CN107586751A - 一株二恶烷降解菌d2及其应用 - Google Patents

Abstract

一株二恶烷降解菌D2及其应用，它涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种二恶烷降解菌及其应用。本发明所述二恶烷降解菌为Xanthobacter autotrophicus，即自养黄色杆菌，属于革兰氏阴性菌。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14610。该菌株对二恶烷具有高效的降解能力和较高的耐受限度，且能在高浓度的二恶烷环境内保持其降解速度。在水体中，该菌株可以二恶烷为唯一碳源生长，能耐受超过2000mg/L的二恶烷，并可以在30℃的条件下将水体中不高于耐受浓度的二恶烷降解至检测限以下。

Description

一株二恶烷降解菌D2及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及菌株Xanthobacte rautotrophicus D2及其在水体中降解二恶烷的应用。

背景技术

二恶烷(1,4-dioxane)是一种在工业上应用广泛的助溶剂，在许多洗涤剂及清洁用品、个人护理品、食品等与人类日常生活密切相关的产品中都有存在；在垃圾焚烧的过程中也会有产生。二恶烷具有致癌、致畸以及使雄性生物雌化的作用，如果处理不当进入自然环境，会对人类和环境生态造成极大危害。制造和使用含有二恶烷的产品时产生的污水，以及垃圾的不当处理，都有可能使二恶烷进入自然水体。二恶烷与水的亲和力很强，虽然其本身易挥发，但进入水体后会变得极其稳定而不易挥发。二恶烷以其被人类的广泛应用和在环境中的存在及危害，已成为环境水体修复的焦点问题之一。

二恶烷结构看似简单，但鲜有关于革兰氏阴性二恶烷降解菌的报道。已经报道的可以二恶烷为唯一碳源生长并能完全降解二恶烷的革兰氏阴性降解菌有：Afipiasp.D1、Acinetobacter baumanniiDD1和XanthobacterflavusDT8。现已发现了许多对二恶烷类似物有降解能力的微生物，但这些微生物不能完成对二恶烷的降解。这些微生物中的一部分可以通过共代谢作用对二恶烷进行部分降解，但产生的降解产物毒性更大，甚至超过二恶烷本身。因此，实现二恶烷的微生物完全降解意义重大。

新分离的菌株Xanthobacterautotrophicus D2可以二恶烷为唯一碳源生长，并能实现对二恶烷的快速、完全降解，对于实现水体中二恶烷的生物处理十分关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一株二恶烷降解菌D2及其应用。

本发明的一株二恶烷降解菌D2，它为自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)D2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月13日，保藏号为CGMCC No.14610。

本发明的菌株用于污水中二恶烷的生物处理；也可以用于污水中四氢呋喃、1,3-二恶烷和乙酸乙酯的生物处理。

所述菌株自养黄色杆菌Xanthobacter autotrophicus D2的形态特征为：在原子力显微镜下，该菌株呈短杆状、无鞭毛；该菌株在固体培养基表面形成的菌落为较小、圆形、黄色、略有凸起、易挑起；该菌株在液体培养基内生长会形成均一的乳黄色菌液。

本发明所述菌株经过宝生物工程(大连)有限公司进行16S rDNA测序，测序结果利用BLAST程序进行同源性比较，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明菌株D2与自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株D2被鉴定为自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)，属于革兰氏阴性菌。

本发明提供了上述二恶烷降解菌在降解水体中的二恶烷中的用途。

本发明提供了上述二恶烷降解菌在处理含有二恶烷的污水中的用途。

本发明所达到的有益效果是：本发明提供的菌株Xanthobacter autotrophicusD2具有较高、较快的降解水体中的二恶烷的能力，在适宜的生长条件下，对含有不超过2000mg/L的二恶烷水体在短时间内的降解率超过99.99％。

除二恶烷外，该菌株对水体中的四氢呋喃、1,3-二恶烷等有毒有害有机溶剂也具有极强的耐受能力和降解能力，3d内可将初始浓度200mg/L的上述物质降解至浓度低于检测限。

