TW202409291A - 甲基丙烯酸及其衍生物的生物生產方法 - Google Patents

Abstract

一種生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法，其包含以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之作用將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。

Description

甲基丙烯酸及其衍生物的生物生產方法

本發明係關於用於甲基丙烯酸及其衍生物之生物生產的方法。具體言之，該方法係關於使用特別的酵素轉化以自異丁醯基-CoA經由甲基丙烯醯基-CoA形成甲基丙烯酸、及自其生產的聚合物或共聚物。

丙烯酸及其烷基酯（尤其是甲基丙烯酸（MAA）及其甲基酯，甲基丙烯酸甲酯（MMA））係化學工業中的重要單體。其等之主要應用係於用於種種應用的塑膠之生產。最顯著的聚合應用係用於生產高透光塑膠的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）之鑄造、模制、或擠製。此外，許多共聚物被使用；重要的共聚物係甲基丙烯酸甲酯及甲基丙烯酸乙酯與α-甲基苯乙烯、丙烯酸乙酯、及丙烯酸丁酯的共聚物。此外，藉由簡單的轉酯化反應，MMA可被轉化成其他酯，諸如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、等等。

目前，MMA（及MAA）係藉由一些化學程序來生產，該等化學程序中之一者係成功的「阿爾法方法」，藉其MMA係自酯丙酸甲酯藉由與甲醛的無水反應來獲得。於阿爾法方法中，丙酸甲酯係藉由乙烯之羰基化來生產。此乙烯原料源自化石燃料。最近，亦獲取永續生質原料以用於化學工業已變得所欲。據此，取代使用阿爾法方法的對於MMA的替代性生質途徑會係有利的。

因此，本發明之一個目的係解決前述問題及提供用於甲基丙烯酸之生產的生物或部分生物方法。

令人意外地，本發明之發明人已發現一以工業上可應用的水平應用對於甲基丙烯酸之形成而言先前未考慮過的新穎的酵素受質組合，從而提供對於關鍵單體（諸如MMA）的新穎且可實施的基於生物的途徑的方法。

已知異丁醯基-CoA之至甲基丙烯醯基-CoA的氧化於纈胺酸降解途徑中天然發生，且已在一些細胞中觀察到進行此轉化的酵素。於此等系統中，該轉化典型使用醯基-CoA脫氫酶酵素，其需要對應的電子傳遞系統以連結受質之氧化與泛醌之還原，其接著被再生。

WO201438216敘述一種使用醇醯基轉移酶的自微生物及甲基丙烯醯基CoA至酯的轉化生產甲基丙烯酸之方法。該文件顯示小量的2-側氧基異戊酸之至異丁醯基CoA及異丁醯基CoA至甲基丙烯醯基CoA的轉化。其亦討論活體內的甲基丙烯酸之自甲基丙烯醯基-CoA的理論上的生產但此未被成功生產。

然而，於WO201438216，甲基丙烯酸之活體內生產之唯一實施例使用在相同屬（赤球菌屬細菌）的宿主中重組表現的源自紅串赤球菌（ Rhodococcus erythropolis）的醯基-CoA脫氫酶。嘗試在不同宿主生物中異源表現在銅綠假單胞菌中發現的類似的醯基-CoA脫氫酶的其他實施例未生產甲基丙烯酸。異源醯基-CoA脫氫酶之在宿主生物中的上調或表現難以實現且未曾被報導過。

因此，本發明之進一步目的係提供改良的甲基丙烯酸之生產。

WO2016/185211敘述一種用於自微生物生產甲基丙烯酸的方法。該文件例示在重組大腸桿菌中異丁醯基-CoA之藉由來自阿拉伯芥的ACX4之作用的至甲基丙烯醯基-CoA的轉化。WO2016/185211亦例示隨後的甲基丙烯醯基-CoA之藉由來自節桿菌屬 物種菌株SU的4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）之作用的至甲基丙烯酸的轉化及（替代性地）甲基丙烯醯基-CoA之於丁醇存在下藉由蘋果醇醯基轉移酶（AAT）之作用的至甲基丙烯酸丁酯的轉化。然而，WO2016/185211未例示前述藉由任何酵素的轉化。

因此，本發明之進一步目的係提供可於工業方法中使用的替代性的可實施的甲基丙烯醯基-CoA之至甲基丙烯酸及／或其甲基丙烯酸酯的酵素轉化。

根據本發明之第一方面，提供了一種生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法，其包含以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻（ Parasponia andersonii）的醯基-CoA氧化酶之作用將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。

有利地，本發明之方法提供一種減少對化石燃料的工業依賴及增加永續性的生產關鍵化學品甲基丙烯酸及其已知衍生物的另外的生物途徑。

該方法使可再生原料之藉由微生物發酵的至異丁醯基-CoA的簡單轉化成為可能，且酵素催化步驟(a)及(b)之共表現會提供至MAA的直接微生物發酵途徑。

又進一步，該等方法對於步驟(a)使用對於甲基丙烯酸之生產先前未考慮過的且在天然存在的纈胺酸途徑中未發現的酵素。用於步驟(a)的該等酵素起作用以將異丁醯基CoA轉化成甲基丙烯醯基CoA而不需要相關的電子傳遞系統。步驟(a)中的該等酵素可單獨使用以改良形成甲基丙烯酸的部分化學程序或以改良形成甲基丙烯酸的生物方法。或者，步驟(a)及(b)之二酵素可一起使用以形成用於以工業可應用水平製造甲基丙烯酸的獨立生物方法，且其在異源宿主生物中有功能。

根據本發明之第二方面，提供了一種微生物，其供於根據本發明之第一方面之方法生產甲基丙烯酸及／或其衍生物中使用。

根據本發明之第三方面，提供了一種重組微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸； 其中該重組微生物係大腸桿菌。

根據本發明之第四方面，提供了一種微生物，其藉由一或多種異源核酸修改以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸。

根據本發明之第五方面，提供了一種微生物，其經改造以用於進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。

根據本發明之第六方面，提供了一種微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成C1至C20甲基丙烯酸酯，適合地係C1至C12甲基丙烯酸酯，諸如C1至C4或C4至C12甲基丙烯酸酯。

根據本發明之第七方面，提供了一種生產甲基丙烯酸之方法，其使用如本發明之第二、第三、第四、第五、及／或第六方面中之任何者之微生物。

根據本發明之第八方面，提供了一種發酵之方法，其包含在發酵培養基中培養一或多種如本發明之第二、第三、第四、第五、及／或第六方面中之任何者的請求項中之任一項之微生物以生產甲基丙烯酸及／或其衍生物。

根據本發明之第九方面，發酵培養基，其包含一或多種如本發明之第二、第三、第四、第五、及／或第六方面中之任何者之微生物。

根據本發明之第十方面，提供了一種生物反應器，其包含一或多種如本發明之第二、第三、第四、第五、及／或第六方面中之任何者之微生物及／或如本發明之第八方面的發酵培養基。

根據本發明之第十一方面，提供了一種製備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物之方法，其包含以下步驟： (i)    根據本發明之第一方面製備甲基丙烯酸及／或其衍生物； (ii)   視需要酯化(i)中製備的甲基丙烯酸以生產該甲基丙烯酸酯； (iii)  聚合(i)中製備的甲基丙烯酸及／或其衍生物及／或若存在時(ii)中製備的酯，視需要與一或多種共單體，以生產其聚合物或共聚物。

根據本發明之第十二方面，提供了自如本發明之第十一方面之方法形成的聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、及聚甲基丙烯酸丁酯均聚物或共聚物。

酵素

於本發明之前後文中，「生物地」意味使用生物催化劑。較佳，該等生物催化劑係酵素，但可包括任何源自生物來源的催化結構。

於本發明之前後文中，「化學地」意味使用生物催化劑（諸如酵素）以外的使用化學方法。

就該第一方面而言，步驟(b)可生物地或化學地進行，較佳步驟(b)可生物地進行。

較佳，步驟(a)及步驟(b)係使用一或多種酵素酵素地進行，其中該等酵素起生物催化劑作用。

步驟(a)係藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶進行。

較佳，步驟(a)可藉由來自菠菜及／或銀白楊，諸如來自菠菜的醯基-CoA氧化酶進行。

較佳，該來自菠菜的醯基-CoA氧化酶可具有GenBank ID編號XP_021855534.1或KNA24566.1，更佳係GenBank ID編號XP_021855534.1或KNA24566.1。

較佳，該來自銀白楊的醯基-CoA氧化酶可具有GenBank ID編號TKS13357.1。

較佳，該來自山黃麻的醯基-CoA氧化酶可具有GenBank ID編號PON92218.1。

較佳，該來自落花生的醯基-CoA氧化酶可具有GenBank ID編號QHO54153.1。

較佳，該來自安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶可具有GenBank ID編號PON51135.1。

較佳，甲基丙烯醯基-CoA係藉由硫酯水解酶（亦稱為硫酯酶）之作用轉化成甲基丙烯酸，該硫酯水解酶適合地係於EC組3.1.2.X下。又更佳，該酵素係醯基CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.20下，3-羥基異丁醯基-CoA水解酶，適合地係於EC組3.1.2.4下、ADP依賴性醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.18下、4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.23下、或於EC組3.1.2.-下的硫酯酶，諸如例如柳醯基-CoA硫酯酶。更佳，該硫酯酶選自以下酵素中之任何者：來自節桿菌屬物種菌株SU的4HBT、來自球形節桿菌的4HBT、來自假單胞菌屬物種菌株CBS-3的4HBT、來自大腸桿菌的EntH、來自大腸桿菌的YciA、來自流感嗜血桿菌的YciA、來自大腸桿菌的TesA或來自大腸桿菌的TesB、來自結核分枝桿菌的FcoT。又更佳，該硫酯酶係醯基-CoA硫酯酶。又更佳，該硫酯酶係4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.23下。最佳，該醯基-CoA硫酯酶係來自節桿菌屬物種菌株SU的4HBT。

因此，於一個實施方式，異丁醯基-CoA可藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之作用轉化成甲基丙烯醯基-CoA且甲基丙烯醯基-CoA可藉由4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.23下，更佳係來自節桿菌屬物種菌株SU的醯基-CoA硫酯酶之作用轉化成甲基丙烯酸。

或者，甲基丙烯醯基-CoA可藉由以下酵素途徑中之一者之作用轉化成甲基丙烯酸：

於一個實施方式，甲基丙烯醯基-CoA係藉由轉移酶之作用轉化成甲基丙烯酸，該轉移酶適合地係於EC組編號2.X.X.X下。較佳，該轉移酶係轉移含硫基團的轉移酶，適合地係於EC組編號2.8.X.X下。更佳，該轉移酶係CoA-轉移酶，適合地係於EC組編號2.8.3.X下。又更佳，該轉移酶係乙酸-依賴性醯基-CoA轉移酶或乙醯乙酸-依賴性丁酸-CoA轉移酶，適合地係分別於EC組編號2.8.3.8及2.8.3.9下。最佳，該轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自梭菌屬物種SB4的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自斯提柯蘭氏梭菌（ Clostridium sticklandii）的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）ATCC824的丁酸:乙醯乙酸CoA-轉移酶、來自大腸桿菌的乙酸輔酶A轉移酶ydiF。

用於本文中，術語接合酶、合成酶、及合酶係如發明所屬技術領域中所了解地可互換地使用。

於另一實施方式，甲基丙烯醯基-CoA係藉由以反方向起作用的合成酶之作用轉化成甲基丙烯酸，該合成酶適合地係於EC組編號6.X.X.X下。較佳，該合成酶係碳-硫鍵形成性合成酶，適合地係於EC組編號6.2.X.X下。更佳，該合成酶係酸-硫醇接合酶，適合地係於EC組編號6.2.1.X下。最佳，該合成酶係可逆ADP或GDP形成性醯基-CoA接合酶，諸如GDP形成性琥珀酸-CoA合成酶，適合地係於EC組6.2.1.4下、ADP形成性琥珀酸-CoA合成酶，於EC組6.2.1.5下、ADP形成性戊二酸-CoA合成酶，於EC 6.2.1.6下、ADP形成性蘋果酸-CoA合成酶，於EC 6.2.1.9下、GDP形成性羧酸-CoA合成酶，於EC 6.2.1.10下、ADP形成性乙酸-CoA合成酶，於EC 6.2.1.13下、或ADP形成性檸檬酸-CoA合成酶，於EC 6.2.1.18下。

