发明内容
发明目的:
针对上述问题,本发明提供一种检测仪器,该检测仪器集免疫磁富集、免疫荧光光谱技术及微流技术于一体,实现对微量及痕量生物样品的检测分析。本发明还提供采用该检测仪器进行检测分析的检测方法。
技术方案:
具体而言,本发明提供一种检测仪器,包括样品池、富集系统、荧光检测系统、连接样品池和富集系统的导管和用于将样品输送到富集系统中的驱动装置。在本发明的检测仪器中,富集系统包括毛细管和磁铁,其中毛细管为样品流动通道和富集场所,磁铁紧邻毛细管,并且产生垂直于样品流动方向的磁场。
在本发明的检测仪器中,驱动装置是蠕动泵,毛细管是光学玻璃毛细管,磁铁包括永磁铁和电磁铁。荧光检测系统包括光源系统、聚焦系统、分光系统和光信号检测系统,用于检测被富集于毛细管内壁上的样品,其中入射光路和检测光路系统与毛细管成垂直方向。
在本发明的检测仪器中,还用导管将毛细管的流出端与样品池或废液瓶连接,前者可为流经毛细管的溶液形成循环回路。
本发明的检测仪器还包括恒温系统。
本发明的检测仪器还包括在样品池和富集系统之间的控制装置,用于控制待测样品、淋洗液或基准物溶液的选择输运,其中控制装置是多位阀。
在本发明的检测仪器中,还包括计算机控制系统和数据分析系统,所述计算机控制系统和数据分析系统包括计算机、软件、单板机控制系统,用于自动控制样品池的温度、样品的流动、富集系统的开关、荧光检测系统的激发波长与检测波长的选择、信号采集与数据分析。
本发明还提供采用该检测仪器进行检测分析的检测方法,该方法采用毛细管作为样品流动通道、富集及检测的场所,并且利用紧邻毛细管的磁铁,使样品在毛细管中流动的过程中得到磁富集,然后用荧光方法检测分析在毛细管中被富集的样品。
本发明的检测方法可用于检测微量及痕量生物样品,包括细菌、病毒或细胞类待测物样品和小分子类待测物样品,
其中对于细菌、病毒或细胞类待测物样品,将待测物样品、表面带有可以识别待测物的抗体的免疫磁珠、荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体,即荧光探针,进行孵育,形成“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,使上述复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物进行荧光检测和分析;或者
将待测物样品、表面带有可以识别待测物的抗体的免疫磁珠进行孵育,形成“免疫磁珠-待测物”复合物,使“免疫磁珠-待测物”复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,在富集后,使荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体,即荧光探针,流经毛细管,对被富集在毛细管内壁的磁珠表面的待测物进行有效识别,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物进行荧光检测和分析。
其中对于小分子类待测物样品,将待测小分子样品、表面带有小分子半抗原抗体(或小分子半抗原)的免疫磁珠、荧光标记的小分子半抗原或小分子人工抗原(或荧光标记的小分子半抗原抗体),即荧光探针,进行孵育,形成“免疫磁珠-荧光探针”复合物,使上述复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-荧光探针”复合物进行荧光检测;然后,将表面带有小分子半抗原抗体的免疫磁珠、相同浓度的荧光标记的小分子半抗原或人工抗原进行孵育,形成“免疫磁珠-荧光探针”复合物,使该复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-荧光探针”复合物进行荧光检测;将两次检测到的荧光强度信号进行对比分析,得到待测小分子样品的浓度信息;或者
将表面带有小分子半抗原抗体(或小分子半抗原)的免疫磁珠、荧光标记的小分子半抗原或人工抗原(或荧光标记的小分子半抗原抗体)进行孵育,形成“免疫磁珠-荧光探针”复合物,或者将表面带有小分子半抗原或人工抗原的免疫磁珠、抗小分子半抗原一抗及荧光标记的抗小分子半抗原一抗的二抗进行孵育,形成“免疫磁珠-一抗-二抗荧光探针”复合物,使形成的复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-荧光探针”复合物或“免疫磁珠-一抗-二抗荧光探针”复合物进行荧光检测;然后,使待测物样品流经毛细管,以便与富集在毛细管中的“免疫磁珠-荧光探针”复合物或“免疫磁珠-一抗-二抗荧光探针”复合物竞争结合,之后进行荧光检测;将两次检测到的荧光强度信号进行对比分析,得到待测小分子样品的浓度信息。
本发明的检测方法还可以用于检测多组分生物样品,
将含有两种或多种微生物待测物样品、表面同时或分别带有上述两种或多种待测微生物相对应的抗体的免疫磁珠、不同荧光标记的对上述两种或多种类待测物有特异性结合能力的抗体,即荧光探针,进行孵育,形成“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,使上述复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,然后对富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物进行荧光检测和分析。其中,用于标记不同抗体的荧光物质,其荧光中心发射峰位的波长差>40nm;
