UA127403C2 - Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти - Google Patents

Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти Download PDF

Info

Publication number
UA127403C2
UA127403C2 UAA201712600A UAA201712600A UA127403C2 UA 127403 C2 UA127403 C2 UA 127403C2 UA A201712600 A UAA201712600 A UA A201712600A UA A201712600 A UAA201712600 A UA A201712600A UA 127403 C2 UA127403 C2 UA 127403C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
coa
methacrylic acid
microorganism
methacrylyl
acyl
Prior art date
Application number
UAA201712600A
Other languages
English (en)
Inventor
Грехем Рональд Істхем
Грэхем Рональд Истхем
Гілл Стівенс
Гилл Стивенс
Ендрю Якометті
Эндрю Якометти
Original Assignee
Мітсубіші Кемікал Юкей Лімітед
Митсубиши Кемикал Юкей Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1508582.2A external-priority patent/GB201508582D0/en
Priority claimed from GBGB1517545.8A external-priority patent/GB201517545D0/en
Application filed by Мітсубіші Кемікал Юкей Лімітед, Митсубиши Кемикал Юкей Лимитед filed Critical Мітсубіші Кемікал Юкей Лімітед
Publication of UA127403C2 publication Critical patent/UA127403C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F120/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F120/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F120/04—Acids; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C08F120/06—Acrylic acid; Methacrylic acid; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F120/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F120/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F120/10—Esters
    • C08F120/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F120/14—Methyl esters, e.g. methyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03006—Acyl-CoA oxidase (1.3.3.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01084—Alcohol O-acetyltransferase (2.3.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02023—4-Hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (3.1.2.23)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу виробництва метакрилової кислоти та/або її похідних, який включає наступні стадії: (a) біологічного перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоА за рахунок дії оксидази; та (b) перетворення метакриліл-СоА в метакрилову кислоту та/або її похідні. Винахід також поширюється на мікроорганізми, пристосовані для проведення стадій способу.

Description

(Б) перетворення метакриліл-СоА в метакрилову кислоту та/або її похідні.
Винахід також поширюється на мікроорганізми, пристосовані для проведення стадій способу.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Представлений винахід стосується способу біологічного виробництва метакрилової кислоти та її похідних. Зокрема, спосіб стосується застосування конкретних ферментативних перетворень з утворенням метакрилової кислоти з ізобутирилу-СоА через метакриліл-СОА, та полімери або співполімери, які отримують з неї.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Акрилові кислоти та їх алкілові складні ефіри, зокрема, метакрилова кислота (МАА) та її метиловий складний ефір, метилметакрилат (ММА) представляють собою важливі мономери в хімічній промисловості. Їх головне застосування полягає у виробництві пластмас для різних застосувань. Найбільш важливим застосуванням для полімеризації є відливка, формування або екструдування поліметилметакрилату (РММА) для отримання високої оптичної прозорості пластмас. Крім того, використовують багато співполімери; важливі співполімери представляють собою співполімери метилметакрилату та етилметакрилату з а-метилстиролом, етилакрилатом та бутилакрилатом. Крім того, з використанням простої реакції переестерифікації, ММА може бути перетворений в інші складні ефіри, такі як бутилметакрилат, лаурилметакрилат, тощо.
На даний момент, ММА (та МАА) отримують, застосовуючи ряд хімічних процедур, одна з яких представляє собою успішний "Альфа-процес", за яким ММА одержують зі складного ефіру, метилпропіонату, шляхом безводної реакції з формальдегідом. В альфа-процесі, метилпропіонат отримують шляхом карбонілювання етилену. Дана етиленова сировина одержується з горючих корисних копалин. Останнім часом, стало бажаним також отримувати з джерела ресурсозберігаючої біомасної сировини для хімічної промисловості. Відповідно, переважним повинен бути альтернативний біомасний спосіб ММА замість використання альфа- процесу.
Таким чином, однією з цілей представленого винаходу є вирішення зазначеної вище проблеми, та забезпечення біологічного або частково біологічного способу виробництва метакрилової кислоти.
Неочікувано, автори представленого винаходу знайшли спосіб застосувати нову комбінацію субстрату ферментів, яка раніше не розглядалася для утворення метакрилової кислоти на промислово придатному рівні, тим самим, забезпечивши новий та практично здійснюваний на біологічній основі шлях до ключових мономерів, таких як ММА.
Відомо, що окиснення ізобутирилу-СОоА до метакриліл-СоА зустрічається в природі в шляху розкладанні валіну І, та в деяких клітинах спостерігаються ферменти, які здійснюють дане перетворення. В даних системах, перетворення, як правило, використовує фермент ацил-СоА дегідрогеназу, який вимагає відповідну систему переносу електрона до окиснення пари субстрату з відновленням убіхінону, який потім регенерується.
ММО201438216 описує спосіб одержання метакрилової кислоти з мікроорганізмів та перетворення метакриліл-СОА в складний ефір, використовуючи алкоголь-ацилтрансферази.
Документ показує невеликий ступінь перетворення 2-оксоіїзолулерінової кислоти в ізобутирил
СоА, та ізобутирилу-СоОА - в метакриліл-СоА. Крім того, обговорюється теоретичне отримання метакрилової кислоти з метакрилілу-СоА іп мімо, але дане отримання не є успішним.
Однак, в М/0201438216, тільки один приклад отримання іп мімо метакрилової кислоти використовує ацил-СоОА дегідрогенази, які походять з Кподососсив егуїпгороїї5, рекомбінантно експресовані в господарі такого ж самого роду; бактерії КПподососсив5. Інші приклади намагання гетерологічно експресувати аналогічні ацил-СоА дегідрогенази, відкриті в Рхеийдотопав5 аегидіпоза в іншому організмі господаря не дали метакрилової кислоти. Позитивна регуляція або експресія гетерологічної ацил-СоА дегідрогенази в організмі господаря є важкою для досягнення, та про яку ще не повідомлялося.
Таким чином, подальшою задачею представленого винаходу є забезпечити покращене виробництво метакрилової кислоти.
Не існує відомих метаболічних шляхів, в яких відбувається продукування метакрилової кислоти, або у вигляді продукту, або у вигляді поміжної сполуки. Ферменти ацил-СоА тіоестерази, як відомо, каталізують гідроліз структурно-споріднених субстратів, однак, дані ферменти, як правило, мають дуже вузьку субстратну специфічність, та, або не були досліджені щодо, або не каталізують гідроліз метакриліл-СоОА. Крім того, такі рідкісні сорти, які мають широку субстратну специфічність, швидше за все, представляють проблему в біологічній системі, такій як клітина-господар експресії, завдяки нецільовому гідролізу основних клітинних складних тіоефірів. В свою чергу, ніщо, як відомо, не каталізує гідроліз метакрилілу-СоА.
Відповідно, дані ферменти, таким чином, до сих пір не були продемонстровані як практично здійснювані для використання в промислових застосуваннях, які включають біологічне 60 виробництво метакрилової кислоти.
Таким чином наступною задачею представленого винаходу є вирішення зазначеної вище проблеми та забезпечення практично здійснюваного ферментативного перетворення метакрилілу-СОоА в метакрилову кислоту, яка може бути використана в промисловому процесі, та яка може використовуватися незалежно від будь-якого ферменту, який функціонує для перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоА.
ВИКЛАДЕННЯ СУТІ ВИНАХОДУ
Відповідно до першого аспекту представленого винаходу, передбаченим є спосіб виробництва метакрилової кислоти та/або її похідних, який включає наступні стадії: (а) Біологічне перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоА за рахунок дії оксидази; та (5) Перетворення метакрилілу-СоА в метакрилову кислоту та/або її похідні.
Відповідно до другого аспекту представленого винаходу, передбаченим є спосіб виробництва метакрилової кислоти, який включає наступні стадії: (а) Перетворення ізобутирилу-СоОА в метакриліл-СоА; та (Б) Біологічне перетворення метакрилілу-"СоА в метакрилову кислоту за рахунок дії тіоестерази, відповідно 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестерази (4НВТ), трансферази, синтетази, та/або фосфотрансацілази та кінази коротколанцюгової жирної кислоти.
Переважно, в способі за другим аспектом представленого винаходу метакриліл-СоА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії тіоестерази, більш переважно 4- гідроксибензоїл-СоОА тіоестерази (4НВТ), відповідно до ЕС групи 3.1,2,23. Найбільш переважно, метакриліл-СоОА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії ацил-СоА тіоестерази
АНВТ з Апйпгобасіег 5р. штаму 5).
Переважно, способи за винаходом передбачають додатковий біологічний шлях отримання ключової хімічної метакрилової кислоти та її відомих похідних, які знижують залежність промисловості від горючих корисних копалин та підвищують раціональне та екологічне природокористування.
Спосіб дозволяє здійснювати легке перетворення відновлюваної сировини в ізобутирил-СоА за рахунок мікробного ферментування, та спільна експресія ферментів, які каталізують стадії (а) та (Б), буде забезпечувати безпосередній спосіб мікробного ферментування до МАА.
Більш того, в способах використовуються ферменти для будь-якої стадії (а) або (б), які
Зо раніше не розглядались для виробництва метакрилової кислоти та не були знайдені в каскаді реакцій валіну, який зустрічається в природі. Зокрема, фермент на стадії (а) діє для перетворення ізобутирилу- СОА в метакриліл-СоА не потребуючи пов'язаної з ним системи переносу електронів, та ферменти на стадії (б) мають високу субстратну специфічність щодо метакрилілу-СоОА, щоб уникнути проблеми накопичення даної поміжної сполуки в організмах- господарях. Таким чином, будь-який із ферментів на стадії (а) або (5) може використовуватися самостійно для того, щоб покращити частково хімічні процедури щодо утворення метакрилової кислоти, або для того, щоб покращити біологічні способи утворення метакрилової кислоти.
Альтернативно, обидва ферменти стадії (а) та (Б) можуть використовуватися разом для того, щоб сформувати окремий самостійний біологічний спосіб одержання метакрилової кислоти, придатний для промислового рівня, та який є функціональним в гетерологічних організмах- господарях.
Ферменти
В контексті представленого винаходу "біологічно" означає використання біологічного каталізатора. Переважно біологічні каталізатори представляють собою ферменти, але можуть включати будь-яку каталітичну структуру, отриману з біологічного джерела.
В контексті представленого винаходу "хімічно" означає використання хімічних засобів, крім використання біологічного каталізатора, такого як фермент.
Стосовно першого аспекту, стадія (Б) може бути здійснена біологічно або хімічно, переважно біологічно.
Стосовно другого аспекту, стадія (а) може бути здійснена біологічно або хімічно, переважно біологічно.
Переважно, стадію (а) та стадію (Б) здійснюють ферментативно з використанням одного або декількох ферментів, при цьому ферменти діють як біологічні каталізатори.
Переважно оксидаза представляє собою оксидазу, яка діє на зв'язки СН-СН, за ЕС номером 1.3.х.х, більш переважно оксидазу, яка діє на зв'язки СН-СН, використовуючи кисень як акцептор електронів, за ЕС номером ЕС 1.3.3.х. Ще більш переважно, оксидаза представляє собою ацил-СоА оксидазу, відповідно за ЕС номером ЕС 1.3.3.6. Більш переважно ацил-СоА оксидазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: АСХ4 з Агарідорзіб5 ІПаїїапа, коротколанцюгової ацил-СоА оксидази з Агіпгобасіег пісойапає, пероксисомальної ацил-СоА 60 оксидази з Мідпа гадіаїа, ацил-СОоА оксидази з Сапаїда 5р. та ацил-СОоА оксидази 4 з Сапаїда ігорісаїє. Найбільш переважно, ацил-СоОА оксидаза представляє собою АСХ4 з Агабрідорвів
Іпаїїапа.
Альтернативно, ізобутирил-СоОА може бути перетворений в метакриліл-СоА за рахунок дії оксидоредуктази, відповідно за ЕС номером групи 1.Х.Х.Х. Переважно, оксидоредуктаза представляє собою оксидоредуктазу, яка діє на групу СН-СН донорів електронів, відповідно за
ЕС групою 1.3.Х.Х. Більш переважно, оксидоредуктаза, яка діє на групу СН-СН донорів, представляє собою АЮ залежну оксидоредуктазу, ще більш переважно оксидоредуктаза представляє собою СоА дегідрогеназу за групами ЕС 1.3.8.Х. Ще більш переважно, оксидоредуктаза представляє собою коротколанцюгову ацил-СоА дегідрогеназу, відповідно за
ЕС групою 1.3.8.1, ізовалерил-СоОА дегідрогеназу, відповідно за ЕС групою 1.3.8.4, ацил-СоА дегідрогеназу з 2-метил-розгалуженим ланцюгом, відповідно за ЕС групою 1.3.8.5 або ацил-СоА дегідрогеназу, відповідно за ЕС групою 1.3.8.-, таку як ізобутирил-СоА дегідрогеназу. Найбільш переважно оксидоредуктазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: ацил-СоА дегідрогеназу з коротким/розгалуженим ланцюгом з Рзейдотопа5 ршйда, ізобутирил-СоА дегідрогеназу з Ното зарієпв5, ізовалерил-СОА дегідрогеназу з Агарідорзів (аїїапа.
СоА-дегідрогеназні ферменти, як правило, вимагають наявності асоційованої системи переносу електронів щодо спареного окиснення субстрата з відновленням убіхінону, який потім регенерується. Така система переносу електронів складається з флавопротеїн, який переносить електрони (ЕТЕ), та убіхінонової оксидоредуктази флавопротеїн, який переносить електрони (ЕТЕОО). ЕТЕ повинен бути сумісним як з ацил-СоА дегідрогеназним ферментом, так і з ЕТЕОО. Відповідно, у варіантах здійснення, в яких використовується ацил-СоА дегідрогеназу, переважно використовується одна з наступних систем регенерації:
В одному варіанті здійснення, ізобутирил-СоА перетворюється в метакриліл-СоА, використовуючи мікроорганізм-господар, який містить ендогенну СоА дегідрогеназу, з активністю до ізобутирилу-СоА, та пов'язану з нею систему переносу електронів, таку як та, що у випадку, наприклад, Рзхейдотопавх ршиїіда.
В другому варіанті здійснення, ізобутирил-СоОА перетворюється в метакриліл-СОА в організмі--господарі за рахунок дії ферменту гетерологічної СоА дегідрогенази, який супроводжується протеїнами системи переносу електронів з того самого організму, що й гетерологічна СоА дегідрогеназа. Наприклад, СоА дегідрогеназа та компоненти системи переносу електронів з Ното зарієп5, Рзепдотопах ршїіда, Рагасосси5 аепйгійсапе, або з
Агарідорбзів ІНаїїапа, всі експресуються Е5спегіспіа соїї (або іншому організмі-господарі).
В третьому варіанті здійснення, ізобутирил-СоА перетворюється в метакриліл-СОА в організмі--господарі за рахунок дії ферменту гетерологічної СоА дегідрогенази, який супроводжується компонентами системи переносу електронів також з різних мікроорганізмів, при цьому дані компоненти є сумісними один з одним та з СОА дегідрогеназою. Наприклад, СоА дегідрогеназа з Ното заріеп5 є сумісною з флавопротеїном переносу електронів з Би5 5сгога, який, в свою чергу, є сумісним з флавопротетном переносу електронів убіхінону оксидоредуктази з КПподобрасіег 5рпаегоіїде5. Альтернативно, оскільки ЕТРЕ-убіхінон- оксидоредуктаза з А. іШйайапа має гарну гомологічність послідовності з ЕТЕ-убіхінон- оксидоредуктазою з К. 5рпаегоїде5, ізовалерил-СоА дегідрогеназу та ЕТЕ з А. Ійпаіапа можуть утворювати функціональну систему з ЕТЕ-убіхінон-оксидоредуктазою з К. 5рпаегоїде5 для окиснення ізобутирилу-СоОА. Нарешті, ЕТЕ та ЕТРЕ-убіхінон-оксидоредуктаза з Рагасоссив5 депігіїсапо, як передбачається, є сумісними з ізобутирил-СоА-дегідрогеназою з іншого джерела, такого як той, що з Н. зарієп5 або гомологів з різних організмів, завдяки подібності
ЕТЕ Р. аепійгітісап5 з людськими та свинячими ЕТЕ.
Переважно метакриліл-СоА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії тіоскладноефірної гідролаза (також відомої як тіоестераза), відповідно за ЕС групою 3.1,2.Х. Ще більш переважно фермент представляє собою ацил-СоА-тіоестеразу, відповідно за ЕС групою
БО 3.1,2,20, З-гідроксіззобутирил-СоА-гідролазу, відповідно за ЕС групою 3.1,2.4, АОР залежну ацил-СоА-тіоестеразу, відповідно за ЕС групою 3.1,2.18, 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестеразу, відповідно за ЕС групою 3.1,2,23, або тіоестеразу за ЕС групою 3.1,2.-, такі як, наприклад, саліцилоїл-СоА-тіоестераза. Більш переважно тіоестеразу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: 4НВТ з штам 5) Агіпгобасіег 5р., 4НВТ з Агіпгобасіег діобітоптів, 4НВТ з штаму СВ5-
ЗРзейдотопаз 5р., ЕпіН з Езспегіспіа соїї, УсіА з Е.соїї, ХсіА з Наеторпйи5 іпїчеп7ає, ТезА з
ЕзсПегісніа соїї або Те5В з ЕзсПегіспіа соїї, Есої з Мусобрасіегішт їшбегсціо5і5. Ще більш переважно, тіоестераза представляє собою ацил-СоА-тіоестеразу. Ще більш переважно, тіоестераза представляє собою 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестеразу, відповідно за ЕС групою 3.1,2,23. Найбільш переважно ацил-СоА-тіоестераза представляє собою 4НВТ зі штаму 5) 60 Ай Пгобасівг 5р.
Таким чином, в одному варіанті здійснення, ізобутирил-СОА може бути перетворений в метакриліл-СоА за рахунок дії оксидази, та метакриліл-«СОА може бути перетворений в метакрилову кислоту за рахунок дії 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази, відповідно за ЕС групою 3.1,2,23, більш переважно ацил-СоА-тіоестерази 4НВТ зі штаму 5) Агпіпгорасіег 5р.
В одному варіанті здійснення, ізобутирил-СоА може бути перетворений в метакриліл-СоА за рахунок дії ацил-СоА-оксидази, відповідно за ЕС номером групи 1.3.3.6, більш переважно АСХА з Агарідорзі5 Іпайійапа, та метакриліл-СОА може бути перетворений в метакрилову кислоту за рахунок дії 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази, відповідно за ЕС групою 3.1,2,23, більш переважно ацил-СоА тіоестераза 4НВТ з штаму 5) Агіпгобасіег 5р.
Альтернативно, метакриліл-СоА може бути перетворений в метакрилову кислоту за рахунок дії одного з наступних ферментативних шляхів:
В одному варіанті здійснення, метакриліл-СоОА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії трансферази, відповідно за ЕС номером групи 2.Х.Х.Х. Переважно, трансфераза представляє собою трансферазу, яка переносить групи, які містять сірку, відповідно за ЕС номером групи 2.8.Х.Х. Більш переважно, трансфераза представляє собою СоА-трансферазу, відповідно за ЕС номером групи 2.8.3.Х. ще більш переважно, трансфераза представляє собою ацетат-залежну ацил-СоА-трансферазу або ап ацетоацетат-залежну бутират-СоА-трансферазу, відповідно за ЕС номерами груп 2.8.3.8 та 2.8.3.9, відповідно. Найбільш переважно трансферазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: бутирил-СоА:ацетоацетат-СоА трансферази з Сіовігідішт 5р. 584, бутирил-СоАсацетоацетат СоА трансферази з Сіовігідійт зіісКІапаїйї, бутират:ацетоацетат СоА-трансферази з Сіовігідічт асеоршуїйсит АТСС824, ацетат- ко-фермента А трансферази удіЕ з Е5сПегіспіа соїї.
Як овикористовється в даному документі, терміни лігаза, синтетаза, та синтаза використовуються взаємозамінно, як це розуміється в даній галузі.
В другому варіанті здійснення, метакриліл-СоОА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії синтетази, яка діє у зворотному напрямку, відповідно за ЕС номером групи 6.Х.Х.Х.
Переважно синтетаза представляє собою синтетазу, яка утворює зв'язок вуглець-сірка, відповідно за ЕС номером групи 6,2.Х.Х. Більш переважно синтетаза представляє собою кислотно-тіольну лігазу, відповідно за ЕС номером групи 6,2.1.Х. Найбільш переважно,
Зо синтетаза представляє собою оборотну АОР або СОР -утворюючу ацил-СоА-лігазу, таку як СОР -утворююча сукцинат-СоА-синтетаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1.4, АОР -утворююча сукцинат-СоА-синтетаза, за ЕС групою 6,2.1.5, АОР -утворююча глутарат-СоА-синтетаза, за ЕС 6б,2.1.6,0 АОР -утворююча малат-СоА-синтетаза, за ЕС 6,2.1.9, БОР -утворююча карбонова кислота-СодА-синтетаза, за ЕС 6,2.1.10, АОР -утворююча ацетат-СодА-синтетаза, за ЕС 6,2.1.13 або АОР -утворююча цитрат-СоА-синтетаза, за ЕС 6,2.1.18.
В третьому варіанті здійснення, метакриліл-СоА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок комбінованої дії фосфотрансацілази, подібної до фосфотрансацетилази або фосфотрансбутирилази за ЕС номером групи ЕС 2.Х.Х.Х, більш переважно за ЕС номером групи ЕС 2.3.Х.Х, ще більш переважно ЕС 2.3.1.Х, найбільш переважно за ЕС номером групи 2.3.1.8 або 2.3.1.19, та кінази коротколанцюгової жирної кислоти, за ЕС номером групи ЕС 2.Х.Х.Х, переважно ЕС 2.7.Х.Х, більш переважно ЕС 2.7,2.Х, найбільш переважно ацетат-кінази за ЕС 2.7,2.1, форміат-кінази за ЕС 2.7,2.6, бутират-кінази за ЕС 2.7,2.7, кінази жирної кислоти з розгалуженим ланцюгом за ЕС 2.7,2.14 або пропіонат-кінази за ЕС 2.7,2.15. Переважно фосфотрансацилаза представляє собою метакриліл-СоА-фосфотрансацілазу. Переважно кіназа коротколанцюгової жирної кислоти представляє собою оборотну кіназу метакрилової кислоти. Найбільш переважно фосфотрансацилазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: фосфотрансбутирилази з Сіозігідічт асе(обшуїїсит АТОС824. Найбільш переважно кіназу коротколанцюгової жирної кислоти вибирають з будь-якого з наступних ферментів: кінази жирної кислоти з розгалуженим ланцюгом з Зрігоспее МА-2, бутират-кінази з Тпептоїода тагіййта, бутират кіназа з Сіовігідічшт Бшїугісит.
В контексті представленого винаходу, термін "їх похідні" означає будь-яку хімічну речовину, яка є безпосередньо пов'язаною з або яка містить або метакриліл-СоА, або метакрилову кислоту, такі як їх складні ефіри, їх ацилгалогеніди, їх ангідриди, їх аміди, їх нітрили, їх лактони, їх солі, їх комплекси, їх ізомери, олігомери або полімери та додаткові будь-які замінені їх варіанти, більш переважно, це означає складні ефіри або їхні солі.
Переважно похідні метакрилової кислоти представляють собою складні ефіри метакрилової кислоти. Переважно складні ефіри метакрилової кислоти представляють собою алкілметакрилати, більш переважно нижчі алкіл-(С1-Сго)-метакрилати, ще більш переважно, С1-
Сіг2-алкілметакрилати, зокрема С:і-С4 алкілові складні ефіри, такі як метил-, етил- або 60 бутилметакрилати, або С.4-Сі2 алкілові складні ефіри. Найбільш переважно, складні ефіри метакрилової кислоти представляють собою бутилметакрилати, наприклад, н-бутилметакрилат.
Складні ефіри метакрилової кислоти можуть бути біологічно утворені з метакрилілу-СоА, переважно за рахунок дії ферменту трансферази за ЕС номером групи ЕС2.Х.Х.Х, більш переважно ацилтрансферази за ЕС номером групи 2.3.Х.Х, ще більш переважно алкоголь ацилтрансфераза за ЕС номером групи ЕС2.3.1.684.
Переважно, коли метакрилові складні ефіри біологічно утворюються з метакрилілу-СоА, метакриліл-СоОА біологічно утворюється з ізобутирилу-СоА за рахунок дії оксидази.
Таким чином, відповідно до третього аспекту представленого винаходу передбаченим є спосіб виробництва складного ефіру метакрилової кислоти, який включає наступні стадії: (а) біологічне перетворення ізобутирил-СоА в метакриліл-СоА за рахунок дії оксидази; та (Б) перетворення метакриліл-СОА в складний ефір метакрилової кислоти за рахунок дії алкоголь ацилтрансферази.
Переважно оксидаза з третього аспекту представляє собою оксидазу, яка діє на зв'язки СІН-
СН, за ЕС номерами 1.3.х.х, більш переважно оксидазу, яка діє на зв'язки СН-СН, використовуючи кисень як акцептор електронів, за ЕС номерами ЕС 1.3.3.х. Ще більш переважно, оксидаза представляє собою ацил-СоА оксидазу, відповідно за ЕС номерами ЕС 1.3.3.6. Більш переважно ацил-СоА оксидазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів:
АСХ4 з Агарідорзіб5 (Паійапа, коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Агіпгобасіег пісойапає, пероксисомальної ацил-СоА оксидази з Мідпа гадіада, ацил-СоА оксидази з Сапаїйда 5р. та ацил-
СоА оксидази 4 з Сападіда ігорісаї5. Найбільш переважно ацил-СоА оксидаза представляє собою АСХА з Агарідорзів ІПаїїапа.
Переважно, складні ефіри метакрилової кислоти з третього аспекту представляють собою алкілметакрилати, більш переважно нижчі алкіл (С1-020) метакрилати, ще більш переважно,
С1-Сі2-алкілметакрилати, особливо С.1-Са-алкілові складні ефіри, такі як метил-, етил- або бутилметакрилати, або С.4-Сі2-алкілові складні ефіри. Найбільш переважно, складні ефіри метакрилової кислоти представляють собою бутилметакрилати, наприклад, н-бутилметакрилат.
Відповідно, алкоголь ацилтрансфераза діє в присутності спирту або фенолу, переважно лінійного або розгалуженого Сі-о назаміщеного спирту, арилалкілспирту або фенол, та конкретно переважно Сі-в- або С1-4--алкілового спирту, такого як метанол, етанол, н-пропанол,
Зо ізопропанол, н-бутанол, ізобутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, н-пентиловий спирт, ізопентиловий спирт, трет-пентиловий спирт, н-гексиловий спирт, ізогексиловий спирт, 2- гексиловий спирт, диметилбутиловий спирт, етилбутиловий спирт, гептиловий спирт, октиловий спирт, 2-етилгексиловий спирт; бензиловий спирт або фенол. Переважно, алкоголь ацилтрансфераза діє в присутності спирту, більш переважно С1-С12 спирту, більш переважно б1-б4 або С4-С12 спирту, ще більш переважно в присутності бутанолу, такого як н-бутанол, ізобутанол, втор-бутанол або трет-бутанол. Найбільш переважно, алкоголь ацилтрансфераза діє в присутності н-бутанолу.
Під терміном спирт в даному документі мають на увазі вид, який має гідроксильну групу (-
ОН групою) та який є здатним утворювати складноефірну групу з метакрилатом. Переважно, спирт може представляти собою С1-Сго алканол, більш переважно С1-С12 алканол, ще більш переважно Сі-С4 алканол або С4-С12 алканол, найбільш переважно Са алканол.
Переважно алкоголь ацилтрансферазу отримують з рослинного походження, більш переважно рослини, яка належить до будь-якого порядку, вибраного з групи, що складається з 2іпдірегаІіе5, Козаїе5, Егісаіез, СисигрйаІе5, Вгаззісаїеє та І ацйгаіе5є; ще більш переважно рослини, яка належить до будь-якої родини, вибраної з групи, яка складається з Мизасеає,
Козасеає, Егісасеає, Асііпідіасеає, Сисигрійасеає, Сагісасеає та І ашгасеае; ще більш переважно рослини, яка належить до будь-якого роду, вибраного з групи, яка складається з Миза, Егадагіа,
Маїн5, Ргипих5, Руги5, Массіпішт, Асіїіпідіа, Сиситіє, Сагіса та Регхзеа; ще більш переважно рослини, яка представляє собою будь-яку одну, вибрану з групи, яка складається з з банану, полуниці, яблука, японської сливи, груші звичайної, чорниці, ківі, дині, папайї та авокадо.
Найбільш переважно, алкоголь ацилтрансфераза отримують з фруктового походження, такого як яблуневе, динне або томатне авокадо, переважно яблуневе походження.
Використовуваними можуть бути біологічна тканина або її оброблений продукт, наприклад, фрукти, листя, пелюстки, стебло, насіння, фруктову шкіру, м'ясистий мезокарпій, тощо, в яких є присутніми алкоголь ацилтрансфераза. Альтернативно, використовуваними можуть бути неочищену ферментну рідину, екстраговану з даних біологічних тканин, очищений фермент, або подібне. Альтернативно, ген алкоголь ацилтрансферази може бути виділений та введений в мікроорганізм-господар для експресії в ній.
Застосування алкоголь ацилтрансферази для перетворення метакриліл-СОА в складні бо ефіри метакрилової кислоти повністю описується в М/О2014/038214, розкриття якого є включеним в даний документ у вигляді посилання, зокрема гени алкоголь ацилтрансферази та їх послідовності, та векторні плазміди які містять зазначені послідовності.
Подальші стадії процесу
Необов'язково спосіб першого або другого аспектів представленого винаходу може додатково включати стадію (с) перетворення будь-якої метакрилової кислоти, утвореної на стадії (Б) в складний ефір метакрилової кислоти.
Переважно складні ефіри метакрилової кислоти представляють собою алкілметакрилати, більш переважно нижчі алкіл-(С1-Сго)-метакрилати, більш переважно С1-С12-алкілметакрилати, ще більш переважно С1-С4- або С4-С12-алкілметакрилати. Найбільш переважно, складні ефіри метакрилової кислоти представляють собою бутилметакрилат.
Складні ефіри метакрилової кислоти, утворені на стадії (с), можуть бути сформовані біологічно або хімічно, переважно вони утворюються біологічно.
Необов'язково, стадія (с) може бути здійснена хімічно шляхом реакції естерифікації з відповідним спиртом. Умови реакції, за яких здійснюється естерифікація, можуть значно варіюватис. Реакція протікає дуже повільно при кімнатній температурі, але досить швидко при підвищених температурах. Як правило, один з реагентів використовується в стехіометричному надлишку для того, щоб керувати реакцією. Інший реагент далі називають лімітуючим реагентом. Приблизно 99 95 лімітуючого реагенту, наприклад, кислот, спиртів або поліолів, можуть бути перетворені в складний ефір в межах декількох годин. Лімітуючі реагенти, як правило, представляють собою реагенти, які є присутніми в не стехіометричному надлишку, наприклад, лімітуючі реагенти, які використовуються для отримання поліольних складних ефірів, представляють собою поліоли.
Оскільки естерифікація спирту та органічної кислоти є зворотною реакцією, реакція естерифікації звичайно не доходить до завершення. Проте можна досягти перетворення понад 99 9565, видаляючи принаймні один з продуктів естерифікації, як правило, води. Якщо один із продуктів кипить з більш низькій температурою, ніж інший продукт, та ніж реактиви, це видалення, як правило, досягається дистиляцією. Відомими в даній галузі є різні способи дистиляції для видалення утвореної води з реакційної зони. Один із способів видалення води включає здійснення реакції у рідкому середовищі, яке може утворювати азеотроп, який має
Зо температуру кипіння, нижчу, ніж у будь-якого або кожного компонента реакції. Якщо реагенти та отриманий в результаті складний ефір мають температуру кипіння вище 100" при атмосферному тиску, то температура реакції може просто регулюватись для того, щоб видалити воду, та для цього не потрібне ніяке рідке середовище, здатне утворювати азеотроп з водою. Крім того, для сприяння дистиляції води з реакційної суміші може використовуватися азеотропоутворювач. Інертні матеріали, такі як циклогексан, гексан, бензол, толуол або ксилол, можуть використовуватися як азеотропоутворювач у виробництві складних ефірів. Крім того, реагент, який має більш низьку температуру кипіння, також може використовуватися як азеотропоутворювач. В цьому останньому випадку реагент, який використовують як азеотропоутворювач, як правило, завантажується в реакційну суміш в надлишку по відношенню до стехіометричних клькостей, необхідних для реакції. Способи естерифікації, включаючи ті, які використовують видалення води, можуть бути здійснені в серійному або безперервному режимі експлуатації. Різні способи естерифікації є розкритими в Моїште 9" Ше Кік-ОїШтег
Епсусіораєдіа ої Спетіса! Тесппоїоду, Бош Еайіоп (1994), рр. 762-768, повний об'єм якої є таким чином включеним у вигляді посилання.
Стандартна процедура серійної естерифікації включає завантаження всіх реагентів у реактор на початку реакційного циклу. В способах каталітичної естерифікації, каталізатор, як правило, додають до реакційної суміші після того як партія досягає заданої температури.
Реакційну суміш потім можуть нагрівати далі. Температура реакційної суміші зростає доки не досягається температура кипіння реакційної суміші, при якій азеотропоутворювач, якщо використовується, та водний співпродукт викіпають з реакційної суміші. Як правило, верхні пари конденсуються, вода відокремлюється від азеотропоутворювача, та азеотропоутворювач повертається в цикл в реакційну ємність. Температуру реакції, та, таким чином, й швидкість реакції, обмежується температурою кипіння реакційної суміші. Коли реагент з більш низькою температурою кипіння також використовується як азеотропоутворювач, його концентрація поступово зменшується, коли відбувається реакція. Крім того, під час реакції зменшуються концентрації реагентів, що негативно впливає на швидкість реакції. Таким чином, температура реакції, та, таким чином, константа швидкості реакції, зростає, коли відбувається реакція, незалежно від того, чи використовується азеотропоутворювач чи ні, особливо, якщо споживання тепла продовжується під час проходження реакції. бо Переважно стадію (с) проводять біологічно за рахунок дії фермента естерази або гідролазамй, який діє по відношенню до складноефірного зв'язку за ЕС номером групи ЕС 3.1.х.х., більш переважно, ферменти знаходяться за.їЕС 3.1.1.Х та представляють собою ферменти гідролазного класу, які беруть участь в каталізі розщеплення та утворення складноефірних зв'язків. Останній огляд мікробних естераз представлений в
Іпт.У.Сит.Містобріо!.Арр.5сі (2013) 2/7): 135-146.
Переважно спосіб додатково включає одну або декілька додаткових стадій виробництва ізобутирил-СоОА, більш переважно виробництва ізобутирилу-СоОоА з 2-кетоізовалеріанової кислоти, та/або з ізомасляної кислоти.
В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає одну або декілька додаткових стадій виробництва ізобутирилу-СоА з 2-кетоіїзовалеріанової кислоти, де одна або декілька додаткових стадій є будь-якою з наступних:
Переважно спосіб додатково включає стадію перетворення 2-кетоізовалеріанової кислоти в ізобутирил-СоА. Більш переважно 2-кетоіїзовалеріанова кислота перетворюється в ізобутирил-
СоА за допомогою ферментативного комплексу дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом, який складається З компонента альфа-субодиниці, компонента ліпоамідацилтрансферази та компонента ліпоаміддегідрогенази. Найбільш переважно, дегідрогеназу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом (ВСКО) з Р. ршіда, ВСКО з ВасшШив зибБійб, ВСКО з Р. аєшигидіпоза,
ВСКО з А. Ійайііапа, ВСКО з зігеріотусез соеїїсоЇог та ВСКО з Тпептив5 ШепторпйЙив5.
Альтернативно, перетворення 2-кетоїзовалеріанової кислоти в ізобутирил-СоА може каталізуватися ферментом оксидоредуктази, відповідно за ЕС групою 1.Х.Х.Х, переважно оксидоредуктазою, яка діє на зв'язки альдегідної або оксо групи донорів, відповідно за ЕС групою 1,2.Х.Х, більш переважно ферментом оксидоредуктази, який діє на зв'язки альдегідної або оксо групи донорів, використовуючи залізо-сірчаний протеїн, як акцептор електронів, відповідно за ЕС групою 1,2.7.Х, найбільш переважно 2-кетоізовалерат-ферредоксинредуктаза (відома також як кетовалін-ферредоксиноксидоредуктази), відповідно за ЕС номером групи 1,2.7.7, яка представляє собою етрамер, який складається з альфа-, бета-, гамма- та дельта- субодиниць. Приклади таких ферментів включають 2-кетоіїзовалерат-ферредоксинредуктазу з
Ругососсивз Тшгіовів; 2-кетоїзовалерат-ферредоксинредуктазу з Ругососсив 5р.; 2-кетоіїзовалерат-
Зо ферредоксинредуктазу з ТПегптососси5 зр; 2-кетоїзовалерат-ферредоксинредуктазу з
Тпептососсиз ІШогаїїв; 2-кетоїзовалерат-ферредоксинредуктазу з Тпептососсив5 ргоїспдиз та 2- кетоїзовалерат-ферредоксинредуктазу з Меїпапобасіегіит (пеппоашоїгорпісит.
