CN108169480B - 一种生物标志物的分子数量的检测方法及系统、芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物标志物的分子数量的检测方法及系统、芯片，包括：将表面包被一抗的磁珠掉入芯片的飞升孔内，加入包含生物标志物的样品，使所述磁珠上的一抗与所述生物标志物，于所述芯片的飞升孔内结合形成第一复合物；对所述芯片进行清洗；加入二抗，使所述磁珠上的第一复合物与所述二抗，于所述芯片的飞升孔内结合形成第二复合物；对所述芯片进行清洗；加入检测底物，使所述磁珠上的第二复合物与所述检测底物，于所述芯片的飞升孔内反应，发出光；获取发光的飞升孔数；根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量。本发明相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上，便于实现数字化诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤指一种生物标志物的分子数量的检测方法及系统、芯片。
背景技术
当前生物标志物的数字化的检测方法，应用较广的是酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay，简称ELISA)。
传统的ELISA方法采用ELISA板子进行检测，由于ELISA板子的反应孔体积比较大，在几百微升，反应需要很多的底物才能被检测到，可以实现每毫升皮克量级的生物标志物的检测，但不能实现更低浓度的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物标志物的单分子检测的检测方法及系统、芯片，利用芯片的微型小孔所提供的单分子反应体积，能够准确的检测低到几百个蛋白分子，实现每毫升飞克量级的检测，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上，便于实现数字化诊断。
本发明提供的技术方案如下：
一种生物标志物的分子数量的检测方法，包括：步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入所述芯片的飞升孔内；步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；步骤S300对所述芯片进行清洗；步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；步骤S500对所述芯片进行清洗；步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；步骤S700获取发光的飞升孔数；步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量。
在上述技术方案中，芯片的每个飞升孔提供了生物标志物的单分子反应场所，通过对芯片上所有飞升孔的反应结果的跟踪，可以获得更准确的生物标志物的分子数量，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。同时整合检测试剂，将包被好的磁珠提前放入芯片的飞升孔内，可以实现生物标志物检测的标准化和一体化，提高检测的准确率和时间效率。
进一步，所述步骤S100之前还包括以下任意一步：步骤S010通过偶连方法使所述一抗包被磁珠表面，得到包被一抗的磁珠；或，步骤S020利用磁珠表面的疏水性使所述一抗吸附到磁珠表面，得到包被一抗的磁珠。
在上述技术方案中，所述一抗能结合生物标志物，通过让每个磁珠包被一抗，从而使样品中的生物标志物、二抗等附连到磁珠上形成复合物，便于后续通过对各个磁珠的实验跟踪，更准确的统计生物标志物的分子数量。
进一步，所述步骤S100与所述步骤S800之间还包括：步骤S110稳定第一预设时间后，获取掉入磁珠的飞升孔数；所述步骤S800进一步包括：步骤S810根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
在上述技术方案中，通过获取掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，可以评判测试的有效性，协助分析不合理测试结果的原因。
