CN109280631A - 一株磺胺二甲基嘧啶降解菌s-2及其应用 - Google Patents

一株磺胺二甲基嘧啶降解菌s-2及其应用 Download PDF

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Abstract

一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S‑2及其应用，它涉及一株降解菌及其应用，本发明提供一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S‑2及其应用，所述磺胺二甲基嘧啶降解菌为Paenarthrobacter ureafaciens，即产脲节杆菌，属于革兰氏阳性菌。该菌株该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.16360。该菌株对磺胺二甲基嘧啶具有高效的降解能力和较高的耐受限度，且能在高浓度的磺胺二甲基嘧啶环境内保持其降解速度。在水体中该菌株可以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源生长，能耐受超过400mg/L的磺胺二甲基嘧啶，并可以在30℃的条件下将水体中不高于耐受浓度的磺胺二甲基嘧啶降解至检测限以下。

Description

一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2及其在水体中降解磺胺二甲基嘧啶的应用。
背景技术
磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine，SM2)与磺胺嘧啶等同效，适用于治疗溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌及某些革兰氏阴性杆菌等感染的疾病，药效持久。可作为词料添加剂用于防治葡萄球菌及溶血性链球菌等的感染，即主要治疗禽霍乱、禽伤寒、鸡球虫病等。磺胺二甲基嘧啶的添加能明显促进增重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到广泛应用，也因此它常随动物的粪便以原药的形式排出体外，进入到生态环境中。磺胺二甲基嘧啶由于其具有较强的抑菌性，致使其对水环境中某些微小生物的存在构成威胁。水体中广泛存在的磺胺类抗生素会在鱼类及脊椎动物中富集，并最终危机人体健康。磺胺二甲基嘧啶作为普遍使用的磺胺类抗生素代表，其在水体中的降解与去除已成为了环境领域重点关注的问题之一。
磺胺二甲基嘧啶是一种广谱抗菌药物，当磺胺二甲基嘧啶浓度较高时，会严重抑制微生物的降解能力。已经报道的可以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源生长并具有降解该物质能力的降解菌有Achromobacter sp.和Pseudomonas sp.。现已发现部分对磺胺二甲基嘧啶的结构类似物具有降解能力的微生物，但这些微生物目前并没有报道出对磺胺二甲基嘧啶的降解能力。其中已报道菌株也并不能将磺胺二甲基嘧啶进行完全降解，去除率较低。因此，为充分实现磺胺二甲基嘧啶的微生物降解，应针对磺胺二甲基嘧啶的微生物降解行为展开充分的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2及其应用。
本发明的一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2，它为异养产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)S-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年8月30日，保藏号为CGMCC NO.16360。
本发明的菌株用于污水中磺胺二甲基嘧啶的生物处理；以及污水中其他磺胺类抗生素的生物处理。
所述菌株异养产脲节杆菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2的形态特征为：在原子力显微镜下，该菌株呈短杆状；该菌株在固体培养基表面形成的菌落为较小、圆形、白色、略有凸起；该菌株在液体培养基内生长会形成均一的乳白色菌液。
本发明所述菌株经过宝生物工程(大连)有限公司进行16Sr RNA测序，测序结果利用BLAST程序进行同源性比较，本发明菌株与相关菌株的基因序列同源性在99％以上，本发明分离的菌株S-2与产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)的基因序列的同源性在99％以上。
本发明提供了上述磺胺二甲基嘧啶降解菌，即异养产脲节杆菌Paenarthrobacterureafaciens S-2在降解水体中的磺胺二甲基嘧啶的用途。
本发明提供了上述磺胺二甲基嘧啶降解菌，即异养产脲节杆菌Paenarthrobacterureafaciens S-2在处理含有磺胺二甲基嘧啶的污水中的用途。
本发明包含以下的有益效果：
本发明提供的菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2具有较高、较快的降解水体中磺胺二甲基嘧啶的能力，在pH＝7.0，温度为30℃，摇床转速150r/min的条件下，对含有不超过400mg/L的磺胺二甲基嘧啶在短时间内的降解率超过99.99％。
除磺胺二甲基嘧啶外，该菌株对水体中的磺胺类抗生素药物也具有极强的耐受能力和降解能力，3d内可将初试浓度400mg/L的磺胺类抗生素药物降解至浓度低于检测限。
本发明分离的菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源生长，并能实现对磺胺二甲基嘧啶的快速、高效降解，对于实现水体中磺胺二甲基嘧啶的生物处理十分关键。
附图说明
图1是本发明所述降解物磺胺二甲基嘧啶的分子结构式；
图2是本发明所述磺胺二甲基嘧啶降解菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2的原子力显微镜照片；