В другому варіанті здійснення, спосіб додатково включає одну або декілька додаткових стадій виробництва ізобутирил-СоА з ізомасляної кислоти, одну або декілька додаткових стадій, які представляють собою будь-яку з наступних:
Переважно спосіб додатково включає стадію перетворення ізомасляної кислоти в ізобутирил-СоА.
Необов'язково, ізомасляна кислота перетворюється в ізобутирил-СоОА за рахунок дії фермента лігази, відповідно за ЕС номером групи 6.Х.Х.Х, переважно лігази, яка утворює зв'язок вуглець-сірка за ЕС групою 6,2.Х.Х, більш переважно лігази, яка утворює кислота-тіол за
ЕС групою 6,2.1.Х, більш переважно СОР -утворюючої, АЮР --утворюючої або АМР -утворюючої лігази, такої як АМР -утворююча ацетат-СоА лігаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1.1, бутират-
СоА лігаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1,2, карбонова кислота-СоА лігаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1.10, АЮР-утворююча ацетат-СоА лігаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1.13, пропіонат-СоА лігаза, відповідно за ЕС групою 6,2.1.17 або кислотно-тіольна лігаза в ЕС групі 6б,2.1.-. Найбільш переважно лігазу вибирають з будь-якого з наступного фермента: Ас5А з
Рзейидотопа5 спіогогарпіх, бутирил-СоА осинтетази з Раесіотусе5 магіоїї, бутирил-СоА синтетази з мітохондрій бичачого серця.
В третьому варіанті здійснення, спосіб додатково включає одну або декілька додаткових стадій виробництва ізобутирилу-СоА з ізобутирату, одну або декілька додаткових стадій, яка є будь-якою з наступних:
Переважно спосіб додатково включає стадію перетворення ізобутирату в ізобутирил- фосфат, та стадію перетворення ізобутирил-фосфату в ізобутирил-СоА.
Переважно ізобутират перетворюється в ізобутирил-фосфат за допомогою ферменту кінази, відповідно за ЕС номером групи ЕС 2.Х.Х.Х, переважно за ЕС 2.7.Х.Х, більш переважно за ЕС номером групи ЕС 2.7,2.Х, найбільш переважно ацетат-кінази, відповідно за ЕС групою 2.7,2.1, форміат-кінази за ЕС 2.7,2.6, бутират-кінази за ЕС 2.7,2.7, кінази жирної кислоти з розгалуженим ланцюгом за ЕС 2.7,2.14 або пропіонат-кінази за ЕС 2.7,2.15.Найбільш переважно кіназу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: кінази жирної кислоти з 60 розгалуженим ланцюгом з 5рігоспеїе МА-2, бутират-кінази з С. бшутісит.
Переважно ізобутирил-фосфат перетворюється в ізобутирил-СоА за рахунок дії фермента трансферази, за ЕС номером групи 2.Х.Х.Х, більш переважно за рахунок дії адилтрансферази за ЕС номером групи 2.3.Х.Х, ще більш переважно за рахунок дії ацилтрансферази, яка переносить групи інші, ніж аміно-ацил групи за ЕС номером групи 2.3.1.Х. Ще більш переважно фосфат ацетилтрансфераза або фосфат-бутирилтрансфераза, за ЕС номером груп 2.3.1.8 та 2.3.1.19, відповідно. Більш переважно трансфераза представляє собою фосфат- бутирилтрансферазу з Сіозігтіаішт асебшуїйсит АТОС824 або фосфат-ацетилтрансферазу з
Васійи5 зибійв, Согупебасієепйцт аішатіснит АТСС13032, ТНептоїода тата та Сіовіпаійт
Кінуметі. Інші джерела даних ферментів включають інші анаеробні бактерії, зокрема видів
Сіовігідіит, таких як Сіовілаішт равзівшіапит або Сіовзігаїшт Беї|егіпекії.
Найбільш переважно спосіб додатково включає стадію отримання ізобутирил-СОоА з ізомасляної кислоти за рахунок дії фермента синтетази, переважно ізобутирил-СоА синтетази, найбільш переважно ізобутирил-СоА синтетази (Асз5А) з Р. спіогарйпі5 В23.
Необов'язково, будь-які з наступних стадій способу як описано в даному документі вище стосовно першого, та/або другого, та/або третього варіантів здійснення можуть бути поєднаними.
Мікроорганізми
Ферменти зазначеного вище способу можуть міститися в одному або декількох мікроорганізмі(ах) або бути присутніми без мікроорганізму, наприклад, у вигляді безклітинного екстракту або очищеного ферменту в реакційній ємності або прикріпленими на колонці.
Переважно біологічні перетворення за способом здійснюють в одному або декількох мікроорганізм(ах)-господарі(ях). Більш переважно один або декілька ферментів для здійснення біологічних перетворень містяться в одному або декількох мікроорганізмі(ах).
Переважно один або декілька мікроорганізм(ів) експресують один або декілька ферментів, необхідних для того, щоб каталізувати відповідну(ї) стадію(ї). Більш переважно, відповідна) стадія(ї) та будь-якого наступні ферментативні стадії здійснюють іп мімо, в одному або декількох мікроорганізміс(ах).
Відповідно до четвертого аспекту представленого винаходу, передбаченим є мікроорганізм для застосування в отриманні метакрилової кислоти та/або її похідних відповідно до способу за
Зо будь-яким з першого, другого або третього аспектів.
Один або декілька мікроорганізм(ів) можуть експресувати, як правило, один або декілька ферментів, або можуть бути генетично сконструйовані таким чином, щоб експресувати один або декілька ферментів, або можуть експресувати комбінацію як немутантного типу, так і генетично сконструйованих ферментів. Такий генетично сконструйований організм може бути описаний як рекомбінантний організм.
Один або декілька мікроорганізмів можуть експресувати один або декілька ферментів ендогенно або гетерологічно, або комбінацію ендогенних та гетерологічних ферментів.
В контексті представленого винаходу, термін "рекомбінантний організм" означає генетично модифікований або сконструйований організм, який містить генетичний матеріал який був штучно сконструйований та введений в організм. Генетичний матеріал може містити ендогенні або гетерологічні нуклеїнові кислоти, які можуть бути або не можуть бути додатково генетично модифікованими.
В контексті представленого винаходу, термін "ендогенний" означає отримання з одного і того ж виду організму.
В контексті представленого винаходу, термін "гетерологічний" означає отримання з різних видів організму.
В контексті представленого винаходу, термін "пристосований", коли використовується щодо мікроорганізму, означає генетично модифікований або сконструйований організм, як визначено вище, або мутантний штам організму, який, наприклад, був вибраний на основі того, що він експресує, як правило, один або декілька ферментів.
Мікроорганізм(и) для застосування в будь-якому із зазначених вище способів, генетично сконструйовані або модифіковані, як описано вище, можуть бути вибрані з немутантного типу, який зазвичай зустрічається в природі, або рекомбінантного типу, який зазвичай не зустрічається в природі, мікроорганізма(ів), наприклад, бактерій, архей, дріжджів, грибків, водоростей або будь-якого різновиду іншого(их) мікроорганізму(ів), які застосовуються до ферментативних способів.
Таким чином, відповідно до п'ятого аспекту представленого винаходу передбаченим є рекомбінантний мікроорганізм для застосування в способі виробництва метакрилової кислоти, при цьому мікроорганізм є пристосованим для проведення наступних стадій: бо (а) Біологічного перетворення ізобутирилу-СоОА в метакриліл-СоА за рахунок експресування оксидази; та (Б) Біологічного перетворення метакрилілу-СОоА в метакрилову кислоту; де рекомбінантний мікроорганізм представляє собою Ез5сПегісніа соїї.
Відповідно до шостого аспекту представленого винаходу передбаченим є мікроорганізм, для
Б застосування в способі виробництва метакрилової кислоти, при цьому мікроорганізм є модифікованим однією або декількома гетерологічними нуклеїновими кислотами для проведення наступних стадій: (а) біологічного перетворення ізобутирилу-СоОА в метакриліл-СоА за рахунок експресування оксидази; та (5) біологічного перетворення метакрилілу-СОА в метакрилову кислоту.
Відповідно до сьомого аспекту представленого винаходу передбаченим є мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) Біологічного перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоА за рахунок експресування оксидази; та (5) Біологічного перетворення метакрилілу-СОА в метакрилову кислоту та/або її похідні.
Відповідно до восьмого аспекту представленого винаходу передбаченим є мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) Біологічного перетворення ізобутирилу-СоОА в метакриліл-СоА; та (Б) Біологічного перетворення метакрилілу-"СоА в метакрилову кислоту за рахунок експресування тіоестерази, зокрема 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестерази (4НВТ), трансферази, синтетази, та/або фосфотрансацилази та кінази коротколанцюгової жирної кислоти.
Відповідно до наступного аспекту представленого винаходу передбаченим є мікроорганізм, пристосований для того, щоб перетворювати метакриліл-СоА в метакрилову кислоту за рахунок експресування тіоестерази, зокрема 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестерази (4НВТ), трансферази, синтетази, та/або фосфотрансацилази та кіназа коротколанцюгової жирної кислоти.
Відповідно до ще наступного аспекту представленого винаходу, передбаченим є мікроорганізм, модифікований однією або декількома рекомбінантними нуклеїновими кислотами, які кодують один або декілька ферментів, які перетворюють метакриліл-СоА в метакрилову кислоту.
Відповідно до ще наступного аспекту представленого винаходу, передбаченим є мікроорганізм, модифікований однією або декількома рекомбінантними нуклеїновими кислотами, які кодують один або декілька ферментів, які перетворюють метакриліл-СоА в складні ефіри метакрилової кислоти.
Відповідно до ще наступного аспекту представленого винаходу, передбаченим є спосіб отримання метакрилової кислоти, використовуючи один або декілька ферментіів) відповідно до наступних аспектів.
Відповідно до ще наступного аспекту представленого винаходу, передбаченим є спосіб отримання складних ефірів метакрилової кислоти, використовуючи один або декілька ферментіів) відповідно до наступних аспектів.
Подальші переважні ознаки способу за першим, другим або третім аспектами можуть бути поєднаними в будь-яку комбінацію з мікроорганізмом за четвертим, п'ятим, шостим, сьомим, восьмим або наступними аспектами, визначеними в даному документі вище.
В одному варіанті здійснення мікроорганізм(и) експресує(ють) щонайменше наступні ферменти: (а) () ацил-СоОА оксидаза; та/або (ії) СоА дегідрогеназа; та необов'язково одна або декілька з: (5) () ацил-СоА тіоестерази, зокрема, 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестераза (4НВТ); та/або (ї) ацил-СоА трансфераза; та/або (ії) ацил-СоОА синтетаза; та/або (м) фосфотрансацилаза та кіназа коротколанцюгової жирної кислоти; та необов'язково (м) алкоголь ацилтрансфераза.
В одному варіанті здійснення, мікроорганізм(и) експресує(ють), щонайменше, наступні ферменти: (а) () ацил-СоОА оксидаза; та необов'язково один або декілька з: (5) () ацил-СоА тіоестераза; та/або (ї) ацил-СоА трансфераза; та/або (ії) ацил-СоОА синтетаза; та/або (м) фосфотрансацилаза та кіназа коротколанцюгової жирної кислоти; та необов'язково (у) алкоголь ацилтрансфераза. бо В одному варіанті здійснення четвертого, п'ятого або восьмого аспектів, мікроорганізм(и)
експресує(ють), щонайменше, наступні ферменти: (а) () ацил-СоА тіоестераза, зокрема, 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестераза (4НВТ); та/або (ї) ацил-СоА трансфераза; та/або (ії) ацил-СоОА синтетаза; та/або (м) фосфотрансацилаза та кіназа коротколанцюгової жирної кислоти; та необов'язково одна або декілька з: (Б) (її ацил-СоОА оксидази; та/або (ї) ацил-СоА дегідрогенази; та додатково необов'язково (с) () алкоголь ацилтрансферази.
Переважно, коли присутня, СоА дегідрогеназа супроводжується комплементарною системою переносу електронів.
В переважному варіанті здійснення, мікроорганізм(и) експресують щонайменше один з наступних ферментів: (а) ацил-СоОА оксидаза, така як АСХА; та (р) ацил-СоА тіоестераза, така як 4НВТ.
В більш переважному варіанті здійснення, мікроорганізм(и) експресують, щонайменше, один з наступних ферментів: (а) АСХА, відповідно з А. ІНаїіапа; та (Б) 4НВТ, відповідно з АпПгобасіег 5р.
В деяких варіантах здійснення, мікроорганізм є пристосованим для проведення наступних стадій: (а) біологічного перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоА за рахунок експресування ацил-СоА оксидази; та (Б) біологічного перетворення метакриліл-«СоОА в С1-С20 складний ефір метакрилової кислоти, зокрема, С1-С12 складний ефір метакрилової кислоти, такий як С1-С4 або Сб4-С12 складний ефір метакрилової кислоти за рахунок експресування алкоголь ацилтрансферази.
Переважно, складний ефір метакрилової кислоти представляє собою С1-С20 складний ефір метакрилової кислоти, більш переважно С1-С12 складний ефір метакрилової кислоти, ще більш переважно С1-С4 або С4-С12 складний ефір метакрилової кислоти, найбільш переважно
Зо бутилметакрилат.
В даних варіантах здійснення, мікроорганізм може представляти собою ЕзоспПегіспіа соїїЇ, та/або ацил-СоА оксидаза представляє собою АСХА з Агарідорвзі5 ІПаїапа, та/або алкоголь ацилтрансфераза отримують з рослинного походження, як представлено в даному документі, наприклад фрукту, такого як яблуко, та/або мікроорганізм представляє собою рекомбінантний мікроорганізм. Переважно мікроорганізм може представляти собою ЕзспПегіспіа сої, адил-СоА оксидаза може представляти собою АСХА з Агабрідорзі5 (Шаїїапа, алкоголь ацилтрансфераза можуть отримувати з яблучного, динного або помідорного походження, та мікроорганізм може представляти собою рекомбінантний організм.
Переважно мікроорганізм(и) експресує(ють), як зазначені ферменти (а), так і (Б) із зазначених переважних або деяких варіантах здійснення.
Переважно мікроорганізм(іи) додатково експресує(ють) один або декілька з наступних ферментів: фермента дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом або будь-якої з
АрР -утворюючої, 1ЖОР -утворюючої, або АМР - утворюючої ацил-СоА синтетази/синтази/лігази; або кінази коротколанцюгової жирної кислоти та фосфотрансацилази.
Більш переважно мікроорганізм(и) додатково експресує(ють) один або декілька з наступних ферментів: 2-кетоізовалерат-дегідрогенази, ізобутират-СоА лігази, АЮР-утворюючої, СОР- утворюючої або АМР-утворюючої ацил-СоА синтетази/синтази/лігази, або кінази коротколанцюгової жирної кислоти та фосфотрансацилази.
Найбільш переважно, мікроорганізм(и) додатково експресує(ють) ізобутирил-СоА синтетазу, зокрема Ас5А з Рзепдотопах спіогарнпі5, зокрема Рзхейдотопазх сПіогарнпіз В2З
Стосовно четвертого, шостого, сьомого, восьмого та наступних аспектів, переважно мікроорганізм(и)-господар(ї) представляють собою бактерії, де приклади прийнятних бактерій включають: ентеробактерії, які належать до протеобактерій роду ЕбсПегіспіа, Епіегобасіег,
Рапіоєа, Кіерзієйа, бЗеїтайа, Егпміпіа, ЗаїЇтопеМйа, Могдапейа, або подібні, так звані дифтерієподібні бактерії які належать до роду Вгемірасіегішт, Согупебрасіегічт або
Місгобасіегішт, та бактерії, які належать до роду АЇїїсусіорасійй5, Васійй5, Нуагодепобасівг,
Меїнапососсиз, Асеїобасієг, Асіпеїобасієг, Адгобасіепит, Ахопі2орішт, Агоїюобасівг, Апаріазта,
Васієгоїде5, Вапопеїа, Вогаеїейа, Воітеїйа, Вгисейа, ВижПоїЇдепйа, Саїуттаїйорбасіеєгійт,
Сатруобрасієї, СПпПіатуаіа, СПіІатудорнійа, Сіовійдішт, Сохієйа, ЕНпіспіа, Епіегососсив, 60 ЕгапсізеММа, Ризорасіейит, СагапегеПа, Наеторнійсш5, Неїїсобасієг, КеїрзівеІІа, Меїйапобасіетлит,
Містососси5, МогахеїПа, Мусобасієгішт, Мусоріазта, Меїівзегпа, Равзівцгеїа, Реріозігеріососсив,
Рогрпуготопав, РгемоїеІІа, Рзейдотопав, ВНігобішт, ВісКейвіа, Роспаїйтаєа, Ноїніа, Зпідейа, еарпуїососси5, Зіепоїгорпотопах, Зігеріососси5, Тгеропета, Міргіо, УМоІраснпіа, Мегвіпіа, або подібні.
Ілюстративні бактерії включають види, вибрані з ЕзсПегісніа соїї, Кіерзіейа охуюса,
АпаегобріозрійНит 5иссіпісіргодисепв, Асіїіпобасіїїн5 зиссіподепе5, МаппНеєїтіа з5иссіпісіргодисепв,
ВПі2оБбішт ей, Васійив виЇибійв, Согуперасієтійт аішатісит, Суіисопобасієг охудап5, 7утотопав5 тобіїв, Іасіососсив Іасії5, Іасіобрбасійше ріапіагпит, біеріотусе5 соеїїсоЇог, Сіовіпайт асеюршіуїйсит, Реепдотопабз Пиогебзсеп5, Нуйгодепобрасієї Шепторпійй5, Меїпапососсив )аппазспнії та Роеендотопах риїіда.
Стосовно четвертого, шостого, сьомого, восьмого та наступних аспектів, переважно бактерія представляє собою ЕзспПегісніа сої).
Ілюстративні дріжджі або гриби включають ті, які належать до родів бЗасспаготусев,
Зспі2озасспаготусев, Сапаїда, Кіпухеготусевз, Авзрегайшв5, Рісніа, Стуїрососсив, або подібних.
Ілюстративні види дріжджів або грибів включають ті, які вибирають з Засспаготусез сегемівіає,
Зспі2озасспаготусев ротбре, Кіпухеготусез Іасіїз, Кінухеготусев тагхіапив5, Азрегойш5 іетеив,
АзрегоїПив підег, Рісніа равіогів, або подібні.
Один або декілька мікроорганізмів з будь-якого з четвертого, шостого, сьомого, восьмого або наступних аспектів можуть бути генетично модифікованими для підвищення або зниження активності зазначених вище природних або генетично сконструйованих ферментів.
Переважно мікроорганізм(іи) є генетично сконструйованими для того, щоб підвищити виробництво метакрилової кислоти та/або її похідних.
Підвищення виробництва метакрилової кислоти та/або її похідних може включати отримання модифікацій для існуючих клітинних метаболічних способів, нуклеїнових кислот та/або протеїнів шляхом застосування різних генетичних методів конструювання, відомих в даній галузі. Підвищення виробництва метакрилової кислоти та/або її похідних може також включати модифікування мікроорганізма(ів) для того, щоб експресувати один або декілька гетерологічних генів в мікроорганізмі(ах). Вони можуть включати гени, які кодують ферменти бажаного шляху до метакрилової кислоти з вуглецевої вихідної сировини, такі як ті, що представлені в даному документі, або можуть включати інші допоміжні гени, які діють, щоб сприяти функціонуванню та експресії ферментів в таких шляхах, або безпосередньо або опосередковано, як обговорюється докладніше нижче.
Відповідно, мікроорганізм(и) можуть бути модифікованими для того, щоб експресувати один або декілька генів для одержання метакрилової кислоти та/або її похідних та переважно, мікроорганізм(и) є додатково модифікованими для збільшення виробництва метакрилової кислоти та/або її похідних.
Один або декілька ген/генів, які можуть бути експресованими в мікроорганізмі(ах) таким чином, що він є модифікованим для того, щоб продукувати метакрилову кислоту та/або її похідні, включають ті, які кодують будь-який з наступних ферментів: АСХА з Агарідорзвів ІНаїїапа, коротколанцюгову ацил-СоА оксидазу з АпНгобрасієг пісойапає, пероксисомальну ацил-СоА оксидазу з Мідпа гадіаїа, ацил-СоА оксидазу 4 з Сапаїаа ігорісаїї5, ацил-СоА оксидазу з Сапаїда зр. та споріднені оксидази з широкого діапазону субстратів, 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестеразу з
АпПгобрасієг зр, УсіА з ЕвсПегіспіа соїї, МсіА з Наєторпйш5 іпПшМепгає, Те5А з ЕвсПегісніа сої,
ТезВ з ЕвсепПенісніа соїї, 4НВТ з АпНгобасієг діобітюттів, 4НВТ з Рзейдотопазх 5р. штаму СВ5-3,
ЕпіН з ЕзсепНегісніа соїї, бутирил-СоА ацетоацетат-СоА трансферазу з Сіозтідішт вр. 584, бутирил-СоА ацетоацетат-СоА трансферазу з Сіовігідійт в5іїсКіапаїйї, бутират-ацетоацетат Сод- трансферазу з Сіовігідішт асеюршуїйсит АТОС824, ацетат-ко-ферментну трансферазу удіЕ з
ЕзсПетгісніа соїї, фосфотрансбутирилазу з Сіовігідінт асеюршуїйсит АТОС824, кіназу жирної кислоти з розгалуженим ланцюгом з брігоспеїє МА-2, бутират-кіназа з Тпептоїюда таїтйіта, бутират-кіназа з Сіовігідішт Бшугісит, з розгалуженим ланцюгом ацил-СоА дегідрогеназу з
Реєндотопаз риїйда, ізобутирил-СоОА дегідрогеназу з Ното заріеп5, ізовалерил-СоА дегідрогеназу з Агарідорзі5 Іпаійапа, флавопротеїн, який переносить електрони, з Н. заріепв, флавопротеїн, який переносить електрони, з бив 5сгоїа, флавопротеїн, який переносить електрони, з Агарідорзіб5 ІНаійапа, флавопротеїн, який переносить електрони, з Рзендотопав ршіда, флавопротеїн, який переносить електрони, з Рагасоссив адепййісапе, убіхінонову оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з Н. заріеп5, убіхінонову оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з 5Би5 взсгоїа, убіхінонову оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з Рзендотопах риїйда, убіхінонову оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з Агарідорзів ІНаІігапа, убіхінонову 60 оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з НПодобрасієї 5рНнаєгоїдев,
убіхінонову оксидоредуктазу флавопротеїну, який переносить електрони, з Рагасоссив депйиїтісапв.
Один або декілька ген/генів, які можуть бути експресованими в мікроорганізмі(ах) таким чином, що він є модифікованим для того, щоб продукувати метакрилову кислоту та/або її похідні включають ті, які кодують будь-який з наступних ферментів: Ас5А з Рхепидотопах спіогогарпів; рКкадт, ркадг, кав та Ірам з Васійи5 з,ирій5; ркалйт, ркалд2, ркав та Ірам з Рзендотопах ршийаа; аії55 з Васійи5 бий, МО з Е5сПегіспіа соїї, МС з ЕбсПегіспіа соїї, МВ з ЕзсПегіспіа соїї, ММ з
ЕзсПегіспіа соїї, ймі з Еб5сПегіспіа соїї, ймбО з ЕбсПегіспіа соїї, ММ з Е5сПегіспіа сої, їмМНА з
Е5сПегіспіа соїї та МН з Езспегіспіа соїї з мутаціями 5140 та 517Е, ймС з Согупебрасіегійт дішатісит К, що містить мутації 5340, І 48Е та К49Б, ІмВ та їм з Согуперасіегішт К, та ЙММ з
Согуперасіегішт К, що містить мутацію 5156Е, також гомологи з інші організмів, які несуть подібні мутації, як описано вище, для того, щоб полегшити інгібування по типу зворотного зв'язку ферментів та змінити, де це доречно, кофакторну залежність.
Представлений винахід може, крім того, включати модифікації, які зменшують або усувають активність фермента, який каталізує синтез сполуки, іншої ніж метакрилова кислота та/або її похідних, яка конкурує за такі ж самі субстрати, та/або поміжних сполук в зазначених вище способах біосинтезу. Приклади таких ферментів включають УсіА, Те5А, Те5В з Е5сПегіспіа соїїЇ, та ті, які кодуються їТаавВ, їїмА, рапВ, ІечА, уда7, удан, асеБ, асеЕ, ІраА, гріА, рікА, рікВ, тай, рохВ, МЕ, ІА та ПО, в Езспегіспіа соїї, а також гомологи в інших штамах-господарях, як описано в даному документі.
Представлений винахід може, крім того, включати модифікації, які зменшують або усувають активність фермента, який метаболічно перетворює метакрилову кислоту та/або її похідні або метаболічно перетворює поміжну сполуку в в зазначених вище способах біосинтезу. Приклади таких ферментів, які стосуються метаболізму представляють собою ферменти нативного шляху розкладання валіну в Е. соїї, або інші тіоестерази, які можуть споживати тіоскладноефірні поміжні сполуки сконструйованого шляху.
Представлений винахід може, крім того, включати модифікації, які зменшують або усувають активність протеїнів, які беруть участь в інших клітинних функціях, які видаляють поміжні сполуки в зазначених вище способах біосинтезу. Приклади таких клітинних функцій можуть
Зо включати механізми збереження, такі як вакуольне збереження (наприклад, в дріжджах), або інших внутрішньоклітинних тіл, здатних до збереження метаболітів (наприклад, бактеріальні мікрокомпартменти), бактеріальну периплазму або транспортні механізми, такі як трансмембранні насоси або порини, здатні експортувати метаболіти.
Джерела нуклеїнових кислот для генів, які кодують протеїни, зокрема, ферменти, які експресуються в мікроорганізмі(ах) відповідно до представленого винаходу, можуть включати, наприклад, будь-які види, в яких кодований генний продукт є здатним каталізувати зазначену реакцію. Такі види включають як прокаріотичні, так і еукаріотичні організми, включаючи, але не обмежуючись цим, бактерії, включаючи археї та еубактерії, та еукаріоти, включаючи дріжджі, рослину, комаху, тварину, та ссавця, включаючи людину. Ілюстративні види для таких джерел включають, наприклад, Еб5сПегіспіа соЇїї, Ното заріеєп5, Ргоріопірасіегішт їпедепгеїснії,
Метилобасіегішт ехіогдиеп5, ЗПпідейПа Пехпегі, зЗаїтопеїа епієгіса, МУегвзіпіа едепкзепії,
Ргоріопірасієтішт аспез, Вайив погуєдісив, Саєпотавбайнв еієдапв, Васіїйи5 сегеив, Асіпеюбасівг саІсооцтовоїи5, Асіпеїобасіег Бауїуі, Асіпегобасіег 5р., СіІовігідішт Кісумегі, Рзхендотопах 5р.,
ТНнептив Шепторпіїш5, Реєейдотопаз аєгидіпоза, Реейдотопаз риїйда, Огусіоїадив сипісцив,
Сіовігідінт асейБшуйсит, Іецисоповзіос тезепіегоіїде5, Еибрасієгішт БаїКегі, Васієгоіїде5 саріїобзив, Апаегоїтшпси5 соїпотіпіх, Маїапаєгтобійи5 Шепторнийи5, Сатруіобасієг |е)шпі,
Агарідорвзів ІНаїйапа, Согупебрасієгішт дішатісит, Зив в5сгоїа, Васійи5 вибив, Рвемймдотопав5
Пиогезсепз5, Зеггаца тагсе5сепв5, Зігеріотусез соеїїсоЇог, Метилібішт реїгоІвірпйшт, 5ігеріотусе5 сіппатопепвіх, Зігеріотусез амептійів, Атгспаеодіорив Шідідиє, НаїЇоагсціа /тагізтопиі,
Ругобасиішт аегорпішт, Засспаготусев сегемізіає, Сіовітідішт соспієатішт, Сіовійайт
Іетапотогрпит, Сіовігідіит їеїапі, Спгорасієї ата|опаїйсив, НаіІвіопіа ешіторна, Ми тивзсцив, Во5 їайгив, Еиворасієгішт писієайнт, МогдапеїЇа тогдапії, Сіовійаішт разіешіапит, ВАподобасієг зрпаєтоїде5, Хапіпорасієї ашоторнісив, Сіовзійдіит ргоріопісшт, Медазрнаєга е|5авпії,
АзрегоїПи5 іегтеив, Сапаїда, ЗиМоіорив5 юКодаї, МеїаІозрнаєга зедшіа, СпіогоПехив ацгапііасив,
Сіовігідінт засспагорегршуїасеїопісцт, Асідатіпососси5 Теппепіап5, Неїїсобасіег руїогі, а також інші ілюстративні види, розкриті в даному документі або доступні як джерельні організми для відповідних генів.
Слід зазначити, що один або декілька генів, які кодують ферменти, які можуть бути експресовані в мікроорганізмі(ах) за винаходом, також включають гени, які кодують варіанти бо зазначених ферментів, наприклад, варіанти ферментів, які включають заміщення, деліції,
вставки або додавання однієї або декількох амінокислот в поліпептидній послідовності, та де зазначений поліпептид зберігає активність немодифікованого фермента. Такі варіанти ферментів також включають варіанти ферментів, які мають зменшену ферментативну активність у порівнянні з немодифікованим ферментом та ферментами з модифікованим аллостеричним контролем, наприклад ЇмН з Езспегіспіа соїї з мутаціями 5140 та 517РЕ, їмо з
Согуперасіегішт дішатісит К, який містить мутації 53405, 148Е та К49Е, ймВ та ЇмУМ з
Согуперасіегіит К та мМ з Согуперасіегіит К, який містить мутацію 5156Е.
Способи конструювання та тестування експресії протеїна в мікроорганізмі, який продукує метакрилову кислоту, яка не зустрічається в природі, можуть бути здійснені, наприклад, використовуючи рекомбінантні методики та способи детектування, добре відомі в даній галузі.
Такі способи можуть бути знайдені описаними в, наприклад, затьгоок еї аї., МоїІесшаг Сіопіпд:
А І арогаїогу Мапиаї, Тпіга Еа., Со 5ргіпд Нагрог Гарогаїогу, Мем/ МогК (2001); та А!иМзирбеї еї аї.,
Сигтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, доп Уміеу та опо, Вайтоге, Ма. (1999).
Екзогенні послідовності нуклеїнових кислот, які беруть участь у способі отримання метакрилової кислоти та/або її похідних або поміжної сполуки в її утворенні, можуть вводитись стабільно або тимчасово в клітину мікроорганізму, використовуючи методи, добре відомі в даній галузі, включаючи, але не обмежуючись цим, кон'югацію, електропорацію, хімічне перетворення, трансдукцію, трансфекцію, та ультразвукове перетворення.
Приклади методів трансформації можуть включати обробку клітин мікроорганізма(ів) реципієнта з хлоридом кальцію, таким чином, щоб збільшити проникність ДНК, та отримати компетентні клітини з клітин, які знаходяться у фазі росту, з наступною трансформацією з ДНК.
Альтернативно, спосіб одержання ДНК-реципієнтних клітин в протопластах або сферопластах, які можуть легко приймати рекомбінантну ДНК, з наступним введенням рекомбінантної ДНК в клітини, який, як відомо, є застосовуваним до Васійи5 зибійй5, актиноміцети та дріжджи також можуть застосовуватися. Крім того, трансформація мікроорганізмів також може бути здійснена шляхом електропорації. Такі способи є добре відомими в даній галузі.
Для екзогенного експресування в Е. соїї або інших клітин прокаріотичних мікроорганізмів, деякі послідовності нуклеїнових кислот в генах або кКДНК еукаріотичних нуклеїнових кислот можуть кодувати сигнали націлювання, такі як М-термінальний мітохондріальний або інші
Зо націлюючий сигнал, який може бути видалений до перетворення в клітини прокаріотичних мікроорганізмів, якщо це потрібно. Наприклад, видалення послідовності мітохондріального лідера призвело до зростання експресії в Е. соїї (Нойтеівіег еї аї., 9. Віої. Спет. 280:4329-4338 (2005). Для екзогенного експресування в дріжджах або інших клітинах еукаріотичних мікроорганізмів, гени можуть бути експресованими в цитозолі без додавання лідерної послідовність, або можуть бути націленими на мітохондрії або інші органели, або націленими на секрецію, за рахунок додавання прийнятної націлюючої послідовності, такої як мітохондріальне націлювання або секреторний сигнал прийнятних для органели-мішені. Таким чином, мається на увазі, що відповідні модифікації для послідовності нуклеїнової кислоти для того, щоб видалити або включити націлюючу послідовність, можуть бути включені в екзогенну послідовність нуклеїнової кислоти, щоб надати бажані властивості. Крім того, гени можуть бути піддані оптимізації кодону з використанням способів, добре відомих в даній галузі для досягнення оптимальної експресії протеїнів в мікроорганізмі(ах).
Вектор або вектори експресії можуть бути сконструйованими для включення однієї або декількох нуклеїнових кислот, які кодують фермент(и) біосинтетичного шляху, як проілюстровано в даному документі, функціонально зв'язані з контрольними послідовностями експресії, які функціонують в мікроорганізмі(ах). Вектори експресії, прийнятні для застосування в мікроорганізмі(ах) за винаходом включають, наприклад, плазміди, косміди, фагові вектори, вірусні вектори, епісоми та штучні хромосоми, включаючи вектори та селекційні послідовності або маркери, які функціонують для стабільної інтеграції в хромосому-господар.
Крім того, вектори експресії можуть включати в себе один або декілька здатних до селекції маркерних генів та відповідні експресійні контрольні послідовності. Здатні до селекції маркерні гени також можуть бути включеними для того, щоб, наприклад, забезпечити резистентність до антибіотиків або токсинів, доповнити ауксотрофні дефіцити, або постачати найважливіші поживні речовини не в культуральних середовищах. Експресійні контрольні послідовності можуть включати конститутивні, індуковані або репресивні промотори, енхансери транскрипції, термінатори транскрипції, трансляційні сигнали та подібні, які є добре відомими в даній галузі.
Коли дві або більше екзогенних кодуючих послідовностей нуклеїнових кислот повинні бути спільно експресованими, обидві послідовності нуклеїнових кислот можуть бути введені, наприклад, в один вектор експресії або в окремі вектори експресії. Для одного вектора експресії, бо кодуючі нуклеїнові кислоти можуть бути функціонально зв'язаними з однією загальною експресійною контрольною послідовністю або зв'язаними з різними експресійними контрольними послідовностями, такими як індуковані промотори та конститутивні промотори. В деяких варіантах здійснення, вектор може мати два або більше промоторів для спів-експресії декількох генів або оперонів. В деяких варіантах здійснення, гени/оперони можуть бути експресованими в одному або декількох різних векторах з одним або декількома відповідними промоторами.
Вектор, який використовується для трансформації, може представляти собою вектор, здатний до автономної реплікації, в клітині мікроорганізма(ів). Приклади векторів, здатних до автономної реплікації, в бактеріях Епіегорасієгіасєає Басієгіа, таких як Е.соїї можуть включати плазмідні вектори рОС19, руОсС18, рвАЗ322, В5Е1010, рнОаг99, рнзаг98, рніЗазЗ99, рнозаз98, ротм28, ретм29, рЕТ2ОБ(-), рЕТ28Б(-) (рЕТ вектори є доступними від Момадеп), рі уз5, (рнза та ротТМ вектори є доступними в ТакКага Віо Іпс.), РММ/119, РММ/118, рМУу219, рМУу/218 (рМУу вектори є доступними в Мірроп Сепе Со., 4.) тощо, та їх похідні. Крім того, вектори для дифтерієподібних бактерій можуть включати рАМ330 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 58-67699), рНМ1519 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 58-77895), реонкб (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення
Мо. 2000-262288), руУК7 (О5Р2О03-0175912А), рАуЧб55, рАшШбії, рАд)д1844 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 58-192900), рСас1 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 57-134500), рос2 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 58-35197), рбОш4, робО11 (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення Мо. 57-183799), рНКаА (Патент Японії, викладений для загального ознайомлення
Мо. 5-7491) та так далі. Крім того, вектори для дріжджів можуть включати дріжджові плазміди, такі як, наприклад, рОб02 або ро905 для Рісніа разіюгі5, або рО1201, рО1204, рО1205, рор1207, ро1211, рО1214 ро1215, ро1217, рр1218, роО1221, рО1224, рор1225, рО1227, рО1231, рор1234, ро1235, рО1237 для басспаготусе5 сегемівіає. Гени також можуть бути інтегрованими в хромосому господаря, використовуючи добре відомі способи (наприклад, Юаїеп5Ко апа У/аппег (Оаїзепко, К. А. апа У/аппег", В. І. 2000, Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА, 97:6640-6645)).
