白質。於280nm監視蛋白質洗提並將藉由SDS-PAGE確認餾份中經羧基端His標記的4HBT之存在與純度。將含有純CtHis-4HBT蛋白質的餾分倒在一起並於VivaSpin Viva6 10,000分子量截止離心濃縮器中進行以磷酸鉀分析緩衝劑(100mM，pH 7.5)置換洗提緩衝劑的緩衝劑交換。為進行該緩衝劑交換，將倒在一起的餾分於18℃下於10,000g下離心通過離心濃縮器之超過濾膜直到倒在一起的餾分之體積減低至1ml。將剩下的蛋白質餾分於磷酸鉀分析緩衝劑中稀釋六倍並藉由在相同的條件下通過超過濾膜進一步離心來濃縮樣本直到達成體積減少六倍。後面的於磷酸鉀分析緩衝劑中的稀釋與再濃縮係再進行一次且CtHIS-4HBT蛋白質之濃度係藉由在NanoDrop ND1000分光光度計中的UV280吸光度測定(使用20970M-1.cm-1的莫耳消光係數以及經羧基端His標記的4HBT酵素的17516.5mg.mmol-1的分子量)。莫耳消光係數與分子量之值係使用Expasy ProtParam工具測定(使用於pET20b(+)：：CtHis-4HBT質體中的編碼經羧基端His標記的4HBT酵素的基因 序列(SEQ.ID 5)之胺基酸轉譯)。
經純化的經羧基端六組胺酸標記的4HBT酵素之動力學特徵界定係針對先前製備的甲基丙烯醯基輔酶A、與針對異丁醯基輔酶A(以異丁醯基輔酶A鋰鹽的形式自Sigma Aldrich購買)進行。
於Nunc 96槽孔盤中進行甲基丙烯醯基輔酶A水解反應(200μl)，使用經純化的CtHis-4HBT蛋白質(0.075mg.ml-1)與DTNB(0.5mM)以監視反應。針對0.375mM、0.3mM、0.225mM、0.15mM與0.075mM的甲基丙烯醯基輔酶A起始濃度測定初始速率。藉由加入酵素來起始該等反應。
亦於Nunc 96槽孔盤中進行異丁醯基輔酶A水解反應(200μl)，使用經純化的CtHIS-4HBT蛋白質(1mg.ml-1)與DTNB(0.5mM)以監視反應。針對0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM與0.1mM的異丁醯基輔酶A起始濃度測定初始速率。再次地，藉由加入酵素來起始該等反應。
針對甲基丙烯醯基輔酶A(圖1)與異丁醯基輔酶A(圖2)兩者之動力學特徵界定繪製Lineweaver-Burke圖。經羧基端六組胺酸標記的4HBT對於甲基丙烯醯基輔酶A的動力學常數為1.6mM的KM與470nmols.mg-1.min-1的Vmax，而對於異丁醯基輔酶A，其等為3mM的Km與16.7nmols.mg-1.min-1的Vmax。
因此，已展現4HBT會催化甲基丙烯醯基輔酶A之水解且可用於生產甲基丙烯酸。由於4HBT會以較低的KM值與較高的Vmax值(相較於對異丁醯基輔酶A者)水解甲基丙烯醯基輔酶A，甲基丙烯醯基輔酶A藉由4HBT的水解係有益地高選擇性。
1.4 實施例2-自異丁醯基輔酶A的甲基丙烯醯基輔酶A與甲基丙烯酸之形成
酵素來自阿拉伯芥的短鏈醯基輔酶A氧化酶(ACX4)(Genbank登錄號AB017643.1，Uniprot登錄號Q96329，EC編號1.3.3.6)係透過文獻搜尋被鑑認為當在昆蟲細胞株表現時對異丁醯基輔酶A(作為受質)具有可偵測的活性的醯基輔酶A氧化酶酵素。
為測定此氧化酶是否可被於大腸桿菌中功能性地表現而具有對異丁醯基輔酶A作為受質被併入至代謝途徑中有用的活性水平以使之，由Life Technologies將編碼ACX4之胺基酸序列的基因針對在大腸桿菌中表現作密碼子最佳化並將NdeI限制位置併入其5’端與將XhoI限制位置併入其3’端。
所合成的聚核苷酸(SEQ.ID 6)係於pMA-RQ：：ACX4質體中遞送且基因插入物被次選殖入先前線性化的pET20b(+)載體的NdeI與XhoI限制位置以形成pET20b(+)：：ACX4。接著將新構築的pET20b(+)：：ACX4質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中以形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：ACX4。
為了測試ACX4之表現，以來自以葡萄糖、氯黴素與卡本西林補充的LB瓊脂盤的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：ACX4之單一菌落接種以卡本西林與氯黴素補充的MSX起始培養物。於37℃下伴隨以200rpm搖動培養起始培養物(20ml)16h。藉由於4℃下於5000g下離心15min自該起始培養物收穫細胞並接著將其再懸浮至亦以氯黴素與卡本西林補充 的新鮮的MSX培養基中間培養物(100ml)中。於37℃下伴隨以200rpm搖動培養該中間培養物直到1.0的OD600。接著藉由於4℃下於5000g下離心該中間培養物15min來收穫細胞並將其再懸浮至在2.5L具緩衝板搖動燒瓶中的以氯黴素、卡本西林以及以核黃素補充的新鮮的MSX培養物(1L)中。於37℃下伴隨以200rpm搖動培養該培養物直到0.7的OD600並接著藉由添加IPTG至0.4mM的最終濃度來誘發表現。於相同的條件下培養該培養物另外7h，之後將細胞分至三個離心管中並藉由於4℃下於5000g下離心20min來收穫。在收穫細胞前取該培養物之樣本並藉由SDS-PAGE分析之，而SDS-PAGE顯示ACX4蛋白質被良好地表現且大約三分之一的ACX4蛋白質係位於可溶的餾分且三分之二係位於不可溶的餾分。於以KOH調整至pH 7.5的HEPES緩衝劑(50mM)中洗滌細胞小丸三次。於-80℃冷凍細胞小丸直到溶胞。對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照菌株重複此方法。
為製備ACX4酵素之無細胞萃取物，將先前製備的細胞小丸之一再懸浮於以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)(最終濃度為10μM)補充的HEPES(50mM，pH 7.5)緩衝劑(6ml)中。接著於Constant Systems One Shot細胞瓦解儀中溶胞經再懸浮的細胞。於4℃下於18,000g下離心溶胞產物15min並於4℃下以57,750rpm進一步離心此之上清液60min。於VivaSpin Viva6 10,000分子量截止離心濃縮器中濃縮上清液，於18℃下於10,000g下離心直到滯留物體積減少六倍。洗滌滯留物一次(其係藉由在再次以FAD(10μM)補充的HEPES緩衝劑(50mM，pH 7.5)中的六倍再稀釋)，接著為透過體積六倍減少的於離心濃縮器中的第二濃縮步驟。使用BioRad DC 蛋白質分析套組使用牛血清白蛋白作為蛋白質標準物測定滯留物的總蛋白質濃度。
開發分析性HPLC方法以解析異丁醯基輔酶A(IB輔酶A)、甲基丙烯醯基輔酶A(MAA輔酶A)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、甲基丙烯酸(MAA)與輔酶A(輔酶A-SH)。輔酶A；甲基丙烯醯基輔酶A與異丁醯基輔酶A分別於11.0min、30.8min與32.2min洗提。輔酶A、甲基丙烯醯基輔酶A與異丁醯基輔酶A各具有與分別於12min、31.6min與32.9min的主要尖峰位聯結的小型拖尾(次要)尖峰(圖3)。甲基丙烯酸於13.5min洗提，且FAD(其用於ACX4之粗分析與作為異丁醯基輔酶A之內部標準物與甲基丙烯醯基輔酶A標準物)於27.8min洗提。