附图说明

图1是本发明所述降解物二恶烷的分子结构式；

图2是本发明所述二恶烷降解菌Xanthobacter autotrophicus D2的原子力显微镜照片；

图3是本发明所述的二恶烷降解菌Xanthobacte rautotrophicus D2的系统发进化树；

图4是本发明所述二恶烷降解菌Xanthobacter autotrophicus D2在二恶烷初始浓度200mg/L的液体培养基2中培养时，其生长和二恶烷降解的浓度与TOC变化的规律图；其中，空心三角形表示菌株的菌浊OD₆₆₀随时间的变化情况，实心三角形表示培养体系中二恶烷浓度的变化情况，空心菱形表示培养体系中TOC的变化情况；

图5是本发明所述二恶烷降解菌Xanthobacter autotrophicus D2菌悬液在22h内对不同初始浓度的二恶烷的降解图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式一：本实施方式的一株二恶烷降解菌D2，它为自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)D2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月13日，保藏号为CGMCC No.14610。

具体实施方式二：本实施方式一株二恶烷降解菌D2的应用，它用于污水中二恶烷的生物处理。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的处理温度为30℃，振荡培养且振荡转速为180r/min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的污水中二恶烷浓度为2000mg/L。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式一株二恶烷降解菌D2的应用，它用于污水中四氢呋喃、1,3-二恶烷和乙酸乙酯的生物处理。其它与具体实施方式一相同。

实施例1

本发明提供的菌株Xanthobacter autotrophicus D2是从活性污泥中筛选分离获得，具体筛选分离步骤如下：

(1)从哈尔滨某污水处理厂二沉池取5g新鲜活性污泥，注入含有200mg/L二恶烷的100mL培养基1中，置于250mL顶空瓶中，用特氟龙垫封口，在30℃的条件下振荡培养，振荡转速为180r/min；

(2)一周后，取20mL步骤(1)的培养物注入到含有100mL的培养基1的250mL顶空瓶中，并添加200mg/L的二恶烷，特氟龙垫封口，在步骤(1)的条件下培养；

(3)重复进行步骤(2)约3个月后，取20mL步骤(2)的培养物注入到含有100mL的培养基2的250mL顶空瓶中，并添加200mg/L的二恶烷，特氟龙垫封口，在步骤(1)的条件下培养；

(4)重复进行步骤(3)约3个月后，取1mL步骤(3)的培养物，用无菌蒸馏水依照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9的倍数对培养物进行梯度稀释，分别取100μL各倍数稀释液涂布于添加15％琼脂的培养基2的平板，将平板置于30℃条件下静置培养；

(5)在步骤(4)中的平板表面有菌落产生后，用接种环挑取所有单菌落，分别接种至10mL的含有200mg/L二恶烷的培养基2中，置于50mL顶空瓶中，特氟龙垫封口，在步骤(1)的条件下培养；

(6)在步骤(5)中的培养物产生明显浊度后，分别对各单菌落的培养物中的二恶烷浓度进行检测，将浓度低于检测限的培养物反复划线于添加15％琼脂的培养基2的平板进行纯化，即完成纯种二恶烷降解菌的筛选。

其中，培养基1成分为：100mL缓冲液1与100mL微量元素液1，用蒸馏水补至1000mL；所述缓冲液1成分为：32.4g K₂HPO₄，10g NaH₂PO₄·H₂O以及20g NH₄Cl，用蒸馏水补至1000mL；所述微量元素液1成分为：1.23g C₆H₆NNa₂O₆、2g MgSO₄·7H₂O、0.12g FeSO₄·7H₂O、0.03g MnSO₄·H₂O、0.03g ZnSO₄·7H₂O以及0.01g CoCl₂·6H₂O，用蒸馏水补至1000mL。

培养基2成分为：0.66g(NH₄)₂SO₄、1g MgSO₄·7H₂O、0.015g CaCl₂·H₂O、1mL微量元素液2、1mL储备液2以及20mL磷酸缓冲液，用蒸馏水补至1000mL；所述微量元素液2成分为：0.5g FeSO₄·7H₂O、0.4g ZnSO₄·7H₂O、0.02g MnSO₄·H₂O、0.015g H₃BO₃、0.01g NiCl₂·6H₂O、0.25g EDTA、0.05g CoCl₂·6H₂O以及0.005g CuCl₂·2H₂O，用蒸馏水补至1000mL；所述储备液2成分为：5g Fe-Na EDTA以及2g Na₂MoO₄·2H₂O，用蒸馏水补至1000mL；所述磷酸缓冲液成分：113g K₂HPO₄以及47g KH₂PO₄，用蒸馏水补至1000mL。