於另一實施方式，甲基丙烯醯基-CoA係藉由與磷酸乙醯基移轉酶或磷酸丁醯基轉移酶類似的磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶之組合作用轉化成甲基丙烯酸，該磷酸醯基轉移酶係於EC組編號EC 2.X.X.X下，更佳係EC組編號EC 2.3.X.X，又更佳係EC 2.3.1.X，最佳係於EC組編號2.3.1.8或2.3.1.19下，該短鏈脂肪酸激酶係於EC組編號EC 2.X.X.X下，較佳係EC 2.7.X.X，更佳係EC 2.7.2.X，最佳係於EC 2.7.2.1下的乙酸激酶、於EC 2.7.2.6下的甲酸激酶、於EC 2.7.2.7下的丁酸激酶、於EC 2.7.2.14下的支鏈脂肪酸激酶、或於EC 2.7.2.15下的丙酸激酶。較佳，該磷酸醯基轉移酶係甲基丙烯醯基-CoA磷酸醯基轉移酶。較佳，該短鏈脂肪酸激酶係可逆甲基丙烯酸激酶。最佳，該磷酸醯基轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶。最佳，該短鏈脂肪酸激酶選自以下酵素中之任何者：來自螺旋體 MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌（ Thermotoga maritima）的丁酸激酶、來自丁酸梭菌（ Clostridium butyricum）的丁酸激酶。

於本發明之前後文中，術語「其衍生物」意味任何與甲基丙烯醯基CoA或甲基丙烯酸直接相關或包含甲基丙烯醯基CoA或甲基丙烯酸的化學品，諸如其酯、其醯基鹵化物、其酐、其醯胺、其腈、其內酯、其鹽、其錯合物、其異構物、其寡聚物或聚合物、及其等之其他任何經取代版本，更佳，其意味其酯或鹽。

較佳，該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯。較佳，該等甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸烷基酯，更佳係甲基丙烯酸低碳數烷基（C1-C20）酯，又更佳係甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，尤其係C1-C4烷基酯，諸如甲基丙烯酸甲酯、乙酯、或丁酯、或C4-C12烷基酯。最佳，該等甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯，例如甲基丙烯酸正丁酯。

該等甲基丙烯酸酯可自甲基丙烯醯基-CoA生物地形成，較佳係藉由於EC組編號EC2.X.X.X下的轉移酶酵素，更佳係於EC組編號2.3.X.X下的醯基轉移酶，又更佳係於EC組編號EC2.3.1.84下的醇醯基轉移酶之作用。

較佳，該等甲基丙烯酸酯可藉由醇醯基轉移酶之作用自甲基丙烯醯基-CoA生物地形成，該醇醯基轉移酶適合地係於EC組編號EC2.3.1.84下。

適合地，該醇醯基轉移酶於醇或酚存在下起作用，該醇或酚較佳係線性或分支的C1-20未經取代的醇、芳烷基醇、或酚，且特佳係C1-8或C1-4烷基醇，諸如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、二級丁醇、三級丁醇、正戊醇、異戊醇、三級戊醇、正己醇、異己醇、2-己醇、二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇；苄基醇或酚。較佳，該醇醯基轉移酶於醇，更佳係C1-C12醇，更佳係C1至C4或C4-C12醇存在下，又更佳係於丁醇，諸如正丁醇、異丁醇、二級丁醇、或三級丁醇存在下起作用。最佳，該醇醯基轉移酶於正丁醇存在下起作用。

用於本文，術語醇意味一種物種，其具有羥基基團（-OH基團）且其能夠與甲基丙烯酸形成酯基團。較佳，該醇可係C1至C20烷醇，更佳係C1至C12烷醇，又更佳係C1至C4烷醇或C4至C12烷醇，最佳係C4烷醇（即丁醇，諸如正丁醇、異丁醇、二級丁醇、或三級丁醇）。

較佳，該醇醯基轉移酶源自植物來源，更佳該植物屬於任何選自由薑目、薔薇目、石楠目、葫蘆目、蕓薹目、及樟目組成的群組的目；又更佳該植物屬於任何選自由芭蕉科、薔薇科、石楠科、獼猴桃科、葫蘆科、番瓜樹科、及樟科組成的群組的科；又更佳該植物屬於任何選自由巴蕉屬、草莓屬、蘋果屬、李屬、梨屬、越橘屬、獼猴桃屬、甜瓜屬、番瓜樹屬、及酪梨屬組成的群組的屬；又更佳該植物選自由香蕉、草莓、蘋果、梅、西洋梨、藍莓、奇異果、甜瓜、木瓜、及酪梨組成的群組中之任一者。最佳，該醇醯基轉移酶源自水果來源，諸如蘋果、甜瓜、或番茄來源，適合地係蘋果來源。

可使用其中該醇醯基轉移酶存在的生物組織或其加工產物，例如果實、葉、花瓣、莖、種子、果皮、果肉、等等。或者，可使用自此等生物組織萃取的粗酵素液體、經純化酵素、等等。或者，可分離該醇醯基轉移酶之基因並導入宿主微生物中以用於在其中表現。

使用醇醯基轉移酶以將甲基丙烯醯基CoA轉化成甲基丙烯酸酯係於WO2014/038214中充分敘述，該文獻之揭露內容係以引用方式併入本文中，尤其該等醇醯基轉移酶基因及其等之序列、及包含所述序列的載體質體。 進一步方法步驟

視需要，本發明之方法可進一步包含將步驟(b)中形成的任何甲基丙烯酸轉化成甲基丙烯酸酯的步驟(c)。

較佳，該等甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸烷基酯，更佳係甲基丙烯酸低碳數烷基（C1-C20）酯，更佳係甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，又更佳係甲基丙烯酸C1-C4或C4-C12烷基酯。最佳，該等甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯。

步驟(c)中形成的甲基丙烯酸酯可係生物或化學地形成，較佳其等係生物地形成。

視需要，步驟(c)可藉由與適合的醇的酯化反應化學地進行。於其下實現酯化的反應條件可變化相當大。該反應於室溫下進行極慢，但於升高的溫度下進行頗快。典型地，以化學計量上過量使用反應物之一以驅動反應。其他反應物則被稱為限制性試劑。約99%的限制性試劑（例如酸、醇、或多元醇）可在幾小時內轉化成酯。限制性試劑典型係不以化學計量過量存在的試劑，例如用於製造多元醇酯的限制性試劑係多元醇。

因為醇及有機酸之酯化係可逆反應，酯化反應通常不進行到完全。然而，超過99%的轉化可藉由移出酯化產物中之至少一者（典型係水）來實現。若產物中之一者於低於其他者及試劑的溫度沸騰，此移出典型係藉由蒸餾來實現。各種各樣用於自反應區域移除產生的水的蒸餾技術於發明所屬技術領域係已知的。一種移除水的方法包括在可形成具有比反應之一或每一組份者低的沸點的共沸物的液體介質中進行反應。若試劑及所得酯於大氣壓力下具有高於100˚C的沸點，則可簡單地調整反應溫度以移除水且不需要能夠與水形成共沸物的液體介質。此外，可使用共沸添加劑以幫助水自反應混合物蒸餾出。可於酯之生產中使用惰性物質（諸如環己烷、己烷、苯、甲苯、或二甲苯）作為共沸添加劑。此外，亦可利用具有較低沸點的反應物作為共沸添加劑。於此後者之例子，用作為共沸添加劑的反應物典型以超過反應所需的化學計量量的量充至反應混合物中。酯化程序（包括利用水移除者）可以批式或連續的運作模式進行。種種酯化程序係於Kirk-Othmer化學技術百科全書（Kirk-Othmer Encyclopaedia of Chemical Technology）第9卷, 第四版(1994), pp. 762-768揭露，該文獻之完整內容特此以引用方式併入。

一種習用批式酯化程序包括於反應循環開始時將所有反應物充入反應器中。於催化性酯化程序，催化劑典型於批次達到目標溫度後加至反應混合物。反應混合物可接著被進一步加熱。反應混合物之溫度升高直到實現反應混合物之沸點，於該點共沸添加劑（若使用）及水副產物自反應混合物沸騰出。典型地，頂上的蒸氣凝結，水自共沸添加劑分離，且共沸添加劑被回收至反應容器。反應溫度（及因此反應之速率）受反應混合物之沸點限制。當沸點較低的反應物亦被用作為共沸添加劑時，其濃度隨著反應進行逐漸減低。此外，反應物之濃度於反應期間減低，其負面地影響反應速率。因此，反應溫度（及因此反應之速率常數）隨著反應進行增加，無論是否使用共沸添加劑，特別是若於反應過程期間持續輸入熱。

較佳，步驟(c)係藉由於EC組編號EC 3.1.x.x.下的對酯鍵作用的酯酶或水解酶酵素之作用生物地進行，更佳，該等酵素係於EC 3.1.1.X下且係酯鍵之切裂及形成之催化中涉及的水解酶類型之酵素。一篇最近的微生物酯酶之回顧如下：Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2013) 2(7): 135-146。

較佳，該方法進一步包含一或多個生產異丁醯基-CoA，更佳係自2-酮異戊酸及／或自異丁酸生產異丁醯基-CoA的進一步步驟。

於一個實施方式，該方法進一步包含一或多個自2-酮異戊酸生產異丁醯基-CoA的進一步步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任何者：

較佳，該方法進一步包含將2-酮異戊酸轉化成異丁醯基-CoA的步驟。更佳，2-酮異戊酸係藉由支鏈酮酸脫氫酶酵素複合物轉化成異丁醯基-CoA，該支鏈酮酸脫氫酶酵素複合物由阿爾法次單元組份、硫辛醯胺（lipoamide）醯基轉移酶組份、及硫辛醯胺脫氫酶組份組成。最佳，該脫氫酶選自以下酵素中之任何者：來自戀臭假單胞菌的支鏈酮酸脫氫酶（BCKD）、來自枯草芽孢桿菌的BCKD、來自銅綠假單胞菌的BCKD、來自阿拉伯芥的BCKD、來自天藍色鏈黴菌（ Streptomyces coelicolor）的BCKD、及來自嗜熱棲熱菌（ Thermus thermophilus）的BCKD。

或者，2-酮異戊酸之至異丁醯基-CoA的轉化可由氧化還原酶酵素催化，該氧化還原酶酵素適合地係於EC組1.X.X.X下，較佳係對供體之醛或側氧基基團作用的氧化還原酶，適合地係於EC組1.2.X.X下，更佳係對供體之醛或側氧基基團作用，使用鐵-硫蛋白作為電子受體的氧化還原酶酵素，適合地係於EC組1.2.7.X下，最佳係2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶（亦稱為酮纈胺酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶），適合地係於EC組編號1.2.7.7下，其係由阿爾法、貝他、伽瑪、及德爾塔次單元組成的四聚體。如此酵素之實例係來自激烈火球菌（ Pyrococcus furiosis）的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自火球菌屬（ Pyrococcus）物種的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自嗜熱球菌屬（ Thermococcus）物種的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自海岸嗜熱球菌（ Thermococcus litoralis）的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶；來自深嗜熱球菌（ Thermococcus profundus）的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶、及來自嗜熱自養甲烷桿菌（ Methanobacterium thermoautotrophicum）的2-酮異戊酸鐵氧化還原蛋白還原酶。

於一第二實施方式，該方法進一步包含一或多個自異丁酸生產異丁醯基-CoA的進一步步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任何者：

較佳，該方法進一步包含將異丁酸轉化成異丁醯基-CoA的步驟。

視需要，異丁酸係藉由接合酶酵素之作用轉化成異丁醯基-CoA，該接合酶酵素適合地係於EC組編號6.X.X.X下，較佳係於EC組6.2.X.X下的碳-硫鍵形成性接合酶，更佳係於EC組6.2.1.X下的酸-硫醇形成性接合酶，更佳係GDP-形成性、ADP形成性、或AMP形成性接合酶，諸如AMP形成性乙酸-CoA接合酶，適合地係於EC組6.2.1.1下、丁酸-CoA接合酶，適合地係於EC組6.2.1.2下、羧酸-CoA接合酶，適合地係於EC組6.2.1.10下、ADP形成性乙酸-CoA接合酶，適合地係於EC組6.2.1.13下、丙酸-CoA接合酶，適合地係於EC組6.2.1.17下、或EC組6.2.1.-中的酸-硫醇接合酶。最佳，該接合酶選自以下酵素中之任何者：來自綠葉假單胞菌（ Pseudomonas chlororaphis）的AcsA、來自多變擬青黴（ Paecilomyces varioti）的丁醯基-CoA合成酶、來自牛心臟粒線體的丁醯基-CoA合成酶。