為確保輔酶A、甲基丙烯酸、異丁醯基輔酶A與甲基丙烯醯基輔酶A不與來自無細胞萃取物的尖峰搞混，進行無受質對照組，其使用於HEPES緩衝劑中的ACX4無細胞萃取物(0.8mg.ml-1)、經純化的CtHis-4HBT(0.6mg.ml-1)與FAD(10μM)。未觀察到於輔酶A、甲基丙烯酸、甲基丙烯醯基輔酶A或異丁醯基輔酶A洗提時間洗提的尖峰(圖4)。
於1.5ml微離心管中進行ACX4之活性測試。粗酵素反應由於HEPES緩衝劑(50mM，pH 7.5)中的無細胞ACX4蛋白質萃取物(0.8mg.ml-1)、異丁醯基輔酶A(500μM)與黃素腺嘌呤二核苷酸(10μM)組成。於30℃下伴隨以250rpm搖動於1.5ml微離心管中培養反應30min並藉由分析性HPLC分析最終反應產物(圖5)。甲基丙烯醯基輔酶A為主要產物，其主要尖峰位於30.7min。在粗酵素分析期間形成的甲基丙烯酸之濃度係74μM。
為確認甲基丙烯醯基輔酶A尖峰係真的，且其並非有移動的洗提時間的異丁醯基輔酶A尖峰，以異丁醯基輔酶A摻加樣本並再次藉由HPLC分析。當樣本被酸化時ACX4失活化且此確保所有另外的異丁醯基輔酶A都不會被轉變成甲基丙烯醯基輔酶A。確實，摻加異丁醯基輔酶A的樣本不僅顯示原來的甲基丙烯醯基輔酶A尖峰，且亦顯示具有異丁醯基輔酶A之特徵性拖尾尖峰的位於32min的另外的尖峰(圖6)。
為測定甲基丙烯酸是否可於酵素偶聯反應中自異丁酸生產，建立實驗，藉其以經純化的CtHis-4HBT酵素培養粗ACX4。使用相同的ACX4之無細胞萃取物作為ACX4的蛋白質來源，但再次製備純CtHis-4HBT，此是以與實施例1中用於其之動力學特徵界定相同的方式，但於最後進行緩衝劑交換成HEPES緩衝劑(50mM，pH 7.5)，代替先前使用的磷酸酯緩衝劑。因此，於HEPES緩衝劑中共培養粗ACX4(0.8mg.ml-1)、純CtHis-4HBT(0.6mg.ml-1)與FAD(10μM)及異丁醯基輔酶A(500μM)。於30℃下伴隨以250rpm搖動培養樣本30min，並藉由HPLC分析。甲基丙烯酸與輔酶A係主要的產物。於13.45min觀察到甲基丙烯酸尖峰而分別於11.1min與12.1min觀察到輔酶A主要與次要尖峰。在偶聯酵素反應期間產生的甲基丙烯酸之濃度(圖7)係345μM，比在僅僅粗ACX4分析期間者高4.7倍。
此確認ACX4會氧化異丁醯基輔酶A。進一步展示了ACX4與4HBT之組合使以工業上可應用的水平試管內將異丁醯基輔酶A轉換成甲基丙烯酸成為可能。
1.5 實施例3-異丁酸變成甲基丙烯酸之全細胞生物變換。
本實施例中顯示使用醯基輔酶A合成酶以以輔酶A活化異丁酸以形成異丁醯基輔酶A的異丁酸變成甲基丙烯酸之進一步生物變換，與顯示來自阿拉伯芥的醯基輔酶A氧化酶ACX4之異丁醯基輔酶A被氧化成甲基丙烯醯基輔酶A以及來自關節桿菌屬物種菌株SU的醯基輔酶A硫酯酶4HBT之將甲基丙烯醯基輔酶A水解成甲基丙烯酸與輔酶A。
從資料庫與文獻搜尋鑑認出來自針假單胞菌B23的醯基輔酶A合成酶AcsA(Genbank登錄號：BAD90933.1，uniprot登錄號：Q5CD72)作為能夠將異丁酸活化成異丁醯基輔酶A的AMP形成性醯基輔酶A合成酶，其經公開的米開勒斯氏常數(Km)為0.14mM，且轉換數(kcat)為10.6s-1。
於此實例中，吾人顯示一種用於從在pET20b(+)之T7啟動子控制下的單一操縱子的編碼4HBT、ACX4與AcsA的基因之共表現的基於pET20b(+)載體(pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA)之構築，與其於編碼用於異丁酸變成甲基丙烯酸之全細胞生物變換的代謝途徑之用途。
操縱子之構築係以兩個階段進行。第一個階段包含構築基於pET20b(+)的載體(pET20b(+)：：4HBT-ACX4)，其用於僅編碼4HBT與ACX4的基因之共表現，而第二階段涉及將編碼AcsA的基因次選殖入pET20b(+)：：4HBT-ACX4載體中(其自己的核糖體結合位置在適當的位置)以構築最終的pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA質體。
為了構築pET20b(+)：：4HBT-ACX4載體，首先將編碼4HBT與ACX4基因結合成單一的聚核苷酸，其在編碼4HBT的基因與編碼ACX4的基因之間具有新的核糖體結合位置，以確保之後有效的轉譯。為將該二個基因結合在一起，進行重疊延伸聚合酶連鎖反應。該重疊延伸聚合酶連 鎖反應本身係以兩個步驟進行。首先，於兩個分開的聚合酶連鎖反應(反應「A」與「B」)中將編碼4HBT與ACX4基因自其等各自的表現載體(pET20b(+)：：4HBT與pET20b(+)：：ACX4)擴增出。
用於重疊延伸聚合酶連鎖反應的引子係引子OE.A.F(SEQ.ID 7)，其係用於重疊延伸聚合酶連鎖反應A的正向引子；引子OE.A.R(SEQ.ID 8)，其係用於聚合酶連鎖反應A的逆向引子；引子OE.B.F(SEQ.ID 9)，其係用於重疊延伸聚合酶連鎖反應B的正向引子以及最後是OE.B.R(SEQ.ID 10)，其係用於重疊延伸聚合酶連鎖反應B的逆向引子。引子OE.A.F之突出係經設計以於新聚核苷酸之5’端維持deI限制位置。引子OE.A.R與OE.B.F之突出係經設計以含有針對彼此的互補性序列以使連接來自反應A與B的兩個PCR產物成為可能。互補性序列係經設計以使得在連接兩個PCR產物後，會導入在4HBT基因與ACX4基因之間的基因間序列，其含有一用於後面的基因的新的核糖體結合位置。最後，引子OE.B.R之突出係經設計以含有兩個限制位置，NheI限制位置與XhoI限制位置。此允許含有欲選殖入pET20b(+)質體的NdeI與XhoI限制位置以形成pET20b(+)：：4HBT-ACX4的4HBT與ACX4基因的經連接聚核苷酸且允許AcsA基因被選殖入pET20b(+)：：4HBT-ACX4質體的NheI與XhoI限制位置之間以形成pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA質體。在引子OE.B.R之NheI與XhoI限制位置之間包含富腺嘌呤與胸腺嘧啶間隔序列以降低引子之退火溫度以使得其更密切符合其他引子之退火溫度，且以使於鄰接的NheI與XhoI限制位置中的有效雙重消化成為可能。
聚合酶連鎖反應A(50μl)含有作為模版DNA的 pET20b(+)：：4HBT(10pg.μl-1)、KOD DNA聚合酶(1單位)、引子OE.A.F(0.4μM)、引子OE.A.R(0.4μM)、去氧腺嘌呤核苷三磷酸(dATP)(0.2mM)、去氧胸腺嘧啶核苷三磷酸(dTTP)(0.2mM)、去氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)(0.2mM)、去氧鳥嘌呤核苷三磷酸(dGTP)(0.2mM)、MgCl2(1mM)與用於KOD DNA聚合酶的Novagen緩衝劑(1X)。