所述培养基均在配制后立即用高温高压灭菌器在121℃的条件下灭菌20min。

本发明的菌株Xanthobacter autotrophicus D2的形态特征为：在原子力显微镜下，该菌株菌体呈短杆状、无鞭毛(见附图说明2)；该菌株用涂布或划线法接种在固体培养基表面，于30℃培养5d后，能形成明显可见菌落，其形态为较小、圆形、黄色、略有凸起、易挑起；将该菌株菌落少量接种在含200mg/L二恶烷的液体培养基2内，在30℃的条件下以180r/min振荡培养3d，会形成均一的乳黄色菌液。

本发明提供的菌株Xanthobacter autotrophicus D2经宝生物工程(大连)有限公司通过16S rDNA进行鉴定，具体步骤如下：

(1)挑取菌体，置于50μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物理解缓冲液(CodeNo.9164)中，80℃变性15min后，离心取上清作为PCR模板；

(2)使用TaKaRa 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(Code No.RR176)进行PCR扩增目的片段，反应条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共30个循环；72℃5min，一个循环。

(3)上述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用ShAP法经37℃反应30min、70℃反应15min进行纯化；

(4)上述纯化后的PCR以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA测序；

(5)上述测序结果通过Blast程序进行同源性比较，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明菌株D2与自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株D2被鉴定为自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)，属于革兰氏阴性菌，详见附图说明3，菌株Xanthobacterautotrophicus D2以实心三角突出标示。菌株Xanthobacter autotrophicus D2的16SrDNA的序列如序列表Seq ID No：1所示。

实施例2

本实施例提供一种在以二恶烷为唯一碳源培养基中对其降解及菌株Xanthobacterautotrophicus D2的生长状况研究的应用，其步骤如下：

(1)挑取生长在含有200mg/L二恶烷并添加了15％琼脂的培养基2的平板上的D2菌落，接种于100mL含200mg/L dioxane的液体培养基2中，用200mL顶空瓶盛装，30℃振荡培养至OD₆₆₀＝0.123，作为D2生长降解曲线测定实验的细菌母液；

(2)将上述细菌母液接种至30mL含有初始浓度200mg/L的二恶烷的液体培养基2中，置于50mL顶空瓶中，以特氟龙垫封口，置于30℃、180r/min的条件下振荡培养，分时段取样并检测样品的OD₆₆₀、TOC和二恶烷浓度。

所述的样品OD₆₆₀的检测，是用紫外分光光度计在紫外波长660nm的条件下对样品的浊度进行测量。

所述的样品TOC的检测，是将10mL样品用孔径为0.45μm的有机膜过滤后上样，用Multi N/C 2100S分析仪对样品的TOC进行检测。

所述的样品二恶烷浓度的检测，是将样品顶空上样，用安捷伦7890气相色谱火焰离子检测器进行检测，色谱柱INNOWH4(30m×0.53mm×1.0μm)。所述的仪器方法为：初始柱箱温度45℃，保持3min，再以15℃/min升至70℃；进样器温度250℃；检测器温度300℃；进样量1μL；氢气流量40mL/min，临界空气流量300mL/min；尾吹气流量(氮气)10mL/min。

附图说明4为菌株Xanthobacte rautotrophicus D2在以二恶烷为唯一碳源的培养基中生长和对二恶烷降解的情况。由图可知，菌株Xanthobacter autotrophicus D2对二恶烷的快速降解主要发生在对数生长期；反应体系中的TOC随着二恶烷的浓度的降低不断减少，表明二恶烷被菌株Xanthobacter autotrophicus D2完全降解；在适宜的生长条件下，菌株Xanthobacter autotrophicus D2可将初始浓度200mg/L的二恶烷在3d内降解至浓度低于检测限以下。

实施例3

本实施例提供一种在不同二恶烷初始浓度条件下，菌株Xanthobacterautotrophicus D2对二恶烷的降解率，具体步骤如下：

(1)用含有200mg/L二恶烷的培养基2培养菌株Xanthobacter autotrophicus D2，48h后收集菌体，用培养基2洗涤二次；

(2)将上述洗涤后的菌体重悬于培养基2中，使其成为OD₆₆₀＝0.145的菌悬液；

(3)向上述菌悬液中分别添加浓度为200mg/L、400mg/L、600mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L的二恶烷，在30℃的条件下以180r/min反应22h；