該方法可進一步包含一或多個自異丁酸生產異丁醯基-CoA的進一步步驟，該一或多個進一步步驟係以下者之任何者：

較佳，該方法進一步包含將異丁酸轉化成異丁醯基-磷酸的步驟、及將異丁醯基-磷酸轉化成異丁醯基-CoA之步驟。

較佳，異丁酸係藉由激酶酵素轉化成異丁醯基-磷酸，該激酶適合地係於EC組編號EC 2.X.X.X下，較佳係於EC 2.7.X.X下，更佳係於EC組編號EC 2.7.2.X下，最佳係乙酸激酶，適合地係於EC組2.7.2.1下、於EC 2.7.2.6下的甲酸激酶、於EC 2.7.2.7下的丁酸激酶、於EC 2.7.2.14下的支鏈脂肪酸激酶、或於EC 2.7.2.15下的丙酸激酶。最佳，該激酶選自以下酵素中之任何者：來自螺旋體 MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自丁酸梭菌的丁酸激酶。

較佳，異丁醯基-磷酸係藉由轉移酶酵素之作用，該轉移酶酵素係於EC組編號2.X.X.X下，更佳係藉由於EC組編號2.3.X.X下的醯基轉移酶之作用，又更佳係藉由於EC組編號2.3.1.X下的轉移胺基-醯基基團以外的基團的醯基轉移酶之作用轉化成異丁醯基-CoA。又更佳，磷酸乙醯基轉移酶或磷酸丁醯基轉移酶，分別於EC組編號2.3.1.8及2.3.1.19下。更佳，該轉移酶係來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶或來自枯草芽孢桿菌、麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032、海棲熱袍菌、及克魯維氏梭菌（ Clostridium kluyveri）的磷酸乙醯基轉移酶。此等酶之其他來源包括其他厭氧細菌，尤其係梭菌屬物種，諸如巴氏梭菌（ Clostridium pasteurianum）或拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）。

最佳，該方法進一步包含藉由合成酶酵素之作用自異丁酸生產異丁醯基-CoA的步驟，該合成酶酵素較佳係異丁醯基-CoA合成酶，最佳係來自綠葉假單胞菌（ P. chloraphis）B23的異丁醯基-CoA合成酶（AcsA）。

視需要，可組合以上敘述的進一步方法步驟之任何者。 微生物

以上方法之酵素可係含在一或多種微生物內，或以無微生物形式存在，例如呈在反應容器中或保留在管柱上的無細胞萃取物或經純化酵素。

較佳，該方法之生物轉化係在一或多種宿主微生物中進行。更佳，用於進行該等生物轉化的一或多種酵素係含在一或多種微生物內。

較佳，該一或多種微生物表現催化相關步驟所需的一或多種酵素。更佳，相關步驟及任何進一步的酵素性步驟係在該一或多種微生物內活體內進行。

該一或多種微生物可天然表現該一或多種酵素，或可經基因工程改造以表現該一或多種酵素，或可表現野生型或經基因工程改造的酵素兩者之組合。如此經基因工程改造的生物可稱為重組生物。

該一或多種微生物可內源或異源地表現該一或多種酵素、或內源及異源的酵素之組合。

於本發明之前後文中，術語「重組生物」意味一種經基因修改或經基因工程改造的生物，其包含已經人工構築並插入該生物中的遺傳物質。該遺傳物質可包含可已經或未經進一步經基因修改的內源或異源核酸。

於本發明之前後文中，術語「內源的」意味源自相同的生物之物種。

於本發明之前後文中，術語「異源的」意味源自不同的生物之物種。

於本發明之前後文中，當用於微生物時，術語「經改造」意味經基因修改或經基因工程改造的生物（如以上定義）或生物之突變菌株，其（例如）已基於其天然表現該一或多種酵素的基礎挑選。

供於以上方法之任何者使用的微生物（經基因工程改造或修改，如以上敘述）可選自天然存在的野生型或非天然存在的重組微生物，例如細菌、古菌、酵母菌、真菌、藻類、或可用於發酵程序的各種各樣其他微生物之任何者。

該（等）微生物可表現至少以下酵素： (a)    (i)  來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及／或 (b)   (i)  醯基-CoA硫酯酶，適合地係4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT），更適合地係來自節桿菌屬物種的4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）；及／或 (ii) 醯基-CoA轉移酶；及／或 (iii) 醯基-CoA合成酶；及／或 (iv) 磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶；及視需要 (v) 醇醯基轉移酶。

該（等）微生物可表現至少以下酵素： (a)    (i)  來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及／或 (b)   (i)  醯基-CoA硫酯酶，適合地係4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT），更適合地係來自節桿菌屬物種的4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）。

於一些實施方式，該微生物經改造以進行以下步驟： (a)    藉由醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成C1至C20甲基丙烯酸酯，適合地係C1至C12甲基丙烯酸酯，諸如C1至C4或C4至C12甲基丙烯酸酯。

較佳，該甲基丙烯酸酯可係甲基丙烯酸丁酯。

該微生物可係任何適合的微生物。該微生物可係大腸桿菌。該微生物可係重組生物。

該（等）微生物可表現本文中定義的酵素(a)及／或(b)。較佳，該（等）微生物可表現如本文中定義的酵素(a)及(b)兩者。

較佳，該（等）微生物進一步表現以下酵素中之一或多者：支鏈酮酸脫氫酶酵素或ADP形成性、GDP形成性、或AMP形成性醯基-CoA合成酶／合酶／接合酶；或短鏈脂肪酸激酶及磷酸醯基轉移酶。

更佳，該（等）微生物進一步表現以下酵素中之一或多者：2-酮異戊酸脫氫酶、異丁酸-CoA接合酶、ADP形成性、GDP形成性、或AMP形成性醯基-CoA合成酶／合酶／接合酶、或短鏈脂肪酸激酶及磷酸醯基轉移酶。

最佳，該（等）微生物進一步表現異丁醯基-CoA合成酶，尤其是來自綠葉假單胞菌（ Pseudomonas chloraphis），尤其是綠葉假單胞菌（ Pseudomonas chloraphis）B23的AcsA。

該（等）宿主微生物可係任何適合的微生物。較佳，該（等）宿主微生物係細菌，適合的細菌之實例包括：屬於以下屬的變形菌門的腸內細菌：艾氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬（ Pantoea）、克留氏菌屬、沙雷氏菌屬、伊文氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、摩根氏菌屬（ Morganella）、等等、屬於以下屬的所謂的棒狀桿菌群細菌：短桿菌屬、棒狀桿菌屬、或微桿菌屬、及屬於以下屬的細菌：脂環酸芽孢桿菌屬（ Alicyclobacillus）、芽孢桿菌屬、氫桿菌屬（ Hydrogenobacter）、甲烷球菌屬、醋酸桿菌屬、不動桿菌屬、農桿菌屬、固氮根瘤菌屬（ Axorhizobium）、固氮菌屬、無形體屬（ Anaplasma）、類桿菌屬、巴東體屬、博德氏桿菌屬、疏螺旋體屬、布氏桿菌屬、伯克氏菌屬、莢膜樣菌屬、彎曲桿菌屬、披衣菌屬、嗜衣原體屬（ Chlamydophila）、梭菌屬、柯克斯氏體屬、艾利希氏體屬、腸球菌屬、法蘭西斯氏菌屬（ Francisella）、細梭菌屬、加德納氏菌屬（ Gardnerella）、嗜血桿菌屬、螺旋桿菌屬、克雷伯氏菌屬（ Kelbsiella）、甲烷桿菌屬、微球菌屬、莫拉氏菌屬、分枝桿菌屬、黴漿菌屬、奈瑟氏球菌屬、巴氏桿菌屬、消化鏈球菌屬（ Peptostreptococcus）、卟啉單胞菌屬（ Porphyromonas）、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、立克次體屬、羅卡利馬氏體屬（ Rochalimaea）、羅氏菌屬（ Rothia）、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬（ Stenotrophomonas）、鏈球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬、沃爾巴克氏體屬（ Wolbachia）、耶氏桿菌屬、等等。

例示性細菌包括選自以下者的物種：大腸桿菌、產酸克留氏菌（ Klebsiella oxytoca）、產琥珀酸厭氧螺菌（ Anaerobiospirillum succiniciproducens）、產琥珀酸放線桿菌（ Actinobacillus succinogenes）、產琥珀酸曼海姆氏菌（ Mannheimia succiniciproducens）、埃特利根瘤菌（ Rhizobium etli）、枯草芽孢桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、氧化葡糖酸桿菌、運動發酵單胞菌（ Zymomonas mobilis）、乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）、胚芽乳酸桿菌、天藍色鏈黴菌、丙酮丁醇梭菌、螢光假單胞菌、嗜熱氫桿菌（ Hydrogenobacter thermophilus）、詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）、及戀臭假單胞菌。

較佳，該細菌係大腸桿菌。

例示性酵母菌或真菌包括屬於以下屬者：酵母菌屬、裂殖酵母菌屬、念珠菌屬、克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces）、麴菌屬、畢赤酵母菌屬、隱球菌屬（ Crytpococcus）、等等。例示性酵母菌或真菌物種包括選自以下者：釀酒酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、乳酸克魯維酵母菌（ Kluyveromyces lactis）、馬克斯克魯維酵母菌（ Kluyveromyces marxianus）、土麴菌、黑麴菌、巴斯德畢赤酵母菌（ Pichia pastoris）、等等。

該一或多種微生物可經基因修改以增強或減低以上天然或經基因工程改造的酵素之活性。

較佳，該（等）微生物可經基因工程改造以增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產。

增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產可包括藉由使用種種發明所屬技術領域中已知的基因工程技術對存在的細胞代謝程序、核酸、及／或蛋白質作修改。增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產可亦包括修改該（等）微生物以在該（等）微生物中表現一或多種異源基因。此等可包括編碼自基於碳的原料（諸如本文中闡述者）至甲基丙烯酸的所欲途徑之酵素的基因，或可包括起作用以直接或間接促進如此途徑中的酵素之功能及表現的其他輔助基因，如以下詳細討論的。

據此，該（等）微生物可經修改以表現用於生產甲基丙烯酸及／或其衍生物的一或多種基因，且較佳該（等）微生物經進一步修改以增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產。

可在該（等）微生物內表現以使得其經修改以生產甲基丙烯酸及／或其衍生物的一或多種基因包括編碼來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶及以下酵素中之任何者者：來自節桿菌屬物種的4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶、來自大腸桿菌的YciA、來自流感嗜血桿菌的YciA、來自大腸桿菌的TesA、來自大腸桿菌的TesB、來自球形節桿菌的4HBT、來自假單胞菌屬物種菌株CBS-3的4HBT、來自大腸桿菌的EntH、來自梭菌屬物種SB4的丁醯基-CoA乙醯乙酸CoA轉移酶、來自斯提柯蘭氏梭菌的丁醯基-CoA乙醯乙酸CoA轉移酶、來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的丁酸-乙醯乙酸CoA-轉移酶、來自大腸桿菌的乙酸輔酶A轉移酶ydiF、來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶、來自螺旋體MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌的丁酸激酶、來自丁酸梭菌的丁酸激酶、來自戀臭假單胞菌的支鏈醯基-CoA脫氫酶、來自智人的異丁醯基-CoA脫氫酶、來自阿拉伯芥的異戊醯基-CoA脫氫酶、來自智人的電子轉移黃素蛋白、來自豬的電子轉移黃素蛋白、來自阿拉伯芥的電子轉移黃素蛋白、來自戀臭假單胞菌的電子轉移黃素蛋白、來自反硝化副球菌（ Paracoccus denitrificans）的電子轉移黃素蛋白、來自智人的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自豬的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自戀臭假單胞菌的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自阿拉伯芥的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自球形紅桿菌（ Rhodobacter sphaeroides）的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶、來自反硝化副球菌的電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶。

可在該（等）微生物內表現以使得其經修改以增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產的一或多種基因包括編碼以下酵素之任何者者：來自綠葉假單胞菌（ Pseudomonas chlororaphis）的AcsA；來自枯草芽孢桿菌的 bkdA1、 bkdA2、 bkdB、及 lpdV；來自戀臭假單胞菌的 bkdA1、 bkdA2、 bkdB、及 lpdV；來自枯草芽孢桿菌的 alsS、來自大腸桿菌的 ilvD、來自大腸桿菌的 ilvC、來自大腸桿菌的 ilvB、來自大腸桿菌的 ilvN、來自大腸桿菌的 ilvI、來自大腸桿菌的 ilvG、來自大腸桿菌的 ilvM、來自大腸桿菌的 ilvH、及來自大腸桿菌且具有G14D及S17F突變的 ilvH、來自麩胺酸棒狀桿菌R且帶有S34G、L48E、及R49F突變的 ilvC、來自棒狀桿菌屬R的 ilvB及 ilvN、及來自棒狀桿菌屬R且帶有G156E突變的 ilvN、以及來自其他生物、帶有與以上敘述者類似的突變以（於適當時）減輕酵素之回饋抑制並以改變輔因子依賴性的同源物。