或者
其中将含有两种或多种微生物的待测样品、表面同时或分别带有上述两种或多种待测微生物相对应的抗体的免疫磁珠进行孵育,形成“免疫磁珠-待测物”复合物,使该复合物溶液流经毛细管,同时利用磁铁产生的磁场使其富集在毛细管的指定位置,在富集后,使不同荧光标记的对不同待测物有特异性结合能力的抗体,流经毛细管,对被富集在毛细管内壁的磁珠表面的待测物进行有效识别,然后对形成的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物进行荧光检测和分析,其中用于标记不同抗体的荧光物质的荧光中心发射峰位的波长差>40nm。。
技术效果:
本发明的生物样品分析检测仪器和检测方法具有以下优点:1)采用磁富集联用技术,由于在生物样品检测中无需传统扩增过程,因此检测过程耗时被大大缩短,可在2h甚至更短时间内完成检测,而传统的细菌培养检测法至少需要48h;2)采用毛细管作为样品富集及检测的场所,样品在流动过程中得到富集,因此更有利于对微量及痕量生物样品的检测;3)结合不同种类的示踪物,如具有不同荧光发射波长的荧光材料来识别待测物可有效地实现对两种以上生物组分样品的联合检测。其中,可同时检测的生物样品的种类数目仅取决于示踪标记物的信号差异及信号检测器对示踪信号的分辨能力。针对荧光示踪物来讲,就是指不同种类荧光标记物荧光发射波长的差别及光学探测器的对该差别的分辨能力;4)结合荧光光谱分辨程序可提高待检测组分的数目。
因此,本发明的生物样品分析检测仪器和检测方法以磁珠为载体,将免疫磁富集、免疫荧光光谱技术及微流技术集成于一体,实现了微量及痕量生物样品分析的自动化分析,具有快速,高通量及小型化的特点,因此在基础医学、临床医学、生命科学研究以及食品科学、环境科学乃至于进出口检验检疫领域中具有巨大的应用前景。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的检测仪器和检测方法进行详细描述。
检测仪器
图2显示了本发明的检测仪器的构筑模块图。本发明的检测仪器可以包括样品池、恒温系统、微流系统、富集分离系统、荧光检测系统、计算机分析与控制系统等构筑模块。下面就各个部分作进一步说明。
样品池:
样品池2既是进样池,又是免疫磁珠及荧光探针与待测样品的免疫识别反应的反应池。样品池2可根据反应物体积灵活选择不同体积的玻璃容器。
恒温系统:
恒温系统提供免疫磁珠及荧光探针与待测样品识别反应所需温度,该系统包括:温度控制仪、加热元件、保温箱体、循环水冷系统、温度传感器等,其中恒温系统所能提供的恒温范围是20~95℃。图1是恒温系统的剖面图示意图。箱体4采用发泡聚苯乙烯制成的热绝缘材料。内部空腔为40×40×40(mm),内衬金属板。电加热元件3采用四片硅胶电加热板,夹在内衬金属板和热绝缘箱体之间。温度传感器5为Pt100温敏电阻,位于底部金属板下面。温度控制仪为商品仪器,通过232口接收计算机控制。
微流系统:
微流系统用于选择溶液、控制溶液流速和流向。微流系统包括导管6、多位阀8,20、蠕动泵13、光学玻璃毛细管16和废液瓶24等。多位阀8用于待测样品、缓冲液14和基准物质15的选择输送;多位阀20用于控制样品流向。蠕动泵用于流速控制。微流系统的多位阀的转动、蠕动泵的启动和停止以及转动速度由计算机7控制。
典型的微流系统由一个转速连续可调的蠕动泵13、一个三入口一出口的进样控制多位阀8、一个一入口两出口的残液控制多位阀20和若干内径为0.8mm的硅橡胶导管6组成。多位阀8的样品入口9与样品池2相连,入口10与淋洗缓冲液14相连,入口11与基准物质样品池15相连。待测样品流经毛细管16后,由多位阀20的入口21经出口23通向样品池2或经出口22通向废液瓶24。
蠕动泵13的转速决定了样品的流速,蠕动泵的转速受计算机7控制。蠕动泵13的入口通过导管6和多位阀8的出口12相连,出口通过导管6和富集-检测毛细管16的入口相连。
多位阀20的转动用于实现残液不同流路的切换。多位阀20有一个入口21两个出口22,23。入口21通过导管6和富集-检测毛细管16的出口相连。多位阀20的出口23通过导管6和样品池2相连。多位阀20的出口22通过导管6和废液瓶24相连。多位阀20的转动由计算机7控制。
荧光检测系统:
图3是荧光检测系统简化的结构框图。荧光检测系统由激发光源18、荧光分光及光学系统25、光电转换26、信号放大器27、信号采集28及计算机7组成。其中,激发光源18用于激发样品中的荧光物质产生荧光。光电转换26可以采用光电倍增管PMT或雪崩光电二极管APD将荧光信号转换为电信号。根据量子效率来分,它们又可分为光子计数型和普通型。光子计数型和普通型的光电转换器所要求的放大器及数据采集器是不相同的。光子计数型适合对极微弱信号检测,具有很高的灵敏度。放大器27由两级以上的放大元件组成。第一级为前置放大器,将光电转换器的微弱电流信号放大;第二级将前级的输出电压信号进一步放大到所需的水平,并提供足够的输出电流。信号采集28将放大器的信号输出转化为计算机所能识别的数字信号。信号采集工作状态由计算机7控制。激发光路与荧光检测光路与毛细管16成垂直方向。激发光源为氙灯、发光二极管或激光。