聚合酶連鎖反應B(50μl)係由作為模版DNA的pET20b(+)：：ACX4(20pg.μl-1)、KOD DNA聚合酶(1單位)引子OE.B.F(0.4μM)、引子OE.B.R(0.4μM)、dATP(0.2mM)、dTTP(0.2mM)、dCTP(0.2mM)、dGTP(0.2mM)、MgCl2(1mM)與用於KOD DNA聚合酶的Novagen緩衝劑(1X)構成。
此兩個PCR反應皆係平行進行且係於相同的條件下進行，以於95℃下3min的最初的變性步驟開始，接著是25個由於98℃下15s的變性步驟、於50℃下2s的退火步驟及於72℃下20s的延長步驟組成的循環。此等25個循環後接著是於72℃下再5min的延長步驟。藉由瓊脂糖凝膠電泳與凝膠萃取來純化兩個雙股PCR產物(產物A與產物B)，且藉由分析性瓊脂糖凝膠電泳測定其等之濃度。
接著於由以下者組成的第二聚合酶連鎖反應中連接PCR產物A與B：PCR產物A(15nM)、PCR產物B(15nM)、dATP(0.2mM)、dTTP(0.2mM)、dCTP(0.2mM)、dGTP(0.2mM)、MgCl2(1mM)、用於KOD DNA聚合酶的Novagen緩衝劑#1(1X)、二甲基亞碸(5%(v/v))與KOD DNA聚合酶(8nl/μl)。於如下設定的熱循環儀中進行該反應：以於95℃下3min開始與繼續15個循環的於98℃下15s的變性步驟，於50℃下2s的退火步 驟及於72℃下20s的延長步驟，與最後以於72℃下持續5min的進一步延長步驟結束。
在此PCR程序後，加入直接來自濃縮儲備物(50μM)的分別用於放大A與B的外面的正向引子與外面的逆向引子，使其等最終濃度為0.5μM。接著使用如下設定的熱循環儀使經修飾的PCR反應混合物經歷另一輪PCR：以於95℃下3min的最初融化步驟開始，然後繼續15個由於98℃下持續15s的融化步驟、於55℃下持續2s的退火步驟與於72℃下持續20s的延長步驟組成的循環，然後以於72℃下持續5min的進一步延長步驟結束。
藉由瓊脂糖凝膠電泳與凝膠萃取來純化此連接步驟之產物(SEQ.ID 11)，並將其鈍端連接至pJET1.2選殖載體中以形成pJET1.2：：4HBT-ACX4。接著將含有經連接的4HBT與ACX4基因的聚核苷酸次選殖入pET20b(+)中，形成pET20b(+)：：4HBT-ACX4。接著藉由於NheI與XhoI限制位置限制酶消化來線性化pET20b(+)：：4HBT-ACX4質體。
對於pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA質體之構築中的下一個階段，針對在大腸桿菌中表現對編碼AcsA之胺基酸序列的基因作密碼子最佳化並由Biomatik Corporation合成之，其具有接附至其3’端的XhoI限制位置、與接附至其5’端的短序列。此序列含有NheI限制位置、核糖體結合位置、與以胞嘧啶-腺嘌呤-胸腺嘧啶三核苷酸結束的間隔序列，其與AcsA之起始密碼子一起編碼NdeI限制位置。
所合成的經密碼子最佳化的AcsA聚核苷酸(SEQ.ID 12)係於pBMH：：AcsA選殖質體中遞送且將AcsA基因與其之5’核糖體結合位 置一起次選殖入經線性化pET20b(+)：：4HBT-ACX4載體的NheI與XhoI限制位置之間，形成pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA質體(圖8)。接著將此質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA。介於pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA質體中的NdeI與XhoI限制位置之間且包含其等的序列係於SEQ ID NO 13顯示。
為了構築用於表現單單AcsA基因的菌株，將單單AcsA基因自pBMH：：AcsA選殖載體次選殖出並次選殖入pET20b(+)質體的NdeI與XhoI限制位置之間，形成pET20b(+)：：AcsA。接著將pET20b(+)：：AcsA質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：AcsA。
藉由大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA的4HBT、ACX4與AcsA之共表現係藉由於兩種不同的測試溫度(37℃與28℃)下將大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA之培養物(100ml)培養在以核黃素(1mg.L-1)補充的MSX培養基中來確認。將培養物生長至0.5的OD600並以添加IPTG(0.4mM)來誘發表現。在緊接著表現之誘發前、以及誘發後1h、3h、5h與20h取樣本。亦於相同的條件下培養對照組菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：ACX4(如於實施例2中製備的)與大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：AcsA。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析在於大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA中的4HBT、ACX4與AcsA之共表現期間收取的樣本以及在於大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：ACX4中的單單 ACX4和於大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：AcsA中的AcsA之表現期間收取的樣本。
藉由SDS-PAGE的分析(圖9)顯示當於37℃下進行表現時，於誘發後5h，偵測到高水平的可溶性4HBT(左手邊底部的條帶)與良好水平的ACX4(左手邊頂部的條帶)且偵測到極少不可溶性蛋白質，雖然偵測到高水平的不可溶性AcsA(右手邊頂部的條帶)且於可溶的部分未看到AcsA蛋白質。道1)空的pET20b(+)載體陰性對照。2)Spectra BR蛋白質階梯。3)pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA表現0h可溶性。3)3h可溶性。4)5h可溶性。5)0h不可溶性。6)pET20b(+)：：AcsA表現5h可溶性。7)pET20b(+)：：ACX4可溶性。8)pET20b(+)：：4HBT可溶性。9)pET20b(+)：4HBT-ACX4-AcsA 0h不可溶性。10)pET20b(+)：4HBT-ACX4-AcsA 3h不可溶性。11)pET20b(+)：4HBT-ACX4-AcsA 5h不可溶性。12)pET20b(+)：：AcsA 5h不可溶性.