Посилення активності фермента може включати посилення експресії гена-мішені шляхом заміни експресійної регуляторної послідовності гена-мішені, такої як промотор, в геномній ДНК
Зо або плазміді на промотор, який має відповідну силу. Наприклад, Ійг промотор, Іас промотор, ігр промотор, їгс промотор, рі. промотор, їас промотор, тощо, є відомими як часто використовувані промотори. Приклади промоторів з високою експресійною активністю в мікроорганізмах, таких як бактерії, можуть включати промотори гена фактор елонгації Ти (ЕЕ-Ти), її, промотори генів, які кодують спів-шаперонін СгоЕБ/ЕЇ, тіоредоксин-редуктазу, фосфогліцерат-мутазу, гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназу, та подібні (М/О2006/028063, ЕР1697525). Приклади сильних промоторів та способів оцінки сили промоторів є добре відомими в даній галузі.
Крім того, можливим також є замінити декілька нуклеотидів в промоторній ділянці гена, таким чином, що промотор має відповідну силу, як розкрито в ММО 2000/18935. Заміщення експресійної регуляторної послідовності може бути здійснено, наприклад, за таким самим способом, як і при заміщенні генів, використовуючи температурно чутливу плазміду. Приклади векторів, які мають температурно чутливе реплікаційне походження, які можуть використовуватися для ЕбсПегіспіа соїї або Рапіоєа апапаїіїх, можуть включати, наприклад, плазміду РМАМО97, описану в міжнародній публікації М/О 1999/03988, її похідну, та так далі.
Крім того, заміщення експресійної регуляторної послідовності також можуть бути здійснені за способами, які використовують лінійну ДНК, такими як спосіб, який називається "Червоною керованою інтеграцією", використовуючи червону рекомбіназу А-фага (ОаїбхепКо, К. А. апа
МУаппег, В. Г. 2000, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 97:6640-6645), де спосіб поєднує спосіб червоної керованої інтеграції та А-фагову допускаючу вирізання систему (Спо, Е. Н. еї аїІ. 2002. 9.
Васіетої!. 184:5200-5203) (МИО2005/010175), та так далі. Модифікація експресійної регуляторної послідовності може бути поєднаною зі збільшенням номера копії гена.
Крім того, відомо, що заміщення декількох нуклеотидів в спейсері між сайтом зв'язування рибосоми (КВ5) та початковим кодоном, та, зокрема, послідовності безпосередньо проти ходу транскрипції початкового кодону кардинально впливають на здатність до трансляції мРНК.
Трансляція може бути підвищена за рахунок модифікування данних послідовностей.
Коли ген-мішень вводять в зазначену вище плазміду або хромосому, будь-який промотор може використовуватися для експресії гена за умови, що вибирають промотор, який функціонує у використовуваному(их) мікроорганізмі(ах). Промотор може бути нативним промотором гена, або модифікованим промотором. Експресія гена може також контролюватися, застосовуючи відповідний відбір промотора, який ефективно функціонує у вибраному(их) мікроорганізмі(ах), бо або шляхом аппроксимації -35 та -10 ділянок промотора, близького до консенсусної послідовності.
Трансформаційна, трансдукційна, кон'югаційна або хромосомна вставка екзогенних послідовностей нуклеїнових кислот, включених в метаболітичний або синтетичний шлях можуть бути підтверджені, використовуючи способи, добре відомі в даній галузі. Такі способи включають, наприклад, екстракцію плазміди або хромосомної ДНК з наступною ампліфікацією полімеразного ланцюга специфічних цільових послідовностей, або рестрикційним картуванням, подальшим аналізом нуклеїнових кислот, таким як нозерн-блот або ампліфікація полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) мРНК, або електрофорез на поліакріламідному гелі, або вимірювання ферментативної активності, або імуноблоттінг для експресії генних продуктів, або інші прийнятні аналітичні способи для дослідження експресії введеної послідовності нуклеїнової кислоти або її відповідного генного продукта. Кваліфікованим фахівцям в даній галузі зрозуміло, що екзогенна нуклеїнова кислота експресуються в достатній кількості для отримання бажаного генного продукта, та далі розуміється, що рівні експресії можуть бути оптимізовані для отримання достатньої експресії, використовуючи способи, добре відомі в даній галузі.
Необов'язково, один або декілька мікроорганізмів четвертого, шостого, сьомого, восьмого або наступних аспектів для застосування в будь-якому із зазначених вище способів за винаходом можуть бути додатково модифікованими для зменшення або усунення активності фермента або протеїна, який бере участь в клітинній функції, яка: () перенаправляє матеріал зі шляхів продукування метакрилової кислоти; та/або (ї) метаболічно перетворює метакрилову кислоту та/або її похідні.
З метою зменшення або усунення активностей зазначених вище ферментів або протеїнів, мутації для зменшення або усунення внутрішньоклітинних активностей ферментів або протеїнів можуть бути введені в гени зазначених вище ферментів або протеїнів за допомогою звичайних випадкових або сайт-спрямованих мутагенезів або способів генної інженерії. Приклади мутагенезу можуть включати, наприклад, рентгенівське або ультрафіолетове опромінення, обробку мутагеном, таким як М-метил-М'-нітро-М-нітрозогуанідин, іп міго сайт-спрямований або випадковий мутагенез за рахунок високої точності або схильної до помилок полімеразної ланцюгової реакції, відповідно, та так далі. Сайт на гені, де вводять мутацію, може знаходитись в ділянці кодування, яка кодує фермент або протеїн, або ділянці контроля експресії, такій як
Зо промотор. Приклади способів генної інженерії можуть включати генетичну рекомбінацію, трансдукцію, клітинне злиття, генні нокаути, та так далі.
Зменшення або усунення внутрішньоклітинної активності цільового фермента або протеїна та ступінь зменшення можуть бути підтвердені шляхом вимірювання активності фермента або протеїна в клітинному екстракті або його очищеній Фракції, отриманій з кандидатного штама, та порівнюючи її з рівнем штама немутантного типа, або шляхом вимірювання утворення цільового продукту цілими клітинами.
Приклади інших способів передачі або посилення здатності до отримання метакрилової кислоти та/або її похідних та/або їх поміжних сполук можуть включати передачу резистентності до метакрилової кислоти або органічної кислоти - аналога, інгібітор дихальних шляхів або подібні, та передачу чутливості до інгібітора синтезу клітинної стінки. Дані способи можуть включати, наприклад, відбір резистентних клітин шляхом росту з підвищенням концентрацій токсичної речовини, передачу резистентності до монофтороцтової кислоти, передачу резистентності до аденіну або резистентності до тиміну, ослаблення уреази, передачу резистентності до малонової кислоти, передачу резистентності до бензопіронів або нафтохінонів, передачу резистентності до НОСОМО, передачу резистентності до альфа- кетомалонової кислоти, передачу резистентності до гуанідину, передачу чутливості до пеніциліну, та так далі, як є відомим в даній галузі.
Приклади таких резистентних бактерій можуть включати наступні штами: Вгемірасієтійт
МТамит АуЧЗОї9 РЕВАМ ВР-2632; Согуперасієгйцт дішатісит АуУЧ1І1628 РЕНАМ Р-5736;
Вгемірбасіейцт Яамит Ад11355 РЕВМ Р-5007; Согуперасіейцт дішатісит Ау1І1368 РЕВМ Р- 5020; Вгемірасіейит ЧЯЧамит АуУ11217 РЕВМ Р-4318; Согуперасівейит дішатісит АуУ11218 ГЕВМ
Р-4319; Вгемірасієгтішт Памит АуУ11564 РЕНМ Р-5472; Вгемірасієгішт йамит АуУ11439 РГЕВМ Р- 5136; Согупебасієпит дішатісит Н7бЄ84 РЕВМ ВР-3004; Вгемірасієтит Іасіотептепішт АУ11426
ЕЕВМ Р-5123; Согуперасієтшт дішатісит АуУ11440 РЕВМ Р-5137; та Вгемірасіегішт
Іасіотептепішт А.)11796 РЕНМ Р-6402.
Крім того, способи передачі або посилення здатності до отримання метакрилової кислоти та/або її похідних та/(або їх поміжних сполук можуть включати передачу резистентності до негативних регуляторів/інгібіторів, передачу чутливості до позитивних регуляторів/активаторів або полегшення необхідності аллостеричної активації ферментів іншими сполуками. 60 Наприклад, полегшення необхідності аллостеричної активації дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом з Рхепдотопах5 ршйда валіном, або полегшення аллостеричного інгібування ацетолактат-синтази з Е5сПегіспіа соїї.
Ферментація
Відповідно, зазначені вище способи за винаходом можуть бути здійснені шляхом культивування мікроорганізма(ів) четвертого, шостого, сьомого, восьмого або наступних аспектів за винаходом, які є здатними продукувати метакриліл-СоОА поміжну сполуку, та/або метакрилову кислоту, та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти, відповідно у середовищі.
Відповідно, таким чином, способи першого, другого або третього аспектів за винаходом може, крім того, включати стадію культивування одного або декількох мікроорганізмів для продукування метакрилової кислоти та/або її похідних, таких як складні ефіри метакрилової кислоти.
Переважно зазначене культивування відбувається в ферментаційному середовищі.
Таким чином, відповідно до дев'ятого аспекту представленого винаходу, передбаченим є спосіб ферментації, який включає культивування одного або декількох мікроорганізмів четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого або наступних аспектів в ферментаційному середовищі для того, щоб отримати метакрилову кислоту та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти.
Метакрилова кислота та/або її похідні можуть бути присутніми в ферментаційному середовищі або в клітинах мікроорганізма(ів).
Відповідно, таким чином, способи першого, другого або третього аспектів винаходу можуть, крім того, включати стадію збирання метакрилової кислоти, таЛ"або поміжної сполуки при її утворенні, та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти з ферментаційного середовища або з клітини мікроорганізма(ів).
Метакрилова кислота та/або її похідна, така як складний ефір метакрилової кислоти може бути присутньою в ферментаційному середовищі застосовуючи мікроорганізм(и), які секретують метакрилову кислоту та/або її похідну, таку як складний ефір метакрилової кислоти, як описано в даному документі вище.
Метакрилова кислота та/або її похідна, така як складний ефір метакрилової кислоти, може
Зо бути присутньою в клітинах мікроорганізма(ів), застосовуючи мікроорганізм, який накопичує метакрилову кислоту та/або її похідні, такі як складний ефір метакрилової кислоти, як описано в даному документі вище.
Відповідно, таким чином, клітини видаляються з ферментаційного середовища будь-яким способом, відомим в даній галузі, таким як фільтрація, центрифугування, тощо, та метакрилову кислоту або її сіль талабо складний ефір метакрилової кислоти збирають з ферментаційного середовища за будь-яким способом, відомим в даній галузі, таким як: дистиляція, екстракція рідина-рідина, тощо. Відповідно, таким чином, способи за винаходом можуть включати додаткову стадію збирання метакрилової кислоти та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти, з навколишнього середовища, це можуть бути реалізованим спочатку шляхом видалення клітин з середовища шляхом фільтрації або центрифугування та потім екстрагування метакрилової кислоти та/або її похідної з очищеного середовища шляхом дистиляції або екстракції рідина-рідина.
Необов'язково, збирання метакрилової кислоти та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти може, крім того, включати стадію вивільнення метакрилової кислоти та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти з клітини, яка може бути здійснена за будь-яким способом, відомим в даній галузі, переважно, де клітину лізують для того, щоб вивільнити бажаний продукт, таким як: з використанням ультразвуку, гомогенізація, ферментативна обробка, розмелення в кульовому млині, осмотичний шок, заморожування- розморожування, обробка кислотою/основою, фаговий лізис, тощо, з наступною аналогічним способом збору з ферментаційного середовища, як детально зазначено вище. Відповідно, таким чином, способи за винаходом можуть включати додаткові стадії збирання метакрилової кислоти та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти, з клітин, це може бути реалізованим шляхом лізингу клітин, та подальшої фільтрації клітинного дебрісу з наступною екстракцією метакрилової кислоти та/або її похідної, такої як складний ефір метакрилової кислоти.
Відповідно, культивування або культивація мікроорганізму вимагає вуглецевої сировини, на якій мікроорганізм може отримувати енергію та рости. Переважно, таким чином, мікроорганізм(и) культивують на вуглецевій сировині, та способи першого або другого аспектів за винаходом можуть, крім того, включати стадію культивування одного або декількох бо мікроорганізмів, які є здатними для того, щоб отримати метакрилову кислоту та/або її похідні з вуглецевої сировини.
Переважно культивування або культивація відбувається в ферментаційному середовищі, відповідно, навколишнє середовище якого оточує мікроорганізм(и), переважно, в середовищі присутньою є вуглецева сировина, необов'язково розчинена або суспендована в середовищі, барбатована через середовище та/або змішана із середовищем. Переважно, таким чином, середовище містить мікроорганізм(и) та вуглецеву сировину разом з будь-якими буферами та солями.
Таким чином, відповідно до десятого аспекту представленого винаходу передбаченим є ферментаційне середовище, яке містить один або декілька мікроорганізмів з четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого або наступного аспектів.
Переважно ферментаційне середовище додатково включає метакрилову кислоту та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти.
Переважно мікроорганізм(и) продукують метакрилову кислоту та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти зі збільшеним показником, зазначеним вище, ніж базовий показник, як пояснюється вище, таким чином, що, переважно, концентрація метакрилової кислоти та/або її похідних, таких як складні ефіри метакрилової кислоти, що є присутніми в середовищі, або від безпосередньої секреції або від лізингу клітин, має високий титр.
Переважно, титр метакрилової кислоти та/або її похідних, таких як складні ефіри метакрилової кислоти, яка є присутньою в ферментаційному середовищі, становить, щонайменше, 5 мг/л. Наприклад, 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155 мг/л, переважно, щонайменше, більше, ніж 130 мг/л.
Переважно, в варіанті здійснення, коли метакрилова кислота та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти, накопичуюються в мікроорганізмі(ах), концентрація метакрилової кислоти, та/або її поміжної сполуки, та/або її похідної, такої як складні ефіри метакрилової кислоти, які є присутніми в клітині, становить, щонайменше, 0,05 мМ, більш переважно, щонайменше, 0,1 мМ, більш переважно, щонайменше, 1 мМ, більш переважно, щонайменше, 2
ММ, більш переважно, щонайменше, 5 мМ, більш переважно, щонайменше, 10 мМ. Переважно концентрація метакрилової кислоти або її поміжної сполуки, та/або її похідних, таких як складні ефіри метакрилової кислоти, в клітині знаходиться в діапазоні від 10 мМ до приблизно 300 мМ,
Зо більш переважно від приблизно 20 мМ до приблизно 200 мМ, ще більш переважно від приблизно 30 мМ до приблизно 100 мМ, найбільш переважно від приблизно 40 мМ до приблизно 70 мМ.
Мікроорганізм(и) за винаходом можуть бути культивованими або вирощуваними як партія, повторювана партія, підживлення, повторюване підживлення або а безперервний процес культивування.
Відповідно, процес культивування відбувається в культуральному середовищі, за іншими причинами відомим в даному документі як навколишнє середовище або ферментаційне середовищі. Переважно застосовують процес підживлення або повторюваного підживлення, в якому джерело вуглецю, та/або джерело азоту, та/або додаткові сполуки подаються в процес культивування. Більш переважно, джерело вуглецю та/або азоту подається в процес культивування.
Ферментаційне середовище, в якому мікроорганізм(и) зо представленим винаходом культивують, можуть представляти собою будь-яке комерційно доступне середовище, прийнятне для потреб організма про який йде мова, за умови, що відповідні поживні речовини, необхідні для зазначеного, організма є лімітуючими. Культура може бути аеробною або анаеробною, однак в контексті винаходу, коли застосовують фермент оксидазу, культура є переважно аеробною.
Ферментаційне середовище відповідно містить вуглецеву сировину, як описано вище, та джерело азоту, а також додаткові сполуки, необхідні для росту мікроорганізма(ів) та/або утворення метакрилової кислоти та/або складного ефіру метакрилової кислоти.
Приклади прийнятних вуглецевих сировин, відомих в даній галузі, включають глюкозу, мальтозу, мальтодекстрини, сахарозу, гідролізований крохмаль, крохмаль, лігнін, ароматичні речовини, синтез-газ або його компоненти, метан, етан, пропан, бутан, меласу та олії.
Переважно вуглецеву сировину отримують з біомаси. Також використаними можуть бути суміші, а також відходи, такі як муніципальні відходи, харчові відходи та лігноцелюлозні відходи харчової промисловості, лісового господарства або сільського господарства.
Приклади прийнятних джерел азоту, відомих в даній галузі, включають борошно з соєвих бобів, рідкий кукурудзяний екстракт, дріжджовий екстракт, аміак, солі амонію, нітратні солі, сечовину, газоподібний азот або інші джерела азоту. бо Приклади додаткових сполук, необхідних для росту мікроорганізма(ів), включають антибіотики, протигрибкові засоби, антиоксиданти, буфери, фосфат, сульфат, солі магнію, мікроелементи та/або вітаміни.
Загальна кількість вуглецевої сировини та джерела азоту, які додаються до середовища, може змінюватись в залежності від потреб мікроорганізма(ів) та/або тривалості процесу культивування.
Співвідношення між вуглецевою сировиною та джерелом азоту в культуральному середовищі може змінюватись в значній мірі.
Додаткові сполуки, необхідні для росту мікроорганізма(ів) та/або для продукування метакрилової кислоти та/або її похідних, таких як складні ефіри метакрилової кислоти, такі як фосфат, сульфат, або мікроелементи, можуть бути добавлені в кількостях, які можуть варіюватись між різними класами мікроорганізмів, тобто між грибами, дріжджами та бактеріями.
Крім того, кількість додаткової сполуки, яку додають, може бути визначена залежно від того, чи утворюється метакрилова кислота та/або її похідні, такі як складні ефіри метакрилової кислоти, та які шляхи використовуються для їх утворення.
Як правило, кількість кожного компонента ферментаційного середовища, необхідного для росту мікроорганізма, визначається шляхом вимірювання виходу росту на поживній речовині, та додатково оцінюється стосовно кількості вуглецевої сировини, використовуваної в культивуванні або процесі культивування, оскільки кількість утвореної біомаси в першу чергу буде визначатися за кількістю використовуваної вуглецевої сировини, та обмеженнями щодо поживних речовин, наданими під час будь-якого режиму подачі сировини.
Культивування або процес культивування відповідно до винаходу переважно здійснюється у промисловому масштабі. Процес промислового масштабу, як мається на увазі, охоплює культивування або процес культивування в одному або декількох ферментерах з масштабом об'єму, який становить 20,01 му, переважно 20,1 м3, переважно 20,5 му, переважно 25 му, переважно 210 му, більш переважно 225 му, більш переважно 250 му, більш переважно 2 100 му, найбільш переважно 2200 м3.
Переважно, культивування або культивація мікроорганізма(ів) за винаходом, як правило, здійснюється в біореакторі. "Біореактор" загалом, як мається на увазі, означає контейнер, в якому мікроорганізми культивують в промисловому масштабі. Біореактори можуть бути будь-
Зо якого розміру, кількості та форми, та можуть включати вхідні отвори для подачі поживних речовин, додаткових сполук для росту, свіжого середовища, вуглецевої сировини, добавок газів, таких як, але не обмежуючись цим, повітря, азот, кисень або діоксид вуглецю.
Біореактори, також можуть містити вихідні отвори для видалення об'ємів культурального середовища для збирання метакрилової кислоти та/або складного ефіру метакрилової кислоти або з самого ферментаційного середовища або з середини мікроорганізма(ів). Біореактор, переважно, також має пах ап вихідний отвір для відбору зразків культури. Біореактор, як правило, може бути сконфігурований для змішування ферментаційного середовища, наприклад, за рахунок перемішування, перекидання, струшування, інвертування, барботування газу через культуру тощо. Альтернативно, деякі постійні культури не вимагають перемішування, наприклад, мікрореакторні системи, які використовують систему із закупорюючим потоком.
Біореактори є загальними та добре відомими в даній галузі, та приклади можуть бути знайдені в стандартних підручниках, таких як "ВіоїесппоІоду: А ТехіроокК ої Іпаивігіа! Місгоріоіоду, Зесопа
Еайіоп" (1989) Айшійоге: УМиїї Стуедаг та Аппеїїзе Стиедег, перекладений Тпотаз 0. ВгоскК Зіпацег
А55осіаїез, Іпс., Зипаепапа, МА.
Таким чином, відповідно до одинадцятого аспекту винаходу, передбаченим є біореактор, який містить один або декілька мікроорганізмів з четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого або наступного аспектів, та/"або ферментаційне середовище десятого аспекту.
Необов'язково, біореактор може містити декілька різних мікроорганізмів за представленим винаходом.
Переважно, біореактор містить тільки мікроорганізм(и), здатні здійснювати спосіб за винаходом.
Більш переважно біореактор містить тільки мікроорганізм(и) однакових видів, таким чином, що однакові умови культивування можуть використовуватися повсюди.
Сировина для біомаси
Переважно використовувана біомаса містить велику кількість вуглеводів, особливо переважними є вуглеводи, які представляють собою джерела з С5 або Сб цукрів, гази на основі вуглецю, або ароматичні речовини, переважно з С5 або Сб цукрів, більш переважно глюкозу, такі як, але не обмежуючись цим крохмаль, лігнін, целюлозу, глікоген, арабіноксилан, хітин або пектин. бо Альтернативно, використовувана біомаса містить велику кількість жирів, особливо переважними є жири або олії, які представляють собою джерела гліцерину та жирних кислот, зокрема тригліцеридів. Прийнятних тригліцериди включають будь-яку олію або жир, які є легко доступними з рослинного або тваринного джерела. Приклади таких олій та жирів включають: пальмову олію, лляну олію, рапсову олію, сало, масло, оселедцеву олію, кокосову олію, рослинну олію, соняшникову олію, рицинову олію, соєву олію, оливкову олію, какао-масло, топлене масло, покровний жир, тощо.
Біомаса може складатися з одного або декількох різних джерел біомаси. Приклади прийнятних джерел біомаси є наступними: первинна деревина, енергетичні сільськогосподарські культури, сільськогосподарські залишки, харчові відходи, муніципальні відходи та промислові відходи або супутні продукти.
Джерело біомаси - первинна деревина може включати, але не обмежується цим; дерев'яні чіпси; кору; хмиз; колоди; тирсу; деревні пелети або брикети.
Джерело біомаси - енергетичні сільськогосподарські культури можуть включати, але не обмежується цим; короткі ротаційні породи або лісництво; недеревні трави, такі як міскантус, конопля, просо прутоподібне, тростини або жито; сільськогосподарські культури, такі як цукристі, крохмальні або олійні культури; або водні рослини, такі як мікро- або тасговодорості та бур'яни.
Сільськогосподарські залишки можуть включати, але не обмежується цим; лушпиння; солому; кукурудзяну солому; борошно; зерно; курячий послід; органічні добрива; навозу жижу; синтез-газ; або силос.
Харчові відходи можуть включати, але не обмежується цим; кожуру/шкіру; шкарлупу; лушпиння; серцевини; зернята/кісточки; неїстівні частини тварин або риби; м'якоть з соку та олійну екстракцію; пивні дробини або хміль з пивоваріння; побутові кухонні відходи; сало, або олії, або жири.
Промислові відходи можуть включати, але не обмежується цим; не оброблену деревину, включаючи пелети, оброблену деревину, сланцеві гази, деревні композити, включаючи
МОР/О50, дерев'яні ламінати, паперову масу / подрібнення / відходи; текстиль, включаючи волокна / нитки / стічні води; або осад стічних вод.
Додаткові продукти
Зо Крім того, передбаченим також є виробництво інших корисних органічних сполук, наприклад, похідних метакрилової кислоти, таких як їхні різні складні ефіри. Відповідно, продукт метакрилової кислоти можуть бути естерифікованим для того, щоб отримати їх складний ефір.
Потенційні складні ефіри можуть бути вибрані з С1-Сго алкілових або С2-Сі2 гідроксіалкілових, гліцидилових, ізоборнілових, диметиламіноетилових, трипропіленгліколевих складних ефірів.
Найбільш переважно спирти або алкени, використовувані для утворення складних ефірів можуть бути отримані з біо- джерела, наприклад біометанол, біоетанол, біобутанол. Переважні складні ефіри представляють собою етил-, н-бутил-, ізо-бутил-, гідроксиметил-, гідроксипропіл- або метилметакрилат, найбільш переважно, метилметакрилат або бутилметакрилат.
Переважно метакрилова кислота перетворюється в алкіл- або гідроксіалкілметакрилат за допомогою реакції естерифікації. Прийнятні умови реакції для такого перетворення є добре відомими в даній галузі та є описаними в поєднані з виробництвом метакрилової кислоти в
МО/2012/069813.
Відповідно до дванадцятого аспекту представленого винаходу передбаченим є спосіб отримання полімерів або співполімерів метакрилової кислоти, або складних ефірів метакрилової кислоти, який включає стадії: () отримання метакрилової кислоти та/або її похідних відповідно до першого, другого або третього аспектів або наступних аспектів винаходу; (і) необов'язкової естерифікації метакрилової кислоти, отриманої на (ї) для того, щоб отримати складний ефір метакрилової кислоти; (ії) полімеризації метакрилової кислоти та/або її похідних, отриманих на (ї) та/або, якщо присутній, складного ефіру, отриманого на (ії), необов'язково з одним або декількома співмономерами, для того, щоб отримати їх полімери або співполімери.
Стадія () може включати будь-які з подальших ознак, представлених стосовно першого, другого та третього аспектів в даному документі вище, в комбінації з тими, які з дванадцятого аспекту.
Переважно, складний ефір метакрилової кислоти з (ії), зазначеної вище, вибирають з С1-Сго алкілових або С2-С:12 гідроксіалкілових, гліцидилових, ізоборнілових, диметиламіноетилових, трипропіленгліколевих складних ефірів, більш переважно етил-, н-бутил-, |ізо-бутилу-, гідроксиметила-, гідроксипропіл- або метилметакрилату, найбільш переважно, 60 метилметакрилату, етилметакрилату, бутилметакрилату або бутилметакрилату.
Таким чином, відповідно до наступного аспекту представленого винаходу передбаченим є спосіб отримання полімерів або співполімерів складних ефірів метакрилової кислоти, який включає стадії: () отримання складних ефірів метакрилової кислоти відповідно до третього аспекту або наступного аспектів за винаходом; (ії) полімеризації метакрилової кислоти та/або її похідних, отриманих на (ії), необов'язково з одним або декількома співмономерами, для того, щоб отримати їх полімери або співполімери.
Стадія () може включати будь-які з подальших ознак, представлених стосовно третього аспекту в даному документі, описаному вище, в комбінацію тими, які зазначені в дванадцятому аспекті.
Переважно, такі полімери будуть мати значну частину, якщо не всі з мономерних залишків, отриманих з джерела іншого, ніж горючі корисні копалини.
В будь-якому випадку, переважні співмономери включають наприклад, моноетиленно ненасичені карбонові кислоти та дикарбонові кислоти, та їх похідні, такі як складні ефіри, аміди та ангідриди.
Зокрема переважні співмономери представляють собою акрилову кислоту, метилакрилат, етилакрилат, пропілакрилат, н-бутилакрилат, ізо-бутилакрилат, трет-бутилакрилат, 2- етилгексилакрилат, гідроксіетилакрилат, ізо-борнілакрилат, метакрилову кислоту, метилметакрилат, етилметакрилат, пропілметакрилат, н-бутилметакрилат, ізо- бутилметакрилат, трет-бутилметакрилат, 2-етилгексилметакрилат, гідроксіетилметакрилат, лаурилметакрилат, гліцидилметакрилат, гідроксипропілметакрилат, ізо-борнілметакрилат, диметиламіноетилметакрилат, трипропіленгліколь-диакрилат, стирол, а-метилстирол, вінілацетат, ізоціанати, включаючи толуол діїзоціанат та р, рі-метилен дифеніл діїзоціанат, акрилонітрил, бутадієн, бутадієн та стирол (МВ5) та АВ5 піддані дії будь-якого із зазначених вище співмономерів, які не є мономером, вибраним з метакрилової кислоти або складного ефіру метакрилової кислоти в (ії) або (ії), зазначених вище в будь-якій наведеній співполімеризації зазначеного кислотного мономера або складного ефіра в (ї) або зазначеного мономера складного ефіра в (ії) з одним або декількома співмономерами.
Звичайно, також можливим є використовувати суміші різних співмономерів. Співмономери
Зо самі по собі можуть бути або не можуть бути отриманими за одним й тим самим способом, як мономери з (ї) або (ії), зазначених вище.
Відповідно до дванадцятого аспекту представленого винаходу передбаченою є поліметакрилова кислота, поліметилметакрилатні (РММА) та полібутилметакрилатні гомополімери або співполімери, утворені зі способу одинадцятого аспекту за винаходом в даному документі.
Приклади
Зараз винахід буде проілюстрований з посиланням на наступні не обмежуючі приклади та фігури, де: -
Фігура 1 показує графік Лайнуівера-Берка для кінетичної характеристики карбокси- термінального гексагістидину, міченого 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестеразою (75 мкг.мл") з
Апіпгорасіег 5р. 5 з метакрилілом-СоА як субстратом.
Фігура 2 показує графік Лайнуівера-Берка для кінетичної характеристики карбокси- термінального гексагістидину, міченого 4-гідроксибензоїл-СоОА тіоестеразою (1 мг.мл") з
Апіпгорасіег 5р. 5 з ізобутирилом-СоА як субстратом.
Фігура З показує сліди перекриття ВЕРХ стандартів ізобутирил-СоА (основний пік при 32,2 хв. та незначний пік при 32,9 хв), метакриліл-СОА (основний пік при 30,8 хв. та незначний пік при 31,6 хв), метакрилової кислоти (пік при 13,5 хв) та ко-фермента А (основний пік при 11 хв. та незначний пік при 12 хв), використовуючи спосіб ВЕРХ для того, щоб визначити іп міго активність коротколанцюгової ацил-СоА оксидази (АСХ4) з Агарідорвів ІНаійапа для окиснення ізобутирилу-СоОА до метакрилілу-СоА. Флавін-аденін динуклеотид елюювали при 27,8 хв, та використовували як внутрішній стандарт для ізобутирилу-СоА та метакрилілу-СоА.
Фігура 4 показує слід ВЕРХ аналізованої суміші, яка містить екстракт, який не містить АСХА, очищений карбокси-термінальний гексагістидин, мічений 4НВТ та флавін-аденін динуклеотид в
НЕРЕЗ буфері для аналізу, без додавання будь-якого субстрату, як негативного контролю.
Фігура 5 показує аналіз ВЕРХ аналізованої суміші після 30 хв. інкубування безклітинного екстракту АСХА з ізобутирилом-СоА в буфері для аналізу НЕРЕ5, який містить флавін-аденін динуклеотид.
Фігура 6 показує аналіз ВЕРХ аналізованої суміші після 30 хв. інкубування безклітинного екстракта АСХА з ізобутирилом-СоА в буфері для аналізу НЕРЕ5, який містить флавін-аденін бо динуклеотид, який був введенний з додатковим ізобутирилом-СоОА після цього реакційну суміш було зупинено підкисленням.
Фігура 7 показує аналіз ВЕРХ фермент-зв'язаної реакції для перетворення ізобутирилу-СоА в метакрилову кислоту та ко-фермента А з використанням АСХА4 безклітинного екстракту та очищеного карбокси-термінального Нібх-міченого 4АНВТ.
Фігура 8 показує РЕТ2ОБ5(я):А4НВТ-АСХ-Асз5А плазміду, РЕТ2ОБ(к) плазміду, яка містить 4НВТ ген, АСХА ген та Ас5А ген всі під контролем одного промотора 17.
Фігура 9 показує 505-РАСЕ аналіз 4НВТ, АСХА та АсзА спів-експресії з використанням Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ5(-):4НВТ-АСХА-АсзаА.
Фігура 10 показує сліди ВЕРХ що виконуються для аналізу біотрансформації ізомасляної кислоти до метакрилової кислоти та всіх відповідних контролів, 20,5 годин після індукування, причому фігура 10А показує сліди, проведені для культури Е. соїї ВІ21 (ОЕЗ) рі уз5 рРЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХА-АсзА, в яку не додавали ніякої ізомасляної кислоти; фігура 108 показує культуру Е. соїї ВГ21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20Б(ж), в яку не додавали ніякої ізомасляної кислоти; фігура 10С показує слід ВЕРХ 5 мМ стандарта ізомасляної кислоти; фігура 100 показує слід
ВЕРХ культури Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ(х), яка була доповнена ізомасляною кислотою (5 мМ) через 1 год. після індукування експресії рекомбінантного протеїну, фігура 10Е показує слід ВЕРХ коктейлю зі стандартів ізомасляної кислота (5 мМ) та метакрилової кислоти (200
МКМ), та фігура 10Е показує слід ВЕРХ БЕ. соїї В 21 (ОЕЗ) р ув рЕТ2ОБ():4НВТ-АСХ4-Ас5А культури, в яку додавали ізомасляну кислоту (5 мМ) через 1 год. після індукування експресії рекомбінантного протеїну.
Фігура 11 показує зміну в концентрації метакрилової кислоти з часом (нижня лінія) в культурі
Е. сої ВІ21 (ОЕЗ) ріуз5 рЕТ205(4)4НВТ-АСХА-Ас5А, яка була доповнена ізомасляною кислотою, а також зміну в ІпП(ОЮвоо) культури з часом (верхня лінія), з моменту додавання ізомасляної кислота в культуру.
Фігура 12 показує плазміду РЕТ20О5(-4):4НВТ-АСХ4А-ррВСКО, плазміду рЕТ2ОБ(ю) з кодон- оптимізованими генами, які кодують 4НВТ з Аппгорасієї зр. штама 5), АСХ4 з Агабідорвів
ІШаїапа, а також гени рКалт, ркад2, рКкав та Ірам з Рзейдотопа5 риїйда КтТ2440, всі під контролем одного 17 промотор.
Фігура 13 показує аналіз ВЕРХ коктейлю зі стандартів 2-кетоізовалеріанової кислоти (5 мМ),
Зо ізомасляної кислоти (5 мМ) та метакрилової кислоти (200 мкм), при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 14 95 ацетонітрил в 50
ММ КНеРО», який підкислювали до рн 2,5 з НОСІ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв".
Фігура 14 показує аналіз ВЕРХ культури штама Е. соїї ВІ21 (ОЕЗ3) рі уз5 рЕТ2ОБ(ю)з негативним контролем, при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 14 95 ацетонітрил в 50 мМ КНеРоО», який підкислювали до рн 2,5, використовуючи НОЇ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв".
Фігура 15 показує аналіз ВЕРХ культури БЕ. соїї В 21 (ОЕЗ) р ув5 рЕТ2О5(-):4НВТ-АСХУ-
РРВСКО, при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 1495 ацетонітрил в 50 мМ КНеоРО»з, який підкислювали до рН 2,5 використовуючи НОСІЇ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв"", демонструючи виробництво метакрилової кислоти з глюкози.
Фігура 16 показує аналіз ВЕРХ зразка культури Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ():АНВТтТ-
АСХ4А-ррВСОКО, який був введенний з додатковими 0,24 мМ аутентичної метакрилової кислоти, при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 1495 ацетонітрил в 50 мМ КНеРО», який підкислювали до рН 2,5 використовуючи НОЇ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв".
Фігура 17 показує аналіз ВЕРХ культури штама Е. сої ВІ21 (ОЕЗ) рі уз рЕТ2ОБ(ю) з негативним контролем, яка була доповнена 2-кетоїзовалеріановою кислотою, при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 14 95
БО ацетонітрил в 50 мМ КНеРоОз, який підкислювали до рН 2,5 використовуючи НОСІЇ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв".
Фігура 18 показує аналіз ВЕРХ культури БЕ. соїї В 21 (ОЕЗ) р ув5 рЕТ2О5(-):4НВТ-АСХУ-
РРВСКО, яка була доповнена 2-кетоїзовалеріановою кислотою (5 мМ), при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 14 95 ацетонітрил в 50
ММ КНегРО», який підкислювали до рН 2,5 використовуючи НС, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв", демонструючи, що доповнення культури 2-кетоїзовалеріановою кислотою стимулює продукування метакрилової кислоти даним штамом.
