CN111944719B - 一株二恶烷降解菌is20及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株二恶烷降解菌IS20，及其制备方法和应用。二恶烷降解菌IS20为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20134。在水环境中，二恶烷降解菌IS20能以工业糖浆为基质高效共代谢降解二恶烷，且具有较高的环境适应性。二恶烷降解菌IS20的制备方法，包括步骤：配置无机盐培养基，驯化与富集菌种，以及分离与纯化单一菌种，制备方法简单、操作方便。本发明为二恶烷的生物降解提供了优良的菌种资源，可广泛应用于被二恶烷污染的水环境的生物修复。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株二恶烷降解菌IS20，及其制备方法和应用。
背景技术
1,4-二恶烷(1,4-dioxane，1,4-D)是一种工业上广泛应用的助溶剂，其已被广泛用作粘合剂，纺织品，染料，清漆，清漆，脱脂剂和化妆品的工业溶剂。1,4-D是一种环状有机污染物，包含两个对称且相对的醚键，具有致癌、致畸以及使雄性生物雌化的作用，如果处理不当进入自然环境，会对人类和环境生态造成极大危害。另外，在聚乙烯塑料和聚氧乙烯化学品的生产中，1,4-D也是有害的副产物。制造和使用含有1,4-D的产品时产生的污水，以及垃圾的不当处理，都有可能使二恶烷进入自然水体。醚键中的氧原子导致高水溶性和低挥发性，从而使1,4-D在环境中非常稳定。自1990年以来，国际癌症研究机构，美国环境保护局和有毒物质与疾病登记局已将1,4-D确认为人类致癌物。
处理技术的选择对于治理二恶烷污染至关重要。生物修复技术由于其具有高效、低成本、节能等优点，被认为是一种很有前景的处理方法。近年来，国内外已报道了多种二恶烷降解微生物，包括纯细菌(如假诺卡氏菌ENV4789和假诺卡氏菌CB119010)、菌群和真菌(如冬虫夏草A11)。降解二恶烷的共代谢细菌在处理被二恶烷污染的水环境中发挥着重要的作用。现有报道中，各学者对利用正丁醇、丙烷或甲苯作为初级底物的某些微生物在共代谢降解二恶烷方面已进行了深入研究。然而，在二恶烷生物降解方面，尚未有使用工业糖浆协同降解的报道。
工业糖浆是精制糖等工业过程中产生的一种粘稠、黑褐色、呈半流动的废液，是一种常用的微生物碳源，主要成分是葡萄糖和蔗糖。因工业糖浆具有价格低廉、无二次污染等优点，以其作为共代谢基质进行污染物生物修复的应用具有广阔的前景。
因此，开发一株能以工业糖浆为基质，共代谢降解二恶烷的菌种，对于水环境中二恶烷的生物治理十分重要。
发明内容
为此，需要提供一种二恶烷降解菌，其能够以工业糖浆为共代谢基质，实现快速、高效共代谢降解二恶烷，为二恶烷污染的水环境提供生物修复所需的菌种资源。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一株二恶烷降解菌IS20，其为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20134。
本发明的第一方面所述的菌株通过16S rRNA测序，测序结果与GenBank数据库中已有的核苷酸序列进行同源性比对，结果表明该菌株IS20与鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)的基因序列的同源性在99％以上，因此该菌株IS20被鉴定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)，属于革兰氏阴性杆菌，通过扫描电镜观察其形态特征进一步确认了其菌属特性。
本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的二恶烷降解菌IS20的应用，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理。
优选的，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以工业糖浆为基质，共代谢降解二恶烷。
优选的，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以质量体积百分比为0.01％-5.0％的工业糖浆为基质，共代谢降解20mg/L的二恶烷。
优选的，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以质量体积百分比为0.01％-1.0％的工业糖浆为基质，共代谢降解20mg/L的二恶烷。
优选的，所述生物处理的处理条件为：震荡培养转速为150rpm，处理盐度为0-8.0％，pH范围为5-11。
