CN1306023C - 一株可降解有机磷农药的降解菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株可高效降解有机磷农药的降解菌，该降解菌的分类命名为：苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1221。用途为：该菌株用于降解有机磷农药及含氮芳香烃类物质；可用于受这些物质污染的水体、土壤或农产品的生物净化。

Description

一株可降解有机磷农药的降解菌及其用途

发明领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株可降解有机磷农药的降解菌及其用途。

背景技术

有机磷农药(Organophosphorus pesticides，OPs)由于具有低残留、高效和使用成本低等特点，是目前品种多、产量高和应用广泛的农用药剂。有机磷农药的使用在农业增产和疾病媒介害虫防治方面产生了巨大的经济效益和社会效益，但由于其对非靶标生物的毒性高和某些有机磷农药有潜在迟发性神经毒性和对生态环境的负效应。有证据表明，OPs具有诱变性和致畸胎性，哺乳动物的神经和免疫系统疾病大多都与OPs相关，这些疾病包括疯牛病、海湾战争综合症、帕金森综合症等。因此，如何消除有机磷农药对环境和人类的危害，已成为事关人类健康和国民经济发展的问题。

减少农药的使用是解决农药危害的根本出路，残留农药的去除也是减少农药危害的有效途径。有机磷农药消除方法有许多，包括物理的、化学的、和生物的。传统的物理方法(包裹、焚烧和掩埋)和化学方法(包括氧化、还原和水解)成本高，可能产生新的污染物，且作用相对较慢。利用生物或生物产品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解毒高浓度的农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。微生物具有种类多、变异快和基因容易操作等特点，是环境生物修复的重要生物资源。用微生物或无细胞酶制品来消减农药污染的生物修复技术显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可降解有机磷农药的降解菌，该降解菌从山东高密市受有机磷农药长期污染的土样中分离出，具有降解有机磷农药及含氮芳香烃类物质的能力。

本发明的另一目的是提供本发明的可降解有机磷农药的降解菌的用途，其用途是降解有机磷农药及含氮芳香烃类物质。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的一株可降解有机磷农药的降解菌，其特征在于，该降解菌的分类命名为：苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(地址为北京市海淀区中关村北一条13号)，其保藏号为CGMCC No.1221。

该降解菌(称B₂株)经形态、生理生化特性分析和16s rRNA基因序列同源性分析，鉴定为变形细菌α-亚群中的根瘤菌科苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，。B2株在pH8～9、温度30℃左右生长良好，能以甲基对硫磷为唯一碳源或磷源生长。菌株B₂表现对氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素的抗性，但对利富霉素、氯霉素敏感。

采用薄板层析(TLC)、紫外光谱(UV)、气谱-质谱(GC-MS)技术分析了菌株B₂降解甲基对硫磷(MP)的中间产物，结果表明菌株B₂水解甲基对硫磷产生对硝基苯酚(PNP)，PNP的进一步代谢通过产生4-硝基邻苯二酚(4-nitrocatechol，4-NC)和1，2，4-三羟基苯(1，2，4-trihydroxybenzene，THB)的途径。采用气相色谱法测定菌株B₂对甲基对硫磷的降解率，在起始菌的OD₆₀₀为0.02时，B₂在3小时内可将100mg/L的甲基对硫磷降解99.2％。菌株B₂可以以PNP为碳源生长，在48小时内，将50mg/kg的PNP完全降解；也可以以4-NC为碳源生长，在60小时内，将30mg/L 4-NC完全降解。

本发明的可降解有机磷农药的降解菌的筛选：

1、土样：采自山东省高密市长期受有机磷农药污染的土壤；

2、菌体的富集和分离

将受有机磷污染的土样混匀，称取1g加入到含有50mg/L MP的富集培养基中，28℃，150r/min，摇床培养一周，按10％的接种量转接到新鲜的富集培养基中，传代培养过程中，MP的富集培养基中MP的浓度从50mg/L逐步提高到500mg/L；然后再转入到含50mg/L MP的无机盐培养基中，驯化传6代，其间MP的无机盐培养基中MP的浓度从50mg/L逐步提高到300mg/L；用平板稀释法将其涂布在含有100mg/L的MP的无机盐固体培养基上，挑取单菌落，划线纯化，将纯化后的单菌落再接入到含有100mg/L MP的无机盐液体培养基中，选取生长速度最快的一株菌株；该降解菌的分类命名为：苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)，于2004年09月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1221；