Фігура 19 показує аналіз ВЕРХ зразка культури Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ():АНВТтТ-
АСХ4А-ррВОКО, яка була доповнена 2-кетоізовалеріановою кислотою (5 мМ), яка була введенна бо з додатковими 0,24 мМ аутентичної метакрилової кислоти, при цьому компоненти розділялись з використанням ізократичного елюювання, використовуючи 14 95 ацетонітрил в 50 мМ КНеРОх, який підкислювали до рН 2,5 використовуючи НОЇ, при об'ємній швидкості потоку 1 мл.хв".
Фігура 20 показує структуру плазміди РММА121 для експресії Агарідорзіз ІНайапа АСХА протеїна в Е.соїї.
Фігура 21 показує продукування метакрилілу-СоА з ізобутирилу-СоА, використовуючи протеїн Агабрідорзів Інаійапа АСХА4, отриманий з рекомбінантної Е.соїї з приклада 5.
Фігура 22 показує 50О5-РАСЕ аналіз фракцій рекомбінантної Е.соїї з приклада 5, який містить протеїн Агабідорзів ІНаійапа АСХА.
Фігура 23 показує структуру плазмід руУуА0О8, рмММА133 та рмММА134 для експресії яблучного ААТ (МрААТІ), АСХА з Агарідорвіб5, та БКалхт, ркадг, ькав та Ірам: ВСКАО генів комплексу з штаму Рзепдотопазх аєгидіпоза РАО!1 в рекомбінантній Е.соїї.
Фігура 24 показує продукування бутилметакрилату з 2-кетоїзовалерату та бутанолу, застосовуючи ВЕРХ аналіз зразка культури продукування рекомбінантної Е.соїї, яка експресує плазміду РММА 134.
Приклад 1: Селективний гідроліз метакрилілу-СоА
Приклад 2: Окиснення ізобутирилу-СоА до метакрилілу-СоА та іп міо перетворення ізобутирилу-СоА в метакрилову кислоту та ко-фермент А в фермент- сполучуванній реакції.
Приклад 3: Цільноклітинна білтрансформація ізомасляної кислоти в метакрилову кислота.
Приклад 4: Цільноклітинне продукування метакрилової кислоти з глюкози через поміжну сполуку - 2-кетоіїзовалерат.
Приклад 5: Цільноклітинне продукування бутилметакрилату з 2-кетоізовалерату з використанням рекомбінантної ЕвсПетгісніа соїї 111 Матеріали для прикладів 1-4
Переліченими є бактеріальні штами, які використовуються в прикладах з першого по четвертий, а також середовища для росту та агарові пластини, які використовуються протягом всіх експериментів. В таблиці праймерів наведені всі праймери, які використовуються в даному дослідженні, та в таблиці плазмід наведені всі плазміди, які використовуються та сконструйовані під час даного дослідження. 1.11 Бактеріальні штами
Зо Е. соїї УМ107 використовували як господар плазміду клонування, тоді як Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) ріг узо використовували як господар експресії генів. 1.1.2 Бактеріальні середовища для росту та агарові пластини з поживними речовинами 1.1.2.1 Бульйон Луріа-Бертані (І.В середовища)
Високосольове середовище Луріа-Бертані (Мейога) (25 г.л") використовували там, де згадується середовище ІВ, при цьому 25 г високосольового середовища ІВ в 1 літрі складається з пептону з казеїнового лізату (10 г.л"7), дріжджового екстракту (5 г.л"") та хлориду натрію (10 гл"). Середовище ІВ часто доповнювали карбеніциліном (50 мкг.мл"), хлорамфеніколом (34 мкг.мл 7) та/або глюкозою (1 95 мас./об.). Середовище І В стерилізували з використанням автоклаву, в той час, як вихідні розчини глюкози (20 95 мабс./0б.) у воді, карбеніциліну (100 мг.мл") у воді та хлорамфеніколу (34 мг.мл") в етанолі стерилізували та додавали окремо. 1.1.2.2 М5Х мінімальне середовище
МОХ середовище отримували шляхом поєднання середовища М5БА (760 мл.л"), середовища М5В (200 мл.л") та 12,5 95 (мас./о0б.) вихідного розчину глюкози (40 мл.л") при кімнатній температурі. Середовище М5В складалося з МНАСІ (15 г.л") та МаЗО».7НгО (2.0 г.ли) та стерилізували з використанням автоклаву. Середовище М5А складалося з КНеРох (7.89 г.л- т), вишняк-мікроелементи (2.63 мл.л") та розчин КОН додавали доки рН не досягало 7,0 до того, як МЗА стерилізували з використанням автоклаву. Вишняк-мікроелементи були отримані як попередньо описано (Мізийпіас МУ, Запієї М. ТНЕ ТНІОВАСІМІ. ВасіеєгіоІодіса! Вемієм5 1957;21(3):195-213.), але використовуючи тільки 3,9 г.л" 7п504.7Н2О. Глюкозу стерилізували фільтрацією, використовуючи 0,22 мкм стерилізуючий фільтр. Середовище МОХ (іноді доповнювали рибофлавіном (1 мг.л"), та спочатку це досягалося за рахунок розчинення рибофлавіну в МОВ середовища (5 мг.л"). Даний розчин потім стерилізували фільтрацією, та розчин М5В ж рибофлавін потім змішували з М5А та глюкозою в такому самому об'ємі, як для середовища М5Х самостійно, для утворення МОХ, доповненого рибофлавіном. Як М5Х, так і
М5Х, доповнений рибофлавіном, завжди доповнювали карбеніциліном (50 мкг.мл") та хлорамфеніколом (34 мкг.мл"), отриманим як попередньо описано для середовища І В. 1.1.2.3 Луріа-Бертані агарні планшети
Агарні планшети Луріа-Бертані були отримані, використовуючи високосольове середовище 60 Луріа-Бертані (Меога) (25 г.л") та агар (20 г.л"). Суміш з ЇВ та агару стерилізували з використанням автоклаву та давали охолонути протягом 1 години в 50 "С водяній бані перед виливанням. ІВ агарні планшети часто доповнювали карбеніциліном (50 мкг.мл-ї1), хлорамфеніколом (34 мкг.мл-1) та/або глюкозою (1 95 мас./об.). Вихідні розчини карбеніциліну, хлорамфеніколу та глюкози отримували, як попередньо описано для рідкого бульйону Луріа-
Бертані, та додавали до ЇВ агарного розчину тільки перед виливанням. Вихідний розчин глюкози попередньо нагрівали на 50 "С водяній бані протягом 1 години перед тим, як його додавали до І В агару.
Таблиця 1.1.3
Таблиця праймерів та перелік послідовностей
ОБАВ |СТОССАТАТСТАТАТСТОСТОТТАСТСАСсАСаСосАСЯ 77778
ОЕВ.Е 0 |СТОАСТААСАССАСАТАТАСАТАТОССАСТІСТаДасСАОС 77777779
ЗЕБЕО ІЮ МО. 1 - послідовність кодон-оптимізованого гена для 4-гідроксибензоїл-Сод- тіоестерази (4НВТ) з Аппобасієг 5р. штаму 5) для експресії в ЕвсПегісніа сої.
ЗЕО І МО. 4 - Продукт полімеразної ланцюгової реакції, здійсненої для модифікації гена
АНВТ таким чином, що суб-клонування ПЛР продукту в рЕТ20ОБ(ї) плазміді з утворенням рЕТ2ОБ(-):СІНІібз-4НВТ плазміди.
ЗЕО ІЮ МО. 5 - ген, який кодує мічений карбокси-термінальним гістидином 4НВТ фермент в рЕТ2ОБ(-):СІНІібз-4НВТ плазміді.
ЗЕО ІЮ МО. 6 - кодон-оптимізований ген, який кодує коротколанцюгову ацил-СоА оксидазу (АСХа) з Агарідорзів ІНаїіапа для експресії в ЕвсПегісніа сої.
ЗЕО ІЮ МО.11 - Продукт полімеразної ланцюгової реакції з праймерами перекривання для конкатенату 4НВТ та АСХА в одному полінуклеотиді.
ЗЕБЕО ІЮ МО.12 - кодон-оптимізований ген, який кодує ацил-СоА синтетазу (Ас5А) з
Рзепдотопавх сПіогогарпіз В23 для експресії в ЕвсПетгісніа сої.
ЗЕО І МО.13 - Послідовність між, та включаючи, сайти рестрикції Має!ї та ХнНої в рРЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХА-АсзаА.
ЗЕО І МО 14 - полінуклеотид "рРрРВСКО", синтезований ВіотаїйкК, який містить чотири гени, які кодують субодиниці Рзейдотопах риїіда КТ2440 дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом, яка доставляється в плазміду РВОК:"ррвоко.
ЗЕО ІЮ МО.15 - Послідовність між, та включаючи, сайти рестрикції Має! та Хної в плазміду рРЕТ2ОБ(-)анНВвВТ-АСХА-ррВСКО.
Зо ЗЕО ІО МО. 22 - послідовність вектора експресії РЕТ16р (556), який містить модифікований з5е8387І сайт рестрикції.
ЗЕО ІЮ МО. 23 - кодон-оптимізований ген, який кодує коротколанцюгову ацил-СоА оксидазу (АСХ4) з Агарідорзіз ІНаіапа для експресії в векторі експресії РЕТ16БЬ (556).
ЗЕО ІО МО. 24 - кодон-оптимізований ген, який кодує алкоголь-ацилтрансферазу (ААТ) з яблука для експресії в векторі експресії РЕТ16Б (556).
Таблиця 1.1.4
Таблиця плазмід
Вектор клонування, який надає резистентність рвМН:аНВт бютагх. до ампіциліну, який містить кодон- огрогайоп оптимізований ген, який кодує 4НВТ фланкований сайтами рестрикції Маеєї та Мої.
Вектор клонування, який надає резистентність до ампіциліну, який містить кодон-
Віотацік оптимізований ген, який кодує АсзА,
РВМН:АсзА с . фланкований сайтом рестрикції 3" ХпоЇї та 5", огрогайноп . . . ні - послідовність якого містить сайт рестрикції
Мпеї, сайт зв'язування рибосоми, спейсерну послідовність та сайт рестрикції Маеї.
Вектор клонування з чотирма генами, які кодують комплекс дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом з Рзендотопав
Віотацік ршіда КТ2440, фланкований 3" Хпої сайт рвок:ррвсКко Согрогайоп рестрикції та 5" послідовність, яка складається з сайту рестрикції Храї, спейсерної послідовності, сайта рестрикції Мпеї, сайта зв'язування рибосоми та другої спейсерної послідовності.
Плазміда клонування, яка надає резистентність до ампіциліну, та яка містить
РМА-НО:АСХА Іїте Тесппоіодієб5 | кодон-оптимізований ген, який кодує АСХА з
Агарідорзів (паіапа, фланкований 5" Маеї та 3"
ХПпОЇ сайт рестрикції. сон роУЄТ1.2 лінеаризований вектор клонування з руУЕЄТ1,2 вектор клонування, який містить продукт полімеразної ланцюгової реакції для заміщення стоп-кодона 4НВТ з 5-с(А-3"
РОТІ 2:СІНІЗ-АНВТ Дана робота послідовністю з наступним сайтом ХПОЇ, таким чином, що при суб-клонуванні вставка в рЕТ2ОБ(т), утворений ген кодує 4НВТ з С- термінальною Ніб-міткою, доданою до кінця, з трипептидним лінкером в поміжному стані. руУЕЄТ1,2 вектор клонування, який містить продукт полімеразної ланцюгової реакції з , праймерами перекривання, який зв'язує 4НВТ рт 2гаЯНВТАСХЯ Дана робота та АСХА гени в один полінуклеотид з новим сайтом зв'язування рибосоми поміж двох генів. рЕТ20ОБ(х) вектор експресії, який містить , кодон-оптимізований ген, який кодує 4НВТ з рЕт2гор(іюЮ НВ Дана робота Агіпгобрасіег 5р. штаму З) між Маеї та Мої! сайтами рестрикції. рЕТ20ОБ(х) вектор експресії зі вставкою з рУЄТІ1 2:СЯІНІЗ-4НВТ суб-клонованим поміж , мае! та Хпої сайтами рестрикції, для експресії ретгор(ю:СІНІЗЯНВТ Дана робота 4НВТ з СІу-і ви-Сіо-Нів-Нів-Нів-Нів-Ніз-Нів пептидом, доданим до карбокси-кінця кожної субодиниці.
Таблиця 1.1.4 (продовження) рЕТ20ОБ(х) вектор експресії, який містить кодон-оптимізований ген, який кодує
РЕТ2ОБ(- :АСХА Дана робота коротколанцюгову ацил-СоА оксидазу з
Агабрідорзів (паіІапа, клоновану поміж Маеї та
ХпОЇ сайтів рестрикції. рРЕТ2ОБ(-у вектор експресії, який містить , кодон-оптимізований ген, який кодує Асз5А, рЕТ2ОБ(к) :АсвА Дана робота клонований поміж Має! та Хпої сайтів рестрикції. рЕТ20ОБ(х) вектор експресії, який містить 4НВТ та АСХА гени, суб-клоновані як один полінуклеотид з РУЕТІ 2:4НВТ-АСХА плазміди в РЕТ2ОБ(к) плазміду поміж Маеї та ХпоЇ! рРЕТ2ОБ(-)аНВТ-АСХА Дана робота сайтамии рестрикції, таким чином, що утворюється експресійна одиниця для спів- експресії як 4НВТ, так і АСХА, та здатний прийняти другу вставку між ново введеними сайтом Мпеї та сайтом Хпої. рЕТ20ОБ(-):4НВТ-АСХА вектор експресії, який , містить Ас5А ген, суб-клонованим з рЕТ2оБ(5) ЯНВ АСХа-АсзА | Дана робота РВМН:АсзА плазміди поміж його сайтами Мпеї та Хпої. рЕТ20ОБ(х) вектор експресії, який містить , чотири гени, які кодують ррВСКО комплекс, рЕТ2гоБ(7ррВСКО Дана робота суб-клонований з рВ5К:ррВСКО плазміди поміж хХваї та Хпої! сайтами рестрикції. рЕТ20ОБ(-):4НВТ-АСХА вектор експресії, який , містить чотири гени, які кодують РРВСКО
ВК Дана робота комплекс, суб-клонований з рВ5К:ррВСКО плазміди в ньому поміж його сайтами рестрикції Мпеї та ХпоЇ. рЕТ16Б вектор експресії з модифікованим рЕТ16Б (55є) вектор експресії, який містить
АСХА ген з АПаїїапа, оптимізований для
РММАТ21 Дана робота експресії в РЕТ16р (556) між його сайтами рестрикції Храї! та 55е83871. рЕТ16Б(55е) вектор експресії, який містить оперон, який кодує ВСКАЮО комплекс з штаму ру/Аоов Дана робота Р. аегодіпоза РАС, введеного між його МесоЇ та 55е8387І сайтами рестрикції. рЕТ(55е) вектор експресії, який містить ААТ ген з яблука, оптимізованого для експресії в рАдтагте Дана робота РЕТІ6Б (556), введений між його Мсо! та з5е8387І сайтами рестрикції рААТ212 плазміда, яка додатково містить
АСХА ген з АПаїїапа, оптимізований для
РММАТЗЗ Дана робота експресії в вектор РЕТ16Б (556), введений між сайтом рестрикції Зреї та геном ААТ. рРММА133 та румАбО8 плазміди ліговані разом та які містять ген АСХА з АПаїїапа, оптимізований для експресії в вектор РЕТ16р
РММА134 Дана робота (55є), ген ААТ з яблука, оптимізований для експресії в векторі РЕТ16р (556), та комплекс
ВСКАбО з штаму Р. аегидіпоза РАО1, введений між хваї та 55е8387І сайтами рестрикції.
1.2 Загальні способи для Прикладів 1-4 1.2.1 Трансформація плазмід в господар клонування Е. соїї УМ107.
Плазміди (1 нг) трансформували в Е. соїї УМ107 (50 мкл), який був зроблений компетентним, використовуючи бактеріальний трансформаційний набір ЕРептепіа5 ТгтапвіоптАїій("мМ, Свіже трансформовані клітини інкубували на кризі протягом 5 хв., потім висівають в попередньо нагріті
ЇВ агарні планшети, доповнені карбеніциліном (50 нг.мкл"). Планшети інкубували при 37 С протягом 16 годин. 1.2.2 Фрагменти рестрикції плазмід
Для того, щоб виділити ген або полінуклеотидні вставки з плазмід, фрагментів рестрикції плазмід здійснювали, використовуючи серії Регптепіаз Разібідез(ке рестрикційних ендонуклеаз, відповідно до наданих інструкцій. Всі реакції фрагментів рестрикції здійснювали на водяній бані при 37 "С протягом З годин. 1.2.3 Отримання лінійного вектора експресії
Плазміди лінеаризували в реакціях фрагмента рестрикції (100 мкл), які включають плазміду
ДНК (100 нг.мкл"), сбгеєп буфер Рептпепіаз Разібідеб5( (1Х) та Регтепіаз Разібіде5(в рестрикційні ендонуклеази, як описано вище. Лінеаризовані вектори чистили, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі та екстракцію геля без першого інактивування нагріванням рестрикційних ендонуклеаз. 5" фосфати лінеаризованих векторів потім гідролізували з використанням антарктичної фосфатази (Мем Епдіапа Віоїар5) відповідно до наданих інструкцій. Дефосфорильований вектор концентрували за рахунок осадження етанолу, що вимагало додавання ЗМ натрію ацетату, рН 5,2, до зразка (об'єм, який додають: 1/1072 від початкового об'єму зразка) з наступним додаванням абсолютного етанолу (об'єм, який додають: 2х об'єм нового зразка). Осаджену суміш інкубували протягом ночі при -20 "С. Осаджену ДНК потім центрифугували в роторі Еррепдогії тіпізріп Е-45-12-141 при 13400 обертах/хвилину протягом 30 хв. Супернатант відкидали, та клітинну пелету промивали 70 95 (об./06.) етанолом.
ДНК пелету потім центрифугували в тому самому роторі та та з тією ж самою швидкістю, як до цього протягом додаткових 10 хв. Супернатант видаляли, та ДНК пелету сушили на повітрі у витяжній шафі протягом 20 хв. перед тим, як знову суспендували у воді вільній від нуклеази (50 мкл). Концентрацію лінеаризованого вектора визначали, застосовуючи аналітичний
Зо електрофорез на агарозному гелі. 1.2.4 Електрофорез на агарозному гелі та екстракція геля
Лінійні фрагменти ДНК з розщеплення плазміди або ПЛР ампліфікації чистили, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі. Лізати або ПЛР продукти завантажували на агарозний гель, який складається з агарози (1 95 (мас./06.)), броміда етидію (1,78 мкм), Тгі5 ацетату (4 мМ) та етилендіамінтетраоцтової кислота (ЕДТО) (1 мМ). Різниця потенціалів 7В на сантиметр довжини гелю застосовувалась по всьому гелю для того, щоб розділити полінуклеотиди. ДНК візуалізувались на гелі за допомогою а транслюмінотора, та фрагмент гелю, який містить полінуклеотид який викликає зацікавленість видаляли скальпелем.
Полінуклеотид очищали від фрагмента гелю за допомогою набора для екстракції геля
ОСПІАдиїскКеУ. концентрацію полінуклеотида визначали, застосовуючи аналітичний електрофорез на агарозному гелі. 1.2.5 Лігування вставок в лінеаризовані плазміди
Генні вставки лігували в лінеаризовану плазміду в реакції лігування (20 мкл). Реакції лігування складалися з генної вставки та лінійного вектора (50 нг) в молярному співвідношенні 31 для генних вставок менших, ніж З тис.пар в довжину, або молярному співвідношенні 1:1 для генних вставок більших, ніж З тис.пар в довжину, разом з Т4 ДНК лігазою (1 одиниця) та буфера
Еегтепіах для Т4 ДНК лігази (1Х). Лігування здійснювали при кімнатній температурі протягом 20 хв, та суміш лігування (2,5мкл) використовували як джерело плазміди для трансформації в Е. соїї УМ107, яке здійснювали, використовуючи набір для бактеріальної трансформації Регтепіа5
ТгапетоптАїйа, як і до цього. Трансформовані клітини висівали на попередньо нагріті І В агарні планшети, доповнені карбеніциліном, та інкубували при 37 "С протягом 16 годин. 1.2.6 Суб-клонування полінуклеотиду в вектор експресії
Для того, щоб суб-клонувати полінуклеотид в новий вектор, вектор-джерело спочатку ампліфікували за рахунок його трансформінгу (1 нг) в Е. соїї "М107, використовуючи набір для бактеріальної трансформації Рептепіа5 ТгапетогтАїйа М, та потім отриману І В культуру (5 мл) доповнювали карбеніциліном для кожної з 5 унікальних колоній на агаровому планшеті. 5х5 мл культури І ВеКарбеніцилін інкубували при 37 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 16 годин, та плазміди чистили від культури, використовуючи набір ОІАСЕМ ОІАргер?
Зріп тіпіргер як описано у посібнику. Полінуклеотиди, які викликають зацікавленість, бо відщеплювали від кожної плазміди отримання в реакціях рестрикції фрагмента (20 мкл),
використовуючи 1 мкл потрібної рестрикційної ендонуклеази для кожного з бажаних 5" та 3" сайтів клонування. Фрагменти рестрикції об'єднували разом, та полінуклеотид, який повинен бути суб-клонованим в новий вектор, очищали від залишку вектора-джерела, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі та екстракцію геля. Встановленою була реакція лігування для того, щоб лігувати полінуклеотидну вставку в лінеаризований вектор експресії, попередньо отриманий з комплементарними "липкими" кінцями до вставки. Реакцію лігування (2,5мкл) використовували як джерело плазміди для трансформації в Е. соїї УМ107, як вже описано.
Експресуючу плазміду ампліфікували шляхом інокуляції культури І В-Карбеніцилін (100 мл) з однією колонією з планшета трансформантів, інкубуючи культуру при 37 "С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину протягом 16 годин, та очищуючи оплазміду від культури, використовуючи набір для плазміди МіадаіРгер ОІАСЕМ. 1.2.7 Трансформація Е. соїї ВІ 21 (СЕЗ) р уз5 з використанням вектора експресії
Вектор експресії (1 нг) трансформували в господаря експресії Е. соїї ВГ21 (ОЕЗ) рі уз5.
Компетентні клітини були придбані у Момадеп, та охолоджену кригою циркулярну плазміду (1 нг) додавали до охолоджених кригою компетентних клітин (20 мкл). Трансформаційну суміш інкубували на кризі протягом 5 хв. перед 30 с термічним шоком при 42 "С. Після термічного шоку, клітини інкубували на кризі протягом додаткових 2 хв. БОС середовище (Момадеп) (80 мкл) додавали до трансформованих клітин, та клітини інкубували при 37 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 60 хв. перед тим, як висівати в І В агарні планшети, які доповнювали карбеніциліном (50 мкг.мл"), хлорамфеніколом (34 мкг.мл'") та глюкозою (1 95, мас./о6.). Планшети інкубували при 37 "С протягом 16 годин. 1.2.8 Аналітичний електрофорез на агарозному гелі
Лінійну гомогенність та концентрацію ДНК визначали, застосовуючи аналітичний електрофорез на агарозному гелі. Агарозні гелі складалися з агарози (1 95 (мас./об.)), броміда етидію (1,78 мкм), Тгі5 ацетату (4 мМ) та ЕДТО (1 мм). Фіксований об'єм (5 мкл) зразка ДНК завантажували на гель поряд з СепеКшег"м 1 тисгоснов плюс ДНК леддер (Тпепто Зсіепійіс) (мкл). Для того, щоб оцінити концентрацію зразка, інтенсивність смуги зразка була візуально зіставлена з нтенсивністю смуг подібного розміру та відомих мас в леддері, як описано у посібнику для Сепекціег "м 1 тис.основ плюс ДНК леддер.
Зо 1.2.9 Натрію-додецил-сульфатний електрофорез на поліакріламідному гелі
Зразки (1,5 мл) були взяті з клітинних культур, та клітини пелетували центрифугуванням при 50009 протягом 10 хв. Клітині пелети знову суспендована в клітинному лізисному буфері, використовуючи 100 мкл для кожної ОЮвоо одиниці, клітинна культура була в момент взяття зразків. Клітинний лізисний буфер містив калію фосфатний буфер (100 мМ, рн 7,5), клітинний лізисний детергент ВидВивіег (Мегок-МійШіроге) (1Х), бензоназну нуклеазу (Зідта Аїагісп) (0,01 Об, об./06.) та коктейль з інгібітора протеази (Коспе). Знову суспендовані клітини інкубували протягом 20 хв. зі струшуванням при 250 обертах/хвилину та центрифугували при 18 000 д протягом 20 хв. при 4 "С. Нерозчинну фракцію знову суспендували в калій-фосфатному буфері (100 мМ, рн 7,5), використовуючи такий самий об'єм, як використовували для того, щоб знову суспендувати клітинну пелету. Розчинну та нерозчинну фракції змішували в співвідношенні 1:1 з 2Х буфером Леммлі для зразка (Віо-Кад), який містить В-меркаптоетанол (5 95, об./06.). Зразки кип'ятили при 100 "С протягом 5 хв. та завантажували на збірний гель Віо-Ваа Апуко тах.
Електрофорез здійснювали при 200 В в буфері для перебігу Тгіз/Гліцин/505 (Віо-Каай). Гелі промивали шляхом просочення їх в подвійній дистильованій воді при кімнатній температурі з легким перемішуванням (50 обертів/хвилину) протягом 5 хв. Воду видаляли та процедуру промивання повторювали додаткових чотири рази. Гелі потім забарвлювали шляхом просочення протягом ночі (16 год.) в реагенті для забарвлення гелю Е7ВІне "М (БЗідта-Апагісн) при кімнатній температурі з легким перемішуванням протягом 16 годин. 1.3 Приклад 1 - Отримання метакрилової кислоти з метакрилілу-Сод:
Фермент 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестераза (4НВТ) з АпНгорасієї зр. штама 5) (Сепрапк номер доступу ААС80224.1, МОпіргої номер доступу 004416, ЕС номер 3.1.2.23) був ідентифікований як кандидат тіоестерази для гідроліза метакрилілу-СоА після пошуку по базі даних та літературі щодо тіоестераз з відомою активністю на субстратах, які є структурно зв'язаний з метакрилілом-СоА.
Ген, який кодує амінокислотну послідовність для 4НВТ, представляв собою кодон, оптимізований для експресії в Е. соїї та синтезований Віотаїйк Согрогайоп із сайтом рестрикції мае, інтегрованим в 5" кінець, та сайтом рестрикції Мої, доданим до 3" кінця.
Синтезований полінуклеотид (ЗЕО). ІО 1) був доставлений в вектор клонування РВМНАНВТ, та вставка гена 4НВТ була суб-клонована в попередньо лінеаризований рЕТ2ОБ(к) вектор бо експресії, в сайти рестрикції Маєї та Моїй, для утворення рЕТ20Б(ж7)4НВТ. Заново сконструйовану рЕТ20ОБ(х):4НВТ плазміду потім трансформували в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 для утворення Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) р уз5 рЕТ2ОБ(-):4НВТ.
Для того, щоб експресувати фермент - 4-гідроксибензоїл-СоОА тіоестеразу, стартову культуру (20 мл) середовища ІВ, яке доповнювали глюкозою, карбеніциліном та хлорамфеніколом, спочатку інокулювали однією колонією Е. соїї ВІ21 (ОЕЗ) ріГуз5 рЕТ20Б(-4НВТ з ІВ агарного планшета, доповненого глюкозою, хлорамфеніколом та карбеніциліном. Стартову культуру інкубували при 37"С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину до тих пір доки культура не досягала ОЮбвоо 1,0. Клітини потім збирали шляхом центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С та використовували для інокулювання поміжної культури (100 мл) середовища ІВ, також доповненого глюкозою, карбеніциліном та хлорамфеніколом. Поміжні культури також інкубували при 37 С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину до ОЮвоо 1,0. Клітини в поміжній культурі потім збирали шляхом центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С перед тим, як повторно суспендували в свіжому середовищі ЇВ (1 ол), знову доповненому глюкозою, карбеніциліном та хлорамфеніколом, в 2,5 л колбі для культивування з дефлекторами. Дану культуру інкубували при 37 "С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину до ООЮвоо 1,0 та потім індукували експресію 4АНВТ шляхом додавання ізопропіл-В-Ю-тіогалактопіранозиду (ІРТС) до кінцевої концентрації 0,4
ММ. Культуру інкубували протягом додаткових 5,5 год. при тих самих умовах. Культуру поділяють рівномірно на три центрифужні пробірки, та клітини потім збирали шляхом центрифугування при 50009 протягом 20 хв. при 4 "С. Зразок культури, взятий перед тим, як клітини збирали, апалізували, використовуючи 505-РАСЕ, який показав, що протеїн є високо розчинним та таким, що добре експресується. Клітині пелети в кожній центрифужній пробірці промивали три рази в буфері для аналізу (50 мл), який складається з 2-І4-(2-гідроксіетил)піперазин-1-іл|)етансульфонової кислоти (НЕРЕБ5) (50 мМ), рН якого регулювали до 7,5 гідроксидом калію. Клітинні пелети заморожували при -80 "С до лізування.
Даний процес повторили для Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ(х), штама негативного контроля холостого РЕТ2ОБ(к) вектора.
Для того, щоб одержати безклітинний екстракт фермента 4НВТ, одну з клітинних пелет Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) р уз5 рЕТ20Б(7):4НВТ, який отримували попередньо, повторно суспендували в
Зо буфері для аналізу НЕРЕЗ (50 мМ, рн 7,5) та лізували в системах з постійними парметрами одноточкового клітинного дезінтегратора. Клітинний лізат центрифугували при 18 00049 протягом 15 хв. при 4 "С, та супернатант з цього центрифугували при 57 7509 протягом додаткових 60 хв. при 4 "С. Даний супернатант промивали, використовуючи центрифужний концентратор з відсіканням за молекулярною масою Мімазріп Мімаб 10 000, центрифугуючи при 10 0009 при 18 "С до шести-разового зменшення об'єму, з наступним шести-разовим повторним розбавленням в буфері для аналізу НЕРЕ5 та додатковим шести-разовим зменшенням об'єму в центрифужному концентраторі. Визначення загальної концентрації протеїну безклітинних екстрактів з надекспресуючої культури Е. соїї В21 (ОЕЗ) рГуз5 рЕТ20Б(к):4НВТ здійснювали, використовуючи набір для аналізу Віокай ОС, використовуючи бичачий сироватковий альбумін як протеїновий стандарт. Такої самої процедури дотримувалися для того, щоб одержати безклітинні екстракти з клітинної пелети Е. соїї ВГ21 (0ОЕЗ3) ріуз5 рЕТ2ОБ(ю), негативного контрольного штаму.
Для того, щоб проаналізувати фермент 4НВТ щодо активності до метакрилілу-СоА, спочатку отримували метакриліл-СоА. Синтез метакрилілу-СоА здійснювали за реакцією ко-фермента А з метакриловим ангідридом. Реакція складалася зі ко-фермента А (20 мМ) та метакрилового ангідрида (40 мМ) в натріє-фосфатному буфері (100 мМ, рН 8,5). Реакційну суміш інкубували на кризі та перемішували на вортексі кожні 2 хв. протягом 30 хв., та кінцеву реакційну суміш підкислювали до рН 3,5 соляною кислотою. Побічний продукт метакрилової кислоти та непрореагований метакриловий ангідрид видаляли шляхом екстракції з використанням 4 х10 мл насиченого водою діеєтилового ефіру. Метакриліл-СоОА очищали, застосовуючи високоефективну рідинну хроматографію з оберненою фазою (ОФ-ВЕРХ) на колонці аналітичного розміру (Адіїеєпі 7огїбах Есіїрзе ХОВ С18 колонка, 4,6 мм х 150 мМ). Зразок (75 мкл) впорскували в С18 колонку, та елюювали через 40 хв., застосовуючи лінійний ацетонітрильний градієнт (1,8 95 - 13,5 95) в 0,1 95 трифтороцтовійї кислоті (ТФО), зі швидкістю потока 1 мл.хв".
Основний пік представляв собою пік, який містить метакриліл-СоА, та фракції, які містять метакриліл-СоОА, збирали та об'єднували. Ацетонітрил видаляли застосовуючи ротаційний випарник (21"С, 3 кПа), залишаючи за собою водний розчин метакрилілу-СоА та трифтороцтової кислоти. Даний розчин метакрилілу-СоА та трифтороцтової кислоти доводили рН 7, застосовуючи гідроксид натрію та миттєво заморожували з рідким азотом перед тим, як бо ліофілізувати. ТФО видаляли щляхом повторного розчинення висушеного при заморожуванні зразка у воді вільній від нуклеази (10 мл), та повторення циклу заморожування-висушування- повторне розчинення в двічі більше, один раз в 5 мл, та нарешті в 1 мл води, вільної від нуклеази. Концентрацію метакрилілу-СоА визначали за поглинанням на 260 нм з коефіцієнтом молярного екстинкції 16800 М" .см".
Приблизні ферментні аналізи 4НВТ здійснювали в кюветах (1 мл), які містять безклітинний протеїновий екстракт (1 мг.мл"), метакриліл-СоОА (приблизно 100 мкм), 5'5-дитіобіс-(2- нітробензойну) кислоту (ОТМВ) (500 мкм). Реакції розпочинали шляхом додавання субстрата та контролювали при 412 нм. Ферментні аналізи повторювали для безклітинних екстрактів Е. сої
ВІ21 (ОЕЗ) ріуз5 рЕТ2ОБ(ї). Ферментні аналізи для безклітинних екстрактів як 4НВТ надекспресуючого штама, так і холостого контрольного штама вектора повторювали також для ізобутирил-СоА, як субстрату.
Приблизні ферментні аналізи 4НВТ демонстрували, що 4НВТ каталізує гідроліз метакрилілу-«СоОА, та демонстрували селективність для метакрилілу-СоОА в порівнянні з ізобутирилом-СоА, як субстратом.
Для того, щоб краще охарактеризувати 4-гідроксибензоїл-СоА тіоестеразу, фермент був Нів- міченим таким чином, щоб його можна було проаналізувати як чистий фермент, а не як частину безклітинного екстракту. Для Нів-міченого фермента, проводили полімеразну ланцюгову реакцію. Прямі та зворотні праймери для 4НВТ Нівз-мічення, ННТ.Е (ЗЕО. ІО 2) та ННТ.А (5ЕО.
ІО 3), були розроблені для заміщення (5-ТАА-3") стоп-кодону з гена, який кодує 4НВТ на (5- са«аА-3") послідовність та для введення 3" ХНо!Ї сайта рестрикції безпосередньо після цього.
Таким чином, при клонуванні ПЛР продукт врізався в рЕТ2ОБ(к) між сайтами рестрикції Має! та
ХпОї, створювалася відкрита рамка зчитування, яка кодує 4НВТ зі спейсерною послідовністю гліцин-лейцин-глутамат та карбокси-термінальною гексагістидиновою (Нів) міткою.
Суміші полімеразної ланцюгової реакції містили РЕТ20ОБ(-):4НВТ плазміду як матричну ДНК (50 пг.мкл"), КОО ДНК-полімераза (1 одиниця), праймер ННТ.Е (0,4 мкм), праймер ННТ.В (0,4 мкм), дезоксиаденозинтрифосфат (аАТР) (0,2 мМ), дезокситимідинтрифосфат (ТР) (0,2
ММ), дезоксицитидинтрифосфат (аСТтТР) (0,2 мМ), дезоксигуанозинтрифосфат (дДСТР) (0,2 мМ),
Масіг (1 мм) та Моухадеп буфер Я для ДНК-полімерази КОВО (1Х). Суміші ПЛР завантажували в ампліфікатор, запрограмований на початок при 94 "С протягом З хв., потім потім цикл через 30
Зо ітерацій з 30 с плавленням при 94 "С, 30 с ренатурацією при 55 "С, 80 с подовженням при 72 "С, перед закінченням з 5 хв. при 72 70.
Продукт ПЛР (5ЕО. ІЮ 4) очищали, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі з наступною екстракцію геля, та тупий кінець лігували в рУЕТ1,2 вектор клонування з утворенням рУЄТІ,2:СІНіз-4НВТ. Потім вставку суб-клонували з руєТ1,2:СІНіЗ-АНВТ в рЕТ2ОБ(ю поміж сайтами рестрикції Має! та Хпої з утворенням рЕТ2ОБ(к):СТНІіз-4НВТ. Господар експресії Е. соїї
ВІ21 (ОЕЗ3) ріуз5 потім трансформували з рЕТ20Б(ж):СІНіє-4НВТ з утворенням сС- термінального міченого гексагістидином господаря експресії 4НВТ, ЕБ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рРЕТ2ОБ(:СТНІібз-4НВТ.