图4是图3中荧光检测部分的荧光光纤束及光耦合简化框图。位于光纤束中心的石英激发光纤31传导激发光29;周围的光纤32传导荧光34。激发光29通过透镜30(1)聚焦耦合进入激发光纤31。在出射端经过透镜30(2)聚焦激发样品,样品荧光被透镜30(2)收集聚焦耦合进入信号光纤32,在另一端出射后经过准直系统33变成准直光34经过荧光分光及光学系统25后被光电转换26成电信号。
图5是分光系统中采用的滤光片转盘及驱动示意图,负责选择激发及荧光波长。滤光片转盘35直径为40mm,上面均匀分布有五个直径为5mm的通孔,其中四个通孔用于放置不同波长的滤光片36,此外还有一遮光板37。转盘边缘有可与传动齿轮40相啮合的轮齿。38是轴承,39是固定杆。41是电机轴,42是直流步进电机。受计算机7控制。计算机发出的步进信号使步进电机转动相应的角度,带动滤光片转盘转动,选取需要的滤光片。
图6是基于光子计数型PMT或APD的放大和数据采集系统的简化框图。43是高速前置放大器。PMT输出的电信号Vin经隔直耦合电容C、50欧姆匹配电阻R1进入前置放大器43,电阻Rf、Rg构成反馈网络,决定放大器放大倍数。第二级放大器44是高速比较放大器,将前置放大器的模拟脉冲信号转化为数字脉冲信号。R2是电位器,调节灵敏度和本底值。脉冲整形器45将高速比较放大器44输出脉冲变成宽度恒定的脉冲信号。计数器46对脉冲整形器45的脉冲信号进行计数。检测时间到后将计数值打入锁存寄存器47,通过单板机控制系统48,将结果送入计算机7。计数值的大小对应光强的大小。单板机控制系统48还接收来自计算机的控制命令,控制计数器以及锁存寄存器的工作。
图7是基于常规PMT或APD的放大和数据采集的简化框图。前置放大器49将光电转化器的微弱电流信号转化为电信号。电阻R3决定前放49的伏安V/A增益倍数。电阻Rg和Rf构成反馈网络,决定第二级放大器50的放大倍数,使信号被放大到合适的输出电压和电流。电位器R8调零,消除本底。放大器输出的模拟信号经ADC模拟/数字转换器51转换为数字信号,转换结果送入锁存寄存器47,通过单板机控制系统48,将结果送入计算机7。单板机控制系统48还接收来自计算机的控制命令,控制ADC模拟/数字换器51及锁存寄存器47的工作。
图8是单板机控制系统48的简化框图。计算机7和微处理控制器53通过串行通信口RS23250(52)传送控制信号流55。微处理控制器根据计算机的控制命令,发出相应的控制信号,结合个受控部分的工作状态,启动、停止计数器46或模拟/数字转换器51工作、启动锁存寄存器47传送数据以及多位阀8和20的转动、蠕动泵13转动、滤光片36的选择及磁富集系统17的开启和关闭。56是微处理控制器和锁存寄存器、模拟/数字转换器、计数器之间的控制/状态信息流;57是数据流。
图9是微处理控制器的程序框图,每测量一个组分启动一次该程序。
图10是计算机的程序框图。它们相互配合完成整个测量过程。
生物样品的检测方法:
下面详细描述利用本发明仪器进行生物样品检测的过程。
本发明采用的试剂有免疫磁珠(如:
产品)和荧光探针(如:
公司的量子点荧光产品及Molecular
公司的荧光染料产品)。其中,免疫磁珠担当待测样品的富集试剂;荧光探针担当待测样品的检测试剂。
本发明的检测方法可用于检测微量及痕量生物样品,包括细菌、病毒或细胞类待测物样品和小分子类待测物样品。
针对细菌、病毒或细胞类待测物,其结构特征是表面可以结合多个抗体分子,具体的检测步骤如下:
1)将免疫磁珠(即表面带有可以识别待测物的抗体)、待测样品及荧光探针(即荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体)导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为37℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟;或孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时,形成含“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物;
2)利用蠕动泵驱动上述复合物溶液流经毛细管,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选1~5mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场使“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的复合物,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)启动荧光检测系统检测富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,根据检测到的荧光信号对待测物进行分析;
或
1)将表面带有可以识别待测物的抗体的免疫磁珠、待测物样品导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟,形成含“免疫磁珠-待测物”复合物;