优选的，所述生物处理的处理盐度为2.0％，pH为9。
区别于现有技术，本发明提供了一株二恶烷降解菌IS20，其为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20，为二恶烷的生物降解提供了优良的菌种资源。在水环境中，二恶烷降解菌IS20能以工业糖浆为基质高效共代谢降解二恶烷，且具有较高的环境适应性，可广泛应用于被二恶烷污染的水环境的生物修复。此外，二恶烷降解菌IS20的制备方法，包括步骤：配置无机盐培养基，驯化与富集菌种，以及分离与纯化单一菌种，制备方法简单、操作方便。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20的系统发育树；
图2为本发明实施例1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20的扫描电镜成像图；
图3为本发明实施例1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20在质量体积百分比为0.01-5.0％工业糖浆下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果图；
图4为本发明实施例1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20在质量体积百分比为0.3％工业糖浆为底物和在不同初始盐度条件下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果图；
图5为本发明实施例1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20在质量体积百分比为0.3％工业糖浆为底物和在不同初始pH条件下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例中所涉及的二恶烷降解菌IS20为鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)IS20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20134。
本发明实施例中所涉及的液体硝酸盐(NMS)培养基的组成成分为：0.1g MgSO4·7H2O，0.02g CaCl2·6H2O，0.1g KNO3，0.1mL质量体积百分比为3.8％Fe-EDTA溶液，0.5mL质量体积百分比为0.1％Na2MoO4·4H2O和1mL微量元素溶液，用双蒸水定容至1000mL。固体NMS培养基的成分与液体NMS培养基的组成成分相同，不同之处在于，固体NMS培养基需另添加10wt％的琼脂粉。
本发明实施例中所涉及的NMS培养基中的微量元素溶液的组成成分为：250.0mg/LEDTA，500.0mg/L FeSO4·7H2O，400.0mg/L ZnSO4·7H2O，20.0mg/L MnCl2·7H2O，15.0mg/LH3BO3，50.0mg/L CoCl2·6H2O和10.0mg/LNiCl2·6H2O。
实施例1二恶烷降解菌IS20的制备
本实施例提供了一种二恶烷降解菌IS20(鲁氏不动杆菌IS20，Acinetobacterlwoffii)的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)配置培养基：分别配置液体NMS培养基和固体NMS培养基，121℃高压灭菌15min，得到无菌液体NMS培养基和无菌固体NMS培养基。
(2)驯化与富集菌种：将采集的活性污泥以8000rpm的转速离心10min，去除上清、保留污泥沉淀，接着用无菌液体NMS培养基清洗污泥沉淀三次。接着，在100mL锥形瓶中加入5g清洗后的污泥沉淀、45mL无菌液体NMS培养基，配置成10％的土样悬液，添加终浓度为100mg/L二恶烷和质量体积百分比为0.01％工业糖浆。接着，将上述锥形瓶置于恒温摇床中以28℃，150rpm回旋震荡孵育。每隔两周按10％的接种量进行传代一次，每次传代均补充100mg/L二恶烷和质量体积百分比为0.1％工业糖浆。
(3)分离和纯化：经过2个月的驯化和富集，上述菌种已传代至第五代，得到第五代富集培养物。接着，将第五代富集培养物接种至无菌NMS琼脂培养平板中，28℃恒温培养4天后，分别挑选不同形态的单克隆菌落至含有100mg/L二恶烷和质量体积百分比为0.1％工业糖浆的无菌液体NMS培养基中，筛选出能快速并能稳定共代谢降解二恶烷的单克隆菌株，并接种至10倍稀释的无菌固体NMS培养基中继续划线分离和纯化3次，获得了能够以工业糖浆为代谢底物降解二恶烷的纯化菌株。
实施例2纯化菌种的鉴定与表征