Чистий карбокси-термінальний Ніз-мічений фермент 4НВТ був потім отриманий шляхом першого вирощування культур Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рі уз рЕТ2ОБ(-):СТНІібз-4НВТ та індукування експресії точно так само, як було виконано для Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) р ухє5 рЕТ20Б(:4НВТ. Зразок культури, взятої через 5,5 год. після експресії показав, що карбокси-термінальний Ніб-мічений
АНВТ фермент також був дуже розчинним та експресувався на високих рівнях. Клітини збирали шляхом розщеплення клітинної культури в три центрифужні пробірки та центрифугування при 50009 протягом 20 хв. при 4 "С. Клітині пелети не промивали зовсім, та замість цього безпосередньо зберігали при -80 "С. Безклітинний екстракт карбокси-термінального міченого гексагістидином 4НВТ отримували шляхом повторного суспендування однієї з клітинних пелет
Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20Б(-): СТІНібз-4НВТ у зв'язувальному буфері (б мл) для нікель- сефарозної ЕРІ С колонки. Зв'язувальний буфер складався з МанНгРО»х (10 мМ), МагНРО» (10
ММ), Масі (500 мМ), імідазолу (30 мМ) та рН регулювали до 7,4 за допомогою НСІ. Бензоназу? нуклеазу (0,6 мкл) додавали до повторно суспендованих клітин перед тим, як їх лізували в системі з постійними парметрами одноточкового клітинного дезінтегратора. Клітинний лізат потім чистьили, застосовуючи центрифугування при 18 000д протягом 15 хв. при 4 С, з наступним центрифугуванням супернатанта при 57 7509 протягом 60 хв. при 4 "С. Даний супернатант потім завантажували в колонку СЕ Неайпсаге НізТгтар'М ЕЕ Сгиде (1 мл), яку урівноважували зв'язувальним буфером. Незв'язані протеїни вимивали з колонки п'ятьма об'ємами колонки зв'язувального буфера, та Ніз-мічений протеїн елюювали лінійним градієнтом концентрації імідазолу від 30 мМ до 500 мМ понад 20 об'ємів колонки. Елюювання протеїну відслідковували на 280 нм, та фракції перевіряли на присутність та чистоту карбокси- бо термінального Ніз-міченого 4НВТ, застосовуючи 505-РАСЕ. Фракції, які містили чистий СІНІів-
АНВТ протеїн об'єднували, та буферний обмін для того, щоб замінити буфер елюювання на калію-фосфатний буфер для аналізу (100 мМ, рН 7,5) здійснювали в Мімазріп Мімаб 10,000 центрифужному концентраторі з відсіканням за молекулярною масою. Для того, щоб здійснити буферний обмін, об'єднані фракції центрифугували через ультрафільтраційну мембрану центрифужного концентратора при 10 0009 при 1829С доки об'єм об'єднаних фракцій зменшувався до 1 мл. Протеїнову фракцію, яка залишилась розбавляли в шість разів калію- фосфатним буфером для аналізу, та зразки концентрували, застосовуючи подальше центрифугування через ультрафільтраційну мембрану при тих самих умовах до досягнення шести-разового зменшення об'єму. Останнє розбавлення в калію-фосфатному буфері для аналізу та повторне концентрування здійснювали ще раз, та концентрацію СІНІЗ-4НВТ протеїну визначали за УФгво поглинанням, з використанням спектрофотометру МапоОгор МО1000, за коефіцієнтом молярної екстинкції 20970 М7.см" та а молекулярною масою 17516,5 мг.ммоль" для карбокси-термінального Ніз-міченого 4НВТ фермента. Значення коефіцієнта молярної екстинкції та молекулярної маси визначали, за допомогою інструмента Ехразу РгоїРагат, використовуючи амінокислотну послідовність гена трансляції, що кодує карбокси-термінальний пі5 мічений фермент 4НВТ (5ЕО). ІО 5) в рЕТ20Б(ж):СІНІбз-4НВТ плазміді.
Кинетична характеристика очищеного карбокси-термінального міченого гексагістидином фермента 4НВТ здійснювалася для метакрилілу-СОоА, який був попередньо отриманий, та для ізобутирилу-СоА (придбаний у 5ідта Аїагіси, як літієва сіль ізобутирил-СоА).
Реакції гідролізу метакрилілу-СоА (200 мкл) здійснювали в 96б-лункових планшетах Мипс, використовуючи очищений СІНіє-4НВТ протеїн (0,075 мг.мл") та ОТМВ (0,5 мМ) для відслідковування реакції. Початкові швидкості визначали для початкових концентрацій метакрилілу-СОоА 0,375 мМ, 0,3 мМ, 0,225 мМ, 0,15 мм та 0,075 мм. Реакції починали шляхом додавання фермента.
Реакції гідролізу ізобутирилу-«СоА (200 мкл) також проводили в 96б-лункових планшетах
Мипс, використовуючи очищений СІНІЗ-4АНВТ протеїн (1 мг.мл") та ЮОТМВ (0,5 мМ) для відслідковування реакції. Початкові швидкості визначали для початкових концентрацій ізобутирилу-СоА 0,5 мМ, 0,4 мМ, 0,3 мМ, 0,2 мМ та 0,1 мМ. Реакції знову починалися шляхом додавання ферменту.
Зо Графіки Лайнуівера-Берка були побудовані для кінетичної характеристики, як метакриліла-СоА (Фіг. 1), так і ізобутирил-СоА (Фіг. 2). Кінетичні константи для карбокси- термінального міченого гексагістидином 4НВТ для метакрилілу-СоА становили Км 1,6 мМ та
Мтах 470 нмоль.мг".хв", тоді як для ізобутирил-СОА, вони становили Кт З мМ та Мтах 16,7 нмоль.мг хв.
Таким чином, було продемонстровано, що 4НВТ каталізує гідроліз метакрилілу СОоА та може використовуватися для того, щоб отримати метакрилову кислоту. Оскільки 4НВТ гідролізує метакриліл-СоОА з більш низькими значеннями Км та більш високими значеннями Мтах, ніж для ізобутирилу-СоА, гідроліз метакрилілу-"СоА за допомогою 4НВТ переважно є високо селективним. 1.4 Приклад 2 - Утворення метакрилілу-СоА та метакрилової кислоти з ізобутирилу-СоА
Фермент коротколанцюгової ацил-СоА оксидази (АСХ4) з Агабрідорзіз ІПаМйапа (Сепрапк номер доступу АВО17643.1, Опіргої номер доступу 096329, ЕС номер 1.3.3.6) був ідентифікованим, використовуючи літературний пошук, як фермент ацил-СоА оксидаза з детектованою активністю до ізобутирилу-СОоА, як субстрату, коли експресується в клітинних лініях комах.
Для того, щоб визначити, чи може дана оксидаза бути функціонально експресована в
ЕзсПегісніа соїї з корисними рівнями активності до ізобутирилу-СоА, як субстрату для його інтеграції в метаболітичний шлях, ген, який кодує амінокислотну послідовність для АСХА, представляв собою кодон оптимізований для експресії в Е. соїї від І їе Тесппоіодіє5 із сайтом рестрикції Маеї, інтегрованим в 5" кінець та сайтом рестрикції ХпоЇ - в 3" кінець.
Синтезований полінуклеотид (5ЕО. ІО б) доставлявся в рРМА-КОАСХА плазміду, та ген- вставка був суб-клонованим в попередньо лінеаризований рЕТ2ОБ(к) вектор, в сайти рестрикції мае! та Хпої, з утворенням РЕТ20Б(7)АСХ4. Заново сконструйовану РЕТ2ОБ(ї):АСХА плазміду потім трансформували в Е. соїї В21 (ОЕЗ3) рі уз5 з утворенням Е. соїї В21 (ОЕЗ) рі уз5
РЕТ2ОБ(- :АСХАа.
Для того, щоб дослідити експресію АСХ4, МОХ стартової культури, яке доповнювали карбеніциліном та хлорамфеніколом, інокулювали з однією колонією Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20ОБ(ї:АСХА з І В агарового планшета, який був доповнений глюкозою, хлорамфеніколом та карбеніциліном. Стартову культуру (20 мл) інкубували при 37"С зі струшуванням при бо 200 обертах/хвилину протягом 16 годин. Клітини збирали зі стартової культури шляхом
Зо центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С та потім повторно суспендували в свіжому
М5Х середовищі поміжної культури (100 мл), яке також доповнювали хлорамфеніколом та карбеніциліном. Поміжні культури інкубували при 37"С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину до ОЮвоо 1,0. Клітини потім збирали з поміжної культури за допомогою центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С та повторно суспендували в свіжому МОХ культури (1 л), який доповнювали хлорамфеніколом, карбеніциліном та також рибофлавіном, в 2,5 л колбі для культивування з дефлекторами. Культуру інкубували при 37 "С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину до ОЮвоо 0,7, та потім індукували експресію шляхом додавання ІРТО до кінцевої концентрації 0,4 мМ. Культуру інкубували протягом додаткових 7 год. при тих самих умовах перед тим, як клітини розділяли на три центрифужні пробірки та збирали за допомогою центрифугування при 50009 протягом 20 хв. при 4 "С. Зразок культури, взятий перед тим, як клітини збирали та апалізували, застосовуючи 50О5-РАСЕ, який показав, що АСХ4 протеїн добре експресується та, що приблизно одна третя АСХ4 протеїна знаходиться в розчинній фракції та дві треті в нерозчинній фракції. Клітинні пелети промивали три рази в буфері НЕРЕ5 (50 мм), рН якого регулювали до 7,5, використовуючи КОН. Клітинні пелети заморожували при - 80 "С перед тим, як лізувати. Спосіб повторювали для Е. соїї В 21 (ОЕЗ) руз5 рЕТ2ОБ(), негативного контрольного штаму.
Для одержання безклітинного екстракту фермента АСХ4, одну з клітинних пелет, яку попередньо отримували, повторно суспендували в буфері НЕРЕЗ (50 мМ, рн 7,5) (6 мл), який був доповнений флавін-аденін-динуклеотидом (БА) з кінцевою концентрацією 10 мкм.
Повторно суспендовані клітини потім лізували в системі з постійними парметрами одноточкового клітинного дезінтегратора. Лізат центрифугували при 180009 протягом 15 хв. при 4 "С, та супернатант з цього додатково центрифугували при 57 750 обертах/хвилину протягом 60 хв. при 4"С. Супернатант концентрували в МімазЗріп Мімаб 10000 центрифужному концентраторі з відсіканням за молекулярною масою, центрифугуючи при 100009 при 18 "С до шести-разового зменшення об'єму ретентату. Ретентат промивали один раз за рахунок шести- разового повторного розбавлення в буфері НЕРЕ5З (50 мМ, рн 7,5), який знову доповнювали
ЕАО (10 мкм), з наступною другою стадією концентрування в центрифужному концентратору шляхом зменшення об'єму в шість-разів. Загальна концентрація протеїну в ретентаті
Зо визначалась, використовуючи ВіоКай ОС протеїновий набір для аналізу, використовуючи бичачий сироватковий альбумін, як протеїновий стандарт.
Аналітичний спосіб ВЕРХ був розроблений для розділення ізобутирилу-СоА (ІВ-СоА), метакрилілу-СоА (МАА-СоА), флавін-аденін-динуклеотиду (ЕАБ), метакрилової кислоти (МАА) та ко-фермента А (СоА-5Н). Ко-фермент А, метакриліл-СоА та ізобутирил-СоА елюювали на 11,0 хв., 30,8 хв. та 32,2 хв., відповідно. Ко-фермент А, метакриліл-СоОА та ізобутирил-СоА кожен невеликий пік хвоста (другорядний), пов'язаний з основним піком на 12 хв., 31,6 хв. та 32,9 хв., відповідно (Фіг. 3). Метакрилову кислоту елюювали на 13,5 хв.,, та ЕА0, використовувану в наближеному аналізі АСХ4 та як внутрішній стандарт для стандартів ізобутирилу-СоА та метакрилілу-Соа, елюювали при 27,8 хв.
Для того, щоб забезпечити те, щоб ко-фермент А, метакрилова кислота, ізобутирил-СоА та метакриліл-СоА не повинні бути сплутаними з піками безклітинного екстракту, безсубстратний контроль здійснювали, використовуючи АСХ4 безклітинний екстракт (0,8 мг.мл"), очищали
СяНібз-АНВТ (0,6 мг.мл") та ГАО (10 мкм) в буфері НЕРЕЗ. Ніякі піки не спостерігались при елююванні в періоди часу елюювання ко-фермента А, метакрилової кислоти, метакрилілу-СоА або ізобутирилу-СоА (Фіг. 4).
Дслідження активності АСХА здійснювали в 1,5 мл мікро-центрифужній пробіркці. Реакційні суміші неочищеного фермента складалися з безклітинного АСХА протеїнового екстракта (0,8 мг.мл"7), ізобутирила-СоА (500 мкм) та флавін-аденін-динуклеотида (10 мкм) в буфері НЕРЕ5 (50 мМ, рн 7,5). Реакційну суміш інкубували при 30 "С в 1,5 мл мікро-центрифужній пробірці, зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 30 хв., та кінцевий реакційний продукт аналізували, застосовуючи аналітичну ВЕРХ (фіг. 5). Метакриліл-СоОА представляв собою основний продукт, з піком при 30,7 хв. концентрація утвореної метакрилової кислоти під час наближеного ферментного аналізу становила 74 мкМ.
Для того, щоб підтвердити, що пік метакрилілу-«СоА був справжнім, та, що він не представляв собою пік ізобутирилу-СоА із зсувом часу елюювання, зразок був введенний з ізобутирилом-СоОА та знову аналізували використовуючи ВЕРХ. АСХА інактивували, коли зразок підкислювали, та це гарантувало те, що будь-який додатковий ізобутирил-СОА не буде перетвореним в метакриліл-СоА. Більш того, введенний зразок ізобутирила-СоА показав не тільки вихідний пік метакрилілу-СоА, але також додатковий пік при 32 хв. з характерним піком в 60 хвості ізобутирила-СоА (Фіг. 6).
Для того, щоб визначити, чи може метакрилова кислота бути отримана із ізомасляної кислоти в реакції сполучення ферментів, було постановлено експеримент, в якому сирий АСХА інкубували з очищеним ферментом СІНіє-4НВТ. Такий самий безклітинний екстракт АСХ4 використовували як джерело протеїну для АСХА4, хоча чистий СІНІіз-4АНВТ отримували знову, за таким самим способом як і для його кінетичної характеристики в прикладі 1, але здійснюючи буферний обмін в буфері НЕРЕЗ (50мМ, рН 7,5) на кінці, замість попередньо використовуваного фосфатного буферу. Таким чином, неочищений АСХА (0,8 мг.мл") спільно інкубували з чистим СІНізх-4НВТ (0,6 мг.мл") разом з ЕРА (10 мкм) та ізобутирил-СоА (500 мкм) в буфері НЕРЕ5. Зразок інкубували при 30 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 30 хв, та аналізували, застосовуючи ВЕРХ. Метакрилова кислота та ко-фермент А представляли собою основні продукти. Пік метакрилової кислоти спостерігався на 13,45 хв., в той час, як основний та другорядний піки ко-фермента А спостерігалися на 11,1 хв. та 12,1 хв., відповідно. Концентрація метакрилової кислоти, яка утворювалась під час реакції сполучення фермента (Фіг. 7), становила 345 мкм, що була в 4,7 разів більше, ніж під час наближеного аналізу одного АСХА.
Це підтверджує, що АСХА окиснює ізобутирил-СоОА. Крім того, було продемонстровано, що комбінація АСХА з 4НВТ іп міїго надає можливість перетворення ізобутирилу-СоА в метакрилову кислоту до промислово прийнятних рівнів. 1.5 Приклад 3 - Цільноклітинна біотрансформація ізомасляної кислоти в метакрилову кислоту.
Крім того, біотрансформація ізомасляної кислоти в метакрилову кислоту, використовуючи ацил-СоА синтетазу для того, щоб активувати ізомасляну кислоту зі ко-ферментом А з утворенням ізобутирилу-СоА є показаною в представленому прикладі, та це також показаним є для ацилу-СоА оксидази АСХ4А з Агарідорвіз Шаїїапа, щоб оксидизувати ізобутирил-СоА в метакриліл-СоА, а також для ацил-СоА тіоестерази 4НВТ з АпНгорасієї зр. штаму З), щоб гідролізувати метакриліл-СОА в метакрилову кислоту та ко-фермент А.
Ацил-СоА синтетаза Ас5А з Рзецпдотопа5 сПпіогогарпіз В23 (СепрапкК номер доступу:
ВАБООО933.1, ипіргої номер доступу. 052072) була ідентифікованою із бази даних та літературного пошуку як АМР-утворююча ацил-СоА синтетаза, здатна активізувати ізомасляну
Зо кислоту до ізобутирилу-СОоА, з опублікованою константою Міхаєліса (Кт) 0,14 мМ, та число оборотів (Кса) 10,6 с".
В даному прикладі, ми демонструємо конструкцію вектора на основі рЕТ2ОБ(ю),
РЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХА-АсзА, для спів-експресії генів, які кодують 4НВТ, АСХА та Ас5А з одного оперону під контролем Т7 промотора рЕТ20Б(-), та його використання для кодування метаболічного шляху для цільноклітинної біотрансформації ізомасляної кислоти в метакрилову кислоту.
Конструювання оперону здійснювали в дві стадії. Перша стадія включала конструювання вектора на основі РЕТ2ОБ(ю), рЕТ2ОБ(яу:4НВТ-АСХА, для спів-експресії генів, які кодують тільки
АНВТ та АСХА, в той час, як друга стадія включала суб-клонування гена, який кодує Ас5А в векторі РЕТ2ОБ5(ї)4НВТ-АСХА, зі своїм власним сайтом зв'язування рибосоми на місці, для того, щоб сконструювати кінцеву плазміду РЕТ2О0Б(ї-:4нНВвВтТ-АСХ4-АсзА.
Для того, щоб сконструювати вектор рЕТ20Б(ї):4НВТ-АСХЯ4, гени, які кодують 4НВТ та
АСХА4, спочатку були скон'юговані в один полінуклеотид, з новим сайтом зв'язування рибосом між геном, який кодує 4НВТ та, який кодує АСХ4, для того, щоб забезпечити ефективну трансляцію останнього. Для об'єднання двох генів разом, здійснювали полімеразну ланцюгову реакцію з праймерами перекривання. Полімеразну ланцюгову реакцію з праймерами перекривання здійснювали саму по собі в дві стадії. Спочатку, гени, які кодують 4НВТ та АСХА4, ампліфікували з їх відповідних векторів експресії, РЕТ20ОБ(ї):4НВТ та рЕТ20ОБб(ї):АСХЯ, в двох окремих полімеразних ланцюгових реакціях, реакціях "А" та "В".
Праймери, які використовувались для полімеразної ланцюгової реакції з праймерами перекривання представляли собою праймер ОБ.АЕ (5ЕО. ІО 7), прямий праймер для полімеразної ланцюгової реакції з праймерами перекривання А; праймер ОБ.А.К (5ЕО. ІО 8), зворотний праймер для полімеразної ланцюгової реакції А; праймер ОЕ.В.Е (ЗЕО). ІО 9), прямий праймер для полімеразної ланцюгової реакції з праймерами перекривання В та нарешті, ОЕ.В.К (ЗЕБЕО. 10 10), зворотний праймер для полімеразної ланцюгової реакції з праймерами перекривання В. "Липкий" кінець праймера ОЕ.А.Е був розроблений для того, щоб утримувати сайт рестрикції Маеї на 5" кінці нових полінуклеотидів. "Липкі" кінці праймерів ОБЕ.А.К та ОБ.В.Е були розроблені так, щоб вони містили комплементарні послідовності один до одного для того, щоб забезпечити конкатенація двох продуктів ПЛР з реакцій А та В. Комплементарні бо послідовності були розроблені таким чином, що при конкатенації двох продуктів ПЛР буде вводитись міжгенна послідовність між геном 4НВТ та геном АСХ4, яка містить новий сайт зв'язування рибосоми для останнього гена. Нарешті, "липкий" кінець праймера ОЕБЕ.В.К був розроблений так, щоб містити два сайти рестрикції, сайт рестрикції Мпеї та сайт рестрикції ХпоЇ.
Це дозволило об'єднати полінуклептид, який містить гени 4НВТ та АСХ4, для клонування в плазміді РЕТ2ОБ(ж) в його сайтах рестрикції Має! та Хпої! з утворенням рЕТ2ОБ(ю):4НВТ-АСХА, та для гена Ас5А - для клонування в плазміді РЕТ20ОБ(ї):4НВТ-АСХА поміж сайтами рестрикції
Мпе! та ХпоЇ з утворенням рЕТ20р(ю:4НВвВТ-АСХ4-Ас5А плазміди. Спейсерна послідовність, збагачена аденіном та тиміном була включена між сайтами рестрикції Мнеї та Хпої в праймері
ОЕБЕ.В.К для того, щоб знизити температуру ренатурації праймера таким чином, щоб ближче відповідав дії інших праймерів, та давав можливість ефективному подвійному розщепленню на суміжних сайтах рестрикції Мпеї та ХпоЇ.
Полімеразна ланцюгова реакція А (50 мкл) включала рЕТ20Б(ї):4НВТ (10 пг.мкл"), як матричну ДНК, КОЮ ДНК полімеразу (одиниця), праймер ОБЕ.А.Е (0,4 мкм), праймер ОБ.А.К (04 мкм), дезоксиаденозинтрифосфат (АТР) (0,2 мМ), дезокситимідинтрифосфат (аТтТР) (02 ММ), дезоксицитидинтрифосфат (СТР) (0,2 мМ), дезоксигуанозинтрифосфат (астр) (0,2 мМ), Мосі» (1 мМ) та Момадеп буфер для КОЮ ДНК полімерази (1Х).
Полімеразна ланцюгова реакція В (50 мкл) складалося з рРЕТ20ОБ(-):АСХА. (20 пг.мкл"), як матричної ДНК, КОЮ ДНК полімерази (1 одиниця), праймера ОЕ.В.Е (0,4 мкм), праймера ОЕ.В.А (0,4 мкм), АТР (0,2 мМ), аттТР (0,2 мМ), астеР (0,2 мм), астрР (0,2 мМ), Масігг (1 мМ) та буфера
Момадеп для КОО ДНК полімерази (1Х).
Обидві ПЛР реакції здійснювали паралельно та за тих самих умов, починаючи з початкової стадії денатурації при 95 "С протягом З хв., з наступними 25 циклами, які складалися з 15 с стадії денатурації при 98 "С, 2 с стадії ренатурації при 50 С та 20 с стадії подовження при 7276. Дані 25 циклів були з наступною додатковою 5 хв. Стадією подовження при 72 "0. Два подвійні дволанцюгові продукти ПЛР, продукт А та продукт В, чистили, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі та екстракцію геля, та їх концентрації визначалися, застосовуючи аналітичний електрофорез на агарозному гелі.
ПЛР продукти А та В потім об'єднували в другій полімеразній ланцюговій реакції, яка складається з продукту ПЛР А (15 нМ), продукту ПЛР В (15 нм), аАТР (0,2 мМ), аттТР (0,2 мМ),
Зо астр (0,2 мМ), астрР (0,2 мМ), Мосі» (1 мм), буфера Момадеп Я! для КОО ДНК полімерази (1Х), диметилсульфоксида (5 95 (06./06.)) та КОЮ ДНК полімераза (8 нл/мкл). Реакцію здійснювали в ампліфікаторі, запрограмованому на початок при 95 С протягом З хв. та продовжували з 15 циклами 15 с стадії денатурації при 98 С, 2 с стадії ренатурації при 50 С та 20 с стадії подовження при 72 "С, та нарешті закінчували додатковою стадією подовження протягом 5 хв. при 7276.
Після даної програми ПЛР, зовнішній прямий праймер та зовнішній зворотний праймер, які використовуються в ампліфікації А та В, відповідно, додавали безпосередньо з концентрованого стокового розчину (50 мкм) до кінцевої концентрації 0,5 мкм. Потім модифіковану реакційну суміш ПЛР піддавали іншому циклі ПЛР, використовуючи ампліфікатор, запрограмований починати діяти з початкової З хв. стадії плавлення при 95 "С, та продовжувати з 15 циклами, які складаються зі стадії плавлення, яка триває 15 с при 98 "С, стадії ренатурації, яка триває 2 с при 55 "С та стадії подовження, яка триває 20 с при 72 "С, перед тим як завершитися додатковою стадією подовження, яка триває 5 хв. при 72 70.
Продукт з даної стадії конкатенації (5ЕО. ІО 11) очищали, застосовуючи електрофорез на агарозному гелі та екстракцію геля, та тупий кінець лігували в вектор клонування руЕТ1.2 з утворенням рУЕЄТ1,2:4НВТ-АСХЯ. Полінуклеотид, який містить конкатенатні гени 4АНВТ та АСХ4 потім суб-клонували в рЕТ20Бб(, утворюючи рЕТ20Б(-):4НВТ-АСХА. Плазміда рРЕТ2ОБ5(-4):4НВТ-АСХА потім була лінеаризованою з використанням рестрикції фрагмента в сайтах рестрикції Мпеї та ХпоЇ.
Для наступної фази конструювання плазміди рЕТ20ОБ5(ї):4НВТ-АСХ4І-АсзА, ген, який кодує амінокислотну послідовність Ас5А представляв собою кодон, оптимізований для експресії в Е. соїї та синтезований корпорацією Віотаїйік із сайтом рестрикції ХпоїЇ, доданим в 3" кінець, та короткою послідовністю, доданою в 5" кінець. Дана послідовність містила сайт рестрикції Мпеї, сайт зв'язування рибосоми, та спейсерну послідовність, яка закінчувалась тринуклеотидом цитозин-аденін-тимін, який разом з початковим кодоном АсзА кодував сайт рестрикції мае.
Синтезований кодон, оптимізований полінуклеотид Ас5А (5ЕО. ІЮ 12), доставлявся в плазміду клонування РВМН.АсСЗзА, та ген Ас5А суб-клонували разом з його 5" сайтом зв'язування рибосоми в лінеаризований вектор рЕТ2ОБ(я:4НВТ-АСХА, між сайтами рестрикції Мпеї та ХпоЇ, утворюючи плазміду РЕТ20Ор(ю):4НВТ-АСХА4-АсзА (Фіг. 8). Дану плазміду потім трансформували бо в Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рГуз5, утворюючи БЕ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2О5(-)4НВТ-АСХА-АсзаА.
Послідовність між, та включаючи, сайтами рестрикції Має! та Хпої в плазміді РЕТ2ОБ(я):АНВТт-
АСХ4-АсзА, є показаною в 5ЕО ІЮ МО 13.
Для того, щоб сконструювати штам для експресії тільки гена Ас5А, ген Ас5А самостійно суб- клонували з вектора клонування РВМН:Асз5А та в плазміду РЕТ2ОБ(х), поміж сайтів рестрикції має! та Хпої, утворюючи рЕТ20Б(ї):Ас5зА. Плазміду рРЕТ20ОБб(:АсзА потім трансформували в Е. соїї ВІ 21 (СЕЗ) рі уз5, утворюючи Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ(--) :АсзаА.
Спів-експресія 4НВТ, АСХ4 та Ас5А з використання ЕЕ. сої ВІ21 (ОЕЗ) ріуз5 рРЕТ2ОБ5():аНВТ-АСХ4А-АсЗА була підтверджена шляхом інкубування культури (100 мл) Е. соїї
ВІ21 (ОЕЗ) ріуз5 рЕТ205(-):НВТ-АСХ4-Ас5А в М5Х середовищі, яке доповнювали рибофлавіном (1 мг.л") при двох різних досліджуваних температурах, 37 "С та 28 "С. Культури росли до ОЮвоо 0,5, та експресію індукували за рахунок додавання ІРТО (0.4 мМ). Зразки були взяті безпосередньо перед індукцією експресії, а також через 1 год., З год., 5 год. та 20 год.
Після індукування. Контрольні штами Е. соїї ВГ 21 (ОЕЗ) рГуз5 рЕТ2ОБ(-:АСХАЯУ, як отримано в прикладі 2, та Е. соїї В21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20Б(ї):Ас5А також культивували при тих самих умовах. Зразки, взяті під час спів-експресії 4НВТ, АСХ4А та АсзА в БЕ. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5
РЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХА-АсзА, а також ті, які взяті під час експресії тільки АСХА в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20О5(їУ:АСХА та Ас5А в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі ух рЕТ2ОБ(к Ас5А аналізували, використовуючи натрійдодецилсульфатний електрофорез на поліакріламідному гелі (505-
РАСЕЕ).
Аналіз з використанням 505-РАСЕ (Фіг. 9) показав, що коли експресю здійснювали при 37 "С, через 5 год. після індукування, високі рівні розчинного 4НВТ (ліва нижня смуга) та гарні рівні АСХ4 (ліва верхня смуга) були детектовані з дуже незначним вмістом нерозчинного протеїну, який детектується, хоча високі рівні нерозчинного Ас5А (права верхня смуга) були експресовані з без Ас5А протеїну, видимого в розчинних фракціях. Трек 1) Холостий РЕТ2ОБ() вектор негативного контроля. 2) Спектри ВК протеїнового леддера. 3) експресія рРЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХА4-АсзА 0 год. розчинявся. 3) З год. розчинявся. 4) 5 год. розчинявся. 5) 0 год. не розчинявся. б) експресія рЕТ2ОБ(ї)Ас5А 5 год. розчинявся. 7) рЕТ20б(-:АСХ4 розчинявся. 8) рЕТ20Б5(ї)4НВТ розчинявся. 9) рЕТ205(ї54НнНВвВТ-АСХА-Ас5А 0 год. не розчинявся. 10) рЕТ20ОБ(ю):4НВвВТ-АСХ4-АсзА З год. не розчинявся. 11) рЕТ20Б5(ї):4НВТ-АСХА-
Зо АсзА 5 год. не розчинявся. 12) РЕТ2ОБ(ж):АсзА 5 год. не розчинявся.
Для того, щоб досліджувати здатність Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рГуз5 рЕТ2О5(-у 4НВТ-АСХА-Ас5А щодо перетворення ізомасляної кислоти в метакрилову кислоту, МОХ для попередньої культури (20 мл), який доповнювали карбеніциліном та хлорамфеніколом, інокулювали з однією колонією
Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рГуз5 рЕТ20Б():4НВТ-АСХ4І-Асз5А в І.В агаровому планшеті, доповненому глюкозою, карбеніциліном та хлорамфеніколом, та інкубували при 37 "С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину протягом 16 годин. Клітини збирали за допомогою центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С, та клітини повторно суспендували в МеХ середовищі (100 мл), доповненому карбеніциліном, хлорамфеніколом та рибофлавіном, в 250 мл колбі для культивування, та дану культури інкубували при 37"С зі струшуванням при 200 обертах/хвилину. Спів-експресію генів індукували шляхом додавання ІРТО (0,4 мМ) при ОЮОвоо 0,5. Культуру інкубували протягом додаткової 1 год. перед тим, як додавали калію ізобутират (рН 7,0) з концентрованого вихідного розчину з концентрацією 500 мМ до кінцевої концентрації 5 ММ в культуральному середовищі. Зразки були взяті безпосередньо після додавання ізомасляної кислоти (зразок в 0 год.) та потім через 1 год., 2 год., 4 год., 6 год., 8 год. та 19,5 год. після цього.
Зразки, взяті під час біотрансформації ізобутирової кислоти в метакрилову кислоту центрифугували в роторі Еррепаогї тіпізріп Б-45-12-41 протягом 5 хв. при 6000 обертах/хвилину. Супернатанти фільтрували через 0,2 мкм Загіогіи5 КС 4 мМ фільтри та потім підкислювали до рН 2,5 5М НС. Підкислений супернатант впорскували в колонку Адіїепі 2ограх
Есіїрхе ХОВ С18 (4,6 мм х 150 мм). ВЕРХ здійснювали зі швидкістю 0,4 мл.хв", та метакрилову кислоту відокремлювали від ізомасляної кислоти шляхом ізократичного елюювання з 14 95 ацетонітрилом в КНгРОх, рН якого регулювали до 2,5 використовуючи НС. Колонку промивали між прогонами за рахунок збільшення швидкості потоку до 1 мл.хв' та концентрації ацетонітрилу до 75 95 протягом 15 хв. Перед тим, як умови поверталися до швидкості потоку 0,4 мл.хв" та 14 95 ацетонітрил для наступного зразка. Колонка давали урівноважитись протягом 20 хв. перед тим, як робили впорскування наступного зразка.
Також робили та аналізували три негативних контроля. Перший контроль представляв собою негативний контрольний штам, Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ(к), який не містив оперон спів-експресії 4НВТ-АСХ4А-Ас5А, та культивували без додавання ізомасляної кислоти до бо середовища після того, як ІРТО додавали до культури середовища. Другий контроль використовув такий самий штам як той, який використовували в першому контролі, але додавали ізомасляну кислоту (5 мМ) через 1 год. після додавання ІРТО до культурального середовища. Третій контроль використовував таку саму ЕЕ. соїї ВІ21 (ОЕЗ3) ріуз5 рРЕТ2ОБ(-):аНВТ-АСХАУ-АсзА, яку використовували в основній біотрансформованій культурі, без додавання ізомасляної кислоти до культуру середовища після спів-експресії 4НВТ, індукували
АСХА та АсзА.
Підсумок слідів ВЕРХ, наведених на фігурі 10, які є слідами зразків, взятих через 20,5 годин після індукування, з усіх чотирьох культур, які досліджувались (19,5 год. - період часу біотрансформації). Фігура 10С представляє собою стандарт ізомасляної кислоти (5 мМ), та фігура 10Е представляє собою стандарт ізомасляної кислоти (5 мМ), змішаної зі стандартом метакрилової кислоти (200 мкм). Фігури 10А, 1088 та 100 показують, що ніяка метакрилова кислота не утворювалась в будь-якому з контролів та фігура 10Е показує, що метакрилова кислота дійсно утворювалася під час біотрансформації.
На фігурі 11 підсумовується отримання метакрилової кислоти з часом, а також рост Е. соїї
ВІ21 (ОЕЗ) ріубз5 рЕТ205(-):4НВТ-АСХ4-Ас5А під час біотрансформації, де кінцева концентрація бажаного продукту метакрилової кислоти становить приблизно 0,25 мМ.
В даному прикладі було продемонстровано цільноклітинний спосіб перетворення вихідної ізомасляної кислоти в метакрилову кислоту на промислово придатних рівнях шляхом спільного експресування 4НВТ, АСХА та АсзА іп міїго в рекомбінантній Е. соїї. 1.6 Приклад 4 - Утворення метакрилової кислоти з глюкози
Комплекс дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом з Рзепдотопа5 ршіда
КТ2440 як було раніше показано, каталізував окисне декарбоксилювання 2-кетоіїзовалеріанової кислоти до ізобутирилу-СОА в рекомбінантному метаболітичному шляху для продукування ізомасляної кислоти в Е. соїї (7папо, К., Хіопо, М. апа Мооагий, А. Р. 2012, СеїІ5 апа теїйод35 ог ргодисіпуд ізоршугіс асії, Міжнародний патент номер УМО 2012/109534 А2). Гени, які кодують альфа-субодиниці дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом (БКаАт), бета- субодиниці дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом (БКаАг), компонент ліпоамід- ацилтрансферази (рКкав) та компонент ліпоамід-дегідрогенази (Ірам) комплекса дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом є згрупованими суміжно один з одним, та всі вони знаходяться під контролем одного промотора в геномній ДНК Рзепдотопаз ршийда КтТ2440 (депрапк номер доступу АЕО15451.1).
Вся немутантного типу послідовність, яка кодує гени БКалт, ркалдг, кам та рам, як вони з'явилися в геномній ДНК Реепдотопавз риїйда КТ2440 між нуклеотидами 4992042 та 4996988, була синтезована корпорацією ВіотаїйікК як одиночний, ррВвВСКО, полінуклеотид (5ЕО. ІЮ 14).