图3是本发明所述的磺胺二甲基嘧啶降解菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2的系统发育进化树；
图4是本发明所述磺胺二甲基嘧啶降解菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2在磺胺二甲基嘧啶初始浓度100mg/L的液体培养基2中培养时，其生长和磺胺二甲基嘧啶降解的浓度与TOC变化的规律图；其中，空心三角形表示菌株的菌浊OD660随时间的变化情况，实心三角形表示培养体系中磺胺二甲基嘧啶的变化情况，实心方块表示培养体系中TOC的变化情况；
图5是本发明所述磺胺二甲基嘧啶降解菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2菌悬液在36h内对不同初始浓度的磺胺二甲基嘧啶的降解图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定被发明。
具体实施方式一：本实施方式的一株磺胺二甲基嘧啶S-2，它为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)S-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年8月30日，保藏号为CGMCC NO.16360。
具体实施方式二：本实施方式一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，它用于污水中磺胺二甲基嘧啶的生物处理。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的处理温度为30℃，生物处理中振荡培养，且振荡转速为160r/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的污水中磺胺二甲基嘧啶浓度为200mg/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式的一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，它用于污水中其它磺胺类抗生素的生物处理，具体为它用于污水中浓度低于100mg/L的蒽酮、磺胺甲基异恶唑、咔唑、磺胺嘧啶或磺胺甲基嘧啶的生物处理。其它与具体实施方式一相同。
实施例1
本发明提供的菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2是从活性污泥中筛选分离获得，具体筛选分离步骤如下：
(1)从哈尔滨某污水处理厂二沉池取5g新鲜活性污泥，注入含有100mg/L磺胺二甲基嘧啶的100mL培养基1中，置于250mL的三角瓶中，在30℃的条件下振荡培养，振荡转速为160r/min；
(2)一周后，取20mL步骤(1)的培养物注入到含有100mL的培养基1的250mL锥形瓶中，并添加100mg/L的磺胺二甲基嘧啶，在步骤(1)的条件下培养；
(3)重复进行步骤(2)约40天后，取20mL步骤(2)的培养物注入到含有100mL的培养基2的250mL锥形瓶中，并添加100mg/L的磺胺二甲基嘧啶，在步骤(1)的条件下培养；
(4)重复进行步骤(3)约5个月后，取1mL步骤(3)的培养物，用无菌蒸馏水依照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的倍数对培养物进行梯度稀释，分别取100μL各倍数稀释液涂布于添加15％琼脂的培养基2的平板，将平板置于30℃条件下静置培养；
(5)在步骤(4)中的平板表面有菌落产生后，用接种环挑取所有单菌落，分别接种至10mL的含有100mg/L磺胺二甲基嘧啶的培养基2中，置于250mL锥形瓶中，以无菌过滤透气封口膜封口，在步骤(1)的条件下培养；
(6)在步骤(5)中的培养物产生明显浊度后，分别对各单菌落的培养物中的磺胺二甲基嘧啶浓度进行检测，将浓度低于检测限的培养物反复划线于添加15％琼脂的培养基2的平板进行纯化，即完成纯种磺胺二甲基嘧啶降解菌的筛选。
其中，培养基1成分为：0.5g(NH4)2SO4、1.5g KH2PO4、3.5g K2HPO4、0.15g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、1ml微量元素以及2mL储备液，用蒸馏水补至1000mL；所述微量元素液成分为：50g EDTA、5.5g CaCl2·2H2O、5.06g MnSO4·4H2O、5g FeSO4·7H2O、2.2g ZnSO4·7H2O、1.61g CoCl2·6H2O、1.57g CuSO4·5H2O、1.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O，用蒸馏水补至1000mL；所述储备液成分为：5g磺胺二甲基嘧啶，用二甲基亚砜(DMSO)补至100mL。
培养基2成分为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，用蒸馏水补至1000mL。
所述培养基均在配制后调节pH至7.0后，用高温高压灭菌器在121℃的条件下灭菌20min。
本发明的菌株Paenarthrobacter ureafaciensS-2的形态特征为：原子力显微镜下，该菌株菌体呈短杆状(见图2)；该菌株用涂布或划线法接种在固体培养基表面，于30℃培养7d后，能形成明显可见菌落，其形态为较小、圆形、黄色、略有凸起、易挑起；将该菌株菌落少量接种在含100mg/L磺胺二甲基嘧啶的液体培养基2内，在30℃的条件下以160r/min振荡培养3d，会形成均一的乳白色菌液。
本发明个提供的菌株Paenarthrobacter ureafaciensS-2经宝生物工程(大连)有限公司通过16S rRNA进行鉴定，具体步骤如下：
(1)挑取菌株，置于50μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物裂解缓冲液(CodeNo.9164)中，80℃变形15min后，离心取上清作为PCR模板；