為測試大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA將異丁酸轉變甲基丙烯酸的能力，以來自在以葡萄糖卡本西林與氯黴素補充的LB瓊脂盤上的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA之單一菌落接種以卡本西林與氯黴素補充的MSX預先培養物(20ml)，並於37℃下伴隨以200rpm搖動培養其16h。藉由於4℃下於5000g下離心15min收穫細胞，並將細胞再懸浮於在250ml搖動燒瓶中的以卡本西林、氯黴素與核黃素補充的MSX培養基(100ml)中，並於37℃下伴隨以200rpm搖動培養此培養物。於0.5的OD600藉由添加IPTG(0.4mM)誘發基因之共表現。將培養物培養另外1h，然後添加來自500mM的濃縮儲備物濃度的異丁酸鉀(pH 7.0)至於該培養基中5mM的最終濃度。 樣本係於添加異丁酸後立即收取(0h樣本)並接著於添加後1h、2h、4h、6h、8h與19.5h收取。
於Eppendorf miniSpin F-45-12-11轉子中將在整個異丁酸變成甲基丙烯酸之生物變換期間收取的樣本以6000rpm離心5min。通過0.2μm Sartorius RC 4mm過濾器過濾上清液並接著以5M HCl將其酸化至pH2.5。將經酸化上清液注射至Agilent Zorbax Eclipse XDB C18管柱(4.6mm x 150mM)上。於0.4ml.min-1下進行HPLC並藉由使用以HCl調整至pH 2.5的在KH2PO4中的14%乙腈的等度洗提從異丁酸解析甲基丙烯酸。在運行間洗滌管柱，其藉由將流率增加至1ml.min-1與將乙腈濃度增加至75%共15min，之後將條件調回0.4ml.min-1的流率與14%乙腈以用於下一個樣本。在注射下一個樣本之前，使管柱平衡20min。
亦進行三個陰性對照並分析之。第一個對照組係陰性對照菌株，大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b，其不含4HBT-ACX4-AcsA共表現操縱子且在將IPTG加至培養基後係以不將異丁酸加至培養基來培養。第二個對照組使用與第一個對照組相同的菌株，但在將IPTG加至培養基後1h添加異丁酸(5mM)。第三個對照組使用與主生物變換培養中所使用者相同的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA，但在誘發4HBT、ACX4與AcsA之共表現後未將異丁酸加至培養基。
於圖10中觀察HPLC圖形之總結，而圖10係於誘發後20.5個小時收取的樣本(來自所測試的四個培養物(19.5h生物變換時間)之每一者)之圖。圖10C係異丁酸之標準物(5mM)且圖10E係與甲基丙烯酸之標準物(200μM)混合的異丁酸之標準物(5mM)。圖10A、10B與10D 顯示在對照組之任一者中皆未形成甲基丙烯酸且圖10F顯示甲基丙烯酸確實在生物變換期間形成。
圖11總結了甲基丙烯酸隨時間的生產以及在生物變換期間大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-AcsA之生長，其中甲基丙烯酸之所欲產物之最終濃度係大約0.25mM。
於此實施例中，展示了以工業上可應用的水平將異丁酸原料轉變成甲基丙烯酸的全細胞方法，其係藉由在重組大腸桿菌中試管內共表現4HBT、ACX4與AcsA。
1.6 實施例4-自葡萄糖的甲基丙烯酸之形成
先前已顯示來自戀臭假單孢菌KT2440的支鏈酮酸脫氫酶複合物會在重組代謝途徑中催化2-酮異戊酸變成異丁醯基輔酶A的氧化性脫羧基化以用於在大腸桿菌中生產異丁酸(Zhang,K.、Xiong,M.與Woodruff,A.P.2012，Cells and methods for producing isobutyric acid，國際專利編號WO 2012/109534 A2)。編碼支鏈酮酸脫氫酶複合物之支鏈酮酸脫氫酶α子單元(bkdA1)、支鏈酮酸脫氫酶β子單元(bkdA2)、硫辛醯胺醯基轉移酶組份(bkdB)與硫辛醯胺脫氫酶組份(lpdV)的基因係彼此相接地聚集在一起且被發現在戀臭假單孢菌KT2440基因組DNA(genbank登錄號AE015451.1)中皆在單一啟動子之控制下。
編碼bkdA1、bkdA2、bkdV與lpdV基因(如同其等在戀臭假單孢菌KT2440基因組DNA中在核苷酸4992042與4996988之間出現的)的完整野生型序列係由Biomatik Corporation以單一(ppBCKD)聚核苷酸(SEQ. ID 14)合成。ppBCKD聚核苷酸於其3’端含有XhoI限制位置，且於其5’端含有短序列，緊接bkdA1基因之起始密碼子的前面。此5’接附序列含有XbaI限制位置、間隔序列、NheI限制位置、核糖體結合位置、與第二個間隔序列。包含該XbaI位置以使將ppBCKD聚核苷酸插入至pET20b(+)質體以構築pET20b(+)：：ppBCKD(其能夠表現戀臭假單孢菌KT2550支鏈酮酸脫氫酶之那四個基因)成為可能。包含第一個間隔序列以在pET20b(+)：：ppBCKD質體中的T7啟動子與核糖體結合位置之間維持與在pET20b(+)質體中存在者數目相同的鹼基對，且除了緊接核糖體結合位置之前的編碼NheI位置的六個核苷酸之外，該間隔序列在pET20b(+)質體中的XbaI位置與核糖體結合位置之間者相同。包含NheI限制位置以使將ppBCKD聚核苷酸插入至pET20b(+)：：4HBT-ACX4質體中以構築pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD質體成為可能。該核糖體結合位置與該間隔序列與該等先前報導過在表現BCKD基因以生產異丁酸時緊接著bkdA1基因之前使用者相同(Zhang,K.、Xiong,M.與Woodruff，A.P.2012，Cells and methods for producing isobutyric acid，國際專利編號WO 2012/109534 A2)。
含有戀臭假單孢菌KT2440支鏈酮酸脫氫酶之四個基因的單一聚核苷酸係於pBSK質體(pBSK：：ppBCKD)中遞送。該四個基因被從pBSK：：ppBCKD質體中次選殖出並次選殖入來自實施例2的pET20b(+)：：4HBT-ACX4質體的NheI與XhoI限制位置之間以形成pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD(圖12)。序列ID 15顯示於pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD質體中在NdeI與XhoI限制位置之間的序列。將pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 中以形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD。類似地，亦將該四個基因次選殖入pET20b(+)質體的NheI與XhoI限制位置之間以形成pET20b(+)：：ppBCKD，且將此質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中以形成大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：ppBCKD。使用此後者的菌株以協助鑑認在SDS-PAGE凝膠上對應於在研究期間表現的bkdA1、bkdA2、bkdB與lpdV基因的條帶(未顯示)。
以來自在以葡萄糖、卡本西林與氯黴素補充的LB瓊脂盤上的單一菌落的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD接種以卡本西林與氯黴素補充的MSX預培養物(10ml)。於37℃下伴隨以250rpm搖動將培養物培養16h。藉由於4℃下於5000g下離心15min來收穫細胞並接著將其再懸浮於在500ml搖動燒瓶中的以核黃素以及卡本西林與氯黴素補充的新鮮MSX培養基(100ml)中。於37℃下伴隨以250rpm搖動培養該新鮮的培養物且於0.5的OD600藉由添加IPTG(0.4mM)而在各培養物中誘發表現。再培養培養物17h，之後收取樣本以用於藉由逆向高效液體層析法(RP-HPLC)的分析。對於大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照培養物進行重複培養。