进一步，所述步骤S300和/或所述步骤S500具体包括：步骤S10在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；步骤S20将磷酸盐缓冲溶液加入所述芯片表面，并使之流入所述芯片的飞升孔内；步骤S30去除所述芯片的底部的磁性；步骤S40在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；步骤S50重复所述步骤S20-步骤S40，直至清洗的操作次数达到预设次数后，结束清洗操作。
在上述技术方案中，通过充分洗涤掉非特异性结合的物质，以及没有结合的二抗等，从而避免非特异结合的物质、以及多余的试剂等引入的对实验结果的干扰。
进一步，所述步骤S700包括：步骤S710读取所述芯片上的第一寄存器，得到所述发光的飞升孔数。
在上述技术方案中，提供了测试结果的自动统计方法，有利于实现生物标志物检测的标准化和一体化，提高检测的时间效率。
进一步，所述步骤S700包括：步骤S720获取含有所有飞升孔的所述芯片的照片；步骤S730检测所述照片上的发光点，根据所述发光点，得到所述发光的飞升孔数。
在上述技术方案中，提供了一种根据发光点的统计方法，比传统的根据颜色的深浅来判断更准确。
本发明还提供一种芯片，包括：芯片本体；所述芯片本体的一面设置有若干个检测单元，每个检测单元包括一个飞升孔，所述飞升孔为从所述芯片的第一表面向第二表面凹陷得到的盲孔；所述第一表面与所述第二表面相对；所述飞升孔为圆柱体，底部直径的范围为2um-10um，高度的范围为2um-10um；所述飞升孔的侧壁和底壁由防水材料组成；每个所述检测单元还包括一个电容传感器；所述芯片上设有第二计数器，所述第二计数器与所有所述电容传感器电连接；所述芯片上设有第二寄存器，所述第二寄存器与所述第二计数器电连接，用于记录所述第二计数器的计数值。
在上述技术方案中，通过芯片的飞升孔提供单分子反应体积，有利于实现每毫升皮克量级的生物标志物的检测，提升了检测的灵敏度。
进一步，所述电容传感器由设置在所述飞升孔的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对。
在上述技术方案中，通过电容传感器自动统计掉入磁珠的飞升孔数，有利于实现生物标志物检测的标准化和一体化，提高检测的时间效率。
进一步，每个所述检测单元设有一个光感应传感器，所述光感应传感器位于所述飞升孔的第三侧，所述第三侧与所述第一侧互相垂直；所述飞升孔与所述正极电极之间设有第一光屏蔽层，所述飞升孔和所述负极电极之间设有第二光屏蔽层，所述飞升孔的第四侧设有第三光屏蔽层，所述第一光屏蔽层与所述第二光屏蔽层通过所述第三光屏蔽层相互连接，所述第四侧与所述第三侧相对；所述芯片上设有第一计数器，所述第一计数器与所有所述光感应传感器电连接；所述芯片上设有第一寄存器，所述第一寄存器与所述第一计数器电连接，用于记录所述第一计数器的计数值。
在上述技术方案中，通过光感应传感器自动统计发光的飞升孔数，有利于实现生物标志物检测的标准化和一体化，提高检测的时间效率。
本发明还提供一种生物标志物的分子数量的检测系统，包括：前面所述的芯片；还包括磁珠，当对生物标志物进行检测时，所述磁珠位于所述芯片的飞升孔内。
在上述技术方案中，提供了一种生物标志物的分子数量的检测系统。该系统利用芯片的飞升孔所提供的单分子反应体积，可以获得更准确的生物标志物的分子数量，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。
进一步，当飞升孔为圆柱体时：所述飞升孔的底部直径与所述磁珠的直径的比例，介于1.2～1.6之间；所述飞升孔的高与所述磁珠的直径的比例，介于0.5～1.5之间。
在上述技术方案中，通过限定飞升孔的孔径与磁珠的直径的比例关系，以及飞升孔的高与磁珠的直径的比例关系，使一个飞升孔只能容纳一个磁珠，从而使统计结果更准确。
通过本发明提供的一种生物标志物的分子数量的检测方法及系统、芯片，能够带来以下至少一种有益效果：
1、本发明可以提升检测灵敏度，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。
2、本发明通过光感应传感器自动统计发光的飞升孔数，以及电容传感器自动统计掉入磁珠的飞升孔数，有利于实现检测结果的自动化统计，提高检测的时间效率。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种生物标志物的分子数量的检测方法及系统、芯片的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明的一种生物标志物的分子数量的检测方法的一个实施例的流程图；
