CN111793587B - 一株节杆菌wn18及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株节杆菌(Arthrobacter sp.)WN18，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20135。该菌株在四氢呋喃作为初级底物下，具有高效降解二恶烷的能力和较高的环境适应性，且能在高浓度的二恶烷和四氢呋喃中保持其反应活性。该菌种为二恶烷污染环境的生物治理提供了优良的菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及一株节杆菌WN18及其用途。
背景技术
新型有机污染物二恶烷是一种环醚，它广泛存在于地表水、地下水和土壤中，其水溶性强，结构稳定，不易被降解且具有潜在致癌性正逐渐引起场地修复领域的广泛关注。二恶烷广泛被应用在医药、化妆品、油漆、除臭剂，以及氯化溶剂的稳定剂，例如1,1,1-三氯乙烷。另外，在工业进程中，特别是在聚氨酯合成革、氨基酸合成革过程中，二恶烷常作为副产物产生。因此，世界卫生组织(WHO)在2003年将二恶烷列入饮用水生产的指南，在2009年9月它被美国环保署添加进最终第三份饮用水污染物候选清单中。
在处理二恶烷大型污染羽方面，生物修复技术由于其经济和环境友好等特点引起人们的关注。近些年，以二恶烷为唯一碳源(例如Pseudonocardia dioxanivorans CB1190)和协同降解二恶烷(例如Pseudonocardia sp.strain ENV478)的细菌不断被分离出来，在较低的初始生物质浓度和二恶烷浓度下(例如小于1mg/L)，细菌的共代谢生物降解速率和对氧气的亲和力优于代谢。迄今尚未有节杆菌(Arthrobacter sp.)降解二恶烷的报道。
发明内容
本发明目的是提供一株节杆菌(Arthrobacter sp.)WN18及应用，该菌能以四氢呋喃为初级代谢基质，好氧共代谢降解二恶烷，从而为生物处理被二恶烷污染的水体提供可选的菌种资源。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一株节杆菌(Arthrobacter sp.)WN18，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20135。
本发明所述节杆菌WN18是从长春垃圾渗滤液处理站分离得到的。新分离的菌株节杆菌WN18可实现快速、高效共代谢降解四氢呋喃和二恶烷并能矿化四氢呋喃，可作为强有力的候选者进行生物降解废水中的二恶烷。该菌株的鉴定是基于其16S rRNA序列测定且与GenBank已有的核苷酸序列进行比对分析而确定。
本发明所述节杆菌WN18的形态特征：在显微镜下观察革兰氏染色的菌株，呈现紫色椭圆形菌落，属于革兰氏阳性菌；扫描电镜下，该菌株呈不规则的短杆状，无丝状体，菌之间有黏连。
本发明提供了上述所述的节杆菌WN18在降解水体中的二恶烷中的用途。
优选地，所述水体的pH为5～11。
优选地，所述水体的pH为7。
优选地，所述水体的温度为15～42℃。
优选地，所述水体的温度为35℃。
优选地，所述水体中含有30～900mg/L的四氢呋喃。
优选地，所述水体中二恶烷的浓度为10～300mg/L。
本发明提供了上述所述的节杆菌WN18在降解水体中的四氢呋喃中的应用。
优选地，所述水体中的四氢呋喃的浓度为0.3～7.0g/L。
有益效果：
1、本发明所述节杆菌WN18可快速、高效共代谢降解二恶烷和四氢呋喃，该菌的分离和获得，为今后环境微生物领域对二恶烷污染环境的治理及代谢机理研究提供了菌种资源。
2、在四氢呋喃为初级基质下，本发明所述节杆菌WN18可耐受较高浓度的二恶烷和四氢呋喃，并能将5.0g/L以下的四氢呋喃矿化，矿化度保持在80％以上。
3、本发明所述节杆菌WN18具有较强的环境适应性，在15-42℃的温度和5-11的pH条件下，该菌仍可保持较高的共代谢降解二恶烷的能力。
附图说明
图1是本发明节杆菌WN18的系统发育树；
图2是本发明节杆菌WN18的扫描电镜成像图片；
图3是本发明节杆菌WN18对100mg/L四氢呋喃和100mg/L二恶烷的共代谢降解情况；
图4是本发明节杆菌WN18在20天内对0.3-14.0g/L的四氢呋喃总有机碳去除率；
图5是本发明节杆菌WN18在以四氢呋喃为底物条件下，对不同初始浓度的二恶烷的去除率；
图6是本发明节杆菌WN18以60mg/L四氢呋喃为初级底物，在不同初始pH下对20mg/L二恶烷的协同降解结果；
图7是本发明节杆菌WN18以60mg/L四氢呋喃为初级底物，在不同培养温度下对20mg/L二恶烷的协同降解结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、菌株的分离
a、铵盐无机盐培养基(AMS)的制备
1L铵盐无机盐培养基包括以下组分：100ml的l0倍浓缩盐溶液，1.0mL的储备液A，20mL的1.0M磷酸盐缓冲液和1.0mL的微量元素，pH约为7.08。
l0倍浓缩盐溶液：6.6g/L(NH4)2SO4，10.0g/L MgSO4·7H2O，0.15g/L CaCl2·6H2O。
储备液A：5.0g/L Fe-EDTA，2.0g/L Na2MO4·4H2O。
1.0M磷酸盐缓冲液：2.26g/L KH2PO4，0.94g/L Na2HPO4。
微量元素：0.25g/L EDTA，0.5g/L FeSO4·7H2O，0.4g/L ZnSO4·7H2O，0.01g/LNiCl2·6H2O，0.015g/L H3BO3，0.05g/L CoCl2·6H2O，0.005g/L CuCl2·2H2O，0.02g/LMnSO4·H2O。各成分121℃高压灭菌15分钟。