於Eppendorf miniSpin F-45-12-11轉子中以6000rpm離心樣本5min。通過0.2微米Sartorius RC 4mm過濾器過濾上清液且接著以5M HCl將其酸化至pH2.5。將經酸化上清液注射至Agilent Zorbax Eclipse XDB C18管柱(4.6mm x 250mM)上。於1ml.min-1下進行HPLC且藉由使用以HCl調整至pH 2.5的在50mM KH2PO4中的14%乙腈的等度洗提來洗提分析物。在運行間洗滌管柱，其藉由將乙腈濃度增加至75%共15min，之後為回到14% 乙腈共20min的再平衡步驟。
甲基丙烯酸(0.2mM)、異丁酸(5mM)與2-酮異戊酸(5mM)之標準物分別係於3.6min、8.3min與8.6min洗提出，且具有尖峰面積5980mAU.min、330mAU.min與1580mAU.min。2-酮異戊酸(5mM)、異丁酸(5mM)與甲基丙烯酸(200μM)之混合物之HPLC分析係於圖13中顯示。
自大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照培養物取得的樣本之HPLC分析(於圖14顯示)在對甲基丙烯酸所預期的區域中未顯示尖峰，而自大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD培養物取得的樣本之分析顯示位於8.6min的尖峰而尖峰面積為0.88AU.min，其對應於0.11mM的甲基丙烯酸濃度(圖15)。
為確認該尖峰確實代表甲基丙烯酸，以來自10mM儲備溶液的另外0.24mM的甲基丙烯酸摻加樣本，且亦藉由HPLC分析此經摻加的樣本，於圖16中顯示。於8.5min觀察到具有2.7AU.min的面積(對應於0.34mM的甲基丙烯酸濃度)的單一尖峰，證實大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD菌株會自葡萄糖直接生產甲基丙烯酸。
為測定以2-酮異戊酸補充培養物是否會提高甲基丙烯酸生產，再次製備兩個以卡本西林與氯黴素補充的MSX預培養物(10ml)，以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD接種一個並以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)接種另一個，如之前的。於37℃下伴隨以250rpm搖動培養該等預培養物16h，之後使細胞成為小丸並將其再懸浮於在500ml搖動燒瓶中的以核黃素、氯黴素與卡本西林補充的新鮮MSX培養基(100ml)中。於0.5的OD600藉由添加IPTG(0.4mM)而在各培養物 中誘發表現，並再培養該等培養物3h，之後在各培養物中添加2-酮異戊酸(pH 7.0)至5mM的最終濃度。再培養該等培養物14h。收取培養物樣本並藉由使用等度洗提的高效液體層析法分析之，如對未以2-異戊酸補充的培養物描述的。
如所預期的，於將2-酮異戊酸添加至空大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)陰性對照培養物後14h收取的樣本之HPLC分析(於圖17中顯示)在甲基丙烯酸通常被觀察到的位置的區域未顯示尖峰。然而，其確實顯示2-酮異戊酸之一些背景消耗(圖6)，而於此培養物中2-酮異戊酸之尖峰面積為3353mAU.min，對應於在培養物中剩下2.8mM 2-酮異戊酸，與原本的5mM相對。
當在將2-酮異戊酸添加至表現用於2-酮異戊酸變成甲基丙烯酸之轉換的基因的培養物(大腸桿菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)：：4HBT-ACX4-ppBCKD培養物)後14h收取的樣本時，在HPLC圖上出現位於8.4min具有尖峰面積1890mAU.min的尖峰(圖18)，表示甲基丙烯酸係以0.24mM的濃度生產。於此樣本中未偵測到2-酮異戊酸，表示其在2-酮異戊酸變成甲基丙烯酸之轉換期間被完全消耗。
以另外的0.24mM甲基丙烯酸摻加樣本且經摻加樣本之分析(圖19)顯示具有尖峰面積3.4AU.min(對應於0.44mM的甲基丙烯酸濃度)的尖峰，因此該原來的甲基丙烯酸尖峰係真的。
於此實例中，支鏈酮酸脫氫酶(即來自戀臭假單孢菌KT2440的BCKD)係在細胞系統中與醯基輔酶A氧化酶(即來自阿拉伯芥的ACX4)與硫酯酶酵素(即來自關節桿菌屬物種菌株SU的4HBT)共表現。展示了 使用重組大腸桿菌自關鍵原料(如葡萄糖，其可自生質輕易獲得)生產甲基丙烯酸是可能的，且進一步展示了該甲基丙烯酸之生產可藉由藉由以2-酮異戊酸補充生長培養基來提高。
1.7 實施例5：藉由重組大腸桿菌自2-酮異戊酸的甲基丙烯酸丁酯之全細胞生產
將來自阿拉伯芥的ACX4基因針對大腸桿菌作密碼子最佳化，合成之並將之選殖入pET16b(Sse)載體中。以NheI/Sse8387I消化基因並連接至以XbaI/Sse8387I消化的pET16b(Sse)中。將所得的質體(pMMA121，參見圖20)導入至大腸桿菌BL21(DE3)中，並如下培養重組大腸桿菌(BL21(DE3)/pMMA121)；將BL21(DE3)/pET16b(載體對照組)或BL21(DE3)/pMMA121接種在以胺苄青黴素(0.1mg/ml)補充的LB培養基並於37℃下於測試管中生長過夜。將一過夜培養之等分試樣轉移至在燒瓶中的100ml的相同培養基並於37℃下搖動2-3個小時。將IPTG(最終1mM)添加至該燒瓶並於20℃下伴隨搖動培養該培養物過夜。
藉由離心收穫細胞並將其懸浮於0.1M磷酸鈉緩衝劑(pH7.0)中，接著藉由聲裂法瓦解之。將經瓦解的大腸桿菌細胞離心成上清液與小丸餾分，且對載體對照組與含有pMMA121的細胞兩者針對ACO(醯基輔酶A氧化酶)活性作分析(參見圖21)與藉由SDS-PAGE分析ACX4蛋白質之表現(參見圖22)。圖21顯示於緩衝劑中單單IBA輔酶A之存在、於含有包含單單未經改變的質體pET16b的細胞的樣本中IBA輔酶A與小量的輔酶A之存在、與於含有包含質體pMMA121的細胞的樣本中與MAA輔酶 A與遠較少的IBA輔酶A和一未知化合物之存在。因此，在BL21/pMMA121之上清液餾分中偵測到高ACO活性，由甲基丙烯醯基輔酶A之生產表明，顯示由圖22之SDS-PAGE偵測到的40kDa蛋白質係ACX4蛋白質。該SDS-PAGE於各到顯示以下者：道1-BL21/pET16b(載體)SF(可溶性餾分)；道2-BL21/pMMA121 SF；道3-BL21/pET16b IF(不可溶性餾分)；道4-BL21/pMMA121 IF；與道5-分子量標記。在大約40kDa，僅僅在BL21/pMMA121道中但未在BL21/pET16b(載體)道中觀察到一個條帶(以黑框強調)。
如下自銅綠假單胞菌PA01菌株選殖BCKAD複合物基因。藉由PCR方法使用引子BCKAD.F與BCKAD.R(於1.1.3中的表)使用基因組的DNA作為模版獲得含有編碼BCKAD複合物基因的完整基因操縱子的DNA片段。以限制酵素BspHI與Sse8387I消化所獲得的片段，並將其插入至載體pET16b(Sse)的NcoI/Sse8387I(pET16b之BamH位置被轉變成Sse8387I位置)之間。所得的質體被命名為pWA008(參見圖23)。
如下構築用於表現蘋果AAT與阿拉伯芥ACX4的質體。藉由PCR方法分別使用引子AAT.F與AAT.R或ACX4.F與ACX4.R(於1.1.3中的表)使用含有經密碼子最佳化的AAT基因或pMMA121的質體作為模版擴增含有AAT或ACX4基因的DNA片段。以限制酵素NcoI與Sse8387I消化pET(Sse)載體並使其與含有AAT基因的DNA片段連接，此藉由使用In-Fusion HD選殖套組(Takara Bio)。以限制酵素SpeI消化所得的質體(pAAT212)並使其與含有ACX4基因的DNA片段連接，此藉由使用In-Fusion HD選殖套組。所得的質體(pMMA133)含有AAT與ACX4基因 與T7啟動子控制(參見圖23)。
如下構築用於表現BCKAD、AAT與ACX4的質體。以限制酵素SpeI與Sse8387I消化質體pMMA133，而獲得經線性化DNA片段。以限制酵素XbaI與Sse8387I消化質體pWA008並分離含有BCKAD複合物基因的5.0kb片段。該兩個片段皆使用DNA連接套組「Mighty Mix」(由Takara Bio Inc.製造)連接。將所得的質體pMMA134(參見圖23)導入至大腸桿菌BL21(DE3)中以用於甲基丙烯酸丁酯生產實驗。