本发明实施例中，鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20是根据实施例1所述的制备方法从活性污泥中筛选分离获得的，鲁氏不动杆菌IS20的纯化菌种的鉴定与表征方法如下所示：
(1)菌种的16S rRNA序列鉴定
本实施例进行了实施例1获得的纯化菌种的16S rRNA扩增，通用引物为27F(5’-3’：AGTTTGATCMTGGCTCAG，如SEQ ID NO:2所示)和1492R(5’-3’：GGTTACCTTGTTACGACTT，如SEQ ID NO:3所示)，以实施例1中筛选分离获得的纯化菌种的DNA为模板，扩增出片段大小约1473bp。
PCR反应体系为：DNA模板(80ng/μL)1.0μL、10×缓冲液5.0μL、dNTP(2.5mM)2.0μL、上游引物(20μM)2.0μL、下游引物(20μM)2.0μL、DNA酶1.0μL，用双蒸水定容至50μL。
PCR反应温度程序为：95℃，5min；94℃，45s；55℃，30s；72℃，1min；72℃，10min；4℃终止反应。将扩增产物送交上海生工生物公司进行测序，获得该纯化菌种的16S rRNA核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。
(2)同源性比较
在NCBI数据库上，将纯化菌种的16S rRNA的序列通过Megalign软件(7.1版)进行序列比对，并使用MEGA程序(6.0版)进行系统发育分析，得到该纯化菌种的系统发育树，如图1所示。
通过BLAST搜索程序与从Genbank获得的高度同源的序列进行比较，比较结果表明该纯化菌种与Acinetobacter lwoffii A6的同源性高达99.93％
因此，该纯化菌种被鉴定为鲁氏不动杆菌，属于革兰氏阴性杆菌，并将其命名为二恶烷降解菌IS20，即鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20。该鲁氏不动杆菌IS20的16S rRNA序列(如SEQ ID NO:1所示)以登录号MT043810保存在GenBank数据库中。
(3)形态特征
鲁氏不动杆菌IS20的形态特征为：通过革兰氏染色，在显微镜下该菌株呈现椭圆形红色菌落；并通过扫描电子显微镜观察其形态，菌体呈短杆状、无鞭毛(如图2所示)。
实施例3二恶烷降解菌IS20对二恶烷的降解效果
本实施例研究了二恶烷降解菌IS20对二恶烷的降解效果。
首先，收集实施例1分离、纯化得到的纯化的二恶烷降解菌IS20。
接着，在含有50mL NMS培养基的100mL锥形瓶中添加终浓度为100mg/L二恶烷和质量体积百分比为0.1％工业糖浆，并加入少许纯化的鲁氏不动杆菌属IS20，然后置于恒温摇床中以28℃，150rpm回旋震荡孵育。
接着，收获指数期细胞，并在4℃下以12000rpm的转速离心5min，然后用无菌液体NMS培养基洗涤细胞沉淀3次，最后用新鲜的无菌液体NMS培养基重悬细胞，备用。
(1)工业糖浆对二恶烷降解率的影响
取7个50mL的血清瓶，每个血清瓶中添加20mL的无菌液体NMS培养基，并分别添加不同浓度(质量体积百分比为0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、5.0％)的工业糖浆和20mg/L二恶烷，然后以0.01(OD600nm)的初始浓度接种重悬细胞，并用丁基橡胶塞密封，并在的旋转振荡器中以150rpm和28℃的条件进行培养。
图3示出了二恶烷降解菌IS20在质量体积百分比为0.01-5.0％工业糖浆下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果。
如图3所示，在工业糖浆初始浓度从质量体积百分比为0.01％提高至质量体积百分比为1.0％时，20mg/L的二恶烷降解速率逐步增加，且在工业糖浆初始浓度为质量体积百分比为1.0％时，可在24h内将20mg/L二恶烷几乎完全降解；在工业糖浆初始浓度为质量体积百分比为0.3％时，可在36h内将20mg/L的二恶烷几乎完全降解；而当工业糖浆的初始浓度升至质量体积百分比为5.0％，可能因为工业糖浆浓度太高，二恶烷降解菌IS20优先利用工业糖浆，而使得20mg/L的二恶烷降解速率变缓，72h二恶烷的降解率为81.0％。
(2)盐度和pH对二恶烷降解率的影响
本实施例还探讨了在不同盐度和pH条件下二恶烷降解菌IS20共代谢降解二恶烷的环境适应性。
A.培养体系盐度对二恶烷降解率的影响