本發明之微生物可進一步包含於以上提及的生物合成途徑中藉由競爭相同的受質及／或中間物來減低或排除催化甲基丙烯酸及／或其衍生物以外的化合物之合成的酵素之活性的修改。如此酵素之實例包括來自大腸桿菌的YciA、TesA、TesB、及在大腸桿菌中由 fadB、 ilvA、 panB、 leuA、 ygaZ、 ygaH、 aceF、 aceE、 lpdA、 tpiA、 pfkA、 pfkB、 mdh、 poxB、 ilvE、 ldhA、及 lldD編碼者、以及在本文中敘述的其他宿主菌株中的同源物。

本發明之微生物可進一步包含減低或排除代謝甲基丙烯酸及／或其衍生物或代謝在以上提及的生物合成途徑中的中間物的酵素之活性的修改。如此與代謝有關的酵素之實例係在大腸桿菌中的天然纈胺酸降解途徑之酵素、或可消耗經工程改造的途徑之硫酯中間物的其他硫酯酶。

本發明之微生物可亦進一步包含減低或排除移除以上提及的生物合成途徑中的中間物的其他細胞功能中涉及的蛋白質之活性的修改。如此細胞功能之實例可包括儲存機制，諸如液胞儲存（例如在酵母菌中）或能夠儲存代謝物的其他胞內體（例如細菌微隔室）、細菌周質、或運輸機制，諸如能夠輸出代謝物的跨膜泵或孔蛋白。

編碼該等蛋白質（尤其是根據本發明的微生物中表現的酵素）的基因之核酸之來源可包括（例如）任何其中所編碼的基因產物能夠催化所述反應的物種。如此物種包括原核及真核生物兩者，包括（但不限於）細菌，包括古菌及真細菌、及真核生物，包括酵母菌、植物、昆蟲、動物、及哺乳動物，包括人類。例示性的如此來源之物種包括（例如）大腸桿菌、智人、費氏丙酸桿菌（ Propionibacterium fredenreichii）、扭曲甲基桿菌（ Methylobacterium extorquens）、副痢疾桿菌、腸道沙門氏桿菌、弗氏耶氏桿菌（ Yersinia frederiksenii）、痤瘡丙酸桿菌、褐鼠、秀麗隱桿線蟲、臘樣芽孢桿菌、醋酸鈣不動桿菌、貝氏不動桿菌（ Acinetobacter baylyi）、不動桿菌屬物種、克魯維氏梭菌、假單胞菌屬物種、嗜熱棲熱菌、銅綠假單胞菌、戀臭假單胞菌、穴兔、丙酮丁醇梭菌、腸膜明串珠菌（ Leuconostoc mesenteroides）、巴氏真桿菌（ Eubacterium barkeri）、多毛類桿菌（ Bacteroides capillosus）、 Anaerotruncus colihominis、嗜熱鹽鹼厭氧菌（ Natranaerobius thermophilus）、空腸彎曲桿菌、阿拉伯芥、麩胺酸棒狀桿菌、豬、枯草芽孢桿菌、螢光假單胞菌、黏質沙雷氏菌、天藍色鏈黴菌、 Methylibium petroleiphilum、肉桂鏈黴菌（ Streptomyces cinnamonensis）、阿維菌素鏈黴菌（ Streptomyces avermitilis）、閃爍古生球菌（ Archaeoglobus fulgidus）、死海鹽盒菌（ Haloarcula marismortui）、好氣熱棒菌（ Pyrobaculum aerophilum）、釀酒酵母菌、針柄勺梭菌（ Clostridium cochlearium）、假破傷風梭菌（ Clostridium tetanomorphum）、破傷風梭菌、無丙二酸檸檬酸桿菌（ Citrobacter amalonaticus）、優養羅爾斯頓氏菌（ Ralstonia eutropha）、小鼠、歐洲牛、具核細梭菌（ Fusobacterium nucleatum）、摩根氏菌（ Morganella morganii）、巴氏梭菌、球形紅桿菌、自養黃色桿菌（ Xanthobacter autotrophicus）、丙酸梭菌（ Clostridium propionicum）、埃氏巨球型菌（ Megasphaera elsdenii）、土麴菌、念珠菌屬、東工大硫化葉菌（ Sulfolobus tokodaii）、勤奮金屬球菌（ Metallosphaera sedula）、橘色綠屈撓菌（ Chloroflexus aurantiacus）、糖乙酸多丁醇梭菌（ Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、發酵胺基酸球菌（ Acidaminococcus fermentans）、幽門螺旋桿菌、以及其他本文中揭露的或可用作為對於對應基因的來源生物的例示性物種。

應注意該編碼可在本發明之微生物中表現的酵素的一或多種基因亦包含編碼所述酵素之變體的基因，該等變體係（例如）包括多肽序列中的一或數個胺基酸之取代、缺失、插入、或添加的變體酵素，且其中所述多肽保留未經修改的酵素之活性。如此變體酵素亦包括相較於未經修改的酵素具有減低的酵素活性的變體酵素及具有經修改的別構控制的酵素，例如來自大腸桿菌且具有G14D及S17F突變的 ilvH、來自麩胺酸棒狀桿菌R且帶有S34G、L48E、及R49F突變的 ilvC、來自棒狀桿菌屬R的 ilvB及 ilvN、及來自棒狀桿菌屬R且帶有G156E突變的 ilvN。

用於在非天然存在的甲基丙烯酸生產性微生物中構築及測試一蛋白質之表現的方法可（例如）藉由發明所屬技術領域中已熟知的重組技術及偵測方法進行。如此方法可於（例如）以下者中發現敘述：Sambrook等人, 分子選殖：實驗室指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, 第三版, 冷泉港實驗室, 紐約(2001)；及Ausubel等人, 現行分子生物學實驗指引（Current Protocols in Molecular Biology）, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)。

可使用發明所屬技術領域中已熟知的技術將用於甲基丙烯酸及／或其衍生物或其形成中的中間物之生產的途徑中涉及的外源核酸序列穩定地或暫時地引入微生物細胞中，該等技術包括（但不限於）接合、電穿孔、化學轉形、轉導、轉染、及超音波轉形。

轉形方法之實例可包括以氯化鈣處理接受微生物細胞以增加DNA之通透性，及自處於生長期的細胞製備勝任細胞，接著以DNA轉形。或者，亦可利用以下方法：使DNA接受細胞成為原生質體或原生質球狀體（其可輕易接收重組DNA），接著將重組DNA引入至該等細胞中，其已知可用於枯草芽孢桿菌、放線菌、及酵母菌。此外，亦可藉由電穿孔進行微生物之轉形。如此方法係發明所屬技術領域中已熟知的。

對於在大腸桿菌或其他原核微生物細胞中的外源表現，一些真核核酸之基因或cDNA中的核酸序列可編碼靶向性訊號，諸如N端粒線體或其他靶向性訊號，其（若所欲）可於轉形至原核微生物細胞中前移除。例如，粒線體前導序列之移除導致在大腸桿菌中的表現增加（Hoffmeister等人, J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)。對於在酵母菌或其他真核微生物細胞中的外源表現，基因可於不添加前導序列下在細胞質液中表現，或可使其靶向粒線體或其他胞器，或靶向分泌，其係藉由添加適合的靶向性序列，諸如適用於目標胞器的粒線體靶向性或分泌訊號。因此，應了解可將對於一核酸序列移除或包括靶向性序列的適當修改併入至外源核酸序列中以賦予所欲的特性。此外，可以發明所屬技術領域中已熟知的技術對基因作密碼子最適化以實現在微生物內的蛋白質之最適化表現。

可構築一或多種表現載體以包括一或多種編碼本文中例示的生物合成途徑酵素的核酸，該（等）核酸被可操作地連接至在該（等）微生物內起作用的表現控制序列。可用於在本發明之微生物中使用的表現載體包括（例如）質體、黏接質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因組、及人工染色體，包括對於至宿主染色體中的穩定併入可操作的載體及挑選序列或標記。

此外，該等表現載體可包括一或多種可挑選標記基因及適當的表現控制序列。亦可包括可挑選標記基因，其（例如）提供對抗生素或毒素的抗性、補足營養缺陷性不全、或補充培養基中沒有的關鍵營養素。表現控制序列可包括發明所屬技術領域中已熟知的組成性、可誘發、或可抑制型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子、轉譯訊號、等等。當欲共表現二或多個外源性編碼核酸序列時，該兩個核酸序列可皆被插入（例如）至單一表現載體中或分開的表現載體中。對於單一載體表現，可將編碼核酸操作性地連接至一個共同表現控制序列或連接至不同的表現控制序列，諸如可誘發啟動子及組成性啟動子。於一些實施方式，該載體可具有用於多個基因或操縱組之共表現的二或多個啟動子。於一些實施方式，該等基因／操縱組可係在一或多個不同的載體上以一或多個對應啟動子表現。

用於轉形的載體可係在該（等）微生物之細胞中可自主複製的載體。在諸如大腸桿菌的腸桿菌科細菌的細菌中可自主複製的載體之實例可包括質體載體pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pET20b(+)、pET28b(+)（pET載體可得自Novagen）、pLysS、（pHSG及pSTV載體可得自Takara Bio Inc. ）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMW載體可得自Nippon Gene Co., Ltd.）等等、及其等之衍生物。此外，用於棒狀桿菌群細菌的載體可包括pAM330（日本專利公開第58-67699號）、pHM1519（日本專利公開第58-77895號）、pSFK6（日本專利公開第2000-262288號）、pVK7（USP2003-0175912A）、pAJ655、pAJ611、pAJ1844（日本專利公開第58-192900號）、pCG1（日本專利公開第57-134500號）、pCG2（日本專利公開第58-35197號）、pCG4、pCG11（日本專利公開第57-183799號）、pHK4（日本專利公開第5-7491號）、等等。此外，用於酵母菌的載體可包括酵母菌質體，諸如例如用於巴斯德畢赤酵母菌的pD902或pD905、或用於釀酒酵母菌的pD1201、pD1204、pD1205、pD1207、pD1211、pD1214 pD1215、pD1217、pD1218、pD1221、pD1224、pD1225、pD1227、pD1231、pD1234、pD1235、pD1237。亦可使用已熟知的方法將基因整合入宿主染色體中（例如Datensko及Wanner（Datsenko, K. A.及Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645））。

酵素之活性之增強可包括藉由置換目標基因之表現調節序列增強目標基因之表現，該表現調節序列係諸如基因體DNA或有具有適當強度的啟動子的質體上的啟動子。例如，已知thr啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、pL啟動子、tac啟動子、等等係頻繁使用的啟動子。在諸如細菌的微生物中具有高表現活性的啟動子之實例可包括延長因子Tu（EF-Tu）基因（tuf）之啟動子、編碼共-陪伴蛋白GroES/EL、硫氧化還原蛋白（thioredoxin）還原酶、磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、等等的基因之啟動子（WO2006/028063、EP1697525）。強啟動子及用於評估啟動子之強度的方法之實例係發明所屬技術領域中已熟知的。

此外，亦可能取代一基因之啟動子區域中的數個核苷酸，以使得該啟動子具有適當的強度，如於WO 2000/18935中揭露的。表現調節序列之取代可（例如）以與於基因取代中相同的方式使用溫度敏感性質體進行。可用於大腸桿菌或菠蘿泛菌（ Pantoea ananatis）的具有溫度敏感性複製起點的載體之實例可包括（例如）國際公開案WO 1999/03988中敘述的質體pMAN997、其衍生物、等等。此外，表現調節序列之取代亦可藉由利用線性DNA的方法進行，該方法諸如係稱為「Red驅動性整合（Red-driven integration）」使用λ-噬菌體之Red重組酶的方法（Datsenko, K. A.及Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645）、組合Red驅動性整合方法及λ-噬菌體切除系統的方法（Cho, E. H.等人2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203）（WO2005/010175）、等等。表現調節序列之修改可與增加基因副本數組合。

此外，已知核糖體結合位（RBS）及起始密碼子間的間隔子，且特別是緊鄰起始密碼子上游的序列中的數個核苷酸之取代強烈地影響mRNA可轉譯性。轉譯可藉由修改此等序列來增強。