图2是本发明的一种生物标志物的分子数量的检测方法的另一个实施例的流程图；
图2a是本发明的一种生物标志物的分子数量的检测方法的另一个实施例的清洗芯片的具体流程图；
图3是本发明的一种生物标志物的分子数量的检测方法的另一个实施例的流程图；
图4是本发明的一种芯片的一个实施例的结构示意图；
图5是本发明的一种芯片的另一个实施例的结构示意图；
图6是本发明的一种生物标志物的分子数量的检测系统的一个实施例的结构示意图；
图7是本发明的一种芯片的一个实施例的俯视图；
图8是本发明的一种芯片的一个实施例的检测单元的放大俯视图；
图9是本发明的一种芯片的另一个实施例的检测单元的放大俯视图。
附图标号说明：
10000.检测系统，11000.芯片，12000.磁珠，11100.芯片本体，11110.检测单元，11111.飞升孔，11112.电容传感器，11113.光感应传感器，11200.第一计数器，11300.第一寄存器，11400.第二计数器，11500.第二寄存器，1.第一光屏蔽层，2.第二光屏蔽层，3.第三光屏蔽层。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
为使图面简洁，各图中只示意性地表示出了与本发明相关的部分，它们并不代表其作为产品的实际结构。另外，以使图面简洁便于理解，在有些图中具有相同结构或功能的部件，仅示意性地绘示了其中的一个，或仅标出了其中的一个。在本文中，“一个”不仅表示“仅此一个”，也可以表示“多于一个”的情形。
在本发明的一个实施例中，如图1所示，一种生物标志物的分子数量的检测方法，包括：
步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入芯片的飞升孔内；
步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；
步骤S300对所述芯片进行清洗；
步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；
步骤S500对所述芯片进行清洗；
步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；
步骤S700获取发光的飞升孔数；
步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量。
具体的，一抗是一种能与生物标志物特异性结合的蛋白。通过表面包被一抗，可以让后续的反应在磁珠上进行。
首先让磁珠表面包被一抗，然后将该磁珠加入芯片表面，通过高速离心使磁珠掉入芯片的飞升孔内。
将含生物标志物的样品，比如血清标本，加入芯片表面，为了确保生物标志物个数少于飞升孔数，需要对包含生物标志物的样品进行适当的稀释。当样品流入芯片的飞升孔内时，孵育第二预设时间，比如15分钟，使生物标志物与磁珠上的一抗结合形成第一复合物。之后，对芯片进行清洗，充分洗涤掉非特异性结合的物质。
将偶联有酶的检测二抗，加入芯片表面。二抗也是一种能与生物标志物特异性结合的蛋白，酶可以是β-半乳糖苷酶，也可以是其他具有催化活性的酶。使二抗流入芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使二抗与磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；之后，对芯片进行清洗，充分洗涤掉没有结合的检测二抗。
将检测底物，比如β-半乳糖苷酶的检测底物，加入芯片表面，并使检测底物流入芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使检测底物与磁珠上的第二复合物反应，发出光；如果磁珠上没有形成第二复合物，则不能发出光，对应的飞升孔不能发光。
只有在飞升孔内，单分子的β-半乳糖苷酶能够反应生成足够的底物，生成的底物发出的荧光能被仪器检测到。而传统ELISA板子由于反应孔体积在几百微升，反应需要很多的底物才能被检测到，所以不能实现单分子的检测。
统计芯片上发光的飞升孔数，比如利用第三方仪器进行统计，每个发光点代表一个标志物，从而计算生物标志物的总量。如果样品是稀释后加入到反应池中，则根据稀释的比例，计算原样品含有的生物标志物的分子数量。
通过对发光的飞升孔数的统计，可以获得更准确的生物标志物的分子数量，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。
