CN105112317A - 一株高效阿特拉津降解菌及其筛选方法以及在农田废水中阿特拉津的生物降解的应用 - Google Patents

一株高效阿特拉津降解菌及其筛选方法以及在农田废水中阿特拉津的生物降解的应用 Download PDF

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Abstract

一株高效阿特拉津降解菌及其筛选方法以及在农田废水中阿特拉津的生物降解的应用，属于环境微生物技术领域，其菌株（Pseudomonas？sp.？ZXY-1）是从吉林化工有限公司农药厂受污染土壤中分离得到，该菌株可以以阿特拉津作为唯一氮源生长，其具有高效降解阿特拉津的能力，10.5小时阿特拉津降解率即可达99%。菌株Pseudomonas？sp.？ZXY-1的最适生长温度为25-35℃，最适生长pH为7.0，最适生长摇床转速为150r/min。该菌种适用于农田废水阿特拉津的生物降解与生物修复。

Description

一株高效阿特拉津降解菌及其筛选方法以及在农田废水中阿特拉津的生物降解的应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，涉及菌株Pseudomonassp.ZXY-1及其在农田废水中阿特拉津的生物降解，可用于农药污染的原位修复。
背景技术
近些年，中国的农业得到了持续快速的发展。随之，农药的使用量逐年增加。在农业生产中，除草剂是一类重要的农药。在不同的除草剂中，阿特拉津因其除草性能好、使用成本低廉等优点得到了广泛的使用。然而，由于缺乏有效的处理技术，绝大部分阿特拉津在使用过后，会随着降雨径流及农田退水等途径直接进入自然水体，从而造成严重的水体污染。因此，为了保证水资源的可持续发展，我们需要开发出可高效降解阿特拉津的处理技术。
处理阿特拉津的主要技术为生物降解法。其中，利用微生物降解阿特拉津因成本低、无二次污染等优点具有广泛的发展前景。在微生物降解法的发展中，不仅要筛选出能够以阿特拉津为单一底物的细菌，更重要的是所筛选的细菌可直接用于处理含有阿特拉津的实际废水。因此，筛选出高效的阿特拉津降解菌并将其应用于实际废水中，将其转化为无毒无害或低毒低害的物质有着重要的意义。
发明内容
本发明目的在于在从自然界筛选出高效高产量的阿特拉津降解菌，并将其应用于含有阿特拉津的农田废水中，为实际农田废水中阿特拉津的去除奠定理论基础。
本发明中一株高效的阿特拉津降解菌，其特征在于为Pseudomonassp.ZXY-1，2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10936，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该菌株为革兰氏阴性菌，单个细菌呈杆状，无芽孢，菌体长为2.27μm，宽为799.76nm；菌株在无机盐固定培养基上生长，菌落呈乳白色略带淡黄色，圆形，不透明，表面光滑略微隆起。该菌株最适生长温度为25-35℃，最适pH为7.0，最适生长摇床转速为150r/min。
本发明中一株高效的阿特拉津降解菌Pseudomonassp.ZXY-1是从吉林化工有限公司农药厂受污染土壤中分离得到，设定温度为30℃，pH7.0筛选，具体筛选步骤如下：
（1）取10g农药厂受污染土壤样品加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，设定转速为150r/min，摇床培养7天，获得富集菌液。
（2）取10ml富集菌液加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，重复此步骤3次。将富集后的菌液进行平板涂布，恒温培养箱培养3天后获得单菌落。
（3）挑取步骤（2）中的单菌落进行平板三区划线，重复此步骤3次直至平板上出现形态大小相同的单菌落，即细菌纯化完成。
（4）将纯菌接入斜面培养基培养3天，4℃保存。
其中，无机盐培养基为：0.9gKH2PO4，6.5gNa2HPO4.12H2O，3g蔗糖，0.2gMgSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，以及1ml微量元素液溶于1000ml蒸馏水中。无机盐固体培养基是在无机盐的成分中另加入琼脂18g/L。
斜面培养基为：0.9gKH2PO4，6.5gNa2HPO4.12H2O，3g蔗糖，1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1gNaCl，0.2gMgSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，1ml微量元素液以及18g琼脂溶于1000ml蒸馏水中。
微量元素液为：0.1gCoCl2.6H2O，0.425gMnCl2.4H2O，0.05gZnCl2，0.01gNiCl2.6H2O，0.015gCuSO4.5H2O，0.01gNa2MoO4.2H2O，0.01gNa2SeO4.2H2O溶于1000ml蒸馏水中。
本发明中一株高效阿特拉津降解菌为假单胞菌属（Pseudomonassp.），经过16SrDNA序列测序，其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与Pseudomonasalcaliphila的同源性达99%。
本发明中一株高效阿特拉津降解菌应用于含有不同浓度阿特拉津农田废水的生物处理。
本发明有益效果：本发明提供的菌株具有高效降解阿特拉津的能力，对初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基，10.5h内该细菌降解能力可达99.9%。
附图说明
图1为菌株Pseudomonassp.ZXY-1原子力显微镜图。
图2为菌株Pseudomonassp.ZXY-1生长曲线图。
图3为菌株Pseudomonassp.ZXY-1降解阿特拉津曲线图。
图4为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同温度下阿特拉津降解图。
图5为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同pH值条件下阿特拉津降解图。
图6为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同摇床转速条件下阿特拉津降解图。
图7为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同初始阿特拉津浓度条件下降解图。
具体实施方式
实施例1：本发明菌株Pseudomonassp.ZXY-1筛选方法按照以下步骤实现：设定温度为30℃，pH7.0筛选。
（1）取10g农药厂受污染土壤样品加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，设定转速为150r/min，摇床培养7天，获得富集菌液。
（2）取10ml富集菌液加入100ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，重复此步骤3次。将富集后的菌液进行平板涂布，恒温培养箱培养3天后获得单菌落。
（3）挑取步骤（2）中的单菌落进行平板三区划线，重复此步骤3次直至平板上出现形态大小相同的单菌落，即细菌纯化完成。