當將目標基因引入前述質體或染色體中時，可使用任何啟動子以表現基因，只要選擇於所使用的微生物中起作用的啟動子。該啟動子可係該基因之天然啟動子、或經修改啟動子。一基因之表現亦可藉由適合地挑選在所選微生物中有力地起作用的啟動子或藉由使一啟動子之-35及-10區域靠近一致序列來控制。

代謝或合成途徑中涉及的外源核酸序列之轉形、轉導、接合、或染色體插入可使用發明所屬技術領域中已熟知的方法確認。如此方法包括（例如）質體或染色體DNA之萃取然後是特定目標序列之聚合酶連鎖擴增、或限制定位、進一步核酸分析，諸如mRNA之北方墨點轉漬法或聚合酶連鎖反應（PCR）擴增、或聚丙烯醯胺凝膠電泳、或酵素活性測量、或對於基因產物之表現的免疫印漬術、或其他適合的分析方法以測試所引入的核酸序列或其對應基因產物之表現。發明所屬技術領域中具有通常知識者會了解外源核酸係以足夠的量表現以生產所欲的基因產物，且會進一步了解可使用發明所屬技術領域中已熟知的方法最適化表現水平以獲得足夠的表現。

視需要，該一或多種本發明之微生物可進一步經修改以減低或排除參與以下細胞功能的酵素或蛋白質之活性： (i)    使來自甲基丙烯酸生產途徑的物質轉向；及／或 (ii)   代謝甲基丙烯酸及／或其衍生物。

為了減低或排除前述酵素或蛋白質之活性，可藉由習用隨機或定位誘變或基因工程技術將用於減低或排除該等酵素或蛋白質之細胞內活性的突變引入至前述酵素或蛋白質之基因中。誘變之實例包括（例如）X射線或紫外線照射、以諸如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍的致突變原處理、分別藉由高保真或易錯聚合酶連鎖反應試管內定位誘變或隨機誘變、等等。基因上突變被引入的位點可位於編碼該酵素或蛋白質的編碼區或諸如啟動子的表現控制區域內。基因工程技術之實例可包括遺傳重組、轉導、細胞融合、基因剔除、等等。

目標酵素或蛋白質之細胞內活性之減低或排除及減低之程度可藉由在自候選菌株獲得的細胞萃取物或其純化部分中測量該酵素或蛋白質活性並比較其與野生型菌株者或藉由測量通過完整細胞的目標產物之形成來確認。

其他用於賦予或增強生產甲基丙烯酸及／或其衍生物的能力及／或其中間物的方法之實例可包括賦予對甲基丙烯酸或有機酸類似物、呼吸抑制子、等等的抗性及賦予對細胞壁合成抑制子的敏感性。此等方法可包括（例如）藉由以增加濃度的毒性物質生長來挑選抗性細胞、賦予單氟醋酸抗性、賦予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性、減弱尿素酶、賦予丙二酸抗性、賦予對苯并哌哢或萘醌的抗性、賦予HOQNO抗性、賦予阿爾法-丙酮二酸抗性、賦予胍抗性、賦予對青黴素的敏感性、等等，如發明所屬技術領域中已知的。

如此抗性細菌之實例可包括以下菌株：黃色短桿菌（ Brevibacterium flavum）AJ3949 FERM BP-2632；麩胺酸棒狀桿菌AJ11628 FERM P-5736；黃色短桿菌AJ11355 FERM P-5007；麩胺酸棒狀桿菌AJ11368 FERM P-5020；黃色短桿菌AJ11217 FERM P-4318；麩胺酸棒狀桿菌AJ11218 FERM P-4319；黃色短桿菌AJ11564 FERM P-5472；黃色短桿菌AJ11439 FERM P-5136；麩胺酸棒狀桿菌H7684 FERM BP-3004；乳酸發酵短桿菌（ Brevibacterium lactofermentum）AJ11426 FERM P-5123；麩胺酸棒狀桿菌AJ11440 FERM P-5137；及乳酸發酵短桿菌AJ11796 FERM P-6402。

用於賦予或增強生產甲基丙烯酸及／或其衍生物的能力及／或其中間物的進一步方法可包括賦予對下調子／抑制子的抗性、賦予對上調子／活化子的敏感性、或減輕對於酵素之經由其他化合物的別構活化的需要。例如，減輕對於來自戀臭假單胞菌的支鏈酮酸脫氫酶之經由纈胺酸的別構活化的需要、或減輕來自大腸桿菌的乙醯乳酸合酶之別構抑制。 發酵

本發明之方法可藉由培養本發明之微生物（適合地係在培養基中）來進行。

適合地，因此，本發明之方法可進一步包含培養一或多種微生物以生產甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的步驟。

較佳，所述培養在發酵培養基中發生。

該甲基丙烯酸及／或其衍生物可存在於發酵培養基中或微生物之細胞內。

適合地，因此，本發明之方法可進一步包含自發酵培養基或自微生物細胞收集甲基丙烯酸及／或在其形成中的中間物及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的步驟。

甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）可經由如本文之前敘述的分泌甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的微生物存在於發酵培養基中。

甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）可經由如本文之前敘述的積累甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的微生物存在於該（等）微生物之細胞中。

適合地，因此，該等細胞係藉由任何發明所屬技術領域中已知的方式自發酵培養基移出，該等方式係諸如過濾、離心、等等，且甲基丙烯酸或其鹽及／或甲基丙烯酸酯係藉由任何發明所屬技術領域中已知的方式自該發酵培養基收集，該等方式係諸如：蒸餾、液體-液體萃取、等等。適合地，因此，本發明之方法可包含自周圍培養基收集甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的進一步步驟，此可藉由首先藉由過濾或離心自該培養基移出該等細胞並接著藉由蒸餾或液體-液體萃取自經澄清化培養基萃取甲基丙烯酸及／或其衍生物來實施。

視需要，收集甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）可進一步包含自細胞釋放甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的步驟，其可藉由任何發明所屬技術領域中已知的方式進行，較佳係其中溶胞細胞以釋放所欲的產物者，諸如：藉由音振、均質化、酵素處理、珠磨、滲壓衝擊、冷凍-解凍、酸／鹼處理、噬菌體溶胞、等等，接著為與以上詳述者類似的自發酵培養基收集的方法。適合地，因此，本發明之方法可包含自細胞收集甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）的進一步步驟，此可藉由溶胞該等細胞隨後過濾細胞殘渣然後萃取甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）來實施。

適合地，微生物之培養或養殖需要基於碳的原料，自其該微生物可得到能量及生長。較佳，因此，該（等）微生物係培養在基於碳的原料上，且本發明之第一或第二方面之方法可進一步包含培養一或多種能夠自基於碳的原料生產甲基丙烯酸及／或其衍生物的微生物的步驟。

較佳，培養或養殖在發酵培養基中發生，該培養基適合地係周圍培養基，其圍繞著該（等）微生物，較佳基於碳的原料存在該培養基中，視需要溶解或懸浮在該培養基中、鼓泡通過該培養基、及／或與該培養基混合。較佳，因此，該培養基包含該（等）微生物及該基於碳的原料以及任何緩衝液及鹽。

較佳，該發酵培養基進一步包含甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）。

較佳，該（等）微生物以高於如以上解釋的基線速率的速率生產甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯），以使得較佳甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）之存在於該培養基中的濃度（來自直接分泌或來自溶胞該等細胞）係於高滴定量。

較佳，甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）之存在於發酵培養基中的滴定量係至少5mg/L。例如，5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155 mg/L，較佳係至少大於130mg/L。

較佳，於其中甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）在微生物內積累的實施方式，甲基丙烯酸及／或其中間物及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）之存在於細胞中的濃度係至少0.05mM，更佳係至少0.1mM，更佳係至少1mM，更佳係至少2mM，更佳係至少5mM，更佳係至少10mM。較佳，甲基丙烯酸或其中間物及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）之在細胞中的濃度範圍介於10mM至約300mM，更佳係約20mM至約200mM，又更佳係約30mM至約100mM，最佳係約40mM至約70mM。

本發明之微生物可以批式、重複批式、饋料批式、重複饋料批式、或連續養殖程序養殖或培養。

適合地，該養殖程序在培養基中發生，該培養基在本文中亦稱為周圍培養基或發酵培養基。較佳，應用饋料批式或重複饋料批式程序，其中將碳源及／或氮源及／或其他化合物饋至養殖程序。更佳，將碳及／或氮源饋至養殖程序中。

本發明之微生物在其中培養的發酵培養基可係任何適用於所論及的生物之需要的可商購培養基，其條件為所述生物所需相關營養素係限制性的。培養可係需氣的或無氧的，然而，於本發明之前後文中，當利用氧化酶酵素時，培養較佳係需氣的。

該發酵培養基適合地係含有如以上敘述的基於碳的原料、及氮源、以及生長該（等）微生物及／或形成甲基丙烯酸及／或甲基丙烯酸酯所需的其他化合物。

發明所屬技術領域中已知的適合的基於碳的原料之實例包括葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精、蔗糖、水解澱粉、澱粉、木質素、芳香族化合物、合成氣或其組份、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、糖蜜、及油。較佳，該基於碳的原料源自生質。可亦使用混合物、以及廢棄物，諸如來自食物加工、林業、或農業的城市廢棄物、廚餘、及木質纖維素廢棄物。

發明所屬技術領域中已知的適合的氮源之實例包括大豆粕、玉米浸液、酵母菌萃取物、氨、銨鹽、硝酸鹽、尿素、氮氣、或其他氮源。

生長該（等）微生物所需的其他化合物之實例包括抗生素、抗真菌劑、抗氧化劑、緩衝液、磷酸鹽、硫酸鹽、鎂鹽、微量元素、及／或維生素。

待加至該培養基的基於碳的原料及氮源之總量可基於該（等）微生物及／或該養殖程序之長度之需要變化。

該培養基中的基於碳的原料與氮源間的比率之變化可相當大。

生長該（等）微生物及／或生產甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）所需的其他化合物（如磷酸鹽、硫酸鹽、或微量元素）可以可在不同類型的微生物間（即真菌、酵母菌、及細菌間）變化的量添加。此外，待添加的其他化合物之量可由甲基丙烯酸及／或其衍生物（諸如甲基丙烯酸酯）是否形成及用於形成其等的途徑為何來決定。

典型地，生長微生物所需的各發酵培養基組份之量係藉由測量在該營養素上的生長產率並就於培養或養殖程序中使用的基於碳的原料之量進一步評估來決定，因為所形成的生質之量主要會由所使用的基於碳的原料之量及於任何饋料體系期間施加的營養素限制決定。

根據本發明的培養或養殖程序較佳係以工業規模進行。工業規模程序被理解成涵蓋在一或多個體積規模≥ 0.01 m ³，較佳係≥ 0.1 m ³，較佳係≥ 0.5 m ³，較佳係≥ 5 m ³，較佳係≥ 10 m ³，更佳係≥ 25 m ³，更佳係≥ 50 m ³，更佳係≥ 100 m ³，最佳係≥ 200 m ³的發酵槽中的培養或養殖程序。

較佳，本發明之微生物之培養或養殖一般係在生物反應器中進行。「生物反應器」一般被理解成意味一容器，於其中微生物被工業地培養。生物反應器可為任何大小、數目、及形式，且可包括用於提供營養素、生長用其他化合物、新鮮培養基、基於碳的原料、氣體添加物，諸如（但不限於）空氣、氮、氧、或二氧化碳的進口。生物反應器可亦包含用於移出培養基之體積以自發酵培養基本身或自微生物內收集甲基丙烯酸及／或甲基丙烯酸酯的出口。該生物反應器較佳亦具有用於取樣培養物的出口。該生物反應器一般可經配置以混合發酵培養基，例如藉由攪拌、搖盪、搖動、翻轉、鼓泡氣體通過培養物、等等。或者，一些連續培養不需要混合，例如使用斷續流動系統的微反應器系統。生物反應器係常見且發明所屬技術領域中已熟知的且實例可於諸如以下者的標準教科書中找到：「生物技術：工業微生物學教科書（Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology）, 第二版」(1989) 作者：Wulf Cruegar及Annelise Crueger, 譯者Thomas D. Brock Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA。 生物反應器

視需要，該生物反應器可包含複數種不同的本發明之微生物。

較佳，該生物反應器僅包含能夠進行本發明之方法的微生物。

更佳，該生物反應器僅包含相同物種的微生物以使得可自始至終使用相同的培養條件。 生質原料

較佳，所使用的生質包含高量的碳水化合物，特佳係為C5或C6糖、基於碳的氣體、或芳香族之來源的碳水化合物，較佳係C5或C6糖，更佳係葡萄糖，諸如（但不限於）澱粉、木質素、纖維素、肝醣、阿拉伯糖基木聚糖、幾丁質、或果膠。