(2)使用TaKaRa 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(Code No.RR176)进行PCR扩增目的片段，反应条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，55℃1min,72℃1.5min，共30个循环；72℃5min，一个循环。
(3)上述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用ShAP法经37℃反应30min、70℃反应15min进行纯化；
(4)上述纯化后的PCR以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA测序；
(5)上述测序结果通过Blast程序进行同源性比较，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明菌株S-2与异养产脲节杆菌(PaenarthrobacterureafaciensS-2)的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株D2被鉴定为异养产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciensS-2)，属于革兰氏阳性菌，详见图3，菌株Paenarthrobacter ureafaciensS-2以实心三角突出标示。菌株PaenarthrobacterureafaciensS-2的16S rRNA的序列如序列表Seq ID No：1所示。
实施例2
本实施例提供一种在以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源培养基中对其降解及菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2的生长状况研究的应用，其步骤如下：
(1)挑取生长在含有100mg/L磺胺二甲基嘧啶并添加了15％琼脂的培养基2的平板上的S-2菌落，接种于100mL含100mg/L磺胺二甲基嘧啶的液体培养基2中，用250mL锥形瓶盛装，30℃振荡培养至OD660＝0.081，作为S-2生长降解曲线测定试验的细菌母液；
(2)将上述细菌母液接种至100mL含有初试浓度100mg/L的磺胺二甲基嘧啶的液体培养基2中，置于250mL锥形瓶中，以无菌过滤透气封口膜封口，置于30℃、160r/min的条件下振荡培养，分时段取样并检测样品的OD660、TOC和磺胺二甲基嘧啶浓度。
所述的样品OD660的检测，是用紫外分光光度计在紫外波长660nm的条件下对样品的浊度进行测量。
所述的样品TOC的检测，是将10mL样品用孔径为0.45μm的有机膜过滤后上样，用Multi N/C 2100S分析仪对样品的TOC进行检测。
所述的样品磺胺二甲基嘧啶浓度的检测，是用waters e2695高效液相色谱仪并配置waters 2489(紫外可见检测器)进行检测，色谱柱为C18(150×4.6nm，5μm)，柱温30℃；流动相为甲醇：1％乙酸水＝25:75，流速1.0mL/min；检测波长265nm；进样量10μL；保留时间为5min。
图4为菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2在以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源培养基中生长和对磺胺二甲基嘧啶降解的情况。由图可知，菌株Paenarthrobacterureafaciens S-2对磺胺二甲基嘧啶的快速降解主要发生在对数生长期；反应体系中的TOC随着磺胺二甲基嘧啶的浓度的降低不断减少，表明磺胺二甲基嘧啶被菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2降解；在适宜的生长条件下，菌株Paenarthrobacterureafaciens S-2可将初试浓度100mg/L的磺胺二甲基嘧啶在3d内降解至浓度低于检测限一下。
实施例3
本实施例提供一种在不同磺胺二甲基嘧啶初始浓度条件下，菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2对磺胺二甲基嘧啶的降解率，具体步骤如下：
(1)用含有100mg/L磺胺二甲基嘧啶的培养基2培养菌株Paenarthrobacterureafaciens S-2，48h后收集菌体，用培养基2洗涤二次；
(2)将上述洗涤后的菌体重悬于培养基2中，使其成为OD660＝0.102的菌悬液；
(3)向上述菌悬液中分别添加浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、1000mg/L、2000mg/L的磺胺二甲基嘧啶，在30℃的条件下以160r/min反应36h；
(4)取出上述反应物，检测反应后磺胺二甲基嘧啶的浓度。
图5是磺胺二甲基嘧啶降解菌Paenarthrobacter ureafaciens S-2菌悬液在36h内对不同初始浓度的磺胺二甲基嘧啶的降解情况。由图可知，该菌株可以耐受超过2000mg/L的磺胺二甲基嘧啶，在反应36h后，菌悬液可以将初始浓度不超过400mg/L的磺胺二甲基嘧啶降解至浓度低于检测限。
实施例4
本实施例提供一种菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2对除磺胺二甲基嘧啶外的有毒有害有机溶剂的降解，具体步骤如下：
(1)挑取生长在含有100mg/L磺胺二甲基嘧啶并添加了15％琼脂的培养基2的平板上的S-2菌落，接种于100mL含有100mg/L不同各底物的培养基2中，底物详情见表1；
(2)将上述制备物于30℃、160r/min振荡培养5d，之后取出培养物检测底物剩余浓度。
表1是菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2以不同底物为唯一碳源生长时对底物利用的情况。
表1是菌株Paenarthrobacter ureafaciens S-2的底物广谱性
注：“+”表示可以对应底物为唯一碳源生长并完全降解。
序列表
<110> 哈尔滨商业大学
<120>一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2及其应用