取6个50mL的血清瓶，每个血清瓶中添加20mL的无菌液体NMS培养基，接着用氯化钠调节各培养体系中的盐度为质量体积百分比为0、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0％，并分别添加质量体积百分比为0.3％的工业糖浆和20mg/L二恶烷，然后以0.01(OD600nm)的初始浓度接种重悬细胞，并用丁基橡胶塞密封，并在的旋转振荡器中以150rpm和28℃的条件进行培养，开展降解实验。
图4示出了二恶烷降解菌IS20在质量体积百分比为0.3％工业糖浆为底物和在不同初始盐度条件下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果。
如图4所示，在盐度为0-8.0％时，二恶烷降解菌IS20均表现出了较强的二恶烷去除能力；在盐度为2.0％，在24h内即可将20mg/L的二恶烷几乎完全降解，在盐度为8.0％时仍具有较强的二恶烷去除能力。
B.培养体系pH对二恶烷降解率的影响
取5个50mL的血清瓶，每个血清瓶中添加20mL的无菌液体NMS培养基，接着将各培养体系中的pH值调节为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，并分别添加质量体积百分比为0.3％的工业糖浆和20mg/L二恶烷，然后以0.01(OD600nm)的初始浓度接种重悬细胞，并用丁基橡胶塞密封，并在的旋转振荡器中以150rpm和28℃的条件进行培养，开展降解实验。
图5示出了二恶烷降解菌IS20在质量体积百分比为0.3％工业糖浆为底物和在不同初始pH条件下对20mg/L二恶烷的共代谢降解结果。
如图5所示，在pH值为5.0-11.0时，二恶烷降解菌IS20均表现出了较强的二恶烷去除能力；在pH值为9.0，在12h内即可将20mg/L的二恶烷几乎完全降解，在pH值低至3.0时，二恶烷降解菌IS20仍可降解20mg/L的二恶烷。
区别于现有技术，本发明实施例所述的二恶烷降解菌IS20具有以下有益效果：
(1)在以工业糖浆作为基质的条件下，鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20可快速、高效地共代谢降解二恶烷，按质量体积百分比为1.0％添加工业糖浆下，该鲁氏不动杆菌IS20可在24h内将20mg/L的二恶烷几乎完全降解。
(2)在以质量体积百分比为0.01-5.0％工业糖浆为初级基质下，该鲁氏不动杆菌IS20可有效降解20mg/L的二恶烷。
(3)鲁氏不动杆菌IS20具有较强的环境适应性，在pH 5-11和0-8％盐度的条件下，该鲁氏不动杆菌IS20可保持稳定的共代谢降解二恶烷的能力。
(4)鲁氏不动杆菌IS20的制备方法简单、操作方便；该菌的分离和获得，为二恶烷污染环境的生物修复技术的应用和研究提供了优良的菌种资源。
(5)鲁氏不动杆菌IS20可广泛应用于被二恶烷污染的工业废水、下水道水、地下水、湖泊河流水等水环境的生物修复。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (7)
1.一株二恶烷降解菌IS20，其特征在于，所述二恶烷降解菌IS20为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)IS20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20134。
2.一种权利要求1所述的二恶烷降解菌IS20的应用，其特征在于，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理。
3.根据权利要求2所述的二恶烷降解菌IS20的应用，其特征在于，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以工业糖浆为基质，共代谢降解二恶烷。
4.根据权利要求3所述的二恶烷降解菌IS20的应用，其特征在于，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以质量体积百分比为0.01％-5.0％的工业糖浆为基质，共代谢降解20mg/L的二恶烷。
5.根据权利要求4所述的二恶烷降解菌IS20的应用，其特征在于，所述二恶烷降解菌IS20用于水环境中二恶烷的生物处理，以质量体积百分比为0.01％-1.0％的工业糖浆为基质，共代谢降解20mg/L的二恶烷。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物处理的处理条件为：震荡培养转速为150rpm，处理盐度为0-8.0％，pH范围为5-11。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物处理的处理盐度为2.0％，pH为9。
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