或者，所使用的生質包含高量的脂肪，特佳係為甘油及脂肪酸，尤其三甘油酯之來源的脂肪或油。適合的三甘油酯包括任何可輕易得自植物或動物來源的油或脂肪。如此油及脂肪之實例包括：棕櫚油、亞麻仁油、菜籽油、豬油、奶油、鯡魚油、椰子油、植物油、葵花油、蓖麻油、大豆油、橄欖油、可可脂、水牛酪油、鯨脂等等。

該生質可由一或多種不同的生質來源構成。適合的生質來源之實例如下；原始狀態木材、能源作物、農業殘餘物、廚餘、城市廢棄物、及工業廢棄物或副產物。

原始狀態木材生質來源可包括但不限於；木屑；樹皮；碎木；原木；鋸屑；木顆粒、或煤磚。

能源作物生質來源可包括但不限於；短期輪作矮林或林產；非木質草，諸如芒草屬、麻類柳枝稷、蘆葦、或黑麥；農作物，諸如糖、澱粉、或油作物；或水生植物，諸如小型或大型藻類及雜草。

農業殘餘物可包括但不限於；種子或果實外殼；禾稈；玉米稈；麵粉；穀粒；家禽糞；糞肥；淤漿；合成氣；或青貯料。

廚餘可包括但不限於；果菜皮／皮；堅果殼；種子或果實外殼；核；肉質果果核／核果果核；動物或魚類之可食部分；來自果汁及油萃取的渣；來自釀造的榖渣或啤酒花；家庭廚餘；豬油或油或脂肪。

工業廢棄物可包括但不限於；未經處理木材，包括顆粒、經處理木材、頁岩氣、木複合材，包括MDF/OSD、木層板、紙渣／碎片／廢棄物；紡織物，包括纖維／紗／廢水；或下水污泥。 進一步產物

亦設想到其他有用有機化合物（例如甲基丙烯酸之衍生物，諸如種種其酯）之生產。據此，甲基丙烯酸產物可被酯化以生產其酯。可能的酯可選自C ₁-C ₂₀烷基或C ₂-C ₁₂羥基烷基、環氧丙基、異莰基、二甲基胺基乙基、三伸丙二醇酯。最佳，用於形成該等酯的醇或烯烴可源自生物來源，例如生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇。較佳的酯係甲基丙烯酸乙酯、正丁酯、異丁酯、羥甲酯、羥丙酯、或甲酯，最佳係甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸丁酯。

較佳，甲基丙烯酸係藉由酯化反應轉化成甲基丙烯酸烷基酯或羥烷基酯。用於如此轉化的適合反應條件於發明所屬技術領域中係已熟知的且與甲基丙烯酸之生產一起於WO/2012/069813中敘述。

根據本發明，提供了一種製備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物的方法，其包含以下步驟： (i)    根據本發明之方法（如本文中定義的）製備甲基丙烯酸及／或其衍生物； (ii)   視需要酯化(i)中製備的甲基丙烯酸以生產該甲基丙烯酸酯；及 (iii)  聚合(i)中製備的甲基丙烯酸及／或其衍生物及／或若存在時(ii)中製備的酯，視需要與一或多種共單體，以生產其聚合物或共聚物。

較佳，以上(ii)之甲基丙烯酸酯選自C ₁-C ₂₀烷基或C ₂-C ₁₂羥烷基、環氧丙基、異莰基、二甲基胺基乙基、三伸丙二醇酯，更佳甲基丙烯酸乙酯、正丁酯、異丁酯、羥甲酯、羥丙酯、或甲酯，最佳甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、或甲基丙烯酸丁酯。

因此，根據本發明，提供了一種製備甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物之方法，其包含以下步驟：

有利地，如此聚合物會具有可觀部分（若非全部）的源自化石燃料以外的來源的單體殘基。

較佳的共單體包括例如單烯系不飽和羧酸及二羧酸及其等之衍生物，諸如酯、醯胺、及酐。

特佳的共單體係丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸三級丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸異莰酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸三級丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸環氧丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸異莰酯、甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯、三伸丙二醇二丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、異氰酸酯，包括甲苯二異氰酸酯及p,p′-亞甲基二苯基二異氰酸酯、丙烯腈、丁二烯、丁二烯及苯乙烯（MBS）及ABS，但(i)中的所述酸單體或酯或(ii)中的所述酯單體之與該等共單體中之一或多者的任何給定共聚合中以上共單體中之任何者非選自以上(i)或(ii)中的甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的單體。

當然，使用不同共單體之混合物亦係可能的。該等共單體本身可或可非藉由與來自以上(i)或(ii)的單體相同的方法製備。

本發明係以以下經編號實施方式進一步界定：

1.一種生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法，其包含以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之作用將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。

2.如實施方式1之方法，其中步驟(b)可生物地或化學地進行。

3.如實施方式1或2中之任一者之方法，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，更佳係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

4.如實施方式3之方法，其中該等甲基丙烯酸酯係甲基丙烯酸丁酯，例如係甲基丙烯酸正丁酯。

5.如實施方式3或4之方法，其中該等甲基丙烯酸酯係藉由轉移酶之作用生物地形成。

6.如實施方式5之方法，其中該轉移酶係醇醯基轉移酶，適合地係於EC組編號2.3.1.84下。

7.如實施方式6之方法，其中該醇醯基轉移酶源自水果來源，諸如蘋果、甜瓜、或番茄來源。

8.如實施方式6或7中之任一者之方法，其中該醇醯基轉移酶於醇存在下起作用以形成相應的烷基酯，該醇係例如C1至C12醇，諸如C1至C4醇或C4至C12醇。

9.如實施方式8之方法，其中該醇係丁醇。

10.如實施方式1或2中之任一者之方法，其中該方法包含將步驟(b)中形成的甲基丙烯酸轉化成甲基丙烯酸酯的進一步步驟(c)。

11.如實施方式10之方法，其中步驟(c)可生物地或化學地進行。

12.如實施方式10或11之方法，其中步驟(c)係藉由酯酶或水解酶之作用生物地進行。

13.如實施方式1、2、或10-12中之任一者之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由以下者之作用轉化成甲基丙烯酸：硫酯酶、轉移酶、合成酶、及／或磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶。

14.如實施方式13之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由硫酯酶之作用轉化成甲基丙烯酸。

15.如實施方式13或14之方法，其中該硫酯酶係4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.23下。

16.如實施方式16或17之方法，其中該硫酯酶係於EC組編號3.1.2.X下，該轉移酶係於EC組編號2.8.3.X下的CoA轉移酶，該合成酶係於EC組編號6.2.1.X下的酸-硫醇合成酶，該磷酸醯基轉移酶係於EC組編號2.3.1.X下，且該短鏈脂肪酸激酶係於EC組編號2.7.2.X下。

17.如實施方式13-16中之任一者之方法，其中該硫酯酶選自以下酵素中之任何者：來自節桿菌屬物種的醯基-CoA硫酯酶、來自球形節桿菌的醯基-CoA硫酯酶、來自假單胞菌屬物種菌株CBS-3的4HBT、來自大腸桿菌的EntH、來自大腸桿菌或流感嗜血桿菌的YciA、來自大腸桿菌的TesA或TesB、及來自結核分枝桿菌的FcoT；該CoA轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自梭菌屬物種SB4的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自斯提柯蘭氏梭菌的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的丁酸:乙醯乙酸CoA-轉移酶、及來自大腸桿菌的乙酸輔酶A轉移酶ydiF；該磷酸醯基轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶；且該短鏈脂肪酸激酶選自以下酵素中之任何者：來自螺旋體 MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌的丁酸激酶、及來自丁酸梭菌的丁酸激酶。

18.如實施方式13至17中之任一者之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由硫酯酶之作用轉化成甲基丙烯酸且該硫酯酶係來自節桿菌屬物種菌株SU的醯基-CoA硫酯酶。

19.如前述實施方式中之任一者之方法，其中該方法之生物轉化係在一或多種宿主微生物中藉由酵素進行。

20.一種微生物，其供於根據如實施方式1-19中之任一者之方法生產甲基丙烯酸及／或其衍生物中使用。

21.一種重組微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸； 其中該重組微生物係大腸桿菌。

22.一種微生物，其藉由一或多種異源核酸修改以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸。

23.一種微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。

24.如實施方式20或23之微生物，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，更佳係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

25.如實施方式20-24之微生物，其中該微生物表現以下酵素： (a)    (i)來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及以下者中之一或多者： (b)   (i)  醯基-CoA硫酯酶； (ii) CoA轉移酶； (iii) 酸-硫醇合成酶； (iv) 磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶； (v) 醇醯基轉移酶。

26.如實施方式25之微生物，其中該微生物表現醯基-CoA硫酯酶，諸如4HBT。

27.如實施方式26之微生物，其中該微生物表現4HBT，其適合地係來自節桿菌屬物種。

28.如實施方式20-27中之任一者之微生物，其中該微生物內源地表現該一或多種酵素或該微生物異源地表現該一或多種酵素，或該微生物表現內源及異源的酵素之組合。

29.如實施方式20-27中之任一者之微生物，其中該微生物選自野生型或重組微生物，例如細菌、古菌、酵母菌、真菌、藻類、或可用於發酵方法的各種各樣其他微生物之任何者。

30.如實施方式29之微生物，其中該微生物係選自屬於以下屬的變形菌門的腸內細菌：艾氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克留氏菌屬、沙雷氏菌屬、伊文氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、摩根氏菌屬、等等、屬於以下屬的所謂的棒狀桿菌群細菌：短桿菌屬、棒狀桿菌屬、或微桿菌屬、及屬於以下屬的細菌：脂環酸芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、氫桿菌屬、甲烷球菌屬、醋酸桿菌屬、不動桿菌屬、農桿菌屬、固氮根瘤菌屬、固氮菌屬、無形體屬、類桿菌屬、巴東體屬、博德氏桿菌屬、疏螺旋體屬、布氏桿菌屬、伯克氏菌屬、莢膜樣菌屬、彎曲桿菌屬、披衣菌屬、嗜衣原體屬、梭菌屬、柯克斯氏體屬、艾利希氏體屬、腸球菌屬、法蘭西斯氏菌屬、細梭菌屬、加德納氏菌屬、嗜血桿菌屬、螺旋桿菌屬、克雷伯氏菌屬、甲烷桿菌屬、微球菌屬、莫拉氏菌屬、分枝桿菌屬、黴漿菌屬、奈瑟氏球菌屬、巴氏桿菌屬、消化鏈球菌屬、卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、立克次體屬、羅卡利馬氏體屬、羅氏菌屬、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬、沃爾巴克氏體屬、耶氏桿菌屬。

31.一種重組微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸； 其中該重組微生物係大腸桿菌。

32.一種微生物，其藉由一或多種異源核酸修改以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸。

33.一種微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT）之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸。

34.一種重組微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸酯； 其中該重組微生物係大腸桿菌。

35.一種微生物，其藉由一或多種異源核酸修改以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸酯。

36.一種微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   藉由醇醯基轉移酶之表現將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸酯。

37.如實施方式32、33、35、或36中之任一者之微生物，其中該微生物係大腸桿菌。

38.如實施方式34-37中之任一者之微生物，其中該醇醯基轉移酶係來自水果來源，諸如蘋果、甜瓜、或番茄來源。

39.如實施方式32、33、或35-38中之任一者之微生物，其中該微生物係重組微生物。

40.如實施方式20-39中之任一者之微生物，其中該微生物經基因修改以增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產。

41.如實施方式20-39中之任一者之微生物，其中該微生物可藉由以下者基因修改：藉由競爭相同的受質及／或中間物來減低或排除催化甲基丙烯酸及／或其衍生物以外的化合物之合成的酵素之活性的修改、減低或排除代謝甲基丙烯酸或代謝甲基丙烯酸之生產中的中間物的酵素之活性的修改、及／或減低或排除其他移除甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產中的中間物的細胞功能中涉及的蛋白質之活性的修改。

42.如實施方式34-41中之任一者之微生物，其中該等甲基丙烯酸酯係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

43.一種甲基丙烯酸之生產之方法，其使用如實施方式20-42中之任一者之微生物。

44.一種發酵之方法，其包含在發酵培養基中培養一或多種如實施方式20-42中之任一者之微生物以生產甲基丙烯酸及／或其衍生物。

45.如實施方式44之方法，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，更佳係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