所述的富集培养基的组分及配比为：蛋白胨10g，葡萄糖1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 1.0g，重蒸水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌30min。

所述的无机盐培养基的组分及配比为：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NH₄Cl 1g，KCl 0.5g，MgSO₄ 0.1g，FeCl₂ 20μg，对氨基苯甲酸0.9mg，烟酸0.9mg，微量元素溶液10ml，重蒸水定容至1.0L，pH7.0，121℃高压灭菌30min。其中，微量元素溶液(L^-1)：(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 20mg，H₃BO₃ 50mg，ZnCl₂ 30mg，CoCl₂·6H₂O3mg，MnCl₂·4H₂O 10mg，(CH₃COO)₂Cu 10mg。

本发明提供的可降解有机磷农药的降解菌的鉴定与属性

1、形态与生理生化特征

菌株B2在LB固体平板上菌落颜色为乳白色至乳黄色，圆形，边缘整齐，低凸，腊状，湿润，菌体呈杆状，极生鞭毛，革兰氏染色阴性，触酶和氧化酶阳性，在King’s培养基上不产生荧光色素，不产生果聚糖和脓青素，不水解七叶灵和明胶，能进行反硝化作用，能利用葡萄糖产酸，能广泛利用碳水化合物、有机酸、氨基酸为碳源，具体特征见表一。

表1.菌株B2的生理生化特征

Tablel.Physiological and biochemical characteristics of strain B2

生理生化指标	结果	生理生化指标	结果
				革兰氏染色	阴性	利用唯一碳源生长
细胞形态	杆状	葡萄糖	+
				鞭毛	极毛1-2根	果糖	+
与氧的关系	好氧	海藻糖	+
				接触酶	+	L-缬氨酸	-
氧化酶	+	β-丙氨酸	+
				产生荧光色素	-	乙酸盐	-
产生果聚糖	-	甘露醇	+
				产生脓青素	-	木糖	+

水解七叶灵	-	阿拉伯糖	+
				水解明胶	-	鼠李糖	+
酯酶(tween80)	-	甘露糖	+
				硝酸盐还原	+	半乳糖	+
利用柠檬酸盐	-	蔗糖	+
				利用丙二酸盐	+	丙酸盐	+
精氨酸双水解酶	-	山梨醇	-
				反硝化	+	麦芽糖	+
积累PHB	-	DL-精氨酸	+
				41℃生长	-	D-酒石酸盐	-
4℃生长	-	亮氨酸	-
				O/F试验	氧化	乳糖	-
葡萄糖产酸	+	L-组氨酸	-
						L-色氨酸	-
		α-酮戊二酸盐	-
						苯乙酸盐	-

2、菌株B2的16s rRNA基因序列(AY661464)

16S rRNA for Ochrobactrum sp.B2(AY661464)

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCAGGC TTAACACATG

CAAGTCGAGC GCCCCGCAAG GGGAGCGGCA GACGGGTGAG TAACGCGTGG

GAACGTACCT TTTGCTACGG AATAACTCAG GGAAACTTGT GCTAATACCG

TATGTGCCCT TCGGGGGAAA GATTTATCGG CAAAGGATCG GCCCGCGTTG

GATTAGCTAG TTGGTGAGGT AAAGGCTCAC CAAGGCGACG ATCCATAGCT

GGTCTGAGAG GATGATCAGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC

CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGGA CAATGGGCGC AAGCCTGATC

CAGCCATGCC GCGTGAGTGA TGAAGGCCCT AGGGTTGTAA AGCTCTTTCA

CCGGTGAAGA TAATGACGGT AACCGGAGAA GAAGCCCCGG CTAACTTCGT

GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GAAGGGGGCT AGCGTTGTTC GGATTTACTG