在本发明的另一个实施例中，如图2所示，一种生物标志物的分子数量的检测方法，包括：
步骤S010通过偶连方法使所述一抗包被磁珠表面，得到包被一抗的磁珠；
或，步骤S020利用磁珠表面的疏水性使所述一抗吸附到磁珠表面，得到包被一抗的磁珠；
步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入所述芯片的飞升孔内；
步骤S110稳定第一预设时间后，获取掉入磁珠的飞升孔数；
步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；
步骤S300对所述芯片进行清洗；
步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；
步骤S500对所述芯片进行清洗；
步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；
步骤S720获取含有所有飞升孔的所述芯片的照片；
步骤S730检测所述照片上的发光点，根据所述发光点，得到所述发光的飞升孔数；
步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量；
步骤S810根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
所述步骤S300和/或所述步骤S500具体包括：
步骤S10在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S20将磷酸盐缓冲溶液加入所述芯片表面，并使之流入所述芯片的飞升孔内；
步骤S30去除所述芯片的底部的磁性；
步骤S40在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S50重复所述步骤S20-步骤S40，直至清洗的操作次数达到预设次数后，结束清洗操作。
具体的，相对前一个实施例，本实施例用步骤S720-S730代替步骤S700，增加了步骤S000、步骤S110、步骤S10-S50、步骤S810。
磁珠包被一抗有多种方法，一种是通过偶连方法，利用磁珠表面的羧基与抗体Fc片段上的氨基化学反应，形成共价偶连；抗体分Fab片段和Fc片段，其中Fab片段与抗原结合有关，所以利用Fc片段的偶连不会影响抗体与检测标志物的结合。另一种，利用磁珠表面的疏水性，主动吸附一抗到材料表面。
将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，在高速离心下，使磁珠掉入芯片的飞升孔内；稳定第一预设时间后，比如30s，通过读取芯片上的第二寄存器，获取掉入磁珠的飞升孔数。
将包含生物标志物的样品加入芯片表面，当样品流入芯片的飞升孔内时，孵育第二预设时间，比如15分钟，使生物标志物与磁珠上的一抗结合形成第一复合物。之后，在芯片的底部加入磁性，比如底部放置磁铁，吸附磁珠，然后离心甩掉芯片中的液体。在芯片表面加入清洗液，比如磷酸盐缓冲溶液(PBST，在溶液中加入0.05％Twen20)，并使之流入芯片的飞升孔内，去除芯片的底部磁铁，再在芯片的底部放置磁铁，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体，这算一次清洗动作。如果预设次数为3次，则重复上述清洗动作，直至清洗的操作次数达到预设次数。通过以上清洗的操作，充分洗涤掉非特异性结合的物质。
将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；之后，在芯片的底部加入磁性，比如底部放置磁铁，吸附磁珠，然后离心甩掉芯片中的液体。在芯片表面加入清洗液，比如磷酸盐缓冲溶液(PBST，在溶液中加入0.05％Twen20)，并使之流入芯片的飞升孔内，去除芯片的底部磁铁，再在芯片的底部放置磁铁，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体，这算一次清洗动作。如果预设次数为3次，则重复上述清洗动作，直至清洗的操作次数达到预设次数。通过以上清洗的操作，充分洗涤掉没有结合的检测二抗。
将芯片放置于数字显微镜下，围绕着有孔的地方进行拍照，然后把含有孔的所有地方的照片无缝无重合的拼接成一张照片，检测照片上的发光点，每个点代表一个标志物，从而计算生物标志物的总量。如果样品是稀释后加入到反应池中，则根据稀释的比例，计算原样品含有的生物标志物的分子数量。