基本上以與如以上針對ACX4之表現所描述者相同的方式培養大腸桿菌BL21(DE3)/pMMA134。藉由離心收穫細胞，以0.1M磷酸鈉緩衝劑(pH7.0)洗滌之並將其懸浮在相同的緩衝劑中以獲得細胞懸浮液。藉由使用該細胞懸浮液，在各小瓶中製備約1ml的靜止細胞反應溶液，其含有40mM 2-酮異戊酸(2-側氧基異戊酸)、60mM丁醇、0.05M磷酸鈉緩衝劑(pH7.0)與細胞(OD650=12.5)。於30℃下、180rpm進行反應3至44個小時，並將1ml乙腈加至小瓶且充分混合以停止反應。在使用注射過濾器DISMIC/孔徑0.45微米(由ADVANTEC製造)過濾後，藉由HPLC在ODS管柱上作分析。HPLC條件如下：裝置：Waters 2695，管柱：CAPCELL PAK C18 UG120，2.0mmI.D.x 250mm，移動相：0.1%磷酸/65%甲醇，流量：0.25ml/min，進行時間：12min，管柱溫度：35C與偵測：UV 210nm。圖24顯示以下化學品隨發酵時間的濃度：■，2-酮異戊酸(2-OIV)；▲，異丁酸(IBA)；◆，甲基丙烯酸丁酯(BMA)：與×，甲基丙烯酸(MAA)。隨著2-酮異戊酸(2-側氧基異戊酸)之原料之濃度降低，於途徑中的中間物異丁酸之生產增加，而最終酯產物甲基丙烯酸丁酯之生產亦如此。
此實施例顯示可行的甲基丙烯酸之衍生物(甲基丙烯酸酯甲基丙烯酸丁酯)自生物化學中間物2-酮異戊酸(2-側氧基異戊酸)(其係直接自葡萄糖生產)與試劑丁醇(其係常見的工業原料)的活體內生產。甲基丙烯酸丁酯之生產係藉由培養表現以下者的重組大腸桿菌細胞以工業上可應用的水平展現：表現BCKAD操縱子以將2-酮異戊酸轉變成異丁醯基輔酶A，表現ACX4氧化酶以將異丁醯基輔酶A轉變成甲基丙烯醯基輔酶A，且表現AAT以藉由與丁醇反應將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸丁酯。
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本發明並不限於以上具體態樣之細節。本發明延伸至於此說明書(包含所附申請專利範圍、摘要、與圖式之任一者)中揭示的特徵之任何新穎者或任何新穎組合，或延伸至如此揭示的任何方法或程序之步驟 之任何新穎者或任何新穎組合。
<110> 盧希特國際公司(Lucite International UK Limited)
<120> 生物生產甲基丙烯酸之方法
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<150> GB 1517545.8
<151> 2015-10-05
<160> 24
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自關節桿菌屬物種菌株SU的經最佳化的4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)
<400> 1
Figure 105115309-A0305-02-0098-7
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖4-HBT的HHT.F正向引子
<400> 2
Figure 105115309-A0305-02-0099-8
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖4HBT的HHT.R逆向引子
<400> 3
Figure 105115309-A0305-02-0099-9
<210> 4
<211> 469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經進行以修飾4HBT基因以用於次選殖入pET20b(+)質體中以形成pET20b(+)：：CtHis-4HBT質體的PCR之產物。
<400> 4
Figure 105115309-A0305-02-0099-10
<210> 5
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 於pET20b(+)：：CtHis-4HBT質體中以羧基端六組胺酸標記的4HBT
<400> 5
Figure 105115309-A0305-02-0100-11
<210> 6
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自阿拉伯芥的經最佳化的醯基輔酶A氧化酶4(ACX4)
<400> 6
Figure 105115309-A0305-02-0100-12
Figure 105115309-A0305-02-0101-13
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於重疊延伸聚合酶連鎖反應A的OE.A.F正向引子
<400> 7
Figure 105115309-A0305-02-0101-14
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於重疊延伸聚合連鎖應B的OE.A.R逆向引子
<400> 8
Figure 105115309-A0305-02-0101-15
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於重疊延伸聚合酶連鎖反應B的OE.B.F正向引子
<400> 9
Figure 105115309-A0305-02-0102-16
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於重疊聚合酶連鎖反應B的OE.B.R逆向引子
<400> 10
Figure 105115309-A0305-02-0102-17
<210> 11
<211> 1805
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於將4HBT與ACX4連接成-個多核苷酸的重疊聚合酶連鎖反應之產物
<400> 11
Figure 105115309-A0305-02-0102-18
Figure 105115309-A0305-02-0103-19
<210> 12
<211> 1663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自針假單胞菌B23的經最佳化的醯基輔酶A合成酶(acsA)
<400> 12
Figure 105115309-A0305-02-0104-20
Figure 105115309-A0305-02-0105-21
<210> 13
<211> 3447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在於pET20b(+)：：4HBTACX4 AcsA中的NdeI與XhoI限制位置間且包含其等的序列。
<400> 13
Figure 105115309-A0305-02-0105-22
Figure 105115309-A0305-02-0106-23
Figure 105115309-A0305-02-0107-24
<210> 14
<211> 4996
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼於pBSK：：ppBCKD質體中遞送的戀臭假單孢菌KT2440分支鏈酮酸脫氫酶之子單元的四個基因的ppBCKD多核苷酸
<400> 14
Figure 105115309-A0305-02-0108-25
Figure 105115309-A0305-02-0109-26
Figure 105115309-A0305-02-0110-27
Figure 105115309-A0305-02-0111-28
<210> 15
<211> 6758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在於pET20b(+)：：4HBT ACX4 ppBCKD質體中的NdeI與XhoI限制位置間且包含其等的序列
<400> 15