2)利用蠕动泵驱动上述复合物溶液流经毛细管,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选1~5mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场使“免疫磁珠-待测物”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)利用蠕动泵驱动荧光探针(荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体)溶液流经毛细管,使荧光探针与被富集并固定在毛细管内壁的磁珠表面的待测分子进行有效识别,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01mL/min~0.1mL/min,时间为1分钟~20分钟,优选5分钟。视荧光探针的量,可启动探针循环流动系统,以避免浪费;
6)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
7)启动荧光检测系统检测“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,根据检测到的荧光信号对待测物进行分析;
或
1)将含有两种或多种微生物的待测样品、表面同时或分别带有上述两种或多种待测微生物相对应的抗体的免疫磁珠、不同荧光标记的对上述两种或多种类待测物有特异性结合能力的抗体,即荧光探针,导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟,形成含“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,其中,用于标记不同抗体的荧光物质的荧光中心发射峰位的波长差>40nm;
2)利用蠕动泵驱动上述复合物溶液流经毛细管,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选1~5mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场使“免疫磁珠-待测物”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)启动波长分辨荧光检测系统检测“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,根据检测到的荧光信号对待测物进行分析。
或
1)将含有两种或多种微生物的待测样品、表面同时或分别带有上述两种或多种待测微生物相对应的抗体的免疫磁珠导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟,形成含“免疫磁珠-待测物”复合物;
2)利用蠕动泵驱动上述复合物溶液流经毛细管,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选1~5mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场使“免疫磁珠-待测物”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)利用蠕动泵驱动不同荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体流经毛细管,其中用于标记不同待测物抗体的荧光物质的荧光中心发射峰位的波长差>40nm,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min,时间为1分钟~20分钟,优选5分钟。视荧光探针的量,可启动探针循环流动系统,以避免浪费;
5)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗富集在毛细管中的“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
6)启动波长分辨荧光检测系统检测“免疫磁珠-待测物-荧光探针”复合物,根据检测到的荧光信号对待测物进行分析。
针对小分子类待测物样品的检测分析的具体步骤如下:
1)将表面带有小分子半抗原的抗体(或小分子半抗原)的免疫磁珠、荧光标记的小分子半抗原或小分子人工抗原(或荧光标记的小分子半抗原的抗体)及待测小分子样品导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,时间为2分钟~8小时,优选10分钟~30分钟;
2)利用蠕动泵驱动“免疫磁珠-荧光探针”形成复合物溶液流经毛细管,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选1~5mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场,富集被悬浮的磁珠,使“免疫磁珠-荧光探针”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)启动荧光检测系统;
6)对检测到的荧光信号进行分析;
7)将表面带有小分子半抗原的抗体(或小分子半抗原)的免疫磁珠、及与步骤1中浓度相同的荧光标记小分子半抗原或小分子人工抗原(或荧光标记的小分子半抗原抗体)导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟;
