CN101294140B - 一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌 - Google Patents

一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌，该菌种从油渍气厂的污泥进行分离、纯化而获得，为苍白杆菌属的一个新种，命名为广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 207191。该菌种具有较高降解吡啶的能力，能够对污泥中的吡啶进行有效的降解，降低了污泥处理的成本。

Description

一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌
技术领域
本发明涉及细菌领域，具体地说，涉及一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌新菌种。
背景技术
作为一种典型的难降解有机污染物，杂环芳烃化合物造成的环境问题已经引起人们越来越多的重视。因其大多具有“三致作用”，危害着人类健康和生态平衡，目前杂环芳烃化合物在环境中的扩散已经造成了土壤、地下水等的严重污染。生物修复时解决此类问题的有效方法，利用从环境中筛选的降解微生物能够有效去除污泥等环境中杂环和苯环类等污染物质。
吡啶作为最基本和典型的杂环芳烃物质而成为研究的焦点，特别是集中在纯菌株对吡啶的生物降解特性。
苍白杆菌属是由Holmes等在1988年建立的新属。细胞染色为革兰氏阴性。专性好氧，最适生长温度是20-30℃，接触酶、氧化酶阳性。不水解明胶。能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源。但至今尚未发现苍白杆菌属中有降解吡啶的菌株。
发明内容
本发明的目的是提出一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌新菌种。
本发明通过对广州某油渍气厂的污泥进行分离、纯化，得到苍白杆菌属的一个新种，经反复试验，发现该菌种具有高效降解吡啶的能力，从而实现了本发明的目的。
本发明所提出的新菌种命名为：广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2。
本发明的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2已于2007年12月5日保存在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉市武汉大学)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 207191。
本发明的广州苍白杆菌P2从广州油渍气厂的污泥进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：
首先把污泥打散，取1g污泥放在以吡啶(1g/L)为唯一的液体基础盐培养基里培养(KH2PO4 2.93g，K2HPO4 5.87g，MgSO4 0.3g，FeSO4 0.01g，NaCl2g，(NH4)2SO4 5g，微量盐溶液2mL)。固体培养基中加入16g琼脂。微量盐溶液(mg/L)：MoO3 4mg，ZnSO4·5H2O 28mg，CuSO4·5H2O 2mg，H3BO34mg，MnSO4·5H2O 4mg，CoCl2·6H2O 4mg).培养一段时间后，转接到浓度分别为2g/L，3g/L，4g/L，5g/L进行驯化.从5g/L的培养基里取1ml到以吡啶为唯一碳源的固体基础培养基中培养，挑取单菌落在以吡啶为唯一碳源的固体基础培养基上划线纯化，直到平板上为单一的纯菌落即为纯菌。
本发明的广州苍白杆菌P2具有如下的形态和生理生化特性：
菌体的形态特性：
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，广州苍白杆菌P2的细胞为革兰氏阴性，杆状，大小为，菌体0.4～0.8×1.6～2.2μm，周身鞭毛。
b.菌落的形态特性：
在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，无色，透明，菌落直径为1-2mm。
主要的生理生化特性：
严格好氧生长，氧化酶和接触酶都为阳性。不能水解明胶。
上述结果表明本发明广州苍白杆菌P2与苍白杆菌属的生理生化特性很相似。
本发明广州苍白杆菌P2分子分类地位：
采用DNA小量提取方法提取细菌总DNA。采用16S rRNA通用引物27F和1522r扩增其16S rRNA基因；将PCR产物直接测序，将获得的16S rRNA基因序列输入GenBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明广州苍白杆菌P2的16S rRNA基因序列与苍白杆菌属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与O.aqua-oryzae DSM 17471T的序列相似性为97.4％。同一菌种的16S rRNA基因序列的同源性应大于97.7％。
综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明广州苍白杆菌P2应归属苍白杆菌属，且为该属的一个新种，命名为广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2。其判断参考如下文献：Holmes，B，et al.International Journal of Systematic Bacteriology 1988 38，406-416；Yanez MA，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，2002，53：875-883.Statomi M，etal.International Journal of Systematic Bacteriology，2003，53：491-499.
将本发明的广州苍白杆菌P2放在杂环化合物吡啶浓度为800mg/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L的液体培养基里以170r/min培养3天后利用分光光度计计算其吡啶降解率。经测定，其吡啶降解率分别是90.91％，92.25％，95.71％，97.14％，98.06％，98.67％。
本发明为污泥中杂环化合物吡啶的处理提供了一种低成本、高效率不发生二次污染的吡啶降解菌。该菌对污泥中吡啶的降解率可高达5g/L.大大节约了成本，提高了常规处理方法的效率，加快生态修复进程。
附图说明
图1为广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191的8900倍左右的电子显微镜图片。
具体实施方式
实施例1：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO4 0.6g，吡啶0.08g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到90.91％。
实施例2：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO4 0.6g，吡啶0.1g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2CCTCC M 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度计(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到92.25％。
实施例3：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO4 0.6g，吡啶0.2g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度计(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到95.71％。
实施例4：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO40.6g，吡啶0.3g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度计(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到97.14％。
实施例5：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO40.6g，吡啶0.3g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度计(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到98.06％。
实施例6：
在100ml去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 1.28g，(NH4)2SO4 0.1g，FeSO4 0.01g，NaCl 0.2g，K2HPO4 0.6g，吡啶0.4g，121℃条件下灭菌20min作为培养液并分装到20ml试管中，每管5ml。从保存的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCCM 207191斜面菌种接种至LB液体培养基中，于30℃，180r/min条件下摇床活化菌体，使菌数达到108数量级，以100μl活化菌液接种到培养液中，放在30℃，180r/min摇床培养，到3d取2ml培养液于5000r/min离心3min，去菌体，采用DU 640紫外分光光度计(BECKMAN)在256nm处测定培养液中吡啶的吸光值。计算吡啶的降解率。3d后广州苍白杆菌P2对吡啶的降解率达到98.67％。

Claims (1)

1.一种具有高效降解吡啶能力的广州苍白杆菌(Ochrobactrum guangzhouense)P2 CCTCC M 207191，从油渍气厂的污泥进行分离、纯化而获得，为苍白杆菌属的一个新种，该菌种的形态和生理生化特性如下：
菌体的形态特性：
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，其细胞为革兰氏阴性，杆状，大小为，菌体0.4～0.8×1.6～2.2μm，周身鞭毛；
b.菌落的形态特性：在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，无色，透明，菌落直径为1-2mm；
主要的生理生化特性：
严格好氧生长，氧化酶和接触酶都为阳性，不能水解明胶。
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