根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。比如，只有10％的飞升孔发光，则需要进一步分析检测结果这么小的原因，如果掉入磁珠的飞升孔数也仅在20％左右，则说明本次测试无效，需要进一步分析掉入磁珠的飞升孔数少的原因。
在本发明的另一个实施例中，如图3、图2a所示，一种生物标志物的分子数量的检测方法，包括：
步骤S010通过偶连方法使所述一抗包被磁珠表面，得到包被一抗的磁珠；
或，步骤S020利用磁珠表面的疏水性使所述一抗吸附到磁珠表面，得到包被一抗的磁珠；
步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入所述芯片的飞升孔内；
步骤S110稳定第一预设时间后，获取掉入磁珠的飞升孔数；
步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；
步骤S300对所述芯片进行清洗；
步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；
步骤S500对所述芯片进行清洗；
步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；
步骤S710读取所述芯片上的第一寄存器，得到所述发光的飞升孔数；
步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量；
步骤S810根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
所述步骤S300和/或所述步骤S500具体包括：
步骤S10在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S20将磷酸盐缓冲溶液加入所述芯片表面，并使之流入所述芯片的飞升孔内；
步骤S30去除所述芯片的底部的磁性；
步骤S40在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S50重复所述步骤S20-步骤S40，直至清洗的操作次数达到预设次数后，结束清洗操作。
具体的，相对前一个实施例，本实施例用步骤S710替代了步骤S720-S730。
利用光感应传感器自动统计发光的飞升孔数，通过读取芯片上的第一寄存器，得到所述发光的飞升孔数，使测试过程更方便快捷，提高检测效率。
在本发明的另一个实施例中，如图4、图7、图8所示，一种芯片11000，包括：
芯片本体11100；
所述芯片本体11100的一面设置有若干个检测单元11110，每个检测单元包括一个飞升孔11111，所述飞升孔11111为从所述芯片的第一表面向第二表面凹陷得到的盲孔；所述第一表面与所述第二表面相对；
所述飞升孔11111为圆柱体，底部直径的范围为2um-10um，高度的范围为2um-10um；
所述飞升孔11111的侧壁和底壁由防水材料组成；
每个所述检测单元11110还包括一个电容传感器11112；
所述芯片11000上设有第二计数器11400，所述第二计数器11400与所有所述电容传感器11112电连接；
所述芯片11000上设有第二寄存器11500，所述第二寄存器11500与所述第二计数器11400电连接，用于记录所述第二计数器11400的计数值。
具体的，图7是芯片的俯视图(图中只是为了方便理解，示意性的画了若干个检测单元，并未画出实际数量的检测单元，用矩形框表示检测单元，只是方便描述，并不代表检测单元的实际俯视图)，图4是芯片的结构示意图。
芯片包括芯片本体和若干检测单元，每个检测单元包括一个飞升孔，如图8所示(图8是检测单元的放大俯视图)。使用微加工技术，在芯片上出飞升大小的小孔。飞升孔主要用于一个蛋白分子或病毒分子的检测，通常病毒分子或蛋白分子的直径比一般分子的大，该分子还需与一抗、二抗等反应形成复合物，复合物的大小约在0.1um左右，该复合物附连在磁珠上，飞升孔需容纳附连了复合物的磁珠，另外还要考虑飞升孔太小会造成磁珠不易进入孔内，以及太小的飞升孔的加工难度等，所以飞升孔的大小需在以上大小上做适当的放大。但是飞升孔也不能太大，由于单个酶在一定的反应时间内催化的检测底物是一样多的，所以飞升孔的体积影响光的检测信号的强弱。当飞升孔形状为圆柱体时，建议底部直径的范围为2um-10um，高度的范围为2um-10um。飞升孔形状也可以为正方体或长方体等，考虑磁珠是球形的，飞升孔形状为圆柱体所消耗的体积最小，这样便于在同等体积的芯片上出更多的孔，所以优选飞升孔形状为圆柱体。