(4)取出上述反应物，检测反应后二恶烷的浓度。

附图说明5是二恶烷降解菌Xanthobacter autotrophicus D2菌悬液在22h内对不同初始浓度的二恶烷的降解情况。由图可知，该菌株可以耐受超过2000mg/L的二恶烷，在反应22h后，菌悬液可以将初始浓度不超过1000mg/L的二恶烷降解至浓度低于检测限。

实施例4

本实施例提供一种菌株Xanthobacter autotrophicus D2对除二恶烷外的有毒有害有机溶剂的降解，具体步骤如下：

(1)挑取生长在含有200mg/L二恶烷并添加了15％琼脂的培养基2的平板上的D2菌落，接种于100mL含200mg/L不同底物的培养基2中，底物详情见表1；

(2)将上述制备物于30℃、180r/min振荡培养5d，之后取出培养物检测底物剩余浓度。

表1是菌株Xanthobacter autotrophicus D2以不同底物为唯一碳源生长时对底物利用的情况。

表1菌株Xanthobacter autotrophicus D2的底物广谱性

注：“+”表示可以对应底物为唯一碳源生长并完全降解。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学

<120>一株二恶烷降解菌D2及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1399

<212> 16srDNA

<213>黄色杆菌（Xanthobacter）。

<220>

<223>自养黄色杆菌（Xanthobacter autotrophicus）D2

<400>1

acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcgccca gcaatgggag cggcagacgg 60

gtgagtaaca cgtggggatc tacccaatgg tacggaataa cccagggaaa cttggactaa 120

taccgtatgt gcccttcggg ggaaagattt atcgccattg gatgaacccg cgtcggatta 180

gctagttggt gaggtaaagg ctcacaaagg cgacgatccg tagctggtct gagaggatga 240

tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300

ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgatgaag gccttagggt 360

tgtaaagcac tttcgccggt gaagataatg acggtaaccg gagaagaagc cccggctaac 420

ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg gggcaagcgt tgctcggaat cactgggcgt 480

aaagcgcacg taggcgggtt gttaagtcag aggtgaaatc ctggagctca actccagaac 540

tgcctttgat actggcgacc ttgagttcga gagaggttgg tggaactgcg agtgtagagg 600

tgaaattcgt agatattcgc aagaacacca gtggcgaagg cggccaactg gctcgatact 660

gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720

gtaaacgatg gatgctagcc gttggggggt ttacctttca gtggcgcagc taacgcatta 780

agcatcccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acgggggccc 840

gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagccttt 900

gacatggcag gacgacttcc ggagacggat ttcttccagc aatggacctg cacacaggtg 960

ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1020

accctcgcct ctagttgcca tcattcagtt gggcactcta gagggactgc cggtgataag 1080

ccgagaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggctg ggctacacac 1140

gtgctacaat ggcggtgaca gtgggatgcg aaagggcgac ctctagcaaa tctcaaaaag 1200

ccgtctcagt tcggattgca ctctgcaact cgagtgcatg aagttggaat cgctagtaat 1260

cgtggatcag catgccacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1320

catgggagtt ggctttaccc gaaggcgctg cgctaacccg caagggaggc aggcgaccac 1380

ggtagggtca gcgactggg 1399

Claims (5)

1.一株二恶烷降解菌D2，其特征在于，它为自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)D2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年9月13日，保藏号为CGMCC No.14610。

2.一株二恶烷降解菌D2的应用，其特征在于，它用于污水中二恶烷的生物处理。

3.根据权利要求2所述的一株二恶烷降解菌D2的应用，其特征在于，所述的处理温度为30℃，振荡培养且振荡转速为180r/min。

4.根据权利要求2所述的一株二恶烷降解菌D2的应用，其特征在于，所述的污水中二恶烷浓度为2000mg/L。

5.一株二恶烷降解菌D2的应用，其特征在于，它用于污水中四氢呋喃、1,3-二恶烷和乙酸乙酯的生物处理。