8)利用蠕动泵驱动“免疫磁珠-荧光探针”形成复合物溶液流经毛细管,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min;
9)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场富集功能,富集被悬浮的磁珠,使“免疫磁珠-荧光探针”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
10)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
11)启动荧光检测系统;
12)对步骤11和6检测到的荧光强度信号进行对比分析,得到待测小分子样品的浓度。
或
1)将表面带有小分子半抗原抗体(或小分子半抗原)的免疫磁珠、荧光标记的半抗原或人工抗原(或荧光标记的小分子半抗原抗体)导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟;
2)利用蠕动泵驱动“免疫磁珠-荧光探针”形成复合物的溶液流经毛细管,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场富集功能,富集被悬浮的磁珠,使“免疫磁珠-荧光探针”复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)启动荧光检测系统;
6)对荧光信号进行检测分析;
7)利用蠕动泵驱动待测样品流经毛细管,此时,待测分子以及半抗原或人工抗原竞争结合小分子半抗原的抗体,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min;
8)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
9)启动荧光检测系统;
10)对步骤9和6检测到的荧光强度信号进行对比分析,得到待测小分子样品的浓度;
或
1)将免疫磁珠即表面带有小分子半抗原、抗小分子半抗原一抗及荧光标记的抗小分子半抗原一抗的二抗导入恒温样品池进行孵育,孵育温度为25℃,孵育时间为2分钟~8小时,优选10分钟~1小时;或孵育温度为37℃,时间为2分钟~8小时,优选5分钟~30分钟;
2)利用蠕动泵驱动“免疫磁珠-一抗-二抗荧光探针”形成复合物的溶液流经毛细管,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min;
3)在上述复合物溶液流经毛细管的同时,启动电磁场富集功能,富集被悬浮的磁珠,使复合物富集在毛细管的指定位置,其中磁场强度为0.01T~1.5T,优选0.5T;
4)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
5)启动荧光检测系统;
6)利用蠕动泵导入待测物溶液,此时,待测物以及免疫磁珠表面的抗原竞争结合小分子半抗原一抗,流速为0.01mL/min~2mL/min,优选0.01~0.1mL/min;时间为1分钟~20分钟,优选5分钟;
7)用生化缓冲液(PBS磷酸缓冲液)淋洗被富集的磁珠,淋洗时间为1分钟~1小时,优选5分钟~20分钟,流速为0.1mL/min~20mL/min,优选0.5~2mL/min;
8)再次检测磁珠的荧光强度
9)对步骤8和5检测到的荧光强度信号进行对比分析,得到待测小分子样品的浓度。
下面,以第一套细菌、病毒类或病变细胞类待测物的检测流程为例,具体描述仪器各个部件的工作流程。
1)将免疫磁珠(即表面带有可以识别待测物的抗体)、待测样品及荧光探针(即荧光标记的对待测物有特异性结合能力的抗体)导入恒温样品池2,恒温孵育。
2)将多位阀8切换到入口9,启动电磁铁17,开启蠕动泵13,将磁珠分散液经多位阀8的出口12输送到富集-检测毛细管16,电磁铁17产生的磁场将磁珠固定到16的特定部位。将多位阀20切换到出口22,残液经出口22排出到废液瓶24;
3)将多位阀8切换到入口10,电磁铁17保持通电,多位阀20切换到出口22,用缓冲液淋洗磁珠表面非特异性吸附的荧光标记抗体,废液经多位阀20出口22排出到废液瓶24;
4)启动光源系统18,通过荧光分光及光学系统25选择合适的荧光波长,进行荧光检测。
5)荧光信号经光电转换器26,放大器27及信号采集系统28,将被转换的电信号传送到计算机7进行处理。
6)计算机7分析得到所测组分的浓度,并输出结果。
7)将多位阀8切换到入口10,多位阀20切换到出口22,关闭电磁铁17,启动蠕动泵13,用缓冲液将纳米磁珠从富集-检测毛细管中排出,完成检测全过程。
本发明集成了免疫磁珠的磁富集技术、免疫荧光分析技术及微流技术,在计算机控制下可实现样品的微量及痕量自动分析,尤其适用于生物样品的分析。该设备及技术的优点如下:
1)待测样品的富集、分离、检测过程全部为自动化过程,因此,操作简单,检测快速。
2)仪器结构简单,成本低廉,采用成熟及高灵敏度的荧光分析技术,重复性好。
3)通过蠕动泵、进样控制多位阀、残液控制多位阀,可使溶液样品构成回路,可大大提高免疫荧光探针的利用效率,从而降低成本。
实施例1
将含有大肠杆菌O157:H7的待检测样品10mL、耦联有大肠杆菌单克隆抗体的免疫磁珠(购于
)200μL及异硫氰酸荧光素(FITC,购于Molecular