Figure 105115309-A0305-02-0111-29
Figure 105115309-A0305-02-0112-30
Figure 105115309-A0305-02-0113-31
Figure 105115309-A0305-02-0114-32
Figure 105115309-A0305-02-0115-33
Figure 105115309-A0305-02-0116-34
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖BCKAD操縱子的BCKAD.F正向引子
<400> 16
Figure 105115309-A0305-02-0116-35
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖BCKAD操縱子的BCKAD.R逆向引子
<400> 17
Figure 105115309-A0305-02-0116-36
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖AAT的AAT.F正向引子
<400> 18
Figure 105115309-A0305-02-0116-37
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖AAT的AAT.R逆向引子
<400> 19
Figure 105115309-A0305-02-0117-38
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖ACX4的ACX4.F正向引子
<400> 20
Figure 105115309-A0305-02-0117-39
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖ACX4的ACX4.R逆向引子
<400> 21
Figure 105115309-A0305-02-0117-40
<210> 22
<211> 5652
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET16b(Sse)表現載體
<400> 22
Figure 105115309-A0305-02-0117-41
Figure 105115309-A0305-02-0118-42
Figure 105115309-A0305-02-0119-43
Figure 105115309-A0305-02-0120-44
Figure 105115309-A0305-02-0121-45
<210> 23
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在pET16b(Sse)中表現的來自阿拉伯芥的經最佳化醯基輔酶A氧化酶4(ACX4)
<400> 23
Figure 105115309-A0305-02-0121-46
Figure 105115309-A0305-02-0122-47
<210> 24
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在pET16b(Sse)中表現的來自蘋果的經最佳化的醇類醯基轉移酶(AAT)
<400> 24
Figure 105115309-A0305-02-0122-48
Figure 105115309-A0305-02-0123-49

Claims (44)

  1. 一種生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的方法，其包含以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4、來自綠豆(Vigna radiate)的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)的短鏈醯基輔酶A氧化酶之作用將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸及/或其衍生物；其中步驟(b)係生物地藉由4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase，4HBT)之作用實施。
  2. 一種生產甲基丙烯酸及/或其衍生物的方法，其包含以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶之作用將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)將甲基丙烯醯基輔酶A轉變成甲基丙烯酸及/或其衍生物；其中步驟(b)係生物地藉由醇醯基轉移酶之作用實施。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項的方法，其中該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。
  4. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯。
  5. 根據申請專利範圍第4項的方法，其中該甲基丙烯酸丁酯是甲基丙烯酸正丁酯。
  6. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中該轉移酶係屬於EC群組編號 2.3.1.84的醇醯基轉移酶。
  7. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中該醇醯基轉移酶係衍生自水果來源。
  8. 根據申請專利範圍第7項的方法，其中該醇醯基轉移酶係衍生自蘋果、甜瓜或蕃茄來源。
  9. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中該醇醯基轉移酶在醇的存在下起作用以形成相對應的烷基酯。
  10. 根據申請專利範圍第9項的方法，其中該醇係丁醇。
  11. 根據申請專利範圍第1或2項的方法，其中該方法包含將於步驟(b)中形成的甲基丙烯酸轉變成甲基丙烯酸酯的進一步步驟(c)。
  12. 根據申請專利範圍第11項的方法，其中步驟(c)可生物地或化學地實施。
  13. 根據申請專利範圍第12項的方法，其中步驟(c)係藉由酯酶或水解酶之作用生物地實施。
  14. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶屬於EC群組3.1.2.23。
  15. 根據申請專利範圍第14項的方法，其中該硫酯酶係選自以下酵素之任一者：來自關節桿菌屬(Arthrobacter)物種的醯基輔酶A硫酯酶4HBT、來自球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)的醯基輔酶A硫酯酶4HBT及來自假單孢菌屬(Pseudomonas)物種菌株CBS-3的4HBT。
  16. 根據申請專利範圍第15項的方法，其中該硫酯酶係來自關節桿菌屬物種菌株SU的醯基輔酶A硫酯酶4HBT。
  17. 根據前述申請專利範圍第1或2項的方法，其中該方法之生物轉變係藉由在一或多種宿主微生物中的酵素實施。
  18. 一種重組的微生物，其能夠實施以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸；其中所述重組的微生物經過基因修飾或改造以表現來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶及4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)；且其中該重組的微生物係大腸桿菌。
  19. 一種重組微生物，其係能夠實施以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸；其中所述微生物經過一或多種異源性核酸基因修飾或改造以表現來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶及4-羥基苯甲醯基輔酶A硫酯酶(4HBT)。
  20. 一種生產甲基丙烯酸的方法，其使用根據申請專利範圍第18或19項中任一項的微生物。
  21. 根據申請專利範圍第18或19項中任一項的微生物，其中該微生物表現以下酵素：(a)來自阿拉伯芥的ACX4；與(b)來自關節桿菌屬物種的4HBT。