每个飞升孔为盲孔，从芯片的第一表面向第二表面凹陷得到。因磁珠需落入飞升孔进行检测阶段的反应，所以飞升孔必须为盲孔，保证磁珠的承载和磁珠与检测底物的反应。
以底部直径3.2um，高4.0um为例，飞升孔的体积为：底面积*圆柱体高＝π*r2*h＝3.14*(3.2/2)2*4＝32.1536立方微米＝32.1536fL，即32.1536飞升。
芯片上还有一些电子类的模块，比如第二寄存器、第二计数器等，所以所述飞升孔的侧壁和底壁需要由防水材料组成。
每个所述检测单元还包括一个电容传感器，如图8所示。所述芯片上还设有第二计数器，与所有电容传感器电连接，便于自动统计落入磁珠的飞升孔数；还设有第二寄存器，便于直接读取落入磁珠的飞升孔数的统计结果，提高了测试效率。
在本发明的另一个实施例中，如图5、图7、图9所示，一种芯片，包括：
芯片本体11100；
所述芯片本体11100的一面设置有若干个检测单元11110，每个检测单元11110包括一个飞升孔11111，所述飞升孔11111为从所述芯片的第一表面向第二表面凹陷得到的盲孔；所述第一表面与所述第二表面相对；
所述飞升孔11111为圆柱体，底部直径的范围为2um-10um，高度的范围为2um-10um；
所述飞升孔11111的侧壁和底壁由防水材料组成；
每个所述检测单元11110还包括一个电容传感器11112；
所述芯片11000上设有第二计数器11400，所述第二计数器11400与所有所述电容传感器11112电连接；
所述芯片11000上设有第二寄存器11500，所述第二寄存器11500与所述第二计数器11400电连接，用于记录所述第二计数器11400的计数值；
所述电容传感器11112由设置在所述飞升孔11111的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对；
每个所述检测单元11110设有一个光感应传感器11113，所述光感应传感器11113位于所述飞升孔11111的第三侧，所述第三侧与所述第一侧互相垂直；所述飞升孔11111与所述正极电极之间设有第一光屏蔽层1，所述飞升孔11111和所述负极电极之间设有第二光屏蔽层2，所述飞升孔11111的第四侧设有第三光屏蔽层3，所述第一光屏蔽层1与所述第二光屏蔽层2通过所述第三光屏蔽层3相互连接，所述第四侧与所述第三侧相对；
所述芯片11000上设有第一计数器11200，所述第一计数器11200与所有所述光感应传感器11113电连接；
所述芯片11000上设有第一寄存器11300，所述第一寄存器11300与所述第一计数器11200电连接，用于记录所述第一计数器11200的计数值。
具体的，相对前一个实施例，本实施例增加了光感应传感器。芯片的结构示意图如图5所示，检测单元增加了光感应传感器，芯片上增加了第一计数器和第一寄存器。芯片的俯视图如图7所示，检测单元的放大俯视图如图9所示。
每个检测单元包含一个飞升孔、一个电容传感器和一个光感应传感器。
电容传感器是由设置在飞升孔的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对。在没有磁珠进入时，飞升孔内部是空的，其介电常数是ε0，正负极板之间的电容为平行板电容器，则电容为C0＝ε0*S/d(ε为极板间介质的介电常数，S为极板面积，d为极板间的距离)；当磁珠进入飞升孔时，其他因数都不会发生改变，只有ε0会变为ε1，那么极板间的电容就会变为C1＝ε1*S/d。根据电容值从C0到C1的变化，可以判定内部是不是有磁珠落入。
光感应传感器采用光敏三极管，位于飞升孔的第三侧，所述第三侧与所述第一侧互相垂直，通过光敏三极管的感应来判断飞升孔是否发光。飞升孔与所述正极电极之间设有第一光屏蔽层，与所述负极电极之间设有第二光屏蔽层；在飞升孔的第四侧设有第三光屏蔽层，第一光屏蔽层与第二光屏蔽层通过第三光屏蔽层相互连接，第四侧与第三侧相对；由于飞升孔的四侧只有一侧是透光的，所以对其他的飞升孔是否发光的检测也没有影响。
第一计数器与所有的光感应传感器电连接，通过第一计数器统计出发光的光感应传感器数；第一计数器统计的结果直接写入第一寄存器，通过读取第一寄存器，可以直接获取发光的光感应传感器数，提高了测试效率。
在本发明的另一个实施例中，如图6所示，一种生物标志物的分子数量的检测系统10000，包括：上述任一实施例中所述的芯片11000；还包括磁珠12000，当对生物标志物进行检测时，所述磁珠位于所述芯片的飞升孔内。
具体的，提供了一种生物标志物的分子数量的检测系统，该系统包括芯片和磁珠。