)标记的大肠杆菌特异性抗体20μL导入恒温样品池2,在37℃下孵育10min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-待测物-荧光探针”形成复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13,流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中悬浮的磁珠,残液经多位阀20的出口22流出至废液瓶24;待测液中的磁珠被富集完毕后,将多位阀8切换到入口10,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与大肠杆菌结合的多余FTIC标记的抗体;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于520nm处检测荧光,并对信号强度进行分析,计算待测样品中大肠杆菌浓度。采用此方法检测大肠杆菌的灵敏度为5CFU/mL。
实施例2
将含有大肠杆菌O157:H7的待检测样品10mL、耦联有大肠杆菌单克隆抗体的免疫磁珠(购于
)200μL导入恒温样品池2,在37℃下孵育10min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-待测物”形成复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,残液经多位阀20流出的出口22至废液瓶24;待测液中的磁珠被富集完毕后,向恒温样品池2中加入20μL FITC标记的大肠杆菌特异性抗体及3mL的PBS磷酸缓冲液,此时蠕动泵13驱动荧光标记抗体流经毛细管16,将多位阀20切换到出口23,将蠕动泵13流速调至0.6mL/min,此时荧光标记抗体可多次流经毛细管16,提高识别效率;10min后,将多位阀8切换到入口10,同时将多位阀20的出口切换到22,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去与大肠杆菌非特异性结合的FTIC标记抗体;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于520nm处检测荧光,并对信号强度进行分析,计算待测样品中大肠杆菌浓度。采用此方法检测大肠杆菌的灵敏度为5CFU/mL。
实施例3
将耦联有可识别“瘦肉精”克伦特罗抗体的免疫磁珠(购于
)200μL、以及耦联有克伦特罗人工抗原的量子点(发射波长610nm,购于
)100μL导入恒温样品池2,25℃下孵育15min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-荧光探针”形成复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,溶液经多位阀20流出至废液瓶24;将多位阀8切换到入口10,蠕动泵13流速设为1mL/min,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与免疫磁珠结合的多余量子点-抗原耦联物;10min后,停止蠕动泵13,启动荧光分光及光学系统25,检测荧光强度信号;然后,将多位阀8切换到入口9,向恒温样品池2中加入含有克伦特罗的待测样品10mL,启动蠕动泵13,流速设为1mL/min,此时待测样品流经毛细管,与富集在毛细管中的“免疫磁珠-荧光探针”复合物中的量子点-人工抗原耦联物竞争结合标记于免疫磁珠表面的抗体;同时,将多位阀20切换到出口23,待测样品循环经过毛细管,以提高竞争效率。30min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于610nm处检测荧光强度信号并进行分析,通过与之前测得的荧光强度信号的对比分析,计算待测样品中克伦特罗的浓度。采用此方法检测克伦特罗的灵敏度为1ng/mL。
实施例4
将耦联有可识别“瘦肉精”克伦特罗抗体的免疫磁珠(购于
)200μL、含有克伦特罗的待测样品10mL以及耦联有克伦特罗半抗原的量子点(发射波长610nm,购于
)100μL导入恒温样品池2,25℃下孵育10min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-荧光探针”复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,溶液经多位阀20流出至废液瓶24;10min后,将多位阀8切换到入口10,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与免疫磁珠结合的多余量子点-抗原耦联物;10min后,停止蠕动泵13,启动荧光分光及光学系统25,检测荧光强度信号;然后,将多位阀8切换到入口11,向基准物质样品池15中导入预先孵育好的由免疫磁珠和克伦特罗半抗原-量子点耦联物所形成的复合物(其中,免疫磁珠及量子点标记的克伦特罗半抗原样品的用量同上,10mL待测样品用相同体积的PBS磷酸缓冲液代替,温育条件同上),开启蠕动泵,流速设为1mL/min,此时“免疫磁珠-荧光探针”复合物溶液流经毛细管,与此同时,电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,残液经多位阀20的出口22流至废液瓶24;待上述富集过程完成后,将多位阀8切换到入口10,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与免疫磁珠结合的多余量子点-抗原耦联物,淋洗速度为0.5mL/min;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于610nm处检测荧光强度信号并与上面测得的信号进行对比分析,计算待测样品中克伦特罗的浓度。采用此方法检测克伦特罗的灵敏度为1ng/mL。