（4）将纯菌接入斜面培养基培养3天，4℃保存。
其中，无机盐培养基为：0.9gKH2PO4，6.5gNa2HPO4.12H2O，3g蔗糖，0.2gMgSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，以及1ml微量元素液溶于1000ml蒸馏水中。无机盐固体培养基是在无机盐的成分中另加入琼脂18g/L。
斜面培养基为：0.9gKH2PO4，6.5gNa2HPO4.12H2O，3g蔗糖，1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1gNaCl，0.2gMgSO4.7H2O，0.01gFeSO4.7H2O，1ml微量元素液以及18g琼脂溶于1000ml蒸馏水中。
微量元素液为：0.1gCoCl2.6H2O，0.425gMnCl2.4H2O，0.05gZnCl2，0.01gNiCl2.6H2O，0.015gCuSO4.5H2O，0.01gNa2MoO4.2H2O，0.01gNa2SeO4.2H2O溶于1000ml蒸馏水中。
该培养基高压蒸汽灭菌条件为121℃，15min。
本实施方式筛选所得细菌原子力显微镜图见图1，单个细胞呈杆状，菌体长为2.27μm，宽为799.76nm。
本实施方式筛选所得细菌形态学特征为：该菌株为革兰氏阴性菌，单个细菌呈杆状，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，菌落呈乳白色略带淡黄色，圆形，不透明，表面光滑略微隆起。
分子生物学鉴定：将菌体于50μLTaKaRaLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR中变性后离心取上清作为模板，使用TaKaRa16SrDNABacterialIdentificationPCRKit进行PCR扩增目的片段。反应条件为：94℃预变性5min，再经30个循环的94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，而后再经过72℃延伸5min。使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit切胶回收目的片段进行DNA测序。将本菌株的16SrDNA基因核苷酸序列进行BLAST比对，比对结果显示，本菌株Pseudomonassp.ZXY-1与Pseudomonasalcaliphila亲缘关系最近，达99%。其序列如下：
ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCCTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATTGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGG
实施例2：将细菌悬液（OD=1.0）转接至初始浓度100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中培养，利用bioscreener细菌生长曲线测定仪，系统每隔15min自动检测在600nm波长下的吸光度值，以时间为横坐标，吸光度OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。细菌生长条件设置为温度30℃，培养基pH7.0。
如图2所示，该菌在0-5h处于调整期，6h开始进入对数生长期，35h后进入稳定生长期。
实施例3：
将OD=1.0的细菌悬液在30℃，pH7.0,摇床转速150r/min的条件下，按照3.3%的接菌量转接至初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，每隔1h检测阿特拉津的浓度。利用高效液相色谱法，色谱条件为：C18柱，流动相为乙腈：水=6:4（V/V），检测波长为220nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μL。
如图3所示，菌株Pseudomonassp.ZXY-1在10.5h内对阿特拉津的降解率可达99%。
实施例4：
将OD=1.0的细菌悬液在pH7.0，摇床转速150r/min的条件下，按照3.3%的接菌量转接至初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，反应时间为24h。考察在不同的温度下阿特拉津的降解率，检测方法同实施例3。
如图4所示，菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同的温度条件下对阿特拉津的降解能力不尽相同，菌株在25℃-30℃范围内降解能力最强，达99.9%，低于25℃或高于35℃，降解能力均下降。因此，菌株的最佳生长温度范围为25℃-30℃。
实施例5：
将OD=1.0的细菌悬液在30℃，摇床转速150r/min的条件下，按照3.3%的接菌量转接至初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，反应时间为24h。考察在不同的培养基pH下阿特拉津的降解率，检测方法同实施例3。
如图5所示，菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同的pH条件下对阿特拉津的降解能力不尽相同，菌株在pH7.0时降解能力最强，达99.9%，因此，菌株的最佳生长pH值为7.0。
实施例6：
将OD=1.0的细菌悬液在30℃，pH7.0的条件下，按照3.3%的接菌量转接至初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，反应时间为24h。考察在不同的摇床转速下阿特拉津的降解率，检测方法同实施例3。
如图6所示，菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同的摇床转速条件下对阿特拉津的降解能力不尽相同，菌株在150r/min和200r/min时降解能力最强，达99.9%，考虑耗电成本等问题，因此，自定义菌株生长的最佳摇床转速为150r/min。
实施例7：
将OD=1.0的细菌悬液在30℃，pH7.0，摇床转速为150r/min的条件下，按照3.3%的接菌量转接至不同初始浓度的阿特拉津无机盐培养基中，反应时间为24h。考察在不同的初始浓度下阿特拉津的降解率，检测方法同实施例3。
如图7所示，菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同初始浓度的阿特拉津条件下有着不同的降解率，在初始浓度为100mg/L和200mg/L时，阿特拉津降解率可达99.9%，但是该菌株在初始浓度为10mg/L和500mg/L时，降解率均可达80%以上，说明该菌有很强的耐受能力。

Claims (2)

1.一株高效阿特拉津降解菌，其特征在于所述菌株为Pseudomonassp.ZXY-1，于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10936。
2.根据权利要求1所述的高效阿特拉津降解菌，其特征在于可应用于农田废水中阿特拉津的生物降解及生物修复。
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