  22. 根據申請專利範圍第18或19項中任一項的微生物，其中該微生物內源地表現該一或多種酵素或該微生物異源地表現該一或多種酵素、或該微生物表現內源性與異源性酵素之組合。
  23. 根據申請專利範圍第19項的微生物，其中該微生物可選自重組的細菌、古細菌(archeae)、酵母菌、真菌、藻類或多種其他可應用於發酵方法的微生物之任一者。
  24. 根據申請專利範圍第23項的微生物，其中該微生物係選自以下者的細菌：艾氏菌屬(Escherichia)、腸內桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克留氏菌屬(Klebsiella)、鋸桿菌屬(Serratia)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙門氏桿菌屬(Salmonella)、摩根氏菌屬(Morganella)之屬的腸內菌、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或微桿菌屬(Microbacterium)之屬的棒狀桿菌群細菌、與脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、氫桿菌屬(Hydrogenobacter)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮根瘤菌屬(Axorhizobium)、固氮菌(Azotobacter)、邊蟲屬(Anaplasma)、擬桿菌 屬(Bacteroides)、巴東體屬(Bartonella)、博德氏桿菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布氏桿菌屬(Brucella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、莢膜樣菌屬(Calymmatobacterium)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、披衣菌屬(Chlamydia)、親衣原體屬(Chlamydophila)、芽胞梭菌屬、柯克斯氏體屬(Coxiella)、艾利希體屬(Ehrlichia)、腸球菌屬(Enterococcus)、法蘭西斯氏菌屬(Francisella)、細梭菌屬(Fusobacterium)、加德納氏菌(Gardnerella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、螺旋桿菌屬(Helicobacter)、克雷伯氏菌屬(Kelbsiella)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、球菌屬(Micrococcus)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、黴漿菌屬(Mycoplasma)、奈瑟菌屬(Neisseria)、巴斯德氏桿菌屬(Pasteurella)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、吡咯單胞菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、立克次體屬(Rickettsia)、羅卡利馬氏體屬(Rochalimaea)、羅思氏菌屬(Rothia)、志賀桿菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、密螺旋體屬(Treponema)、弧菌屬(Vibrio)、沃爾巴克氏體(Wolbachia)、耶氏菌屬(Yersinia)之屬的細菌。
  25. 一種重組的微生物，其能夠實施以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基 丙烯酸酯；其中所述重組的微生物已經過基因修飾或改造以表現來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶及醇醯基轉移酶；且其中該重組的微生物係大腸桿菌。
  26. 一種重組微生物，其能夠實施以下步驟：(a)藉由來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶之表現將異丁醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯醯基輔酶A；與(b)藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基輔酶A生物地轉變成甲基丙烯酸酯；其中所述微生物已經過一或多種異源性核酸基因修飾或改造以表現來自阿拉伯芥的ACX4、來自綠豆的過氧化體醯基輔酶A氧化酶及/或來自煙草節桿菌的短鏈醯基輔酶A氧化酶及醇醯基轉移酶。
  27. 根據申請專利範圍第26項的微生物，其中該微生物係大腸桿菌。
  28. 根據申請專利範圍第25-27項中任一項的微生物，其中所述甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸C1至C20酯。
  29. 一種產生甲基丙烯酸酯的方法，其係使用根據申請專利範圍第25-28項中任一項的微生物。
  30. 根據申請專利範圍第25或26項中任一項的微生物，其中該醇醯基轉移酶係來自水果來源。
  31. 根據申請專利範圍第18、19、25或26項中任一項的微生物，其中該微 生物經基因改造以增強甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產。
  32. 根據申請專利範圍第31項的微生物，其中該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。
  33. 根據申請專利範圍第18、19、25或26項中任一項的微生物，其中該微生物可藉由以下的修飾來基因改造：減低或排除藉由競爭相同受質及/或中間物而催化除了甲基丙烯酸及/或其衍生物以外的化合物之合成的酵素之活性的修飾、減低或排除代謝甲基丙烯酸或代謝在甲基丙烯酸之生產中的中間物的酵素之活性的修飾、及/或減低或排除涉及移除在甲基丙烯酸及/或其衍生物之生產中的中間物的其他細胞功能的蛋白質之活性的修飾。
  34. 根據申請專利範圍第33項的微生物，其中該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。
  35. 一種發酵之方法，其包含在發酵培養基中培養一或多種根據申請專利範圍第18、19、25或26項中任一項的微生物以生產甲基丙烯酸及/或其衍生物。
  36. 根據申請專利範圍第35項的方法，其中該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。
  37. 一種發酵培養基，其包含一或多種根據申請專利範圍第18、19、25或26項中任一項的微生物。
  38. 根據申請專利範圍第37項的發酵培養基，其中該培養基進一步包含甲基丙烯酸及/或其衍生物。
  39. 根據申請專利範圍第38項的發酵培養基，其中該甲基丙烯酸之衍生物 係甲基丙烯酸酯。
  40. 一種生物反應器，其包含一或多種根據申請專利範圍第18、19、25或26項中任一項的微生物及/或根據申請專利範圍第37項的發酵培養基。
  41. 一種製備甲基丙烯酸之聚合物的方法，其包含以下步驟：(i)根據申請專利範圍第1-17或20項中任一項製備甲基丙烯酸及/或其衍生物；及(ii)聚合於(i)中製備的甲基丙烯酸及/或其衍生物，以生產其聚合物。
  42. 一種製備甲基丙烯酸酯之聚合物的方法，其包含以下步驟：(i)根據申請專利範圍第1-17或20項中任一項製備甲基丙烯酸及/或其衍生物；(ii)酯化於(i)中製備的甲基丙烯酸以生產甲基丙烯酸酯；及(iii)聚合於(ii)中製備的甲基丙烯酸酯，以生產其聚合物。
  43. 根據申請專利範圍第41或42項的方法，其中該步驟(iii)中的聚合包括一或多種共單體。
  44. 根據申請專利範圍第43項的方法，其中該甲基丙烯酸之衍生物係甲基丙烯酸酯。
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