对生物标志物的检测，包括复合物合成阶段和检测阶段；复合物合成阶段是指第一复合物和第二复合物的生成阶段。检测阶段是指加入检测底物，使生物标志物发光显示的阶段。无论是复合物合成阶段，还是检测阶段，都是由落在芯片的飞升孔内的磁珠上进行。
该检测系统利用芯片的飞升孔所提供的单分子反应体积，可以获得更准确的生物标志物的分子数量，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。
在本发明的另一个实施例中，如图6所示，一种生物标志物的分子数量的检测系统10000，包括：上述任一实施例中所述的芯片11000；还包括磁珠12000；
当对生物标志物进行检测时，所述磁珠位于所述芯片的飞升孔内；
当飞升孔11111为圆柱体时：
所述飞升孔11111的底部直径与所述磁珠12000的直径的比例，介于1.2～1.6之间；
所述飞升孔11111的高与所述磁珠12000的直径的比例，介于0.5～1.5之间。
具体的，相对前一个实施例，本实施例增加了飞升孔大小与磁珠大小的比例关系约束。
通过限定飞升孔的孔径与磁珠的直径的比例关系，在水平方向使一个飞升孔仅能容纳一个磁珠，从而使统计结果更准确。
通过限定飞升孔的高与磁珠的直径的比例关系，在垂直方向使一个飞升孔仅能容纳一个磁珠，从而使统计结果更准确。
本系统还包括：磁体；所述磁体，用于在对芯片执行清洗时，在芯片底部加入磁性，吸附磁珠。
综上所述，一种生物标志物的分子数量的检测系统，利用前述的检测方法和芯片的飞升孔所提供的单分子反应体积，可以获得更准确的生物标志物的分子数量，相对传统的ELISA技术，检测灵敏度提高100倍以上。如果同时整合检测试剂，将包被好的磁珠提前放入芯片的飞升孔内，则可以实现生物标志物检测的标准化和一体化。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种生物标志物的分子数量的检测方法，其特征在于，所述检测方法非诊断目的，在一芯片中执行，所述芯片包括第一计数器、第一寄存器、第二计数器、第二寄存器和若干个检测单元，每个检测单元包括一个电容传感器、一个光感应传感器和一个飞升孔，所述电容传感器由设置在所述飞升孔的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对；所述光感应传感器位于所述飞升孔的第三侧，所述第三侧与所述第一侧互相垂直；
所述第一计数器与所有光感应传感器电连接，用于统计发光的飞升孔数；所述第一寄存器与所述第一计数器电连接，用于记录所述第一计数器的计数值；
所述第二计数器与所有所述电容传感器电连接，用于统计落入磁珠的飞升孔数；所述第二寄存器与所述第二计数器电连接，用于记录所述第二计数器的计数值；
所述检测方法包括：
步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入所述芯片的飞升孔内，且所述飞升孔最多容纳一个磁珠；
通过所述第二计数器和所述第二寄存器获取掉入磁珠的飞升孔数；
步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；
步骤S300对所述芯片进行清洗；
步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；
步骤S500对所述芯片进行清洗；
步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；
步骤S710读取所述芯片上的第一寄存器，得到所述发光的飞升孔数；
步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量；
根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
2.根据权利要求1所述的生物标志物的分子数量的检测方法，其特征在于，所述步骤S100之前还包括以下任意一步：
步骤S010通过偶连方法使所述一抗包被磁珠表面，得到包被一抗的磁珠； 或，
步骤S020利用磁珠表面的疏水性使所述一抗吸附到磁珠表面，得到包被一抗的磁珠。
3.根据权利要求1所述的生物标志物的分子数量的检测方法，其特征在于，所述步骤S100与所述步骤S800之间还包括：
步骤S110稳定第一预设时间后，获取掉入磁珠的飞升孔数；
所述步骤S800进一步包括：
步骤S810根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