Полінуклеотид ррВвВСсКО містив сайт рестрикції Хпої на 3" кінці, та коротку послідовність на 5" кінці, безпосередньо перед початковим кодоном гена БКаА?Т. Дана 5" додана послідовність містила сайт рестрикції Храї, спейсерну послідовність, сайт рестрикції Мпеї, сайт зв'язування рибосоми, та другу спейсерну послідовність. Сайт ХбаІ був включений для сприяння вставки полінуклеотиду рРРВСКО в плазміду РЕТ2ОБ(к для конструювання рЕТ2ОБ(-:ррвВоСкКОо, здатний експресувати тільки чотири гени з Реепдотопа5 ршіда КТ2550 дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом. Перша спейсерна послідовність була включена для того, щоб підтримувати таку саму кількість пар основ між Т7 промотором та сайтом зв'язування рибосоми в плазміді РЕТ2ОБ(-:ррвосКО, як існує в плазміді рРЕТ2ОБ(ї), та за виключенням шести нуклеотидів, які кодують сайт Мпе! тільки перед сайтом зв'язування рибосоми, спейсерна послідовність є ідентичною до тієї, яка знаходиться між сайтом Храї та сайтом зв'язування рибосоми в плазміді РЕТ2ОБ(ж). Сайт рестрикції МпеІ був включений для того, щоб сприяти вставці полінуклеотида ррВСКО в плазміді РЕТ2ОБ(ї:4НВТ-АСХА для конструювання плазміди рРЕТ2ОБ5(-):аНВТ-АСХА-ррВСКО. Сайт зв'язування рибосоми та спейсерна послідовність були ідентичними до тих, які використовувались тільки перед геном рКал!, коли гени ВСКО були експресовані для продукування ізомасляної кислоти, про яку раніше повідомляли (2Напо, К.,
Хіопд, М. апа Ууосагий, А. Р. 2012, Сеїї5 апа теїШйоаФз ог ргодисіпд ізхоршугіс асії, Міжнародний патент номер УМО 2012/109534 АЗ2).
Одиночний полінуклеотид, який містить чотири гени дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом з Рвзепдотопаб5 ришйда КТ2440, доставлявся в плазміду РВОК (РрВ5КІррВСКО). Чотири гени суб-клонували з плазміди рВОКіррвскО та в плазміду рРЕТ2ОБ5(-):4НВТ-АСХЯА з приклада 2, поміж сайтами рестрикції Мне! та ХНоїЇ, з утворенням рЕТ2ОБ5(-):4НВТ-АСХА-ррВоКО (Фіг. 12). Послідовність ІО 15 показує послідовність між сайтами рестрикції Маеі та ХпоЇ в плазміді рЕТ20Б5(-):нНВвВТ-АСХ4-ррРВСКО. / Плазміду рЕТ20ОБ5(-):4НВТ-АСХА-ррВСКО трансформували в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) р уз5 з утворенням Е. соїї 60 ВІ 21 (ОЕЗ) рГуз5 рЕТ2О5(-):4НВТ-АСХ4А-ррВСКО. Аналогічним чином, чотири гени також суб-
клонували в плазміду рЕТ2гоОБ(ї) між сайтами рестрикції Миеі! та ХроїЇ, утворюючи рЕТ2ОБ5(-) :ррвВокКО, та дану плазміду трансформували в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рГуз5 з утворенням
Е. сої ВІ/21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ5(4):ррВСКО. Даний останній штам використовували щоб допомогти з ідентифікуванням смуг на 505-РАСЕ гелі, які відповідали генам БКалХт, Бкалдг,
БКав та Ірам під час досліджень експресії (не показано).
Попередню культуру М5Х (10 мл), яку доповнювали карбеніциліном та хлорамфеніколом, інокулювали Е. соїї В21 (ОЕЗ3) рі ує5 рЕТ20Б5(я:4НВТ-АСХА-ррВСКО з однієї колонії на І В агаровому планшеті, доповненому глюкозою, карбеніциліном та хлорамфеніколом. Культури інкубували при 37 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 16 годин. Клітини збирали за допомогою центрифугування при 50009 протягом 15 хв. при 4 "С та потім повторно суспендували у свіжому МОХ середовищі (100 мл), яке доповнювали рибофлавіном, а також карбеніциліном та хлорамфеніколом, в 500 мл колбі для культивування. Свіжу культуру інкубували при 37 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину, та експресію індукували в кожній культури при ОЮОвоо 0,5 шляхом додавання ІРТО (0,4 мМ). Культури інкубували протягом додаткових 17 год. перед тим, як були взяті зразки для аналізу з використанням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою (ОФ-ВЕРХ). Повторне культивування здійснювали для культури негативного контролю Е. соїї ВІ21 (ОЕЗ) рі уз5
РЕТ2ОБ( я).
Зразки центрифугували в роторі Еррепадогї тіпібріп Е-45-12-11 протягом 5 хв. при 6000 обертах/хвилину. Супернатанти фільтрували через фільтри 0,2 мікрона Запогпив5 ВО 4 мМ та потім підкислювали до рН 2,5 5М НОЇ. Підкислений супернатант впорскували в колонку
Адііеєпі 2огтбах Есірхе ХОВ С18 (4,6 мм х 250 мМ). ВЕРХ здійснювали зі швидкістю потока 1 мл.хв" та аналіти елюювали з використанням ізократичного елюювання з 14 95 ацетонітрилом в 50 ММ КНгРО», рН якого регулювали до 2,5, використовуючи НОСІ. Колонку промивали між прогонами за рахунок збільшення концентрації ацетонітрилу до 75 95 протягом 15 хв., перед тим, як поверталися до 14 95 ацетонітрилу для 20 хв. стадії попереднього урівноваження.
Стандарти метакрилової кислоти (0,2 мМ), ізомасляної кислоти (5 мМ) та 2- кетоїзовалеріанової кислоти (5 мМ) елюювали на 3,6 хв., 8,3 хв. та 8,6 хв., та з площею піка 5980 мМАЦО.хв., 330 мАШО.хв. та 1580 мАШ.хв., відповідно. Аналіз ВЕРХ коктейлю 2-
Зо кетоіїзовалеріанової кислоти (5 мМ), ізомасляної кислоти (5 мМ) та метакрилової кислоти (200
МКМ) є показаною на фігурі 13.
Аналіз ВЕРХ зразка, взятого з культури негативного контролю Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ20Б(я), показаний на фігурі 14, не демонстрував ніяких піків на очікуваній ділянці для метакрилової кислоти, в той час, як аналіз зразка, взятий з культури Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рі уз5 рРЕТ2ОБ5(-):аНВТ-АСХА-ррВвСКО показав пік на 8,6 хв. З площею піка 0,88 АЦ.хв., що відповідає концентрації метакрилової кислоти 0,11 мМ (Фіг. 15).
Для того, щоб підтвердити те, що пік дійсно є репрезентативним для метакрилової кислоти, зразок був введенний з додатковою 0,24 мМ метакриловою кислотою з 10 мМ вихідного розчину, та даний введенний зразок також аналізували, застосвуючи ВЕРХ, як показано на фігурі 16. Один пік з площею 2,7 АЦШ.хв., який відповідав концентрації метакрилової кислоти 0,34
ММ спостерігали на 8,5 хв., підтверджуючи, що штам ЕЕ. соїї ВІ21 (ОЕЗ3) ріуз5 рРЕТ2ОБ5(-):аНВТ-АСХА-ррВСКО продукує метакрилову кислоту безпосередньо з глюкози.
Для того, щоб визначити, чи доповнення культур 2-кетоїзовалеріановою кислотою може сприяти продукуванню метакрилової кислоти, дві попередні культури М5еХ (10 мл), які доповнювали карбеніциліном та хлорамфеніколом, знову отримували, інокулюванням одним з
Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз рЕТ2О5(-у4НВТ-АСХА-ррВСкКОо та іншим з Е. соїї В 21 (ОЕЗ) рі уз5 рЕТ2ОБ(я), як і до цього. Попередні культури інкубували при 37 "С зі струшуванням при 250 обертах/хвилину протягом 16 годин перед тим, як клітини пелетували та повторно суспендували в свіжому МОХ середовищі (100 мл), яке доповнювали рибофлавіном, хлорамфеніколом та карбеніциліном, в 500 мл колбі для культивування. Експресію індукували в кожній з культур при
ООвоо 0,5 шляхом додавання ІРТО (0.4 мМ), та культури інкубували протягом додаткових З год. перед тим, як додавати 2-кетоіїзовалерат (рН 7,0) до кінцевої концентрації 5 мМ в кожній культурі. Культури інкубували протягом додаткових 14 год. Зразки культур були взяті та проаналізовані з використанням високоефективної рідинної хроматографії з ізократичним елююванням, як описано для культур, які не були доповнені 2-кетоїзовалеріановою кислотою.
Аналіз ВЕРХ зразка, взятого через 14 год. після того, як додавали 2-кетоізовалерат до холостої культури негативного контролю Е. соїї В21 (0ОЕЗ) рГуз5 рЕТ20Б(к), показаний на фігурі 17, не демонстрував ніяких піків на очікуваній ділянці, ні якій, як правило спостерігається, метакрилова кислота, як і очікувалося. Показано, однак, деяке фонове споживання 2- бо кетоіїзовалеріанової кислоти (Фіг. 6), при цьому площа піку для даної 2-кетоізовалеріанової кислоти в даній культурі становить 3353 мАШ.хв., що відповідає 2,8 мМ 2-кетоізовалеріанової кислоти, яка залишилася в культурі на відміну від початкових 5 мМ.
Коли зразок, взятий через 14 год. після того, як 2-кетоізовалерат додавали до культури, яка експресувала гени для перетворення 2-кетоіїзовалеріанової кислоти в метакрилову кислоту, культуру Е. соїї В 21 (СЕЗ) р уз5 рЕТ205(ї)4НВвВТ-АСХА-ррвекОо, де пік на 8,4 хв. з площею піка 1890 мАШ.хв. з'являвся в слідах ВЕРХ (Фіг. 18), вказуючи на те, що метакрилова кислота продукується в концентрації 0,24 мМ. Ніякої 2-кетоіїзовалеріанової кислоти не було детектовано в даному зразку, вказуючи на те, що вона була повністю спожита під час перетворення 2- кетоіїзовалеріанової кислоти в метакрилову кислоту.
Зразок був введенний з додатковою 0,24 мМ метакриловою кислотою, та аналіз введенного зразка (Фіг. 19) показав пік з площею піка 3,4 АШ.хв., що відповідає концентрації метакрилової кислоти 0,44 мМ, таким чином вихідний пік метакрилової кислоти був справжнім.
В даному прикладі, дегідрогеназу кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом, а саме ВСКО з
Рзепдотопах5 ршіда КТ2440, спільно експресували з ацил-СоА оксидазою, а саме АСХА з
Агарідорзів (пайапа, та ферментом тіоестеразою, а саме 4НВТ з Агіпгобасіег зр. штама 5 в клітинній системі. Було продемонстровано, що можливим є отримання метакрилової кислоти з ключової сировини, такої як глюкоза, яка є легко доступною з біомаси, використовуючи рекомбінантну ЕС.соїї, та, до того ж, що отримання зазначеної метакрилової кислоти може бути збільшене за рахунок доповнення середовища для росту 2-кетоізовалеріановою кислотою. 1,7 Приклад 5: Цільноклітинне отримання бутилметакрилату з 2-кетоізовалерату з використанням рекомбінантної ЕвсПетгісніа соїї
Ген АСХА з АдПаїїапа представляв собою кодон, оптимізований для Е. соїї, синтезований та клонований в вектор РЕТ16Б (55єе). Ген розщеплювали МПпе1/55е8387! та лігували в рЕТ16бр (556), розщеплений Хвра1!/55е83871І. Отриману в результаті плазміду, РММА 121 (дивіться Фіг. 20), вводили в Е. соїї ВІ 21(0ОЕ3), та рекомбінантну Е. соїї (ВІ 21(0ЕЗУрРММА121) культивували наступним чином; ВІ 21(0Е3)УрЕТ16Ь (векторний контроль) або ВІ21(0ЕЗУрРММА121 інокулювали І.В середовище, доповннене ампіциліном (0,1 мг/ мл) та ростили протягом ночі в тестових пробірках при 37 "С. Аліквоту культури протягом ночі переносили в 100 мл такого самого середовища в колбі та струшували при 37 "С протягом 2-3 годин. ІРТО (кнцева
Зо крницентрація 1 мМ) додавали до колби, та культуру інкубували зі струшуванням при 20 С протягом ночі.
Клітини збирали, використовуючи центрифугу, та суспендували в 0,1М натрій-фосфатному буфері (рН7,0), потім руйнували ультразвуком. Зруйновані клітини Е.соїї центрифугували до супернатантної та пелетної фракцій, та як векторний контроль, так і клітини, які містили рРММАТ121, аналізували щодо активності АСО (ацил-СоОА оксидази) (дивіться Фіг. 21) та експресії протеїну АСХА за 505-РАСЕ (дивіться Фіг. 22). Фігура 21 показує присутність тільки ІВА-СоА в буфері, присутність ІВА-СОоА та невелику кількість СоА в зразку, який містить клітини, які містять тільки незмінену плазміду рЕТ16Б, та присутність ї МАА-СоА, набагато меншої кількості ІВА-СоА та невідому сполуку в зразку, який містить клітини, які містять плазміду РММА121. Таким чином, висока активність АСО була детектована в супернатантній фракції ВІ 21/рРММА121 зазначеної при отриманні метакрилілу СОА, показуючи, що 40 кДа протеїн, детектований за 505-РАОЕ з фігури 22 представляє собою протеїн АСХ4. 505-РАСЕ показує в треку 1-ВІ 21/рЕТ166р (вектор)
ЗЕ (розчинну фракцію); треку 2-ВІ 21/рРММА121 ЗЕ; треку 3-ВІ 21/рЕТ16р Ігк(нерозчинну фракцію); треку 4-ВІ 21/РММА 121 ІЕ; та треку 5 - маркер молекулярної маси. Приблизно 40 кДа, смуга (виділена чорною рамочкою) спостерігалась тільки в треках ВІ 21/рММА121, але не в треках ВІ 21/рЕТ166 (вектор).
Ген комплекса ВСКАЮ був клонований з Рхендотопах аегидіпоза штама РАО1 наступним чином. ДНК фрагмент, який містить весь генний оперон, який кодує ген комплекса ВСКАОЮ, був отриманий за ПЛР способом з праймерами ВСКАО.Е та ВСКАЮО.К (таблиця в 1.1.3), використовуючи геномну ДНК, як матричну. Отриманий фрагмент розщеплювали рестрикційними ферментами В5рні та 55е8387І, та вводили в вектор рЕТ16Б(55є6) між
Мсо1/556е8387І (сайт ВатН рЕТ16р перетворювався в сайт 55683871). Отримана в результаті плазміда була названа як рУУАбОв8 (дивіться фіг. 23).
Плазміда для експресії яблучного ААТ та АСХА А/Паїїапа були сконструйовані наступним чином. ДНК фрагменти, які містять ААТ або АСХА ген ампліфікували застосовуючи спосіб ПЛР з праймерами ААТ.Е та ААТ.К або АСХ4.Е та АСХ4.К (таблиця в 1.1.3), використовуючи плазміду, яка містить кодон-оптимізований ААТ ген або рРММА121 як матрицю, відповідно.
Вектор рЕТ(55єе) розщеплювали рестрикційними ферментами Мосої та 55е8387І та поєднували з фрагментом ДНК, який містить ген ААТ, використовуючи набір для клонування Іп-Ривіоп НО бо (Такага Віо) Отриману в результаті плазміду, рААТ212, розщеплювали рестрикційними ферментами 5реї! та поєднували з фрагментом ДНК, який містить ген АСХ4, використовуючи набір для клонування Іп-Ризіоп НО. Отримана в результаті плазміда, РММА133, містила гени
ААТ та АСХА з Т7 промоторним контролем (дивіться фіг. 23).
Плазміда для експресії ВСКАЮО, ААТ та АСХ4 була сконструйована наступним чином.
Плазміду рРММА133 розщеплювали рестрикційними ферментами ЗБре! та 55е8387І, та отримували лінеаризований ДНК Фрагмент. Плазміду РУУАОО8 розщеплювали рестрикційними ферментами хХваї та 55е8387І, та виділяли фрагмент з 5,0 тис.осн., який містить ген комплекса
ВСКАЮО. Обидва фрагмента лігували, використовуючи набір для лігування ДНК "Мідніу Міх" (виготовлений ТакКкага Віо Іпс.). Отриману в результаті плазміду РММА134 (дивіться фіг. 23) вводили в Е. соїї ВІ 21(ОЕЗ) для експериментів з отримання бутилметакрилату.
Е. соїї ВГ21(0Е3)У/ РММА134 культивували фактично таким самим способом, як описано вище стосовно експресії АСХ4. Клітини збирали за допомогою центрифуги, промивали 0,1М натрій-фосфатним буфером (ріН7,О) та суспендована в тому самому буфері для того, щоб отримати клітинну суспензію. Використовуючи клітинну суспензію, отримували приблизно 1 мл реакційного розчину клітин в стані спокою в кожному флаконі, який містив 40 мМ 2- кетоїзовалерату (2-оксоїзовалерату), 60 мМ бутанолу, 0,05 М натрій-фосфатного буфера (рН?7,0) та клітини (ООвєзо-12,5). Реакції проводили при 30 "С, 180 обертах/хвилину протягом від
З до 44 годин, та додавали 1 мл ацетонітрилу до флаконів та добре перемішували щоб зупинити реакцію. Після фільтрування, використовуючи шприцевий фільтр СІЗМІС/з діаметром отвору 0,45 мікрон (виробництва АОМАМТЕС), проводили аналіз, використовуючи ВЕРХ на колонці О05.Умови ВЕРХ були наступними: Прилад: Умаїег5 2695, Колонка: САРСЕЇ ЇЇ. РАК С18
ОЦО120, 2,0 мм в.д. х 250 мм, рухома фаза: 0,1 956 фосфорна кислота / 65 95 метанол, кількість потоку: 0,25 мл/хв., час перебігу: 12 хв., температура колонки: 35 "С та детектування: УФ 210 нм. Фігура 24 показує концентрацію наступних хімічних речовин протягом часу ферментації: ш, 2-кетоїзовалерат (2-ОІМ); А, ізомасляна кислота (ІВА); Ф, бутилметакрилат (ВМА): та х, метакрилова кислота (МАА). Оскільки концентрація вихідної сировини 2-кетоізовалерату (2- оксоіїзовалерату) падає, отримання поміжної сполуки в шляху ізомасляної кислоти, зростає, як і виробництво кінцевого складноефірного продукту - бутилметакрилату.
Даний приклад демонструє практично здійснювані іп ммо отримання похідної метакрилової
Зо кислоти, метакрилатного складного ефіру - бутилметакрилату, з біохімічної поміжної сполуки 2- кетоіїзовалерату (2-оксоіїзовалерату), яку отримують безпосередньо з глюкози, та реагента - бутанолу, який представляє собою загальноприйняту промислову сировину. Отримання бутилметакрилату є продемонстрованим на промислово прийнятних рівнях, виходячи з культивування рекомбінантних клітин Е.соїї, які експресують оперон ВСКАЮО для того, щоб перетворювати 2-кетоїзовалерат в ізобутирил-СоА, ооксидазу АСХ4 для того, щоб перетворювати ізобутирил-соА в метакриліл-соА, та ААТ для того, щоб перетворювати метакриліл-СоА в бутилметакрилат за реакцією з бутанолом.
Увага звертається на всі статті та документи, які подаються одночасно з даним описом або раніше даного опису у зв'язку з даною заявкою, та які є відкритими для громадського ознайомлення з даним описом, а також змістом усіх таких статтей та документів, включених до даного документу у вигляді посилання.
Всі ознаки розкриті в даному описі (включаючи будь-які пункти з формули винаходу, реферата та креслень, які додаються), та/або всі зі стадій з будь-якого способу або процесу таким чином розкритого, можуть бути поєднаними в будь-яку комбінацію, за винятком комбінацій, в яких щонайменше деякі з таких ознак та/або стадій є взаємовиключними.
Кожна ознака, розкрита в даному описі (включаючи будь-які пункти з формули винаходу, реферата та креслень, які додаються) можуть бути замінені альтернативними ознаками, які служать такій самій, еквівалентній або подібній меті, якщо чітко не вказано інше. Таким чином, якщо чітко не вказано інше, кожна ознака, яка розкривається, є одним із прикладів тільки
БО загальної серії еквівалентних або подібних ознак.
Винахід не обмежується деталями зазначеного вище варіанта(ів) здійснення. Винахід поширюється на будь-яку нову ознаку або будь-яку нову комбінацію ознак, розкритих в даному описі (включаючи будь-які пункти з формули винаходу, реферата та креслень, які додаються), або на будь-яку нову стадію або будь-яку нову комбінацію стадій з будь-якого способу або процесу, таким чином розкритих.
ПЕРЕЛІМХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«130» цосібе ХІпсегпатіопа! УК іітітей «120» Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти «1302 РЗІОБУМО «150» 681508582.2 «151» 2015-05-19 «1502» о81512545,8 «151» 2015-10-05 «1650» 24 «170» Ракепсїт мег5іоп 3.5 «20» У «ії» 471 «3» ДНК , , «13» Штучна послідовність «20» , «23» оптимізована 4-гідроксибензоїл-соА тіовстераза (С4НВТ) З
АктпгоВасте" зр. штама 5у «40025 ї тахтасататоа сассотассї ствасчдїтс ссасасдаєс пдв єаасс соссодатоє 50 тасттстсає тасссоцеєса сатасуваса дассстоцдчаєсє досасєсятца зссесоєтат 120 суасчааазто ассссабазе зсзсуассос чсстоїтоза дітїассдаса сестосокса 180 зсаїкоЧоЗоХ студтєсасяа штовсассьз стосясаєто зсуааодвтоє стЗосоасеода «й адсоассотт осодітосос асозаазодо таїдатацсу бдітодссаці стлассасає 300
Іст с сасссовіта аздавааіса соттсосоасо озадстостс ясзсссасаЯс 350 цпаоттсєтасс асстозтст оодасаєсс сстоасосдаї затосодтс зсссттас 420 чЧеасоксттсе аєзкстатсо соаотасоєсс осассоєуас газосоадесса Є 47 «М» 7 «211» 36 «й1йх ДНК «213» Штучна послідовність «220» «Ф23» ННТ.Е прямий праймер для клонування 4-НВтТ «00» 2 тастасастато сассотасєст стзасодаттс ссасос 35 «2105 5 «тії» 24 «Ей» дик , , «213» Штучна постідовність «220» о «ййЗ3» ННтТ.К зворотний праймер для клонування «нНвт «а(Ю» З сЕСОзаКсси гсасоасоса асо й
«іх 4 «211» 469 «212» ДНК ; «213» Штучна лослідовність «д2йх ; «Зх Продукт пПлЕ, ЯКУ здійснювали для модифікунання 4НВТ гена для суб . клонування в плазміду рЕТ20ОВ(Ю) з утворенням плазміди рЕТ2ОВСЮ) :СТНІВ нет, «З00» 4 тзєасатата сассотасся стзасозтїс їсзсосоасс д91995аасс Тассооатої 650 теасетстсаї їасссоокто сосасозаса здассстоуає язсассокад кт сохтак 120 сдасдазато ассссоуааєс дтосоассоє зЕстоктова зсстассдаса ссстосуєса 180 ссеєсдЯцає стодттсасз асуасостта стусеасасто зсодЗадасоєсє созвсозседа 240 воасцчассусєх осодстосос асодававодо сахдратовсо устадссаці стаассасає 00 сесттЕсттІс сосссоадтта задзадуєса состсососо дааостаттс осатссвсос 360 дуаксстасс асстоуєксх додасатттс сесососдає затусцоутс дсстосасас 420 чдеакаїстсст атоїстатсоя содсосотос зсоксокдає оддастсова 459 «210» 5 «211: 483 «23122 ДНК , «213» щтучна послідовність «220» хг «223» мічений карбокси-термінальним гексагістидином 4НЕтТ в плазміді рРЕТ2ОВСЯ) ::ІСЖНі5-ЯНВТ «400» 5 ахтасассота ссІстсзасод їтїстсзсосо ассудіоата асстоассода ктоаттосеся БО сахттасссуса Ттососасуа асзозсссто здчасдосассо соду свє саїсдасвав 120 зкдассссод засптасовс сосотстот дааостассо асассстуєсо ссаасеєад 180
Заст асоусоавтос стастосаса стодсодаЗа тасСтовзсоаєс соваосоаасе 24 ассосооіта сосасолаза озудотаєзато асодстодесс азбстаасся сасстсттЕе 300 кссоїссод г(таладавоа ссасакісос одсодазасто гтсосатсса сасовуссї 3650 ассасстоої їстоодзасує скссстосус засоакусоо зксусстото тоасаосоєся 420 тТстасокста гсосоцтсо сссасуссої дасодастсо зсассавсса ссассаєссає 480 тва 483 «30» 6 «211» 1320 «2122 ДНК , й «213» Штучна послідовність «Ох , о «223» оптимізована ацил-сод оксидаза 4 (АСХЯ) з Агабідйореїв спаіїтава «400» 6 й сатасдасац стстозосаЗ сЯсадзЕсЯх дсавосаасо азазавазоаї озазвацса9є бо тастстсуасс тосстссдає доааватуадс стсосатттс сосадасавс ассодсавує 120 асстттссус сттатассад соаттаттакх сатсссвата атстустоає ссстовзаова 180 сацоссаттс дсзадазаці ссотовцитоас зтїодазазад задтуосаєс дастзідасс 240 затаєсодо ааззазсава аттсссотсь сататтассс созаастада гусватоацує 300
ЕсОоссЯцІО дсзоасаєтстаа адуктасозї татссочосс говосаєтає сосаватоса 360 аїтосзассо садазаєкос асосоїттсає осазастута осасстттає сстоазстсах 420 ачсаасстоя зсатосіЗас саттасасто тосод'зосЯ авосасацаз аЗазазатаї 480 стдссозоасс тоосасазесї ззатассатх асатусєстоцо састдавссоа ассодасавах 549 здіазсдасо сазасо9сст спдусассасс дсаассавау стозадосо9 ссодзаааєє 500 засдоаєсаца засоаєтоцЗат тодсваєадс асстттосва асстостодат сасстттоса 660 саїаатасса ссассааїєса дагтаасозс ттсаїсусєста заазадасос ассоадатста 720 заазосзасса азаттсспаз соаваєтоці стясатату9 Хосадзаакоч свв о 7850 стосзозато сот татасс одахдаавах сатстосста зсустаатад сессадовє 840 ассзосааад сЕствросадт стазссокасх асобстосає досадссоаї садтастадс 900 ахтпдоасаєсх: агзасасоату ссассоустатє ссозазодаас зтазаєзатт сзотосассо 360 стоеасадсатї сссадстдва ссадсадава стадусссаца соссодоєза тасссацдаса 1020 ахоктсстоа саоуссдосо їстосотаза стотатоввна ссооїсвоах чзасассовох 1080 савосазоасс тодосайаос атодассвус зосаааосас дтодвзассос садсссоодї 1140 сфсазастос спастодства соцтастскоа асаЗзасстхс своастеасаза асани 1200 чЧчаїствзузвас сазестатає стаєуазцус асстаїуатста їсзатассст ддттассодї 1260 суасозачіта ссоотатсос задстссвзаз ссодсазссс ЗтадссЯакс Зсазстсоао 1320 «2105 7 «21ї» 77 «2122 ДНК «243» Штучна послідовність «20» «223» ОБ.А.ЕЖЕ зноротний праймер для подовження парекривзння лолімеразного ланцюгу , реакція А «400х 7 асататосас соустасстста асооїтс 27 «82105 8 «231» 39 «212» ДНК , , «213» штучна послідовність «веду о , «223» ОБ.А.К зворотний праймер для подовження перекривання полімеразного ланцюгу реакція 8 «40025 58 стоссахтатєс тахтактстсст дктаоісасо асдсодасо 39 «21025 З «2315 0 «2412» ДИК , - «2А3» Штучна послідовність «20 . . , «223» ОБ.В.Е зворотний праймер для подовження перекривання полімеразного ланцюгу , . реакція 8 «00» 9
Чідастазса доугоататао зтакцдсавх сстовусавос 40 «2105 10 «ії» 40 «212» днк «213» Штучна послідовність «20» . , , «3» ОКБ.В.й зворотний праймер для полімеразного ланцюгу перекривання реакція В «400» 10 стсозозтат татазствує ссасздаєт стасодоєта 40 «10х 11 «її» 1805 «212» ДВК «213» Штучна послідовність «ох «993» продукт реакції полімеразного ланцюгу перекривання для поєднання 4НЕтТ та АСХЯ в одному полінуклевтиді «00» її асастатосас сестасстста асодтсстса сосоассодє здхаасстос сптузтєсос Бо ттсісаттає ссошісосої азсозасадас сєстодасвоє ассусадаїї ссосттатсоа 120 созазізаєс ссдовзасчта созссососс соастозаок ассдасассє стосогсвося 180 тсоЗУ3Есто зстсасозс пасттасхо сасастоацсо оздатастою сдассазадс 240 чассотсосо вісососасо зазапдоатає заїдасовсх дассазієта зссасассте 300 тесЕсттссої ссодітсааао задоссасої гсососоадаа встоаттсоса сесасоасова 3650
ТІСТассасс тооктстодо зсоїттсссх дсосовтоат всодоаєсосс сутекасоде 420
ЗтстЕсСтака їстассосай тосохесосо ссотаастаа садзазатат здатаквса 480 сєсковзоса зсосадассо судсавосваї дазаазааао суавазасав статттсдає 540 стосстссоа їоддззасоза сутсосаттє ссосадодсаа сассдосавац сасетккссо 500 ссттоїтасса дсозїсаєта їсаєсттазї одасстоастоа сссстдаада асзодссату БО сотавазза9 гссоїдадіо сасцозаааза чаачтсоосвс соаєтатдає содатаєсод 720 дазазазсвц затісссосткх їсатастасс ссозазссоо отосазатозо прооссоох 750 дїтаюсаїтса задоттасоо ссоїссодас стозосакта ссусааатос застосавсє 840 дсадазаєта сасусєуєсра тасазоссоє адсасеттта сїстоадєсса тадсзасст9 908 дотатосєда ссаттоосасї зтетадіаос дазусасада азуазавата хскусеваде 960 стоодсасдус созатассує сосатусс99 дсастоассо зассудаїтаа тувсацтах ї020 дсавосуціс тодоасассас сусаассала дісдазацкц остодазааї сзасодсса9 1080 лазсоїсода сідосваасау сасстітстоса заїстестда статссссос асосаатасс 1140 ассассааїс адактаасод стссасасї аззазадато сассодоїсє дазадсавее 1200 зазаїсссоа асавааєсод їстосостатя ососазаата Зісатассст дстосадаах 1250
Чессссотос содагозада ск стосст дотагтазта дстттсазод тассаосааа 1320 кЕстоЗсац гтаоссатох татодстоса тадсаЗсєсоа їтоосаїтад сасодотатх 1380 таїдататає дссассуєта їстозавова собазасац ссуоасосасе дстадсвоса 1440 тЕссадстоа аїсадсадаа астодтїсау ахостодоаста асоттсводс аа 1500 згвзодутодс Зсстокоатаз астотасодза ассодтсяза хоасаєсодо ссадоасавоєс 1560 стдадсазао саїаздаєсад садсазадса сотоазасся ссвосстоду ссосоваста 1620 севоокаста актоутастсЄ досадатттє стодтсосаз азосатттто тодасссодай 1680 сечатстата сстатцазоя сасстасоаї ассзатассс свастассояз ссосдаачеєе 1740 ассодтатссо сзадстєсва ассдусаасс сегаоссотс сосавостазо стахаатахє 1800 тсов8о 1505 1» З663 росте Штучна послідовність 253; оптимізована ацил-соА синтетаза Сасба) з Регидотопа» спогогарнів 823 «400» 12 дстадсаода дататасата тососоасєта сдаасасоєт осодаатсте ссозстасся 69 псададсоса асссадоасс тасасуосза астрастості ссодавсасає доход 120 ссзсоатстсос: сасоососасо зсозо9зстає хасістотакє сосчазасос зддзєдосса 180 сасочазсос сассокттсс зсоаїстоса зсоссазосЕ дсасоєттта зсавасеєтсся 240 яасятозасад дасасдазає садусоассо тессосодпасє стватассосє зстассокоаа 30 астостдзаєс дсазієстоз осасттоозсо саїсозтосо дгїтаєсавс состоєєтас 3650 тасоаїссоді ссуаазаєза гсозодсадсо їстовастеє їстаасЗсас Ястозаєтах 420 дассдатсся сасвассусс созвастода свасяттасс застосо статуса ай тассоціцчус дсассусаза асссоцусвуа ссзтсасекі тоукссЗсас тозассозса 540 оосодатоає тасзсоссод соссостода сосатстаса ссустсстає сдакоавасає 6500 сеЕсспасасс асктодсссою саазоссост оддпазотсссо стоєстосда стстудсати 560 тазадоттас атососдато саахсузеєстї дсусостоає даїссосіїсє дозасстодс 720 здаїссовоє тодосатасо оїстотаста сосодтзасі доасссостоо сатекадеста 780 сусасссто єсстасцаса зсссокесає таїсозаксс асссотсаса тсатсосоай 40 аїасоасоакх засвасстод содосадссс дассосттає соесттсстов стоссада 00 сосоддаассєс асодасоста гксоїтоодссо сстоасуєоса Ягтадсвосо сддуєовасе тво зссдвасссу садатацітс Ззссодїквос созасзасто осока са сссатоасса 1020 статозссао ассчазаєте осад сс асосавссзс сасочсстує зесасссод 10850 тсосоа999Ї зоасастоЗсх астосаососс одостаєсоє аксусоукос ходзсвавос 1140 асассоастчацч стоссдоєта Ззссвзассодо са стадсо дсодассото аасасссссс і200 остотоссоЗ сттодсоост асстооаасат оссзасссзу Зсосясоя зсоссатста 1250 сстзсстоодІ зсататсуєто застоозасда соастоаосяос атстстстсо тодассосва 1320 счатоатсто ассаєсассії стрттаєсо сотодасссо тсоасаєсо аосстосасх 1380 застдазсає ссоосадіко стдадостос Тоттаєсоцду азассодасс сосадсотає 1440 тчачстЧаїтї азадсатссо хат тстодаа састесосає стоссааасс содаасто9с 1500 созаоааста сосстасако ттсобсаасу ссходстосо сасусататс сасусдзоах 1550 чзаасістасо дассаєстос созазасссє чістуосааз стосадсоїє єсаттстаса 1620 тзассаддаз аксостаачс зосаддстст дддттзасте дад 1663 «2105 13 «2ії» 3447 кЕі2» ДНК «ії» Штучна послідовність «220» «223» Послідовність між, та йшключаючи, Міеї та хНох сайтами рестрикції в рЕТ20ВС)::9НВТ АСХЯА АсвА, «ЦЮ 13 сататоасасс дтасстсіаа соасссісас псрассодсто одтаасєстост доатуєсост 50 тсісаїстасс содстосота созасадаєс стодасодса ссосодосїї сустатсваєс 120 чазатоассс содаасотос чассосоєст Фсгдавуєта ссзасассстї зсохсадсоє 15 тоодЧдесскоЯ стсасоосоо састтастас осастоусво здатастовоє дассоза9со 740 ассоїтосою стотосасца заадовсато асодсодтто оссвотссвяаа ссасаєстех 300 ттстсссос сочссаавоа апдссасоїї сососодазу стостсоасає ссасасадує 3650
Естассассє доксстдора состтсссто сосдасєзато соадаєсусєст уссосоото 420 тежестатаї статсосоді осасссосУє сосоаєтадас зобвачцатата сатазїд9сад зва ттскозосад сасзоатсях дсазосаату заааалазах дазаавсвзос хатесдасс 550) тЗКстссозї зоааасозЗс зтосасскс сосаоосвляс асктодсзвяс ассттссс во стІтосассау созєсастаї сатєсєтвата аєскостозс ссссдааова садассаттс бо дтаззазачї тсотодаосос зкоолазаво задтадсасс дпаїтаєзаєсс даатаєсова 729 зазайосада астсссаттє сабаєтаєсє суазасєтода сосаатвозє зссссдато 7во
Чкадсаєтва зодттаєдоє тотссодосс тодосаттає сосаавтасвз аїхосааєса 540 садааатїтос асоктоктоаї зсазостеса зсасстттає сстодстсає восадесстоо з00 чіатостцдас саїтосасто татотацсо задсасадза адазаватат стоссодаосс або уосасадсї двактассотх одсататтово састзассда зссодасват 949989 3020 сазоасодісї дозсассасс дсаассаазо гтозадотод ссодазааєо засодссаоа 10850 засаїсадчає хгоддсзатазс асстттосай асскостазі сахстсесоса сутазкаєса 11440 ссассаатіса ззстазсодс стсатсоїта азазауатос ассувутєсто азаосвасса 1200 зазЕєссула сазаатєсоох стасусзктод сосадаатсоза сдататтсто стосацааєо 1260 тт тосс ддасозадах соагстоссту 9дс9ссазтад сссссадааї зссзосааво 1320 тТЕсСтвоасасі тасссутотї аходскосає пасзоссдає кодіаєсаоє ахсодатавси 1389 зІпататоту сесеассустат стозавзавс зсазасацітії стовтосассЯ ссбодсвосах 1440 тссадстдза ссачдсаЗаза стодіїтсаца состоцатаа сосссвадса зх Естов 1500 таочЕсоосЯ їстосоїтава стотатоваа ссопоссадахє дасаєсоянає савосаацес 1550 тодасазаче аходассаас адсзававсає зсовааассяс садсстовУє сохозассос 1620 товатаціза содїзіссто псадатієсєтс сузєссаза адсастссої дзЕстдовас 1680 созЕстатас статовацосє зсстатдата хсаатассстх ватсассоче сосоазвоєста 1740 сспоататтос азоссстаза ссудсаассс зсапссосст дсавостаЗс ауозуасата 15800 састатасзсо астасдааса состЯтоова їсттссваєї асстосазову сСодсазсесад і1860