b、磷酸盐缓冲液(PBS)(每升)：0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4，8.0g NaCl，0.2gKCl，pH 7.2-7.4。
b、将从长春垃圾渗滤液处理站采集的土壤通过16目筛子筛分土壤，以除去大颗粒。用无菌PBS培养基清洗三次，将4g土壤(湿重)添加在含30mL AMS的100mL血清瓶中，添加二恶烷和四氢呋喃，使土样悬液含有100mg/L二恶烷和100mg/L四氢呋喃。然后在30℃，160rpm摇床中持续培养，每隔两周按10％(v/v)的接种量进行传代。经过2个月的驯化和富集，然后进行R2A平板纯化，经过纯化5代，获得了能够用四氢呋喃作为主要代谢底物降解二恶烷的纯化菌株，并将其命名为WN18。迄今，发现的共代谢降解二恶烷的基质已超过3种，例如四氢呋喃、丙烷、1-丁醇等。四氢呋喃具有与二恶烷类似的环醚结构，它们的降解途径由类似的thm基因簇编码的单加氧酶诱导，催化他们降解的初始步骤是单氧化反应。因此这里选用四氢呋喃来富集二恶烷降解菌。
2、菌株的16S rRNA序列鉴定
菌株WN18的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所用16S扩增的通用引物27F(5’-3’：AGTTTGATCMTGGCTCAG)(SEQ ID NO:2)，1492R(5’-3’：GGTTACCTTGTTACGACTT)(SEQ ID NO:3)，以该菌株DNA为模板，扩增出片段大小约1400bp，送交上海生工生物公司进行测序，PCR反应温度程序如表1。
表1 PCR循环程序
而后通过BLAST搜索程序将16S rRNA的序列与从Genbank获得的高度同源的序列进行比较。通过Megalign软件(7.1版)比对序列，并使用MEGA程序(6.0版)进行系统发育分析，如图1所示。16S rRNA序列已以登录号NC2277074保藏在GenBank数据库中。根据序列比对结果，将该菌株鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.)，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20135。
3、菌种的形态特征
通过革兰氏染色，在显微镜下该菌株WN18呈现椭圆形紫色菌落；并通过扫描电子显微镜观察形态如图2所示，菌体呈不规则短杆状，无鞭毛。
实施例2
将菌株WN18在含有200mg/L四氢呋喃的AMS培养基中进行扩增培养，并在30℃下于160rpm的旋转振荡器中孵育48小时。在4℃下以12000g离心5分钟，以指数期收获细胞，并用无菌PBS缓冲液洗涤细胞沉淀3次，然后用新鲜AMS重悬细胞做进一步研究。在每个100ml的玻璃小瓶中分别添加20ml的AMS，并添加不同浓度的四氢呋喃和/或二恶烷，然后以0.01Abs(OD600nm)的初始浓度接种重悬细胞，并用丁基橡胶塞密封，并在旋转振荡器中以160rpm和30℃进行培养。
a、分别添加100mg/L的四氢呋喃和二恶烷，它们的共代谢降解结果如图3所示，当两种底物同时添加至100mg/L时，菌株WN18优先除去四氢呋喃，随后在四氢呋喃浓度降至较低水平(大概是初始浓度的一半)后，开始降解二恶烷，如图4。这与在其他二恶烷分解代谢菌(如Pseudonocardiasp.strain ENV478and Rhodococcusruber strain T5)中观察的结果一致。
b、四氢呋喃耐受实验中，只添加初始浓度分别为0.3、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0和14.0g/L的四氢呋喃，培养20天后测定总有机碳，计算总有机碳的去除率。结果如图4所示，0.3-5.0g/L四氢呋喃的总有机碳去除率均高于80.0％，这证明菌株WN18可以有效矿化四氢呋喃，并且对7.0g/L的四氢呋喃仍有良好的去除能力。
c、在四氢呋喃和二恶烷的浓度比为3:1的条件下，添加不同初始浓度的二恶烷，以此评估菌株WN18对二恶烷浓度的耐受性，添加的二恶烷的初始浓度分别为10、20、50、100、200和300mg/L。结果如图5所示，图中显示了每个样品中的残留二恶烷浓度变化趋势。结果表明，菌株WN18能够在30-900mg/L四氢呋喃为底物下快速有效地将二恶烷从10-300mg/L降解到方法检出限以下(＜1.0μg/L)。
实施例3
为了评价以四氢呋喃为诱导底物下WN18菌在不同的酸碱度和温度条件下共代谢降解二恶烷的环境适应性。将AMS的初始pH调整为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0。在自然下的AMS(PH 7.1)，温度为4℃、15℃、25℃、35℃、45℃条件下开展降解实验。
本发明所述的WN18菌株在不同条件下的实验结果如图6和7所示。结果显示，该菌株可在pH(5.0-11.0)(图6)和温度(4-42℃)(图7)下发生二恶烷的共代谢降解。其中，最佳pH和温度分别为7.0和35℃。pH值在3.0时完全抑制了二恶烷的去除，在11.0时仍具有很强的二恶烷降解能力。当温度从15℃升高到35℃时，二恶烷的降解速率逐渐增加，但在42℃时开始降低，这可能是由于高温杀死了一些细胞所致。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 暨南大学
宝航环境修复有限公司
<120> 一株节杆菌WN18及其用途
<130> WK20-YXJ-CN1-1387
<141> 2020-08-14