46.一種發酵培養基，其包含一或多種如實施方式20-42中之任一者之微生物。

47.如實施方式46之發酵培養基，其中該培養基進一步包含甲基丙烯酸及／或其衍生物。

48.如實施方式47之發酵培養基，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，更佳係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

49.一種生物反應器，其包含一或多種如實施方式20-42中之任一者之微生物及／或實施方式46-48中之任一者之發酵培養基。

50.一種製備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物的方法，其包含以下步驟： (i)    根據實施方式1-19或43中之任一者製備甲基丙烯酸及／或其衍生物； (ii)   視需要酯化(i)中製備的甲基丙烯酸以生產該甲基丙烯酸酯； (iii)  聚合(i)中製備的甲基丙烯酸及／或其衍生物及／或若存在(ii)中製備的酯，視需要與一或多種共單體，以生產其聚合物或共聚物。

51.如實施方式50之方法，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，更佳係C1至C20烷基酯，最佳係C1至C12烷基酯，尤其係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯。

52.一種聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、及聚甲基丙烯酸丁酯均聚物或共聚物，其自實施方式50或51之方法形成。

本發明現將參考以下非限制性實施例及圖式說明。 實施例 細菌菌株

使用大腸桿菌DH5α（ThermoFisher Scientific）作為用於DNA組裝反應之轉形及例行的質體之增殖的普通選殖宿主。

將大腸桿菌BW25113之衍生物用於完整細胞生物轉形實驗（Datsenko KA, Wanner BL (2000) 使用PCR產物的大腸桿菌K-12中的染色體基因之單步驟失活（One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products）. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 97:6640-6645）。 生長培養基

潛溶液態培養基（LB）：將由蛋白月東（10 g/L）、酵母菌萃取物（5 g/L）、及氯化鈉（10 g/L）構成的LB-Miller培養基用於大腸桿菌菌株之例行培養。對於固態培養基，添加瓊脂至1.0%（w/v）的最終濃度。藉由高壓滅菌來滅菌培養基。當適合時，以卡本西林（50 μg/ml）及蔗糖（10% w/v）補充培養基。

LUND 培養基：組合以下者並以去離子水（dH ₂O）補足至1 L的最終體積：200 ml 5x LUND鹽溶液（10 g/L (NH ₄)SO ₄、73 g/L K ₂HPO ₄、18 g/L NaH ₂PO ₄.2H ₂O、2.5 g/L (NH ₄)II檸檬酸鹽）、40 ml葡萄糖溶液（25% w/v）、20 ml MgSO ₄溶液（1M）、2 ml微量元素溶液（0.5 g/L CaCl ₂.2H ₂O、10.03 g/L FeCl ₃、0.18 g/L ZnSO ₄.7H ₂O、0.16 g/L CuSO ₄.5H ₂O、0.15 g/L MnSO ₄.H ₂O、0.18 g/L CoCl.6H ₂O、22.3 g/L Na ₂EDTA.2H ₂O）。當適合時，以卡本西林（50 μg/ml）及丁醇（5 mM）補充LUND培養基。

生物轉形培養基：為製備1 L生物轉形（BT）培養基，組合200 mL 5x BT溶液（73 g/L KH ₂PO ₄、18 g/L NaH ₂PO ₄.2H ₂O、10 mL 1 M MgSO ₄、10 mL LUND微量元素溶液）、1.79 g 2-酮異戊酸鈉（Sigma 198994）、1.11 g 1-丁醇（Sigma 537993）、及10 mL甘油（20% （w/v））並以dH ₂O補足至900 mL，並將pH調整至7.0。添加dH ₂O至1 L的最終體積並藉由真空過濾漏斗於無菌條件下以過濾器（0.2 μm孔徑）滅菌培養基。以卡本西林（50 μg/ml）補充生物轉形培養基。 實施例 1-6 及對照組：甲基丙烯酸丁酯之藉由重組大腸桿菌的自 2- 酮異戊酸的完整細胞生產

對編碼來自菠菜（x2）、銀白楊、山黃麻、落花生、及安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶及作為對照組的來自阿拉伯芥的ACX4的核苷酸序列之每一者作密碼子最適化以用於在大腸桿菌中表現並由Twist Bioscience合成。序列係於pET-21(+)質體（可自Novagen商購）中個別提供。編碼醯基-CoA氧化酶的核苷酸序列之每一者皆加上以下5’-及3’-尾來合成以促進一鍋式DNA組裝： 5’尾：tctagaaataattttgttcgtctcgaattcttaactttaagaaggagatatacc 3’尾：taactcgagtaaactagtgagacggatccggc

酵素之GenBank ID及由Twist合成的核苷酸序列之SEQ ID NO係於以下表1及序列之列表中顯示。

對編碼來自蘋果的醇醯基轉移酶（AAT）的核苷酸序列作密碼子最適化以用於在大腸桿菌中表現並由Twist Bioscience合成。序列係於pET21(+)質體（可自Novagen商購）中提供。編碼來自蘋果的AAT的核苷酸序列係加上以下5’-及3’-尾來合成以促進一鍋式DNA組裝： 5’尾：gagtaacgtctcactagttttgtttaactttaagaaggagatatacc 3’尾：cttaaggagacggagcaaaa 表 1 ： GenBank ID 及序列之列表

實施例	物種	GenBank ID	蛋白質中的胺基酸之數目
1	菠菜（ACX4）	XP_021855534.1	435
2	菠菜（ACXb）	KNA24566.1	624
3	銀白楊	TKS13357.1	437
4	山黃麻	PON92218.1	439
5	落花生	QHO54153.1	439
6	安德森氏山豆麻	PON51135.1	439
對照組	阿拉伯芥	AEE78851.1	436

序列之列表

SEQ ID NO. 1 –用於在大腸桿菌中表現的來自菠菜的醯基-CoA氧化酶（ACX4）之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 2 –用於在大腸桿菌中表現的來自菠菜的醯基-CoA氧化酶（ACXb）之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 3 –用於在大腸桿菌中表現的來自銀白楊的醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 4 –用於在大腸桿菌中表現的來自山黃麻的醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 5 –用於在大腸桿菌中表現的來自落花生的醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 6 –用於在大腸桿菌中表現的來自安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 7 –用於在大腸桿菌中表現的來自阿拉伯芥的醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化基因序列（包括5’-及3’-尾）。

SEQ ID NO. 8 –用於在大腸桿菌中表現的編碼來自蘋果的醇醯基轉移酶（AAT）的經密碼子最適化基因（包括5’-及3’-尾） 。

SEQ ID NO 9 –pGGV4載體之序列（如於圖2顯示）。 一鍋式 DNA 組裝

設置一鍋式DNA組裝反應以構築表現除了戀臭假單胞菌BCKD及蘋果AAT以外的個別候選醯基-CoA氧化酶的質體。

接受質體係pGGV4（SEQ ID NO. 9），如於圖2顯示。pGGV4係含有「ppBCKD」聚核苷酸序列的表現載體，其含有以下者：編碼 戀臭假單胞菌KT2440支鏈酮酸脫氫酶之次單元（ bkdA1、 bkdA2、 bkdB、及 lpdV）的四個基因、賦予對安比西林的抗性的 ampR基因（加上啟動子序列）、及兩側被EcoRI及AflII限制位包圍的 sacB基因（加上啟動子序列）。

供體質體係pET21(+)質體，其等含有候選醯基-CoA氧化酶之經密碼子最適化核苷酸序列且該質體含有蘋果AAT之經密碼子最適化核苷酸序列。對於各一鍋式組裝，將接受質體及兩個供體質體（一個含有候選醯基-CoA序列且一個含有蘋果AAT序列）加至反應混合物。

使20 fmol的量的接受質體與40 fmol的供體質體之各者混合。至此，添加1 μl T4 ^TMDNA接合酶（New England Biolabs，M0202）、1 μl Esp3I（New England Biolabs，R0734）、及2 μl 10xT4 ^TMDNA接合酶緩衝液（New England Biolabs，M2622），及並以去離子H ₂O將體積補至20 μl。接著在熱循環器中於以下條件下培養混合物：30個37°C 5 min接著16°C 5 min的消化-接合循環，接著37°C 5 min的最終消化步驟，及於65°C下20 min的熱失活。接著於轉形至大腸桿菌細胞中前將反應保持在4°C。

於所得質體構築體中，在pGGV4接受質體（SEQ ID NO. 9）中的 sacB基因及啟動子序列被候選醯基-CoA氧化酶序列（SEQ ID NO. 1-7）及蘋果AAT序列（SEQ ID NO. 8）置換。圖3說明除了編碼ppBCKD及蘋果AAT的序列以外含有候選醯基-CoA氧化酶基因的經組裝質體構築體。 質體之至大腸桿菌中的轉形

將2 μl的體積的完成的DNA組裝反應或經純化質體（各1 ng）轉形至化學勝任大腸桿菌細胞（20 μl）中。在冰上培養轉形混合物5分鐘，之後於42°C下熱衝擊30秒。將細胞放回冰上2分鐘，之後添加300 μl SOC培養基（Novagen）並於37°C、250 rpm下培養60 min。隨後將細胞塗盤至具有卡本西林（50 μg/ml）及蔗糖（10% w/v）的培養基上並於37°C下培養16至24 h以允許菌落發展。

於轉形後，在以卡本西林（50 μg/ml）及蔗糖（10% w/v）補充的LB培養基上挑選帶有所欲組裝構築體的大腸桿菌DH5α細胞。藉由PCR及桑格氏定序法確認所得的質體。

在大腸桿菌DH5α細胞中增殖質體並使用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）純化。接著將經純化質體（1 ng）分開地轉形至大腸桿菌BW25113 Δ ldhA中以用於生物轉形實驗。

設置完整細胞生物轉形實驗以測試候選醯基-CoA氧化酶之對異丁醯基-CoA的活性。於37°C、250 rpm下在以卡本西林（50 μg/ml）補充的LB培養基中培養含質體大腸桿菌BW25113 Δ ldhA細胞過夜。接著將細胞繼代培養至以酵母菌萃取物（2 g/L）、卡本西林（50 μg/ml）、及丁醇（5 mM）補充的LUND培養基中。接種LUND培養物以給出0.1的初始OD ₆₀₀並於37°C、250 rpm下培養直到其等達到≥ 3的OD ₆₀₀。為設置生物轉形反應，藉由離心收穫細胞，在生物轉形培養基中洗滌，並以10的OD ₆₀₀再懸浮在相同的培養基中。於37°C、250 rpm下在密封的燒瓶中培養生物轉形反應48 h。於實驗期結束時，針對甲基丙烯酸丁酯藉由如下氣相色層分析法–質譜法（GC-MS）（Agilent 7890A/5975C）分析樣本。

藉由離心自培養基移出細胞並過濾並藉由渦旋混合10 ml體積的上清液與等體積的乙酸乙酯1 min。靜置，隨後自有機相取兩個1 mL樣本以用於GC-MS中的分析二重複。於280 °C、9.4 psi、及24.2 mL min ^-1下分10次將1 µL的各樣本注射至進口中。加熱管柱（Agilent 19091S-433）（30m x 20 µm x 0.25 µm）至300 °C的最大溫度5分鐘，以20 °C間隔自45 °C上升。將烘箱溫度保持於300 °C另外10分鐘。通過管柱的流量係1.197 mL min ^-1，流速係39.78 cm秒 ^-1。各樣本循環以四次純乙醇注射開始及結束以洗滌管柱。結果係於以下表2顯示。

於三個分開的實驗中之一者進行生物轉形，在每個例子中皆使用用來自阿拉伯芥的ACX4作為對照組。

於開始時，各生物轉形反應皆含有13 mM 2-酮異戊酸及15 mM丁醇。2-酮異戊酸與丁醇之至甲基丙烯酸丁酯的轉化（經由BCKD、醯基-CoA氧化酶、及AAT催化反應的順序）僅於候選醯基-CoA氧化酶能夠催化異丁醯基-CoA之至甲基丙烯醯基-CoA的氧化時才可能（參見圖1）。結果清楚顯示甲基丙烯酸丁酯於各生物轉形中形成。因此，結果顯示所測試的醯基-CoA氧化酶中之每一者皆能夠將異丁醯基-CoA轉化成甲基丙烯醯基-CoA。 表 2 – 完整細胞生物轉形之結果