Часстосату осовастозеЕ Тестстозас ясоктосасоцу захоастатоа ссеассасвсе 1920 сасдоасоаза стоактосесх охатсосоза зсосаадато зссасосодча асастассеє 1980 жхссесоаїтс тасваасасся зостосасує сттоадсваст тестусастоз дсадв9саа 23440 агассоазасо ассотуттос ддасссоато ссусотаєсо сдозастосє Затсосааєс 21300 стодосассє дососатсою тосадосетах сазссостат єсастосоїї сортссоваа 2160 дсзаєтовзоас засосстдаз стоКістзас дсасостода стосуассда Тесосасадаєс 2220 сасссоваас тозасцасаї їассдаєтас ссотстатто соостассоо тоадсосассо 2780 спозасссво садассатса стсссоуссс зсастадазасс сісадасбоа гастососо 2340 ссчзсастас стадасясавтс сосвесаЄєсс стастоатах зсасессссоро сассастуцє 2300 сспосадацс сускоцазатї тссустокесе зсаттстоЗ сасставною стасатосоє 2460 часусзаєсо асстасосос тддатоатсос стсстодазесс суосадатсс соц соваса 2320 тасоозкстої астасрсцує дастдчосссо стоцсосокоа зсстасосдас сссеєкекас 2550 засоаакссяє ксастуттоз ахссасссояї сасастсатсу соазатасосє застазеває 2540 стдоасвоута зсссовссоас сстассосттк сткоаттосто сзоососояа атетвсддас 27 детахсука чзїсзкстасяЯ госазттїадс засосоцото зассостоаа сссосадота 2760 чесати стостозаса зстоаокекх остасссата ассастатод ссадзассодав 2820 зЕтЗотатод єсстоктиасва ссассвсодс стосотсасс содіссосча одоатазсосе 2880 застатосає тоссодоста їсотаєсота зсостодата аадсасассо спаостуєся 2340 остадїсадс соцесассє босоаотодас сатавзасост ссссостота стовссдає що дастасстда дсакоассзас ссапосуєсс зсадагсоєе зктасєстаєс тодтоасасс 3060
Чісозастоа зсдасоатод садсаїєстст сєбсосочакс оспасдаєза стаз 3120 асскстооіє ахсоетосадоа сссоїтсдас дітовосєсто сассоаттса всасєссодся за ссоссцава ссостаттає сзатаавассо дасссосадс дтастазост ваїтавазсо 3240 того сес тдаасаєтес отасстоєса зосссвозає Ссоозада астосагссо 3300 саєотксЯїс адсасстодс коососасоса таїтссесося адасозвакт: сотозассат 3360 стассодзаза сессоакстао садастосзо сассісаїттс тосоїтазссв одазатсосх захо зазоасаасзоа стістудотта астс9в9 3447 «210» 14
Б
«й13» Штучна послідовність п» рраско полінуклеотид, який містить чотири гени, які кодують субодиниці з дегідрогенази кето-кислоти з розгалуженим ланцюгом з рзецйопопаз рисідЧа Кт2440, яка доставляється в плазміду рВЗкК::рраско «ай» 14 тстядазатз ассктоїтта астостзоса оддадзаакста зстатозасо аотасосссс Бо сстасЧчтєто сатотасссо адсссассодй ссупссадс соссаасся аїттттсста 120 єстасоссіс засозтосад дссазоасссо тазасссося ассзатоаїсо асостоассов 180 састоєсцдас стоссстаса зсстдсссо собтостсдас дадсаавосу асососвадо 280 сесстооЗсс даацасаєсо асссасадаї сстссоїсза досатососо ссаїтостсав 300 чавсзсоваїс сссуасзоасс зсатодізоє сосссвасЯс сзуаазаада тУукестЕста зба сасясзавос стозоасразо аадссатсуо садсудссво одсустачзсос сдзассвсас 420 сдасаєотос їтсссуасех ассосєсвзоса задсатссто абсдуєсссосо асататсосє 480 чассоадчато асстоссаас густої ссва соузасосаєс сссстсааао оссоссаоЕ 540 зседатсасо татстсроктас ЗзсчавоссЯЯ стхетесасс ассзоасццса зсстаоспас 500 ссащисоєу садосооися зстозоссає чосахсоачсо ассазоауосЯ абассзачах 560 сосстсадса содаїтсозосо асодсостає тоссуадісо дасттссаса седсссітає 720 сіттасссає зсатассосо ссссодісає сексавсасо дксазсваєс заїтаоассає 780 тсссассієс садоасєсаєсо ссовїсоосда сісозаєсасс сктоссоозсє сосок оза щ40 ттасоздтатт зсутсастос одопттзасозв саасдасктс дісоассутох асостцссте За ссостодосо дссозусЯса сесоссосод сстороєсса аосстозссо астодвісяс 260 стассятасс васесасасс соасутсоза сзасссстсс ззотассясе стоссоасов 1020 стадзаєссає ттсссостод зсоасесуає сосссоссто ваусвосаєс сдахсзадах 1080 своссастоо сссозодаао засассавоє соаїсзсоавсс даостсовая стосодсоах 1140 тоассзсасва азадавоассі аЗсаотасач сассстуодсс засоуусаса хесссуазсос 1200 сасстсдату стсдадоато густасавоаз азсасссозс сасстодсасс зссавсосса 1260 чззаастооо зсссоОадасо аасрассаса асаасассає саасссодаа ассассатоа 13720 ссассаєтає сатуассато зіссвацссс хоасоасесвос сатодатосо зсосЕсос 1380 осоасовсаа сотостзато тасзвссазод асесСсдатта сессосоос кате сс 1440 осассоааооз сстосазаає зашіасодса заїтсосясекх отїсзасоса сссастссо 1500 зазасодсаї суссосотасс дссотацоса садракосста таасстасас ссоосодсов 1560 вдаїсссаЧєє соссдастас стстасссод сстссуасса ЗатсЯстсс дадстооссс і620 дестЗсаєта ссзессвосс пасозаїєса ккоссссост дассстосос втассесосо 1680 дсопдсоосат стасодсодс садастсаса зссацадесс созадсЗаєу тссасссвоо 1740 тоахеасодсст Ззсасассото зісссксса азсссстатоз соссвзавоацє сказ о 1500 сстсдассоз атосЗасуає ссоакавтсе стсесопдавсс сааасассто хасвасоосо 1850 спітсчасдоа ссезссасоаасє сосесстотаа ссссатаосс дазосасссу сасзососсо ї20 тасссдрасоЗ стаїтасясс утассостоо асаводссяс саттасссує сстзчосвато 1950 асатавссої астозасстає одсзссасдоа тохасоаєоас ссвоазкоосс пссдвадава 2040 псаосоєсода соссовладто зесоасстає осадсстото оссостодає стодасаста 2190 тсссовадіє зоатазаззва ассоадссес ссугузозь освсоаацасс всссоасакссх 2160 дкодстсора тассовостоа ско ссостдо тосаддадса стяасттссає сасстодаоа РУ свассдатсоа асосоксасс дасстоазвдаса ссссстаєсс їтсасусСсаєва даавсопас 22890 асктусссаз сссжссосоу пїаодсосод сассоааааа Зїсасвово зсссозахоа 2340 цсасосасяаї сассаапаїта ссддасатто осдзадосаї сосусвозіс дасссоаказ «400 засчатксоє свасуєсяос дасатсатсу ссвзаддасся дотоатоаасс Ззасатсвтоа 2460 ссдасазодс сассосооаа атссссесос садесазсод сазочтуєто ассстодока 2520 десазсссод дозаодсвпатоа зсооксодта зсдазстзат ссасазтсоаа зтоодавласса 2550 зсоздсазсся техоазсасо ссісавссза зассоотваз оасссспост ЗсссссвЕКо 2845 садссазосс дозассосад зааздасоїла засссоссої діассадосо сссссаасе 2700 асозавдостаєс асссяхсЯата ссесоссазс сопасуасваа ссостаасс ссдсстассо 2750 тосасазасва сяссстодає пссодтасся застосоїта сососатові воасодесссад 2820 ссоЗзосотат тсбосасоЯда дасстедаєо ссїітсаєово сазоссосаа зоасаавтассв «880 песазасасєс тодаїдостат зссавосаса ссзасвзосоз Зсаоотосєся зсватсоосс 2940 тасассосза одїтосссая сосасосаоу зсуссавасо ссодассасо сасстсавчтї 3000 агддссолода затсодасоїс зссоссстод адоссстосо ссадсвасіс васзосавос 3060 асоппсозсав ссподосазоа стдзссттос тассаттсст детасоасосє сстоддтсесоЯ 3120 сустосотоа сессссосао ассазсоєсєда сстасозтва созазсосво ассаєсассс 3180 чдссассоасоас зоасосатата зусахстоаєса сссааоуєва свасоссто зсооссссо 3240 теастасосса сассозався дасвасстої очдссвастяс соадсовнх ссасосссо99 3500 ссвасооєтос асусзасзас задоссадсс отоозавачся дсссаастсо ассассассє 3360 їзассадсст тоосососто поосодсаєто ссаодсасуєс досодссзає ассссодаза 3420 тїзвсаассає содаоссавс сзсаєвоєсо засддссазії зд9єзассвасє зссавяссо 3480 тсутасасяа чатазтсаає стаахссваст саїтсдасса ссосоєовзє ватоосасоо 3540 аєоссассст зсссатссза одссутасуго дсстасссда асазсссосс сусстокса 3600 тоададтавос ахтосаасава їтаїсссзозс їзссстоїта зссассоасо зсзсессто 36Бо спадстаєсоєса одсадссаєсс псоассодоса астддосатє сстассотає тафіодавов 3720 ссвдосасітя зосодсасст дсстозасат соастосаєс ссркссагоз сусстватеся 3780 сахтодессзаз сазттссасс здассткосо стстассова сесусСяссяс ктооосатссво 3840 сусуасттсо ссосасссоЗ асзісоЗсся одзасоїсасс тадазодася одсаттоксов 3900 ссосстдасс асадуєоїто ссосестаст оазаааасас одпдсоззад соавсосатад 3060 ттадоссазо дкастодасо асалосадої соддоєсдаї дассаусяїта тесадтуєда 4020 осатстасєсо стпдсозссо оїтссазсао гогсозасто сстатастос састоааосо9 ово сссудсзатї тестсуассо звоссстоас дссозазаєс стоссосває ассто9т99ї 140 оахсоосовх бустатахтса чсстозаостї ободсатскосєс саєсусазос тодо9сосаса 4200 одосдаціосо зсадазосос додадсосає сстуссдасс сасозсаасо заттаассос 4250 сесдоасодсе азаєсостоа зозазстодо сасадсясте сасстазоасс асавсеєсоа 320 осастасодаз заїпостоасс тостодссад сдасодсазо одусодосзає хосвсстда 41380 чЧпассазссяз састовкво ссговася ссузссасЯає асславцесх тсаасстоба 3440 втсстадасє стозадаїтцда зсоддсяссЯс саїттоассаєс дасовасесх ссасвссай 4500 саїтдсасзає якстдоддсса ксоддсвасої састдосова ссвасостод сосассодцас 4560 сахтдаасссао чдасоадатод хсоссдавахє саїссоссозс авоозсссваєс осттсзаасс 4520 дасадсоааїтї чссоссоатЯЄ стстассоа ссесодавосо дтодіоас9 дсазоасссс 4680
Чозасаазсс адссадсацо зсстозаєсто сахсоєсосо савексссої стоссдссаа 4740 таассодосс атозосстоо азісозазад содссссяка совосоачьоо сусоссотоа 480 сзавссаєсєсто атсЯсовозїх досадасозє сдоскозосо Яістесовос татссвоссоє або
Чіттосссза їсостудада сооосасого ссстодазоатї одсовссодта ссатесатас 4920 ссасссвасо стсодствазо садстасазсяа зЗссоасаста сосассстов оссасоссюу 4980 дсасатстоа сЕсоад 49965 «210» 15 «ії» 6758 зх й екчна послідовність
«аву «23» послідовність між, та включаючи, Мбеї та хХпої сайтами рестрикції в плазміду рЕТ2ОВСЯ)::4НВТ АСХЯЄ ррвскО «00» 15 асататасас сотасстста асодіїссса сосоассоці досаасстдє содатотвоє бо тЕстсаєтас ссодстосЯє асозасацас сстодасоос ассасовоєх їсустатсода 120 суаззсоасс ссоодвасяхо суассосокс сугтоазосї ассдасаєсс тост саосо і80 тсоодаісто остсасодто дтостсасто сосастоуса дазатостоо свассозадс 240 дассяттасо чксососасо азазапоатах озтдосаусх дассавтста зссвсасстс 300 тхжЕстсссої ссуусєсвазо аззооїсасає ссососдая встостсоса сесзсоасо9о З5о ттстассасс топатжстово аситтїссссу ссосоватозї ососяїсаєс спа савЕ 420 оїстсстато їссассосоо сосохссоасо ссогоастаз сацдзоатаї зозтасооса 480 дкхстдадса дсосасаєсо сосазусазї дааазазазо сгуааазасєав статітсдас 540 стосстссоа содаватово соїтасаст ссосадоусаз сассодсзав сассттЕссо 600 ссттотасса зсзатєктаїта ссассттазе озїістостоз сссссозада зсадоссахх 6БОо сосазаааво стсосоаосо сасодазаза одадсоддсас созстатоас созаїтатс9о 720 чазазацеєзоа дастсссетЕ їсабатстясс ссоваастудо скзсазтодУ каско 780 паїтзасасєта задуєкатод ксесссодах стозасаєста ссосаватос азвссосайсс 840 зсздааатсз сасатоссєва хасавустої зодсасстїта Єсстаціїса свасазссто що озстасостоа ссаттосасї зогоЗїадс озаосСасяда задайаазта тствссозвас 960 стоадсасаос тгозастассяї тосаїтаїтоЗ Зсастовассо азссоратаай Каса зчах 1920 зсавасоадіс сододсассас сосаассаза пстозадото оскодаазає саасодссад 1080 авасоттода стодсаатац сасстїтоса затстоастоз ссасстітос яасотавтдсс о зессассааїс здаттавсоо сттсаксоатє азаааачата сассзоазіст аазадсавсс 1200 вазаїсссда асзазатєтод їссосотата обосацазто зксатаєссї астосаозах 1260
Ччитстстасас содатозада ссоїстоссс доастоєсаата дстттсадда тассадсазад 1320 исстзосад ссадссоФас сасодттоса соЗсадссца стоотаєтад сатодотатх 1380 їатозктакої дссассоста тстоозалоза сотазвасазє сговтосасс осстозсвоса 1440 тЕжсвосіа ассаосадза астодіссво атоссосота акостсацас засос 1500 зісдоассдос дістосоатаа астосастоля зссодісаза кдасассв99 ксадосааоєс 1560 стпддусаазо сатозактай саосаазаса сотозаассо ссавасстода тссоааста 18520 стдоосдата ахдататєссє досадатєтсї студстосаа завсатттто соасстооза 1680 стсцдатстата сстатозаци сасстаїтцат аїсватассє боацстассоз ссотовазех 1740 авссротатсто сааЯстссаа ассодсвасс сугсадссоїс тотавяаство саддацазає 1500 таастатоаа соаохаєдсс сссстосоєє тосатасосс споадсссасс дассооссвЯ 18569 пстоссадас сов кес сасстасоусє їсзасоатосє звассазоєс собазвасссо 1920 сдатсдатає ссаїтостосс засастоссо асстоїсста садсстцваис сасосустса 1980 асчацсавод соасососза дасссстодо ссдзацасає ссдасссосво актсстссотс 2040 азоадсасоса соссакостс аазасосода ссттсоасад ссосатодтз зссосссайс 2100 дссапазцая засоїсссс хасатусааа псстодасоа ададодссвіс доасачзсодсс 2160 задосостодс одсстозассос ассдасатує осттсссоас стассуссво сзазаусатес Кей тазтзвЗссса счасасоксо стовєсрада сзахєстоасса астостоатсс засозасосо 228о0 всссссісза додссассау стоссуаєсяа тргастсош усусодавоасєс восттссеса 2340 ссатсаздсос свасстасо асссвоїтсо сосацоасоЗЄє содстовсс атодсаєсоу 2400 созісааодя сватасстад аєсосстсою сатадаєсоа сзасчасЯасє астассовоє 2460 сддасіїсса сассдсссте асстттоссс асосатассо сзссссивис аїсстсавсо 2520 тадісзасвза ссавсоодсс асссссасстї сссаподссає соссузсЗдс дазссдасса 2580 ссттоассоо ссоасооасосо датсрБоока стосстсост зсоодттоазс досаасдаєє 2640 тсессоассує дхасостусс тсосостдво содссоаусо сосссцассоє часссвасе 2700 садасстоах суазсодЗакхс асстассогоа ссодпсесоса стсоаскс двсовессесе 27650 ссаадіассо ссстоссуас дастодаоєс асттсссосєтї зодсдаєссу аєсясесуєс 2820 тоазоасачса ссіцаєсзаз ассодссасу здакссодода збзасассад вссоссасоо 2880 ссоазасссва заствсоуака астоссосас адазавозазс суазсаостас пасвесестов 2940 ссзасоцаса сатсссовос одссдсстсов мг тсозодца сососасазу заватсссо з000 ассасстосо ссоссаасос садузасісо оод95їїо39а Козасовсса саасвасвос 3060 аксазсссоо азассодсєсатє дассассаст ассатдаєса їдатссадає сстосастсо 3120 зесактодаєу хсатоасссда адсосвасдає закутоадіоо єохасоосса доаасотсоУє 31850 тасстсоосо дсекаттссо стусассодаа доасстосада асзадтзсЯд сазаєсусоєс 3240 состсдасу сосссаїстє содасадсдоєс абсутсуата ссдссасодо сатавотосс 3300 тахтадсстос Ясссдосоох ддадасссад стсоусссастї астестаєсс дасстссоас 3360 садаксаїстї ссозустадс ссасстоасох тассосссря ссодсозаєх сасєтассссо 3420 стдассстас дсатосстста соазсоосоа9дс асстатодсо дссадастса сзассздадс З4во ссддазоасуа хаїїсассса падбсососоде стососассо сзатассоутс саасосттах 3540 здасоссааго зсстЯїтовх сосстісдатєс даатосоася асссоотаат сттсстодай з6о0 сесавасасс тсасаасуо сссустсдат доссассясоу ассоссстоє авссссотов 36650 їсузадсаєс сасасазсос сутосссдає удтсастаса ссотассост доасазадсс 3720 чесасєсассс ссстудсва счасотзасс тостоассх азсодсассас да атасуєв 37во дсссасатод ссоссовача аазсозсяс зчаїтоссуаао сдатсовсст асосвассто 3840 тдассоастод асстадасас таїсоаїсоаз їсоосовааа аззассчассо кс 3900 дсодсасоадо ссасссосас стосоостїс добосспадс содіоїсосє дсосвовад 3960 састосттсс ассасстода дососсдатс ддзасасоєса седдстдоада сассссстає 40250 сстсасасас адазатодос їтасскссса десссттсоас одахацоастоє д9састдава 4080 зацдуєсатдо аросстсаас зодсасасас дісаєсзада тоссодасаї каЗсовадос мо аксососача совок ка9с додаток тс стсазЗЗісЗ осдасатсах соссозодає 4250 садодтоосо9 ссдасаєсах дассдасазо дссассатод заатсссстє оссодтсває 3250
Фісвадатаї тодссстаца тооссвассс одпддзадсоа гоасЗоссда хзсоазсто 4320 аксссосатсо задтодааоцо садсвосазє сатоакодато сосстсадсс аааассудса АЗВО озоадссссоо стосссссає хасзуссазо ссодавссяє аозайцасоє айаасссуєс 43440
Фідсассадо сосссоссая ссасдазоєт осасссатсо тоссусусса яссодоєсдає 45юо завссостад сстсусстаЯс соатасосаза сесассстуЗ асассвкимає созвастосох 4569 тахоатасасу птаздсооссс дассоЗзосоє ассстасасу аазцасстсда свссттсато 46520 досаадссЯс зазосзатос содоасазювса ссідзаєооїї асуссавоса сассдасадєс 46580 чадсадутасє садсдатсод сстосуссос азозісоссс зосдсасоса дозсуссаза 4740 сдссадуатсо сусастієсад Ктасоєсєсоза оавахтсцасо ссассуєсст зозооссста 4800 содссаддсаас єсазсадсаа Зсасодсвасє зассоодоса зостоасстт зстоссаттс 3860 стодстасовсо ссстдоксок засостосує дасттєссос возтсзасусє дасстасоах 4920 часоаадеЗс адатєсатсас ссодссасєзус зсуоагасасо соодЗсвттос сасссаадоує 4980 дасаасодсс тоатацтасс сохостосос сасоассуазаЯ содосадссї ахтодоссяах ко осспддсозоа Зітсусоссх дадссзасуст зсасуїтазаса асаадоссво сспотозвоао 5100 стусссддсті соассаїтсає сстодассяЗс сстодсаюсс тодасодсає соссвосасо 3150 ссадтоадїса асассссода доасдЯсватс стусодоса ассосатоцї соааасодсса 5220 тддітдаєсо асуцссадах сассосЗсос азозспаїтов асстоаїтссво стсЯаттсоас 52850 сассоосоата9 ссдасоддсає зоакаєсусс стостсатсс зодссотася соЗсстосітс 5340 чаасаасссо сстсстаехк сзс9939ї9а дсатусваса сассвессау австассстух 5400 тдатсаєсуд содсозсссх дасозссатд сзосадссаяї ссососсудо саастооуса 5460 тссстассої ассостодаа доссадоасає содосопосає стосстозас атсодстоса 5320 тсссосссва посостозіс сасугтодссо засачтттса ссзоосстся састттассо 5580 зассстсзсс астодасатс аосотдостх соссососст сдоасаїтсуос садавсоєса 5540 ссбоддаасцоз соосаттоєс дассоєстоз ссасадотаї тоссуссста стовазаадєс 57да асдочоаєраз зоїоазсосаї дассводсса адотастодча содсааодсадЗ сода 5750 асчассзосу тасссаотос задсатстат тостодсовс созссссаодс аутуєсозває 5820 тасстактаст чссостоадає засссодівза тжтсстсвчас созазессто дсдссозаав 5ББО сестассоса асзсстосто обассрчася псоостатає сдасстодаЗ стЗдосаєо 5940 сстаїтсосва зстдодукоса садатозота тодсодаацс зсвавасоє зЕсстоассаз 500 ссізсоасад сузаєкдаєс зссссоакоо ссдавїсууєє даадзаасто ддсасавсох обо тосасстадо ссасадсоєс дададссаса зазаєодста сстускдасс зосозсодса 5120 запцчаасоавяса астосоестії Ззадоассцасс зацтассози доассосувяча соссоадссас 65180
Здсассазвцооз стїсазассто дааєодсстоЯ асстоддаадає озасадсасс дссаттасса 6240 тсдасазоасо сстдссасаєс аодсаїтосаса асесстодас сассдосовс пссоскоосЯ 5300 зассдатастї зососассза оссзтозссс асадсоадчаїт чоссоссцрав аксассоссе 53 усазазсссо асостттЗза ссзасасоа стассоссек ятоЯстттасс дасссуЗава 5420 тосокоот99є сдосааоасс ссддаасяаад ссаоссзоса зодсстодас сосассаксоу 54850 содсазктссс зсссоссосс вакцдссово ссатоаусст доавтсуаза засо 5540 тасаоЧіЧчох дасасоссої дасзаєсаєс свассоатодо сСспасзаЗзся щас 99 5600 сочистссоа зстатесваєс сут соссс ааїсостода сасовасося тесссодаза 55650 атасодссод тассаттсає зсссасссва состсоуєда зусозсасао даазссвсає 5720 тососЯсссу додссасосс їїосататсї засссоаа 6758 «230» 16 «211» 26 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «ой» «223» ВСКАр.К прямий праймер для клонування оперому ЯСКАЮ «Нюх 16 засстатсат садсдаєтає пвадссо 26 «2» 17 «11» 15 «йій» ДНК «233» Штучна послідовність кох «223» ВСКАБ.В зворотний праймер для клонузання оперону ВСКАР «40025 17 спассстуса чагссосоад заєсасатуї 9 35 «210» 18 «21і1» 33 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «их «ЯЗ ААТ.Е прямий праймер для клонування лАТ «40025 18 апуасоатата ссасоаааац стесєєстата сс 33 «210» 195 «ії» 44 «21?йх ДНК «833» Штучна послідовність «2205 «23» ААТ. зворотний праймер для клонування ААТ зусадссода тсссстасвза дастадткта стодстадтЯ стає 44 «2102 720 «511» 395 «ві2х ДНК , , «213» Штучна послідовність «20» . «223» АСКХЯ.КЕ прямий праймер для клонування дСха «Нюх 20 сассадссад сзасстаоса вЗсаздатата ссасодсто 39 «2102 21 «2531ї» 37 кг1ї2» ДНК , , «233» Штучна послідовність «220» й «223» АСХ4.8 зворотний праймер для клонування АСХ4 «НЕ 21 тхсссстосаа уастазіїта садодсозоза содатад 37 «2102» 722 «ії» 5657 «232х ДНК , «»ї3» Штучна послідовність «2205 «223» вектор експресії рЕТІ1бБ(552г) «НИ 22 тЕсстолада соааводоасс єсохдатасо сстаттттта їтаддіївато сатоатаає БО затпатсєст тадасоїсад стдасастї: тсоддодават збвсосадаз сесстаттто 120 тттакттттс тазатасатт сазататата їссостсато адасзатазас сстдатаваї 180 зсттсазіза таїтцазаза зууазодзоастат Чазтастссва сатттссеса ссосссттах 2540 тсесесеЕт дсозсаєстихї одссскестаї ссссостсзс ссапазасає соотдазадї 300 зазадатасе давсавІсадх годотосасо зотоадзогстас аїсозастод дісссвасад 360 соотазцатєс сттдаазуєє стсоссссоа адзасетттт ссаатоахтда дсассссєаа 420 зоакЕстоЗста тосовсосооа тастстастсссо єдстоасосс ододсаздазс застсцуєсо «80 ссосасасає таттстсада зіЗасттцзаї соачзтастса ссацтсвсаб лазавсатсії 540 тасодаїтдос ахдасадтіза садааттасо сазтзстусєс аїзассатоа обуатвасає 500 тосочссаає Стастсстда саасдаєсоо аддассоваао дадставссв се тоса 5650 сазсаєсодоц затсатосаа стсоссттоа їсастодоза ссдозостда асовадссаї 720 зссааасозс задсотовса ссасдатосс тосвосвату Зсазасвасоє тосоасазаєє 750 аїсзассчоє чзавстастта стстадсттс ссросаасвза їтїайасабзсї сода вас 830 одаїтазазеєх осавдассає кістасоссс подсссекссо астуЗстаЯах сезсс9стца З0 сазаїстода зссуосозос зкооістса соостаїсатє дсавсастоз зодссадаєоо9 з60 таадссстісс сотаїсотад стіаїстасає дасодоової садосааста годатодасо 3020 азатапасай аксустоазоа садатасстс астазітаво састодтавс соссачасса 1080 засїттассса каїтатасткт зозЕтоактї зааасттсат сстствастта азадозіста 3140 поахоазазатс стук ваха зістсаїтзас саазаєссст їзасутдаятї КеСсесСксоз 1200 стдадсцеса дассссосаз зазадаєсаа зоодвжтсскст Бдадасссск т стосо 12560 сотааєстос тастсстосзаа сазазаааєс ассастасса яса зсстассада 1329 їсазузуєта ссзастстїт сіссдазоує застдодсккс зосазадсує адатассава 1350 тассотссте стаудстртвзос сутавісаду ссассассєс задаастсто хадсассосе 1440 хкасатасстс одсістостаа їсстоїттасс звотодстасі дссвосоосо атазотсота 1500 тсетвссоо9 ттодастсаз озсдатації ассоуаєааоя дсасаосяЯх содостоває 3550
ЧадчоаксЯ тдсасасадс ссацсттозЗа ссовасдасс тасассузає кдадатассє 1520 асвасостоад статувоааа дсоссасясті ссссозадод адазазасуд асавотатсс 1680 посавоасооає адозїсСодсад сздазовосо сасововово сссссадочо давасоєсто 1740
Зухаїстттат адісстатсо зок сосса сстстоассє задсоїсває Кто соато 1800 стсотса999 Здаосадавсс їзтодавава соссадсаасє осодссттї гасу 1850
Чассскктає соосстттту стсасатцстє стттсстосЯ ттатсссста зттстотдаз 1920 таасєсоасаєт ассоссттту астозастоа сассосісос соосацссова содассда9с 1950 садсозаїса зсвадсзадя азосоолаца ососстозкеа соохасстїс єссттасдса 2040 тстусосоаї атїїсасасс осактатасзо тосасестся дсзсзатста стсстоасасе 21300
Зсатачтсаз дссадтатає астссостаї состасотоа стодотсзто Зстасасссс 21850 дасасссосс засасєссост дасососсст дасоодастко сссустсєссо осасєссостє 2220 зсадасааає тотдассоєс тссцддазст дсзсусуїтса даоутетеса ссуїсаєсає 2280 спаззсзсос дзозсаасто соосаазавяасї саїтсвосисо оісотозаЗс дваттсасазда 2340 твКстассто кссасссосо кссадстсує соадестсес садразосоїї засосетац 2400 тЕстчасааз 9дсздосСсаєо стааацвсоо СТЕ сста сто саст пашоасскссо 2450 татазододя аттсстакттс асзоудоїтаз гозктассоаї дааасовово адаатоскса 2570 сдатасодає састдаєоаїт озасаєчссс доскастада асактотоза Ззосазасаас 2580 тдо9сцутато датасдасоз оассададаа зазісастса додєслатує сзасоастксо 2540 їтаватасада татадококї ссзсаслота зссадсавоаса ссстосуато садатєтссооа 2700 всатзаїтчачє зсадсосчст дастессосо сЕсссадаєт скасуазаєсва судавассов 2750 асассаєтса Тоссосвуст спцдтісосаз асастттоса дсадсауєсе сттсвсосес 2820 пстсосесах содтдассса гЕстустаас садізадуса ассссоссад сстаоссаау 2880 тсстсаасов савдадсасо ахсатососа сссотдосса доасссавсо стосссодада 2940 тосассвсох асоддстосто зазасодсяу асоспатода таївстстос сазодаєтад 3000 тгтососаїї сзсазктстс сосвзадааії застоаосісс азктсстова сходові 3060
Кагізасуза дтоссоссуа стіссаєсса пдогсоавото дсссузсєтес зсосассося 3120 асосаасосо оздадосава саадусатстач пасоосЯсст асаавтссата ссзасссоєє З180 ссатогастс дссозоосоо сатазаїсос сотоасуаєс посадіссав трассаасх 3240 тадостадта здазссосуз одссатсстто айостохссс єдасотсоє сатстаєста 3300 сстодасазє згодсстоса асосодесаїє сссовакосся ссдовадсоз даадавесаї 33650 заковоЗаао дссактссвоє сксасоїсос Заасассвос задасосадс ссадсвсоєс 3420 зодссоссата ссоосратаа со9сстаст стсоссозва сусссдосою савуоассаФі 3480 чзасозацост тозосозоб59 сатосзазат кссуватасс усааосдаєса Зоссодвтсає 35340 соєсососіє садсозааос дуссстсосс озааатовсс сарацсосто ссоосасста 3500 тсстасодадї тосасоатаз зуаадасабї сатбтазотосо дсдасдатаз созсоаєсссо 3650 сдсссассоо зазодзаоссва стодуссова дастстсаао доасассуатс даврассссоу з72а тодссстзатоз зудазстває ссасаттаає оса сес стсастссса сттссаЗес 37850 адазасста їсотоссадс тоосатсєтазту аассоадссаа сосесдувоа чацрусавес 3840 зсотаїтоуо соссацдасо зії ксассадкох дасодосаає зустоаткас з900 сстссассос стддссстоз дадачітоса осазоасовис сасоастовії тоссссарса 3950
Часолазатс стосктдато зтсозїтааса осподатаста зсатозоста хстксвосах 4020 суксататсс састассоац ахтзтссесасє сзасвсясва сссодасісо зхазтЧас зо5о здсастесЯсс садсассатс срдатсессо сазссяусає сусзосавда асдатуссст 4140 саєесацсає єЄсосатоціє сустораазає содасасузс астссазеєсо сстссссо 4200 сесостатсоЯ сіозасстоа стосдадсда засассстата ссазссвосс адасасадаєс 42650 асоуссозоає зоазастсаахє доадсссуста зсаососцат стостаатца сссзахосов 43270 ссазатЯастс сасесссацї сЗсусассує сттсатодоа дазазізата статтузкоа «380
ЗгогІстодєс здадасатса здаазкаасо ссоузасаїї зососазудєа дскессасад 4440 саактоавсаїтс стіпатсатсс аасудатач тзасуаєсзо сесастцзасо сесттосасва 4550 здавчзасєтчта сассоссЯст стасаддстє суасоассуєє сс твсс ассуасаєсса 45350 ссасястуус асссацттоа тсоддсосоза атссзаксоє свсзасаатї тосдасодсо 4520 сптасаодос садастудаа підосаасоє садтсадсаз содстаттко сссоссаотї 4680 дЕкосассас зсодітаода асотаатеса одстссуссах соассоєтесс асттееессс 4748 асагтсссоЄ адазасаєуо стопсстодї їсассасосу здааасооєс созгазовов 4800 сассвосата стістосуаса гсусасааси ттастовекх сасаєссаєсєс ассскоуватих 4860 застстусттс содаасустає сатассатас сосоавазоє тттосессає ссузкотох 4920 ссдразаєстс дасастстсс сттатосуає ссстосатта дозадсвоєс саосаятадо 90 хтозоазесаЯх тозасассос соссосвляадо азічососат дсазодаває дуссссяас 5040 апассссссода ссасподЯсс соссассвта сссасассоза васавасест сатовоєссо 5ЩМ0О ааосозсозац сссоасстиес сесатєсоцта асоїтсвосоа їабадасосс восаассоса 5360 сстотдосас судїрасасс одссасовто соаїссозосох зодводаєсва здассесдахс 5220 ссосоааакї засасуасєссо астата9999 аактдтсаос бвоатаасває кессстстад 5280 ааатааєктт ддїстааскї дадазацдаца сахассакод сстосадодо асссастеєс 5340 їазасазадсс созазозава сідазєкоос тоссуссасс дстовосаатї заствосата 5400 ассссттосЯ пдсстставзає чпастсттова засво стоадацова даастасатс 5460 соадататсес Зсавдавчоаєс сдосачітасс досаїзасса засстасосс тасазсактсс 5570 задатзасоз тоссдадоає дасодактозоє одсастоттад аєтстсатаса содтасстом 55850 стозасастзас засстаасто їдаїзааста ссосаїттаза зсттатсоаї датавстої 5540 сззасзтодац за 5852 пи» пи
З Штучна послідовність «0» «223» оптимізована ацил-соА оксидаза 4 (АСХЯ) з дгабідорзіз їВаїідпа для експресії я рЕТІБЮ (5583 «А» 23 аходосстссс тоїсаддсос сассоктосо аясазтцава зазааотола ассстсттас бо стсваксстос сяссчаєода заїтакстосї осасесссодс зодсаасцсс зусаксавсс 128 тссссассої дсасуєтсоса хтатсассаї тттаасдасс состдасссс ддазозасво зо фесатесоха азаваціїса созатоатату дазазацаау їсцсзссоає Єзтвзассдай 240 таїтпоцаза азасодаакк: есУсЕссас астассссояа аастудатасє васодасату зва шссдасоота агасєсаавзца стасозкскоас ссодохстає ссезктасоас азасостатс 360 оздсвдассяссо аваїкосасоа хотадаєсост їсатастсда сотссатсст досссатадс 420 тстссдуоха тоассдассає сосЯстутУє достсададо сссадаавуа вазататєсто 480 ссуксустоз сосзассоза сасодтсоса соссоодсс тодссдваєс ддасватодс 540 посдасоасат страсстодо тассасуцст ассазавтзоа аадусооісо чазаахсаас ОО о9дісаразає чітодатсою саасадтаєс сттосодатс тостоаттає сесасссує 6бо засассасоа ссзасєсадаї саасоакскс ассоссзаза задасасасс дача 720 дстассазаз Сссоаатва затсоцісто соасастозсос асазсоосоа сассстоста 7о саазатитот гос сссода хдаарассві стассодЯсо ссзасацітє ссадпасаєс 840 адсаааніїс хоосадесяо ссодсотсата отодсттодсє зассчатєтооа сатстстато 500 чотакстатч атахтутасса ссаттассту азадаасоса засадіїїтзо соосассасто зва дсадсаттсс аасстуваєса дсазазаста чіссачатує создусяаток дсадосваса 4020 тссстоатод Зстодсасс окотазасто саїдзавсдо оїсачаєуас сссудссаа 1050 зсаазсстад дсаазоассто дасстацттсє азадсосота зайассдсазоа сота 1150 заастастод зсодтазсод саїтсстазсс засттество єсосаззааоЯс сстстосоас 1200 сідозассда їстатасота сдазодтасєс сасуататта атасостоді: дассодЕсуєс 1260 чдазасстасола дсаттосааа сттсааасса астасссокк стсосстота а и «2105 24 п: ре «213» Штучна послідовність 523» оптимізована алкоголь зцилтрансферазиа СдАТ) з яблука для експресії в рЕТІ1бВ(5хе) «4005 74 акозаазост стсстосаст ссазауісаза сусстосзає садаастуаї тасоссадсо 60 азаєсдассс сосадозааас саааттссто їстддасаєсо агозссваца двосстосох 120 дідсадатєсс сдаєсатссаї дізстатаза дасаасссоз осстдавтвя заатсосавє 159 ссадссаадо ссзсссотза дассстохсс сустасастод сстастаєта сесостодсо 240 зассяаїстос оссоапоцесс озагсосава стодсоосо астосватоя гра сакх 300 стос со здосорадсоє доасуєсаєє стддзасазс соодсодсая датестоссо 369 ссатоаєссЯс котсоозада ЧЕстстотас засттсссяз оссадсоатод стаїсатсоаї 420 тосессастас состозттїса адтсасттої стаасосото птодсестакт тстостсто 380 скосстддазесє асассатато тозсосзасо Засктаїтос тостсстовс соссатсоса 549 чаазтодоссс атоотоссса сосасєсоозає астстассодо соїоодаасу созастосто 800 тхсосасуєо асссоссксо таїтасттос дсасассато затасозода состассоас або сатадсозсо чсаодстасос дадсзасвас сазадсаата тоостосазсо садстсстас 720 тесоосасца адоаватоса соїїстосас запсацатсс сосстсасст датсазсасо 780 тосадсасст їтоаєстдах тассосатає ссзсодазоаї зссодтасусє зосостозас 849 ахсазсссоа аадзазссек ссососоаос тотатсотта асососато9у Сайасаказе 00 азтостсасс соссостодо стаїтасодс затосоасссо саїссссоос тастаєстсх 960 задусададе состохутав даассстсто здаїтасоссс содзаєтоує даздазадвсо 1020 азадсдасса гозватодазвоа отатстосає зоасотдасца асстастоауї сесосасадє 1080 сотссусаах астссаодсає дадстсстат стоаєсоєоа дсдасватає ссосоєооде 1140 тесооідату ссвасттсоо Єсодадссво ссачзїссско стодсссоУє свазесатка 1200 чдасстоаєса остсстасої їсвасакаао засаасасцд авзатцатат сс 1260 акосасстас сокссісоЗс дахтоададсоє їхссзасадо апйстодазся саттасссау 1329 чаассузазо асдатастто свасвзакстоа сутадсасса зссаптавд 1368

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб отримання метакрилової кислоти та/або складного ефіру метакрилової кислоти, який включає наступні стадії:
(а) біологічне перетворення ізобутирилу-"СоА в метакриліл-СоОА за рахунок дії АСХ4 з Агабійорвіз ІШайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гасіаа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) перетворення метакрилілу-СОА в метакрилову кислоту та/або складний ефір метакрилової кислоти, де стадію (Б) здійснюють біологічно за рахунок дії 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази (4НВТ) або хімічно.