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 节杆菌(Arthrobacter sp.)
<400> 1
tcaggatgaa cgcgggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgat cccagcttgc 60
tgggggatta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagtaa cctgccctta actatgggat 120
aagcctggga aactgggtct aataccggat atgactcctc atcgcatggt ggggggtgga 180
aagctttatt gtggttttgg atggactcgc ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc 240
tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct 360
gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaggg 420
aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg 540
gtttgtcgcg tctgccgtga aagtccgggg ctcaactccg gatctgcggt gggtacgggc 600
agactagagt gatgtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat 660
caggaggaac accgatggcg aaggcaggtc tctgggcatt aactgacgct gaggagcgaa 720
agcatgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact 780
aggtgtgggg gacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt gccccgcctg 840
gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg 900
agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atgaaccgga 960
aacacctgga aacaggtgcc ccgcttgcgg tcggtttaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gttctatgtt 1080
gccagcgcgt tatggcgggg actcatagga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg 1140
ggacgacgtc aaatcatcat gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg 1200
gtacaaaggg ttgcgatact gtgaggtgga gctaatccca aaaagccggt ctcagttcgg 1260
attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac 1320
gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcac gaaagttggt 1380
aacacccgaa gccggtggcc taaccccttg tgggagggag ctgtcgaagg tgggactggc 1440
gattgggact aa 1452
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 2
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (9)
1.一株节杆菌(Arthrobacter sp.)WN18，其特征在于，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月24日，保藏号为CGMCC No.20135。
2.如权利要求1所述的节杆菌WN18在降解水体中的二恶烷中的应用；
所述水体中含有30～900mg/L的四氢呋喃。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水体的pH为5～11。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水体的pH为7。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水体的温度为15～42℃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水体的温度为35℃。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水体中二恶烷的浓度为10～300mg/L。
8.如权利要求1所述的节杆菌WN18在降解水体中的四氢呋喃中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水体中的四氢呋喃的浓度为0.3～7.0g/L。
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