实施例5
将耦联有“瘦肉精”克伦特罗半抗原的免疫磁珠(购于
)200μL、抗克伦特罗半抗原一抗300μL及吲哚菁类荧光染料Cy5(购于Molecular
)标记的抗克伦特罗半抗原一抗的二抗20μL导入恒温样品池2,加入10mL PBS磷酸缓冲液,25℃下孵育20min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-一抗-荧光标记二抗”复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为0.8mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,残液经多位阀20的出口22流出至废液瓶24;富集完毕后,将多位阀8切换到入口10,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与免疫磁珠结合的一抗及荧光标记二抗;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于650nm处检测荧光强度信号;然后,将多位阀8切换到时入口11,向基准物质样品池15中加入3mL含有“瘦肉精”克伦特罗的待测样品,将蠕动泵流速设为0.05mL/min,此时待测样品流经毛细管,待测样品在流动过程中与被固定磁珠表面的半抗原竞争结合抗克伦特罗半抗原一抗,使此前结合的一抗及荧光标记二抗产生脱落;30min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,于650nm处检测荧光强度信号,并与此前测得的荧光强度信号进行对比分析,计算待测样品中克伦特罗的浓度。采用此方法检测克伦特罗的灵敏度为0.5ng/mL。
实施例6
将同时含有大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的待检测样品10mL、耦联有大肠杆菌单克隆抗体的免疫磁珠(购于
)及沙门氏菌单克隆抗体的免疫磁珠各100μL、20μL标记了610nm的荧光量子点(购于
)的大肠杆菌特异性抗体及20μL标记了530nm的荧光量子点(购于
)的沙门氏菌特异性抗体导入样品池2,于37℃孵育20min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-待测物-荧光探针”形成复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,残液经多位阀20的出口22流至废液瓶24;5分钟后,将多位阀8切换到入口10,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与免疫磁珠结合的大肠杆菌、沙门氏菌及被非特异性结合的量子点标记抗体,流速为1mL/min;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,驱动荧光检测系统中的滤光片转盘35,选择滤光片36分别对待测磁珠在610nm及530nm处的荧光信号进行检测分析,结合波长分辨程序计算待测样品中大肠杆菌及沙门氏菌浓度。采用此方法同时检测到大肠杆菌及沙门氏菌的灵敏度为6~10CFU/mL。
实施例7
将同时含有大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的待检测样品10mL、耦联有大肠杆菌单克隆抗体的免疫磁珠(购于
)及沙门氏菌单克隆抗体的免疫磁珠各100μL导入恒温样品池2,在37℃下孵育10min;将多位阀8切换到入口9,多位阀20切换到出口22,开启蠕动泵13驱动“免疫磁珠-待测物”形成复合物的溶液流经毛细管16,蠕动泵13流速设为1mL/min,与此同时,启动电磁铁17富集溶液中的悬浮磁珠,溶液经多位阀20流出至废液瓶24;富集5分钟完毕后,向基准物质样品池15中加入20μL标记了610nm的荧光量子点(购于
)大肠杆菌特异性抗体、20μL标记了530nm的荧光量子点(购于
)的沙门氏菌特异性抗体及1mL的PBS磷酸缓冲液;然后,蠕动泵13驱动荧光标记抗体流经毛细管16,将多位阀20切换到出口22,将蠕动泵13流速调至0.05mL/min;10min后,将多位阀8切换到入口10,同时将蠕动泵13流速调至1mL/min,此时蠕动泵13驱动缓冲液14淋洗被富集的磁珠,除去未与大肠杆菌及沙门氏菌结合的荧光标记抗体;10min后,停止蠕动泵,启动荧光分光及光学系统25,驱动荧光检测系统中的滤光片转盘,选择滤光片分别对待测磁珠在610nm及530nm处的荧光信号进行检测分析,结合波长分辨程序计算待测样品中大肠杆菌及沙门氏菌浓度。采用此方法同时检测到大肠杆菌及沙门氏菌的灵敏度为6~10CFU/mL。