<160> 1
<210> 1
<211>1352
<212>16S rRNA
<213>产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)
<220>
<223>异养产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)S-2
<400> 1
GTCGAACGAT GATCCGGTGC TTGCGCCGGG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG 60
AGTAACCTGC CCTTGACTCT GGGATAAGCC TGGGAAACTG GGTCTAATAC CGGATATGAC 120
TCCTCATCGC ATGGTGGGGG GTGGAAAGCT TTTTGTGGTT TTGGATGGAC TCGCGGCCTA 180
TCAGCTTGTT GGTGGGGTAA TGGCCTACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG 240
TGACCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA 300
ATATTGCACA ATGGGCGAAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG 360
GGTTGTAAAC CTCTTTCAGT AGGGAAGAAG CCCTCTTTGG GGGTGACGGT ACTTGCAGAA 420
GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCA AGCGTTATCC 480
GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGTTTGTCGC GTCTGCTGTG AAAGACCGGG 540
GCTCAACTCC GGTTCTGCAG TGGGTACGGG CAGACTAGAG TGCAGTAGGG GAGACTGGAA 600
TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGATGGC GAAGGCAGGT 660
CTCTGGGCTG TAACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCATGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC 720
CTGGTAGTCC ATGCCGTAAA CGTTGGGCAC TAGGTGTGGG GGACATTCCA CGTTTTCCGC 780
GCCGTAGCTA ACGCATTAAG TGCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC TAAAACTCAA 840
AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGCG GAGCATGCGG ATTAATTCGA TGCAACGCGA 900
AGAACCTTAC CAAGGCTTGA CATGGACCGG AAAGACCTGG AAACAGGTGC CCCGCTTGCG 960
GCCGGTTTAC AGGTGGTGCA TGGTTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGT 1020
CCCGCAACGA GCGCAACCCT CGTTCTATGT TGCCAGCGGT TCGGCCGGGG ACTCATAGGA 1080
GACTGCCGGG GTCAACTCGG AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAATCATCAT GCCCCTTATG 1140
TCTTGGGCTT CACGCATGCT ACAATGGCCG GTACAAAGGG TTGCGATACT GTGAGGTGGA 1200
GCTAATCCCA AAAAGCCGGT CTCAGTTCGG ATTGGGGTCT GCAACTCGAC CCCATGAAGT 1260
CGGAGTCGCT AGTAATCGCA GATCAGCAAC GCTGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA 1320
CACACCGCCC GTCAAGTCAC GAAAGTTGGT AA 1352

Claims (5)

1.一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2，其特征在于它为异养产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)S-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年8月30日，保藏号为CGMCC NO.16360。
2.一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，其特征在于它用于污水中磺胺二甲基嘧啶的生物处理。
3.根据权利要求2所述的一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，其特征在于所述的处理温度为25～35℃，生物处理中振荡培养，且振荡转速为150～160r/min。
4.根据权利要求2所述的一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，其特征在于所述的污水中磺胺二甲基嘧啶浓度为100～800mg/L。
5.一株磺胺二甲基嘧啶降解菌S-2的应用，其特征在于它用于污水中浓度低于100mg/L的蒽酮、磺胺甲基异恶唑、咔唑、磺胺嘧啶或磺胺甲基嘧啶的生物处理。
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