實施例	實驗	物種	BMA （ mM ）	BIB （ mM ）	BA （ mM ）	總（ mM ）	%BMA	% BMA vs 對照組
1	3	菠菜	0.055	0.25	0.11	0.41	13.33%	315%
2	1	菠菜	0.015	0.87	0.89	1.77	0.86%	21%
3	2	銀白楊	0.026	0.48	0.30	0.81	3.26%	204%
4	1	山黃麻	0.053	0.88	0.90	1.84	2.88%	71%
5	1	落花生	0.016	0.47	1.47	1.96	0.80%	21%
6	3	安德森氏山豆麻	0.00026	0.81	0.73	1.54	0.17%	15%
對照組	1	阿拉伯芥	0.074	0.37	0.038	0.48	15.45%	-
對照組	2	阿拉伯芥	0.013	0.52	0.33	0.87	1.48%	-
對照組	3	阿拉伯芥	0.018	0.69	0.66	1.36	1.29%	-

結果顯示來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻中之每一者的醯基-CoA氧化酶於異丁醯基-CoA之至甲基丙烯酸丁酯的轉化中係活性的且可適用作為來自阿拉伯芥的ACX4的替代物。

應注意與本申請案之本說明書同時提出或於本說明書前提出且與本說明書一起公開供公眾檢視的所有論文及文件及所有如此論文和文件之內容皆以引用方式併入本文中。

本說明書（包括任何所附申請專利範圍、摘要、及圖式）中揭露的特徵之所有者及／或如此揭露的任何方法或程序之步驟之所有者皆可以任何組合來組合，除了其中如此特徵及／或步驟之至少一些彼此互斥的組合以外。

本說明書（包括任何所附申請專利範圍、摘要、及圖式）中揭露的各特徵可以起相同、相等、或類似目的的替代性特徵置換，除非另外明確說明。因此，除非另外明確說明，所揭露的各特徵僅係一通用系列的相等或類似特徵之一個實例。

本發明不限於前述實施方式之細節。本發明延伸至本說明書（包括任何所附申請專利範圍、摘要、及圖式）中揭露的特徵之任何新穎者或任何新穎組合或至如此揭露的任何方法或程序之步驟之任何新穎者或任何新穎組合。

無

[圖1]顯示將2-酮異戊酸與1-丁醇轉化成甲基丙烯酸丁酯的反應流程，該轉化係經由由酵素支鏈酮酸脫氫酶（BCKD）、醯基-CoA氧化酶（ACX）、及醇醯基轉移酶（AAT）催化的依序反應步驟。

[圖2]顯示帶有編碼戀臭假單胞菌KT2440 BCKD複合物的bkdA1、bkdA2、bkdB、及lpdV基因的質體pGGV4的圖示。

[圖3]顯示一種用於在重組大腸桿菌中表現BCKD、ACX、及蘋果AAT的重組質體之圖示。

無

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Claims (28)

1. 一種生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法，其包含以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻（ Parasponia andersonii）的醯基-CoA氧化酶之作用將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。
2. 如請求項1之方法，其中步驟(b)可生物地或化學地進行。
3. 如請求項1或2中之任一項之方法，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，較佳係C1至C20烷基酯，更佳係C1至C12烷基酯，最佳係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯，尤其係甲基丙烯酸丁酯，例如係甲基丙烯酸正丁酯。
4. 如請求項3之方法，其中該等甲基丙烯酸酯係藉由轉移酶之作用生物地形成，該轉移酶諸如係醇醯基轉移酶，適合地係於EC組編號2.3.1.84下。
5. 如請求項4之方法，其中該醇醯基轉移酶源自水果來源，諸如蘋果、甜瓜、或番茄來源。
6. 如請求項4或5中之任一項之方法，其中該醇醯基轉移酶係於醇存在下起作用以形成相應的烷基酯，該醇較佳係C1至C12醇，更佳係C1至C4醇或C4至C12醇，最佳係丁醇。
7. 如請求項1或2中之任一項之方法，其中該方法包含將步驟(b)中形成的甲基丙烯酸轉化成甲基丙烯酸酯的進一步步驟(c)，且其中步驟(c)可生物地或化學地進行。
8. 如請求項7之方法，其中步驟(c)係藉由酯酶或水解酶之作用生物地進行。
9. 如請求項1、2、7、或8中之任一項之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由以下者之作用轉化成甲基丙烯酸：硫酯酶，適合地係於EC組編號2.8.3.X下的硫酯酶、轉移酶，適合地係於EC組編號2.8.3.X下的CoA轉移酶、合成酶，適合地係於EC組編號6.2.1.X下的酸-硫醇合成酶、及／或磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶，適合地係於EC組編號2.3.1.X下的磷酸醯基轉移酶及於EC組編號2.7.2.X下的短鏈脂肪酸激酶。
10. 如請求項9之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由以下者之作用轉化成甲基丙烯酸：硫酯酶，諸如4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶，適合地係於EC組3.1.2.23下。
11. 如請求項9或10中之任一項之方法，其中該硫酯酶選自以下酵素中之任何者：來自節桿菌屬物種的醯基-CoA硫酯酶4HBT、來自球形節桿菌的醯基-CoA硫酯酶4HBT、來自假單胞菌屬物種菌株CBS-3的4HBT、來自大腸桿菌的EntH、來自大腸桿菌或流感嗜血桿菌的YciA、來自大腸桿菌的TesA或TesB、及來自結核分枝桿菌的FcoT；該CoA轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自梭菌屬物種SB4的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自斯提柯蘭氏梭菌（ Clostridium sticklandii）的丁醯基-CoA:乙醯乙酸CoA轉移酶、來自丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）ATCC824的丁酸:乙醯乙酸CoA-轉移酶、及來自大腸桿菌的乙酸輔酶A轉移酶ydiF；該磷酸醯基轉移酶選自以下酵素中之任何者：來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸丁醯基轉移酶；及該短鏈脂肪酸激酶選自以下酵素中之任何者：來自螺旋體 MA-2的支鏈脂肪酸激酶、來自海棲熱袍菌（ Thermotoga maritima）的丁酸激酶、及來自丁酸梭菌（ Clostridium butyricum）的丁酸激酶。
12. 如請求項9-11中之任一項之方法，其中甲基丙烯醯基-CoA係藉由硫酯酶之作用轉化成甲基丙烯酸且該硫酯酶係來自節桿菌屬物種菌株SU的醯基-CoA硫酯酶4HBT。
13. 如前述請求項中之任一項之方法，其中該方法之生物轉化係在一或多種宿主微生物中藉由酵素進行。
14. 一種微生物，其供於根據如請求項1-13中之任一項之方法生產甲基丙烯酸及／或其衍生物中使用。
15. 一種重組微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物； 其中該重組微生物係大腸桿菌；或 一種微生物，其藉由一或多種異源核酸修改以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物；或 一種微生物，其經改造以進行以下步驟： (a)    藉由來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶之表現將異丁醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯醯基-CoA；及 (b)   將甲基丙烯醯基-CoA生物地轉化成甲基丙烯酸及／或其衍生物。
16. 如請求項15之微生物，其中該微生物表現以下酵素： (a) (i)    來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及以下者中之一或多者： (b) (i)    醯基-CoA硫酯酶，較佳係4-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT），更佳係來自節桿菌屬物種的4HBT； (ii)   CoA轉移酶； (iii)  酸-硫醇合成酶； (iv)  磷酸醯基轉移酶及短鏈脂肪酸激酶； (v)   醇醯基轉移酶，較佳係來自水果來源的醇醯基轉移酶，更佳係來自蘋果、甜瓜、或番茄來源的醇醯基轉移酶。
17. 如請求項16之微生物，其中該微生物表現以下酵素： (a)    來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及 (b)   醯基-CoA硫酯酶，較佳係44-羥基苄醯基-CoA硫酯酶（4HBT），更佳係來自節桿菌屬物種的4HBT。
18. 如請求項16之微生物，其中該微生物表現以下酵素： (a)    來自菠菜、銀白楊、山黃麻、落花生、及／或安德森氏山豆麻的醯基-CoA氧化酶；及 (b)   醇醯基轉移酶，較佳係來自水果來源的醇醯基轉移酶，更佳係來自蘋果、甜瓜、或番茄來源的醇醯基轉移酶。
19. 如請求項14-18中之任一項之微生物，其中該微生物內源地表現該一或多種酵素或該微生物異源地表現該一或多種酵素，或該微生物表現內源及異源的酵素之組合。
20. 如請求項14-19中之任一項之微生物，其中該微生物選自野生型或重組微生物，例如細菌、古菌、酵母菌、真菌、藻類、或可用於發酵程序的各種各樣其他微生物之任何者，較佳其中該微生物係選自以下者的細菌：屬於以下屬的變形菌門的腸內細菌：艾氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬（ Pantoea）、克留氏菌屬、沙雷氏菌屬、伊文氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、摩根氏菌屬（ Morganella）、等等、屬於以下屬的所謂的棒狀桿菌群細菌：短桿菌屬、棒狀桿菌屬、或微桿菌屬、及屬於以下屬的細菌：脂環酸芽孢桿菌屬（ Alicyclobacillus）、芽孢桿菌屬、氫桿菌屬（ Hydrogenobacter）、甲烷球菌屬、醋酸桿菌屬、不動桿菌屬、農桿菌屬、固氮根瘤菌屬（ Axorhizobium）、固氮菌屬、無形體屬（ Anaplasma）、類桿菌屬、巴東體屬、博德氏桿菌屬、疏螺旋體屬、布氏桿菌屬、伯克氏菌屬、莢膜樣菌屬、彎曲桿菌屬、披衣菌屬、嗜衣原體屬（ Chlamydophila）、梭菌屬、柯克斯氏體屬、艾利希氏體屬、腸球菌屬、法蘭西斯氏菌屬（ Francisella）、細梭菌屬、加德納氏菌屬（ Gardnerella）、嗜血桿菌屬、螺旋桿菌屬、克雷伯氏菌屬（ Kelbsiella）、甲烷桿菌屬、微球菌屬、莫拉氏菌屬、分枝桿菌屬、黴漿菌屬、奈瑟氏球菌屬、巴氏桿菌屬、消化鏈球菌屬（ Peptostreptococcus）、卟啉單胞菌屬（ Porphyromonas）、普雷沃氏菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、立克次體屬、羅卡利馬氏體屬（ Rochalimaea）、羅氏菌屬（ Rothia）、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬（ Stenotrophomonas）、鏈球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬、沃爾巴克氏體屬（ Wolbachia）、耶氏桿菌屬。
21. 如請求項14-20中之任一項之微生物，其中該微生物經基因修改以增強甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產；及／或其中該微生物經藉由以下者基因修改：藉由競爭相同的受質及／或中間物來減低或排除催化甲基丙烯酸及／或其衍生物以外的化合物之合成的酵素之活性的修改、減低或排除代謝甲基丙烯酸或代謝甲基丙烯酸之生產中的中間物的酵素之活性的修改、及／或減低或排除移除甲基丙烯酸及／或其衍生物之生產中的中間物的其他細胞功能中涉及的蛋白質之活性的修改。
22. 一種生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法，其使用如請求項14-21中之任一項之微生物。
23. 一種發酵之方法，其包含在發酵培養基中培養一或多種如請求項14-21中之任一項之微生物以生產甲基丙烯酸及／或其衍生物。
24. 一種發酵培養基，其包含一或多種如請求項14-21中之任一項之微生物，視需要其中該培養基進一步包含甲基丙烯酸及／或其衍生物。
25. 一種生物反應器，其包含一或多種如請求項14-21中之任一項之微生物及／或如請求項24之發酵培養基。
26. 一種製備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯之聚合物或共聚物之方法，其包含以下步驟： (i)    根據請求項1-13或22中之任一項製備甲基丙烯酸及／或其衍生物； (ii)   視需要酯化(i)中製備的甲基丙烯酸以生產該甲基丙烯酸酯； (iii)  聚合(i)中製備的甲基丙烯酸及／或其衍生物及／或若存在時(ii)中製備的酯，視需要與一或多種共單體，以生產其聚合物或共聚物。
27. 如請求項14-21中之任一項之微生物、如請求項22之生產甲基丙烯酸及／或其衍生物之方法、如請求項23之發酵之方法、如請求項24之發酵培養基、或如請求項26之方法，其中該甲基丙烯酸之其衍生物係甲基丙烯酸酯，較佳係C1至C20烷基酯，更佳係C1至C12烷基酯，最佳係C1至C4烷基酯或C4至C12烷基酯，尤其係甲基丙烯酸丁酯，例如甲基丙烯酸正丁酯。
28. 一種聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、及聚甲基丙烯酸丁酯均聚物或共聚物，其係由如請求項26之方法形成。