2. Спосіб отримання метакрилової кислоти та/або складного ефіру метакрилової кислоти, який включає наступні стадії: (а) біологічне перетворення ізобутирилу-СоОА в метакриліл-СоА за рахунок дії АСХ4 з Агабійорвіз ІШайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гасіаа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) перетворення метакрилілу-СоОА в метакрилову кислоту та/або складний ефір метакрилової кислоти, де стадію (Б) здійснюють біологічно за рахунок дії алюоголь-ацетилтрансферази тіоестерази (ААТ).
3. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1 або 2, в якому складний ефір метакрилової кислоти являє собою С1-С20 алкіловий складний ефір.
4. Спосіб за п. 3, в якому складні ефіри метакрилової кислоти являють собою бутилметакрилати.
5. Спосіб за п. 4, в якому складні ефіри метакрилової кислоти являють собою н- бутилметакрилат.
6. Спосіб за п. 2, в якому трансфераза являє собою алкоголь-ацилтрансферазу за ЕС номером групи 2.3.1.84.
7. Спосіб за п. б, в якому алкоголь-ацилтрансфераза має фруктове походження, таке як яблучне, динне або помідорне походження.
8. Спосіб за будь-яким одним з пп. 6 або 7, в якому алкоголь-ацилтрансфераза діє в присутності спирту з утворенням відповідного алкілового складного ефіру.
9. Спосіб п. 8, в якому спирт являє собою С1-С12 спирт, такий як С1-С4 спирт або С4-С12 Зо спирт.
10. Спосіб за п. 9, в якому спирт являє собою бутанол.
11. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1 або 2, який включає додаткову стадію (с) перетворення метакрилової кислоти, яка утворюється на стадії (б), в складний ефір метакрилової кислоти.
12. Спосіб за п. 11, в якому стадія (с) може бути здійснена біологічно або хімічно.
13. Спосіб за п. 11 або 12, в якому стадію (с) проводять біологічно за рахунок дії естерази або гідролази.
12. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-11, в якому ацил-СоА-оксидаза є за ЕС номером групи
1.3.3.6.
13. Спосіб за п. 12, в якому ацил-СоА-оксидазу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: АСХ4 з Агабрідорзіз ІНа/апа, коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алигобасієї Місомапає, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з МУ/дпа гасйіага. ацил-СоА-оксидази з Сапоїійа р. та ацил-СоА-оксидази 4 з Сапаїда Ггоріса!їв.
14. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-13, в якому ацил-СоА-оксидаза являє собою АСХА з Агарідорвів Іпа/апа.
15. Спосіб за п. 1 або пп. 11-14, в якому 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестераза є за ЕС групою
3.1.2.23.
16. Спосіб за п. 15, в якому тіоестеразу вибирають з будь-якого з наступних ферментів: ацил- СоА-тіоестерази 4НВТ з Алілгобасіеє! 5р.
17. Спосіб за будь-яким одним з пп. 15 або 16, в якому метакриліл-СоА перетворюється в метакрилову кислоту за рахунок дії тіоестерази, та тіоестераза являє собою ацил-СоА- тіоестеразу 4НВТ з Апй/лгобасіе! 5р. штаму ЗИ.
18. Спосіб за будь-яким одним з попередніх пунктів, в якому спосіб біологічного перетворення здійснюють з використанням ферментів в одному або декількох мікроорганізмах-хазяїнах.
19. Рекомбінантний мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) біологічне перетворення ізобутирилу-СОА в метакриліл-СоА за рахунок експресування АСХА з Агабійорвзіз ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гадіаїа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічнеперетворення метакрилілу-СОоА в метакрилову кислоту за рахунок експресування 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази (4НВТ); 60 де рекомбінантний мікроорганізм являє собою ЕзспНегісніа соїї.
20. Мікроорганізм, модифікований однією або декількома гетерологічними нуклеїновими кислотами для проведення наступних стадій: (а) біологічне перетворення ізобутирилу-СОА в метакриліл-СОА за рахунок експресування АСХА з Агабійорвзіз ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гадіаїа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічного перетворення метакрилілу-"СоА в метакрилову кислоту за рахунок експресування 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази (4НВТ).
21. Мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) біологічного перетворення ізобутирилу-СоА в метакриліл-СоОА за рахунок експресування АСХА з Агабідорзіх ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з МУ/дпа гадіага та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічне перетворення метакрилілу-СоА в метакрилову кислоту та/або складні ефіри метакрилової кислоти за рахунок експресування 4-гідроксибензоїл-СоА-тіоестерази (4НВТ).
22. Мікроорганізм за п. 21, де складні ефіри метакрилової кислоти являють собою С1-020 алкілові складні ефіри.
23. Спосіб отримання метакрилової кислоти, використовуючи мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 19-22.
24. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 19-22, де мікроорганізм експресує наступні ферменти: (а) АСХА з Агарійорзів ІПпа/апа; та (Б) 4НВТ з Ап/тобасіег" 5р.
25. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 17-20 або 22, де мікроорганізм ендогенно експресує один або декілька ферментів або мікроорганізм гетерологічно експресує один або декілька ферментів, або мікроорганізм експресує комбінацію ендогенного та гетерологічного ферментів.
26. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 20-22, 24 або 25, де мікроорганізм може бути вибраним з рекомбінантного(их) мікроорганізму(ів).
27. Мікроорганізм за п. 26, де рекомбінантний мікроорганізм є вибраним з бактерії, архей, дріжджів, грибків, водоростей або будь-якого з множини інших мікроорганізмів, прийнятних для ферментативних способів. Зо 28. Мікроорганізм за п. 27, в якому мікроорганізм являє собою бактерію, вибрану з: ентеробактерій, які належать до протеобактерій роду ЕвзсНегісніа, Епіегобасієї, Раповєа, КіІебзіеПа, бетаца, Епуіпіа баІтопеЛйа, Могдапела або подібні, так звані дифтерієподібні бактерії, бактерії, які належать до роду Вгекібасіепит, Согуперасіепит або Мікрорасіепит, та бактерії, які належать до роду А//сусіорбасійих, ВасіПив5, Нуагодепобасієї, МеїНапососсив, Асепобасіє!, Асіпегобасіє!ї, Адгобасіепит, Ахотігобріит, Агообасіє!ї, Апаріахєта, Васіегоідев, Вапопелпа, Вогдеїена, Во!тепа, Вгисейа, ВижнНо/ідегпа, Сауттайобасіеєпит, Сатру!обасієвг, Сіатуаіа, СНіатуаорнйа, Сіовіпдіит, Сохіейа, ЕВРпіснпіа, Епіегососсив, / ЕгапсізеЛа, Еизорасіепит, СагапегеПа, Наеторпйи», Не!ппсорбасієг, КеІрзіелПа, Метапобрасіегит, Мікрососсив, Могахег/а, Мусобасіепит, Мусоріахзта, Меїіз55епіа, Разіешег/а, Реріозігеріососсив, Рогрпуготопав, РгеуоїеПа, Рзепйотопав, ВНігобіит, Ніскейвіа, НосНайтаєа, Ноїніа, бНідепла, оїарнуІососсив, бїепогорпотопаз, 5Ггеріососсив, ТГеропета, Мібгіо, Моірасніа, Уегвіпіа.
29. Мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) біологічне перетворення ізобутирилу-СОА в метакриліл-СОА за рахунок експресування АСХА з Агабійорвзіз ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гадіаїа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічного перетворення метакрилілу-СоА в складний ефір метакрилової кислоти, такий як С1-С20 складний ефір метакрилової кислоти, відповідно С1-С12 складний ефір метакрилової кислоти, такий як С1-С4 або С4-С12 складний ефір метакрилової кислоти, за рахунок експресування алкоголь-ацилтрансферази.
30. Рекомбінантний мікроорганізм, пристосований для проведення наступних стадій: (а) біологічне перетворення ізобутирилу-СОА в метакриліл-СОА за рахунок експресування АСХА з Агабійорвзіз ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гадіаїа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічне перетворення метакрилілу-СОоА в складний ефір метакрилової кислоти, такий як С1-С20 складний ефір метакрилової кислоти, відповідно С1-С12 складний ефір метакрилової кислоти, такі як С1-С4 або С4-С12 складний ефір метакрилової кислоти за рахунок експресування алкоголь-ацилтрансферази; де рекомбінантний мікроорганізм являє собою Езсепегісніа сої.
31. Мікроорганізм, модифікований однією або декількома гетерологічними нуклеїновими 60 кислотами для проведення наступних стадій:
(а) біологічне перетворення ізобутирилу-СОА в метакриліл-СОА за рахунок експресування АСХА з Агабійорвзіз ІПайапа, пероксисомальної ацил-СоА-оксидази з М/дпа гадіаїа та/або коротколанцюгової ацил-СоА-оксидази з Алілгобасіе" пісоїапає; та (Б) біологічне перетворення метакрилілу-СОоА в складний ефір метакрилової кислоти, такий як С1-С20 складний ефір метакрилової кислоти, відповідно С1-С12 складний ефір метакрилової кислоти, такийі як С1-С4 або С4-С12 складний ефір метакрилової кислоти за рахунок експресування алкоголь-ацилтрансферази.
32. Мікроорганізм за п. 29 або 31, де мікроорганізм являє собою ЕзспНегісніа соїї.
33. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 29-32, де ацил-СоА-оксидаза являє собою АСХА з Агарідорвів Іпа/апа.
34. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 29-32, де алюоголь-ацилтрансфераза є фруктового походження.
35. Мікроорганізм за п. 34, де алкоголь-ацилтрансфераза має яблучне, динне або помідорне походження.
36. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 29 або 31-35, де мікроорганізм являє собою рекомбінантний мікроорганізм.
37. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 19-22 або 24-36, де мікроорганізм є генетично модифікованим для збільшення продукування метакрилової кислоти та/або складних ефірів метакрилової кислоти.
38. Мікроорганізм за пп. 19-22 або 24-37, де мікроорганізм є генетично модифікованим шляхом модифікацій, які зменшують або усувають активність ферменту, який каталізує синтез сполуки, іншої, ніж метакрилова кислота, яка конкурує за такі ж самі субстрати та/або проміжні сполуки, шляхом модифікацій, які зменшують або усувають активність ферменту, який метаболічно перетворює метакрилову кислоту або метаболічно перетворює проміжну сполуку в отримання метакрилової кислоти, талабо шляхом модифікацій, які зменшують або усувають активність протеїнів, які беруть участь в інших клітинних функціях, які видаляють проміжні сполуки в отриманні метакрилової кислоти та/або складних ефірів метакрилової кислоти.
39. Мікроорганізм за будь-яким одним з пп. 37 або 38, де складні ефіри метакрилової кислоти являють собою С1-С20 алкілові складні ефіри. Зо 40. Спосіб ферментації, який включає культивування одного або декількох мікроорганізмів за будь-яким з пп. 19-22 або 24-39 в ферментаційному середовищі для того, щоб отримати метакрилову кислоту та/або складні ефіри метакрилової кислоти.
41. Спосіб за п. 40, в якому складні ефіри метакрилової кислоти являють собою С1-С20 алкілові складні ефіри.
42. Ферментаційне середовище, яке містить один або декілька мікроорганізмів за будь-яким з пп. 19-22 або 24-39.
43. Ферментаційне середовище за п. 42, в якому середовище додатково включає метакрилову кислоту та/або складні ефіри метакрилової кислоти.
44. Ферментаційне середовище за п. 43, в якому складні ефіри метакрилової кислоти являють собою С1-С20 алкілові складні ефіри.
45. Біореактор, який містить один або декілька мікроорганізмів за будь-яким з пп. 19-22 або 24- 39 та/або ферментаційне середовище за будь-яким з пп. 42-44.
46. Спосіб отримання полімерів або співполімерів метакрилової кислоти або складних ефірів метакрилової кислоти, який включає стадії: () отримання метакрилової кислоти та/або складних ефірів метакрилової кислоти за будь-яким одним з пп. 1-18 або 23; (ії) отримання метакрилової кислоти, отриманої на стадії (і), для того, щоб отримати складний ефір метакрилової кислоти; (ії) полімеризація метакрилової кислоти та/або складного ефіру метакрилової кислоти, отриманих на стадії (ї) та/"або складного ефіру, отриманого на стадії (ії), з одним або декількома співмономерами для того, щоб отримати їх полімери або співполімери.
47. Спосіб за п. 46, в якому складні ефіри метакрилової кислоти являють собою С1-С20 алкілові складні ефіри. бо в з и ч | 7 : щ | х З зв І соки ж ок соска Ві : во М» ММА АТ ОІВ 0 і РО ов | ше Е
5. М ше ! Я ши ЩІ і чих З Ж 5 я і т | ши і вом. м ов птн бом у , : | нави - 4 ГПМетакрильнСоАді 7 л.мкМмоль і Е КК КК Ж ААААЛАААКААКАЖ АК КАААААА УК АААКАААТАКИ КОКО КК АЛАЛАЛЛААААКААААЛАХААХАКАНАКЯКА
Фіг. 1 З, ї Ж ! сш та г Мі» НН ан СОоВі Зоя с - ; що і ве | ЯК м М. що 2 ФК тю є п я я нанні о В Мах Вк ою лов я ВОМ а: . 4 і Пзобутирил-СоОА У л.мюмоль їх о» т т т я КК в КТК КТ НКТ ТК о од в ву чу пу і у КВ В ну пу я труть Лу л т т тля лу т п Ж ЖК ЖК нт жк кю пу пиву п пт пу пит пуп п п т в в тв в вт вк
Фіг. 2 А к я ок с ст пт нм НН тю чо ач очи ух пу хете тече потоп жін пить от ть Ж Ж Ж ВА и ю тю чу чут тю пил чел пи лют Тл п Мк пуд п Ж у ЖЖ жк ж Кок ж ЖЖ ж ж тя я Ж Ж ся ЖЖ я Ж в ля Тюль лють тюльтьтьть З МО з косе ОбУТИрИЛ- СО є БАД 280 нм ! їх : ме е-у х -3 : сне ддетаквипіпт-Сой я БАД 280 вм «вк ї с» Метакрипова киспота, 215 нм х і пехекх Ко-ВеДМент А, 215 нм . ; Н Х З жом: і г : й ЩЕ : ШЕ в Я ще. її ш ЕТ 5 с і : КЕ їв ; 8 Її ШЕ ; ад и киш У г каш: До феод ттодтюсфестрчну со СКК пря у КК лимон ех хюкююкюю У З 54 553 Б ЗІР) ІІІ АОУх и а ВЕ ВУЗ ІІІ ЗАЗ Час / хв. ;
Фіг. З
Р у ОК як я о Ж ; Ме: в їх з ; ї на їі
В. б їш ОВ 2 м: | ; : іх. Ж і : Х Х В : х ооо З ії Й доемолоюомооооооооххосооююоо ооо оооосоютетстсттня пететееттотетннлукккнкхханкккккк. Мекккеючкх кни ; 543 3 5 х 5 Х в З 3БІзІрізІіЗЗхІвІУЕкіІЗІвНлР гулі ІІ ІВ узі ліва Я ринки винница В В ння -
Фіг. 4 МАРК тя я З АЛААААААААААААААЛААХААААЛАААААААААААААААААААААААА АЛЛА АААААААТА А АЖ КИ АЛАНА АТ тн ет А АТТА оеКнт хх : АЖ : 3 : : 5 ї же; І : х зх З Я
3 . : ! К у 3 з як З х ; Ж 3 х : ї 3 х у 5 ж її Х Ї ї ї х 5 в її . . : ї х х Ж зх ! х - 7 Кк : хх Ї й ; ж З В ;
5. ! у. ї ! 85 і Ії : ї з х її ї Я : х 11. : х : ї КЗ зії З ї ; х КУ х ЗІ х ЩЕ їх а М М ДКЗ у з долу у п мя м а НК КК В КК 5 5 х 3 В 5 5 Б У Ж Б МОБахх Вікі а Іва оі са ков ВИ
Фіг. 5 к вин НК 5 « с: Е 5 МЖК: : ка ії : фо- : 5 : ї : : х ї : х х зе ЕХ х Ї : їх х х а Ї Х Ї Е : Х х х Ж : ЖЕ х У Я ВХ: М ; Я КО: М : З я КУ : В Е я й» : пох Е З : Во З і є шк Б Е с : мох ї : Бе Е ОЯУ : х ЕЕ
Хо. її ХХ, Х ТК Е ро ШЕ: х а ; ТК ; х х 1 х Х х Х хх: і Я В й х ІІІ З ФК уче МУК ок. Хо й Мосохююютоттєючикккчтюттттонкх п ЕН ВЕНИ ї З з їх 5 З а х к х ж хіх гівів ІІІ и ВК ВІКІ а З
Фіг. 6 а и и а а Я а з ООЖ КОЖ Зі «Е і їз і З ї Ж ; т її ї шої ї Ж їх Х і 5 Я х
Я. Ох х ХЕ я ШЕ Ву я Ж г ; В х Ї ще ї ГУ Х Я лк х : З 5 Бо: о: БЕ ШЕ х є ї ЗІ В х ЇВ В й ; за ї ШУ х З М їх МН ; КО 15 м А. ко Я КН: кН ДЖ Кркннкукчную я умерти Аля т сю няня учений Хек Мо Комчнутяхумьху х З хх хх З 5 5 Б У Б 5 ах кікіизвУ із Іс ха хх ах Іа їх А ї ї ниж Час хв. і
Фіг. 7 жоккккккккюкк лого нн ан Ж а ї окккккюююккикию посююююююее ткої ї 3 ? Н ! В оня ї МО в і і: а Ж ас Н ох Я м З ее зм г с о ї щу ди В з з ї : я ШО РО - Е ї Я ей сз уеемнятю й. Е ' М 0 яз ермнинор 5. , хе о оч Н Ж я З Ба ; ех ЩЕ мк Б щ де а ПООМОД че З : ЯКУ й х Бо и і я. і У з : ! У ОТ жах Моя х. Я ї ї ОО 5 В і Е Я З ЗУ У і ї як ЦЕ їх Х СЯ ї ї й УК я Б 55. Н і ДОМУ 5 5 : : ше та 8 З ї ТІ У " З 5. І їі З : і їх і | Кт : І - ї : 3 її . В ї 3 З М ох учв Ж чех хуя й щі 55 : : Я ОК ВЕТИН зіва АС АСА пу В чн і ОК зу вв Ж о Я ОО М Се ке Кай Деу : МОХ Ж сх ЖЕ Но. ї Ех Б НИ; : І в ЖЖ т ОКА :
В. Я Ії І
: 5. га і 3 жу КВ її т. І і Б 2 й ! р т; їх : ; Я як я й х Її У х ж В і : щ їх У и ї їх ї с ж ОК хх; їх с во хх х м ях ї дь З - - є У ї ї ь й у Ще т ех Ж Ї Н "о. хх ев : МО кт чо «и і Н Я Х за я ну Її З ох ее їх ЩІ х а сс і і оно ї і ак ї З ЇЇ ї З З тин : ; ; ХВ п -
Фіг. 8 с 1. с х о. КК я
Фіг. 9
А) 00, В) зов, за зво зо ма ! з | З. і жі. ЕЕ що. що. '
50. о. й баонннаосилпнннн чн донопантст кінних З пінні та Мо 15 13 10 й Ще; о 1 / хв. т/ хв. : с) 00, 0) за.
з. 250
200. 200 Мо | щі . ' я 15 | 55 300 | зо : ' І 50. ; Б: тк і І і НВ ! і ! в ЇМ онннннскнноннкв дн о нн с снення ! ре 12 із за 1 13 ГЕ Ю во, ву 300, ,
250. зво і З 150 І З й ши | о й
300. | мою, й ! ! Рі !
50. ' о її ; Л Аг 10 м 1? 13 10 ци їз з Т/ хв. К/ хв.
Фіг. 10
2 За : 5 х КЗ : й ТО АТ ЮК Ж Кк нти : їБЕ Га ее й -к Ж : , ня : б ; удень ва Бі ї НН ї Кй ден 5 ! ОВ ОО. т ЕН Е ї шк : неї Ї Її т ца Є то є г. й щ ЩО й «8 є ! Кк. щ І дах я зі ; Ж я ДЕ ВК оон нти полон нік Е о в 5 10 із р Час біотрансформації / год. Ж.
Фіг. 11 нн Дня й ване семових з о» сс і і я НМ аумее ТО ту. З. У ; ЯК ша "так "лк. хх ' й М 5 ' я РЕ 5 Й І І: Е щ і і І. РЕТТОБС У )нанвт-АСХ У РОВСКО | З ї 10,338 Бр І її. ' | У У К І й ' мое ; «БЕ ай че й іх р ой "че у Мун Як. У у ай і зе ОН ня созаи кине на !
Фіг. 12 і : у Кіш ї ПЗ і : . і : ї : ; і 5 і ї КЕ З : «я : ЇХ -к ї В : сш 80 х 1 Її : 1 ї її : т Ж ї її : т ї БЖ : ї й х її з ще З ТІ : їж ії її : 1 ї Ії : ї жк : 1: : ї Є її ї Ж 30 5 Ії : М ї І : : ті : ї го ї 11 : ші її : : ж ї її : 1 хх ї її ЕЧ : 1 і Ті В : їх; ги 1 й : тю НЮ я її її : ї Н Ті ІЗ : х ї Ї ї ї І ї Я : її кі : ї ї ї ЗК : ї ке «В длеумукуламум каучук АК М ухекж ки ди те дек км тки ди нини г ппААААКАААЮВ А МВ : ї : ї й : Н я х ж й пт т зв ве 3 : 5775 8 З955: : б051152:55335455555355655775 85955: 3 : : : : : ; Час /хв,
Фіг. 13 нн нн а нн нн У Я що х Н 3 х х х ї з ї В : Н ІЗ Е х ; ї ї У х їх ї : 5 БЕ. ї : Ї х Н х НЕ : ї : т Х ї ен ма гу х ї Ї МЕ: МЕ ї 2 ЕХ ї їз х ї з Кк ї ВІ х : ї ї їх х ї Її Ж і хх ї Ж х їх ї теж хх ї 3 Ж я ї їх х ї ї їх хх Х т х Кк ї їх Х їх ї ї хї Х їх ї Її ХХ х х Її Ж : 35 хх ї ї «фе ї т х ї КОЖ ОВК: ЕЕ : ї ї ті ї «Е : з ї Е злу З УТ ї ї Ж ї 513 х ї 3 З х 15 х ї З Ж ї ІЗ КЕ ї х х І СЯ ї їх х Зх з їх ї ЕЕ їх М Мх ї х о їх ЖІ їх ї 3 Ж МОХ І Щщ ї ї З їх щЩ ї ї Зк їх їх хх ї їм ї Ж ї їо- ї її КАМ ї 1 з ж ї КО М - ї ї нн нн в КО їх ї їв Я ї сх « я Ф хе Є жк У ч ок Кт: мг х хх х х хх с ех п. хоч г» - й х з 5 ж ЖЕ х хх г хг що УЗ з: БЕ й щи «ії рота а 15335555555555 555 ВН : "Часі : З о ХВ. ї ен КК КК КК КК КК В В ,
Фік. 14 ї : З хо. ! ї х: І : «КЕ ї : Н сх ї с : Н у і : т БО я : ІЗ ї ; : ре 2 5 : ї - Ж » ї 5 5 У : їж ї у : 1 Ж ї З :
в 0. с, у хі х хх 5 : ї Ж ї ї З : ї я ї Х І їй во НЕ : : їх І : З : Б жо о. і с Ж 3 я : ї КЗ 3 ї ож х іх : ія мо. ЕЩ й ї ю х53 5 ї Їх І пед В ЯК З кидкннккки, ення ккал А ої ТЯ ; : і ч . г х ох « х ;5 : 2» 205511525533:355845555555775885859558К: ї ї Ж Ї ї і Час /хв. :
Фіг. 15
UAA201712600A 2015-05-19 2016-05-18 Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти UA127403C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1508582.2A GB201508582D0 (en) 2015-05-19 2015-05-19 Process for the biological production of methacrylic acid
GBGB1517545.8A GB201517545D0 (en) 2015-10-05 2015-10-05 Process for the biological production of methacrylic acid
PCT/GB2016/051438 WO2016185211A1 (en) 2015-05-19 2016-05-18 Process for the biological productiion of methacrylic acid and derivatives thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127403C2 true UA127403C2 (uk) 2023-08-16

Family

ID=56081512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201712600A UA127403C2 (uk) 2015-05-19 2016-05-18 Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти

Country Status (14)

Country Link
US (5) US10704063B2 (uk)
EP (1) EP3298153A1 (uk)
JP (3) JP7203496B2 (uk)
KR (1) KR102706404B1 (uk)
CN (1) CN108026548A (uk)
AU (1) AU2016265751A1 (uk)
CA (1) CA2985279A1 (uk)
EA (1) EA201792538A1 (uk)
MY (1) MY198780A (uk)
SG (1) SG10202101577YA (uk)
TW (2) TW202248422A (uk)
UA (1) UA127403C2 (uk)
WO (1) WO2016185211A1 (uk)
ZA (1) ZA201707822B (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2985279A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Lucite International Uk Limited Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof
GB201619827D0 (en) * 2016-11-23 2017-01-04 Lucite Int Uk Ltd Process for the production of methyl methacrylate
JP2018085948A (ja) * 2016-11-28 2018-06-07 国立研究開発法人理化学研究所 メタクリル酸耐性微生物及びその製造方法
CN109722405B (zh) * 2017-10-31 2023-06-23 创享(天津)生物科技发展有限公司 利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途
CN108048425A (zh) * 2017-12-19 2018-05-18 湖北工业大学 一种对羟基苯甲酰-coa硫酯酶及其制备方法
CN108559721A (zh) * 2018-05-15 2018-09-21 北京师范大学 一种净化空气的复合微生物菌剂及其应用
GB201808424D0 (en) 2018-05-23 2018-07-11 Lucite Int Uk Ltd Methods for producing BMA and MMA using genetically modified microorganisms
GB2621337A (en) 2022-08-08 2024-02-14 Mitsubishi Chemical Uk Ltd Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS5867699A (ja) 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
JPS5877895A (ja) 1981-11-02 1983-05-11 Ajinomoto Co Inc プラスミドｐｈｍ１５１９
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
KR100697552B1 (ko) 1997-07-18 2007-03-21 아지노모토 가부시키가이샤 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
JP4066543B2 (ja) 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
BR9917880B1 (pt) 1998-09-25 2014-02-18 Processo para produzir um ácido l-glutâmico
DE19850541C1 (de) 1998-11-03 2000-06-15 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Acrysäureestern und/oder Methacrylsäureestern von Polyoxyalkylenen und deren Verwendung
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
PL1651758T3 (pl) 2003-07-29 2009-04-30 Ajinomoto Kk Sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny przy użyciu bakterii Escherichia o atenuowanej aktywności enzymu jabłczanowego
JP4257730B2 (ja) * 2003-08-25 2009-04-22 キッコーマン株式会社 アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
ES2444785T3 (es) 2004-09-09 2014-02-26 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Fragmento de ADN que tiene función promotora
CA2688292C (en) 2007-06-01 2015-01-27 Evonik Roehm Gmbh A process for preparing methacrylic acid or methacrylic esters
MX2013005510A (es) 2010-11-24 2013-12-16 Lucite Int Uk Ltd Un proceso para la produccion de acido metacrilico y sus derivados y los polimeros producidos a partir de los mismos.
SG192706A1 (en) 2011-02-11 2013-09-30 Univ Minnesota Cells and methods for producing isobutyric acid
US9133487B2 (en) * 2011-04-01 2015-09-15 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing methacrylic acid and methacrylate esters and methods related thereto
WO2013044076A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Codexis, Inc. Direct biocatalytic production of acrylic acid and other carboxylic acid compounds
JP6117576B2 (ja) * 2012-04-16 2017-04-19 東洋鋼鈑株式会社 フォトリフラクティブ材料組成物、フォトリフラクティブ基材およびホログラム記録媒体
CN113957103A (zh) 2012-09-10 2022-01-21 三菱化学株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法
CN104619851B (zh) 2012-09-10 2019-03-19 三菱化学株式会社 甲基丙烯酸酯的制造方法
JP6123196B2 (ja) * 2012-09-12 2017-05-10 凸版印刷株式会社 蓋材
US20140107377A1 (en) 2012-10-15 2014-04-17 The Procter & Gamble Company Microorganisms And Methods For Producing Acrylate And Other Products From Propionyl-CoA
JP5643383B2 (ja) * 2013-05-16 2014-12-17 北越紀州製紙株式会社 インクジェット記録シート
EP3039151A2 (en) * 2013-08-28 2016-07-06 Invista Technologies S.A R.L. Methods for biosynthesizing methacrylate
CA2985279A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Lucite International Uk Limited Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US11753661B2 (en) 2023-09-12
TW202248422A (zh) 2022-12-16
EP3298153A1 (en) 2018-03-28
WO2016185211A1 (en) 2016-11-24
JP2018516561A (ja) 2018-06-28
JP2021176338A (ja) 2021-11-11
US20220372527A1 (en) 2022-11-24
JP7203496B2 (ja) 2023-01-13
TW201713773A (zh) 2017-04-16
AU2016265751A1 (en) 2017-12-14
BR112017024654A2 (pt) 2018-09-18
CN108026548A (zh) 2018-05-11
US11248243B2 (en) 2022-02-15
EA201792538A1 (ru) 2018-06-29
US20180195095A1 (en) 2018-07-12
CA2985279A1 (en) 2016-11-24
US10724058B2 (en) 2020-07-28
KR102706404B1 (ko) 2024-09-12
US20220204999A1 (en) 2022-06-30
JP2023134574A (ja) 2023-09-27
WO2016185211A8 (en) 2017-11-23
TWI801327B (zh) 2023-05-11
US20200308609A1 (en) 2020-10-01
KR20180008786A (ko) 2018-01-24
MY198780A (en) 2023-09-27
US11753660B2 (en) 2023-09-12
ZA201707822B (en) 2021-03-31
JP7381525B2 (ja) 2023-11-15
US10704063B2 (en) 2020-07-07
SG10202101577YA (en) 2021-03-30
US20180171368A1 (en) 2018-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127403C2 (uk) Спосіб біологічного виробництва метакрилової кислоти
Tan et al. Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria
CN107406821B (zh) 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
CN107002019B (zh) 产生3-羟基丙酸的重组酵母和使用其产生3-羟基丙酸的方法
CN107709540A (zh) 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途
Yunus et al. Synthetic metabolic pathways for conversion of CO2 into secreted short-to medium-chain hydrocarbons using cyanobacteria
US20140342414A1 (en) Direct biocatalytic production of acrylic acid and other carboxylic acid compounds
US20160222419A1 (en) Genetically engineered saccharomyces cerevisiae and yarrowia lipolytica and production of fatty alcohols
BR112021011629A2 (pt) Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído
JP2021525085A (ja) メタクリル酸エステルの産生の方法
Zhang et al. Manipulation of triacylglycerol biosynthesis in Nannochloropsis oceanica by overexpressing an Arabidopsis thaliana diacylglycerol acyltransferase gene
CN111197054B (zh) 重组恶臭假单胞菌的构建及其在生产丙酸中的应用
Hu et al. Comparative performance of S-adenosyl-L-methionine biosynthesis and degradation in Pichia pastoris using different promoters and novel consumption inhibitors
US20220127648A1 (en) Genetically engineered yeast yarrowia lipolytica and methods for producing bio-based glycolic acid
CN108330114B (zh) 一种利用epa的甘油二酯酰基转移酶及其应用
US20140329275A1 (en) Biocatalysis cells and methods
GB2621337A (en) Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof
TWI555842B (zh) 釀酒酵母菌株轉殖株、其用途及應用其生產生質乙醇方法
CN111206023A (zh) 一种高效提高微藻甘油三酯含量的代谢工程方法
최은지 Production of 2, 3-butanediol from glucose and galactose in engineered Saccharomyces cerevisiae
BR112017024654B1 (pt) Processo de produzir ácido metacrílico, microorganismo recombinante, processo de fermentação, e, método para preparar polímeros ou copolímeros de ácido metacrílico ou ésteres do ácido metacrílico
BR122024008251A2 (pt) Processo de produzir ácido metacrílico, microorganismo recombinante, processo de fermentação, método para preparar polímeros ou copolímeros de ácido metacrílico ou ésteres do ácido metacrílico
EA043272B1 (ru) Способ биологического получения метакриловой кислоты