4.根据权利要求1所述的生物标志物的分子数量的检测方法，其特征在于，所述步骤S300和/或所述步骤S500具体包括：
步骤S10在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S20将磷酸盐缓冲溶液加入所述芯片表面，并使之流入所述芯片的飞升孔内；
步骤S30去除所述芯片的底部的磁性；
步骤S40在所述芯片的底部加入磁性，吸附磁珠，离心甩掉所述芯片中的液体；
步骤S50重复所述步骤S20-步骤S40，直至清洗的操作次数达到预设次数后，结束清洗操作。
5.一种生物标志物的分子数量的检测方法，其特征在于，所述检测方法非诊断目的，在一芯片中执行，所述芯片包括第二计数器、第二寄存器和若干个检测单元，每个检测单元包括一个电容传感器和一个飞升孔，所述电容传感器由设置在所述飞升孔的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对；
所述第二计数器与所有所述电容传感器电连接，用于统计落入磁珠的飞升孔数；所述第二寄存器与所述第二计数器电连接，用于记录所述第二计数器的计数值；
所述检测方法包括：
步骤S100将表面包被一抗的磁珠加入芯片表面，并使所述磁珠掉入所述芯片的飞升孔内，且所述飞升孔最多容纳一个磁珠；
通过所述第二计数器和所述第二寄存器获取掉入磁珠的飞升孔数；
步骤S200将包含生物标志物的样品加入所述芯片表面，并使所述样品流入所述芯片的飞升孔内，孵育第二预设时间，使所述生物标志物与所述磁珠上的一抗结合形成第一复合物；
步骤S300对所述芯片进行清洗；
步骤S400将二抗加入所述芯片表面，并使所述二抗流入所述芯片的飞升孔内，孵育第三预设时间，使所述二抗与所述磁珠上的第一复合物结合形成第二复合物；
步骤S500对所述芯片进行清洗；
步骤S600将检测底物加入所述芯片表面，并使所述检测底物流入所述芯片的飞升孔内，孵育第四预设时间，使所述检测底物与所述磁珠上的第二复合物反应，发出光；
步骤S720获取含有所有飞升孔的所述芯片的照片；
步骤S730检测所述照片上的发光点，根据所述发光点的数目，得到所述发光的飞升孔数；
步骤S800根据所获取的发光的飞升孔数，计算所述样品中的生物标志物的分子数量；
根据所述获取的掉入磁珠的飞升孔数和发光的飞升孔数，评判测试的有效性。
6.一种芯片，其特征在于，包括：
芯片本体；
所述芯片本体的一面设置有若干个检测单元，每个检测单元包括一个飞升孔，所述飞升孔为从所述芯片的第一表面向第二表面凹陷得到的盲孔；所述第一表面与所述第二表面相对； 所述飞升孔最多容纳一个磁珠；
所述飞升孔为圆柱体，底部直径的范围为2um-10um，高度的范围为2um-10um；
所述飞升孔的侧壁和底壁由防水材料组成；
每个所述检测单元还包括一个电容传感器和一个光感应传感器； 所述电容传感器由设置在所述飞升孔的第一侧的正极电极和第二侧的负极电极组成，所述第一侧与所述第二侧相对；所述光感应传感器位于所述飞升孔的第三侧，所述第三侧与所述第一侧互相垂直；
所述芯片上设有第一计数器和第一寄存器，所述第一计数器与所有光感应传感器电连接，用于统计发光的飞升孔数；所述第一寄存器与所述第一计数器电连接，用于记录所述第一计数器的计数值；
所述芯片上设有第二计数器，所述第二计数器与所有所述电容传感器电连接，用于统计落入磁珠的飞升孔数；
所述芯片上设有第二寄存器，所述第二寄存器与所述第二计数器电连接，用于记录所述第二计数器的计数值。
7.根据权利要求6所述的芯片，其特征在于：
所述飞升孔与所述正极电极之间设有第一光屏蔽层，所述飞升孔和所述负极电极之间设有第二光屏蔽层，所述飞升孔的第四侧设有第三光屏蔽层，所述第一光屏蔽层与所述第二光屏蔽层通过所述第三光屏蔽层相互连接，所述第四侧与所述第三侧相对。
8.一种采用上述权利要求1-5任一所述的生物标志物的分子数量的检测方法的检测系统，其特征在于，包括权利要求6-7任一所述的芯片；还包括磁珠，当对生物标志物进行检测时，所述磁珠位于所述芯片的飞升孔内。
9.根据权利要求8所述的检测系统，其特征在于：
当飞升孔为圆柱体时：
所述飞升孔的底部直径与所述磁珠的直径的比例，介于1.2～1.6之间；
所述飞升孔的高与所述磁珠的直径的比例，介于0.5～1.5之间。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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