GGCGTAAAGC GCACGTAGGC GGACTTTTAA GTCAGGGGTG AAATCCCGGG

GCTCAACCCC GGAACTGCCT TTGATACTGG AAGTCTTGAG TATGGTAGAG

GTGAGTGGAA TTCCGAGTGT AGAGGTGAAA TTCGTAGATA TTCGGAGGAA

CACCAGTGGC GAAGGCGGCT CACTGGACCA TTACTGACGC TGAGGTGCGA

AAGCGTGGGG AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA

CGATGAATGT TAGCCGTTGG GGAGTTTACT CTTCGGTGGC GCAGCTAACG

CATTAAACAT TCCGCCTGGG GAGTACGGTC GCAAGATTAA AACTCAAAGG

AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC

AACGCGCAGA ACCTTACCAG CCCTTGACAT ACCGGTCGCG GACACAGAGA

TGTGTCTTTC AGTTCGGCTG GACCGGATAC AGGTGCTGCA TGGCTGTCGT

CAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT

CGCCCTTAGT TGCCAGCATT TAGTTGGGCA CTCTAAGGGG ACTGCCGGTG

ATAAGCCGAG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCCTCAT GGCCCTTACG

GGCTGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGTGG TGACAGTGGG CAGCGAGCAC

GCGAGTGTGA GCTAATCTCC AAAAGCCATC TCAGTTCGGA TTGCACTCTG

CAACTCGAGT GCATGAAGTT GGAATCGCTA GTAATCGCGG ATCAGCATGC

CGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG

GAGTTGGTTT TACCCGAAGG CGCTGTGCTA ACCGCAAGGA GGCAGGCGAC

CACGGTAGGG TCAGCGACTG GGGTGAAGTC GTAACAAGGT AACCGTA

用BLAST软件对菌株B2的16s rRNA的基因序列和Genbank中已经登录的序列进行核苷酸同源性比较，结果发现B2菌与多株苍白杆菌属的16s rRNA基因序列同源性高度相似(见表2)，说明该菌在分子系统发育分类学上属于苍白杆菌。经16S rRNA的测序并比较同源性后，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology》第九版，最终将菌株B2归类于变形细菌(Proteobacteria)，α-亚群(α-subdivision)根瘤菌科(Rhizobiaceae)苍白杆菌属(Ochrobactrum)。

                     表2 B₂菌的16S rRNA基因序列的BLAST分析

Bacterium strains	GenBank Accession No.	Identity
			Ochrobactrum sp.mp-5Ochrobactrum sp.mp-6Ochrobactrum anthropiOchrobactrum sp.Ochrobactrum tritici strain 5bvl1Ochrobactrum tritici isolate TJ3Ochrobactrum anthropiOchrobactrum anthropiOchrobactrum sp.4FB9Ochrobactrum sp.3CB4Ochrobactrum anthropiOchrobactrum sp.3CB5	AY331579.1AY331580.1AJ276036.1AJ002812.1AY429607.1AF508089.1U88441.1U88442.1AF229875.1AF229883.1U88443.1AF229884.1	1440/1441(99％)1439/1441(99％)1426/1426(100％)1426/1427(99％)1438/1445(99％)1427/1432(99％)1424/1428(99％)1423/1428(99％)1409/1409(100％)1407/1408(99％)1421/1428(99％)1402/1403(99％)

Ochrobactrum anthropiOchrobactrum anthropiOchrobactrum anthropi

D63837.1D12794.1U88444.1

1417/1427(99％)1416/1428(99％)1417/1428(99％)

3、抗生素抗性检测

菌株B₂在含不同浓度的几种抗生素的生长情况见表3，可以看到，菌株B₂表现对多种抗生素的抗性，对氨苄青霉素Ampicillin的抗性大于200μg/ml，对卡那霉素Kanamycin的抗性大于150Oμg/ml，对链霉素Streptomycin的抗性大于50μg/ml，对氯霉素chloramphenicol较敏感，抗性小于25μg/ml，而对利富霉素Rifampicin很敏感，在10μg/ml浓度下，该菌不能生长。

表3 B₂在不同抗生素浓度下的生长

	氨苄青霉素	利富霉素	链霉素	卡那霉素	氯霉素
						10μg/ml25μg/ml50Oμg/ml75Oμg/ml100μg/ml150μg/ml200μg/ml	+++++++	-------	+++----	++++++-	+------

+：生长良好，-：不生长

本发明的可降解有机磷农药的降解菌的用途：

该菌株可降解有机磷农药中的有机磷物质及含氮芳香烃类物质。该菌株可用于受这些物质污染的水体、土壤或农产品的生物净化。

具体实施方式

实施例1：使用菌株B2降解甲基对硫磷

利用气相色谱法测定了菌株B2对MP的降解率，并用分光光度计测定了中间产物对硝基苯酚的产生和降解的量，以及菌株利用MP为碳源的生长情况(见图1)。

在培养过程中，菌株B2可将MP快速降解，在培养3h后，MP的浓度已由起始的100mg/L降到0.805mg/L，而在此期间菌浓度几乎没有增加。在甲基对硫磷减少的同时伴随其降解中间产物对硝基苯酚浓度的增加，经过一段时间，对硝基苯酚的浓度开始降低，32小时后全部降解。

实施例2：菌株B2以对硝基酚(PNP)为碳源生长及其对PNP的降解作用：

菌株B2先在50mg/L的PNP诱导培养，再接入到以50mg/L的PNP为碳源的无机盐中检测其生长以及PNP的降解情况。从图2中可以看出，菌株B2能以PNP为碳源生长，同时将PNP降解，当PNP的浓度为50mg/L时，菌株生长的延滞期小于4小时，培养24小时后菌株B2达到生长高峰，随着菌密度的增加，PNP的量在减少，在48小时内，菌株B2将50mg/L的PNP完全降解。在培养的前8个小时，PNP的浓度降低比较缓慢，随后降解速度加快，这可能是由于培养一段时间后，降解PNP的酶系被诱导，从而加速PNP的降解产生。

实施例3：菌株B2以对硝基邻苯二酚(4-NC)为碳源生长及其对4-NC的降解作用

将1ml的B2种子液接入到含不同浓度的4-NC的无机盐培养基中，浓度分别为10、20、30、40、50mg/L，测定棕褐色的4-NC的消失情况。培养3天发现10、20、30mg/L的4-NC培养液中变为无色，而40、50mg/L 4-NC的培养液中，4-NC的浓度没有改变。因此，我们选用不抑制菌株代谢4-NC的最高浓度，即30mg/L作为试验浓度，测定菌株B2在以30mg/L 4-NC为碳源的培养基中的生长情况以及菌株降解4-NC的情况，结果见图3。从图中可以看出，菌株B2的生长经历一段时间的延滞期(12h)，可能在此期间，降解所需的中间酶系(如苯环类化合物羟化开环的单加氧酶、双加氧酶)被诱导生成，经过这段时间后，菌体才能分解并利用4-NC作为生长的营养物质而快速生长，在60小时内，30mg/L的4-NC几乎完全被降解。

                            SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院动物研究所

<120>一株可高效降解有机磷农药的降解菌及其用途

<130>FPI04221

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1447

<212>DNA

<213>Ochrobactrum sp.B2

<400>1

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc     60

gccccgcaag gggagcggca gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtacct tttgctacgg    120

aataactcag ggaaacttgt gctaataccg tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg    180

caaaggatcg gcccgcgttg gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg    240

atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc    300

ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc    360

gcgtgagtga tgaaggccct agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt    420

aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct    480

agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggacttttaa gtcaggggtg    540

aaatcccggg gctcaacccc ggaactgcct ttgatactgg aagtcttgag tatggtagag    600

gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc    660

gaaggcggct cactggacca ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg    720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgttgg ggagtttact    780

cttcggtggc gcagctaacg cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa    840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc    900

aacgcgcaga accttaccag cccttgacat accggtcgcg gacacagaga tgtgtctttc    960

agttcggctg gaccggatac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt   1020

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgcccttagt tgccagcatt tagttgggca   1080

ctctaagggg actgccggtg ataagccgag aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat   1140

ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg cagcgagcac   1200

gcgagtgtga gctaatctcc aaaagccatc tcagttcgga ttgcactctg caactcgagt   1260

gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg   1320

gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggttt tacccgaagg cgctgtgcta   1380

accgcaagga ggcaggcgac cacggtaggg tcagcgactg gggtgaagtc gtaacaaggt    1440

aaccgta                                                              1447

Claims (2)

1、一株可降解有机磷农药的降解菌，其特征在于，该降解菌的分类命名为：苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，于2004年09月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1221。

2、一种权利要求1所述可降解有机磷农药的降解菌的用途：该菌株用于降解有机磷农药及含氮芳香烃类物质。

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