CN104949943A

CN104949943A - 一种生物样品快速检测方法

Info

Publication number: CN104949943A
Application number: CN201410113488.9A
Authority: CN
Inventors: 王军峰; 王辉; 吴静
Original assignee: SHANGHAI ZHICHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI ZHICHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明提供了一种生物样品快速检测方法，其特征在于，将检测样品用样品处理液处理，形成磁珠+被测物+发光标记微粒的磁珠复合物；将处理后的检测样品滴加在生物芯片上，检测样品沿芯片上的毛细管向另一侧流动，磁珠复合物在定位磁场的作用下，聚集在毛细管检测区域；激发光元件产生一定波长的激发光照射到毛细管上的检测区域后，复合物上的发光标记微粒产生发射光，光检测元件将发射光的强度转换成数字信号，从而形成检测结果。本方法与传统的侧向流层析检测方法相比，灵敏度高、检测范围宽、抗干扰能力强、反应时间短，更适合应用于生物样品的快速检测。

Description

一种生物样品快速检测方法

技术领域

本发明属于医学快速诊断检测技术领域，具体是一种生物样品快速诊断的分析方法。

背景技术

免疫学测定是以抗体‐抗原的特异性识别，抗体标记技术和示踪技术为基础的定量技术。现有的临床体外诊断有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光分析法等。但是在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含杂质成分较多，一定程度上影响了检测速度、检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是生物样品检验工作面临的一个难题。尤其是用于快速诊断领域时，该问题尤其突出。

即时检验（point-of-care testing），包括在病人旁边进行的临床快速检测，如早孕试纸等。即时检验可以在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，因此得到了快速发展。目前市场上的产品多数基于侧向流免疫层析技术的产品。但是由于在层析过程中，样品在试剂卡上会有残留，反应也不够充分，因此很难保证检测结果的精确度和精密度，所以多数情况下仅用于定性或半定量检测。

本发明的目的在于克服侧向流免疫层析用于快速诊断时的不足。

发明内容

本发明提供一种生物样品的快速检测方法，简单、快速、灵敏度和准确性高。

本发明一种生物样品快速检测方法，其特征在于，将检测样品用样品处理液处理，使被测物形成磁珠、被测物和发光标记微粒的复合物；将处理后的检测样品滴加在生物芯片上，检测样品沿芯片上的毛细管向另一侧流动，复合物在定位磁场的作用下，聚集在毛细管检测区域；激发光设备产生激发光照射到毛细管上的检测区域后，复合物上的发光标记微粒受到激发，产生发射光，光检测设备将发射光的强度转换成数字信号，形成检测结果。

如上所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述被测物带有至少两个能够与其他生物片段结合的特定位点；所述样品处理液为包含磁珠、发光标记微粒的缓冲液；所述磁珠连接了能够与被测物特定位点1相结合的生物片段，所述发光标记微粒连接了能够与被测物特定位点2结合的生物片段。

如果被测物是抗原，所述磁珠连接了能够与被测抗原位点1相结合的抗体1，所述发光标记微粒连接了能够与被测物抗原位点2结合的抗体2。如果被测物是抗体，所述磁珠连接了能够与被测抗体位点1相结合的抗原1，所述发光标记微粒连接了能够与被测物抗体位点2结合的抗原2。

磁珠为内核为含有四氧化三铁的高分子微球，在其表面覆盖聚苯乙烯材料，并有羧基修饰，其直径为30nm‐1000nm，更优选为直径分布在200‐400nm。例如可以是洛阳惠尔纳米科技有限公司的羧基修饰微球。

发光标记微粒为含有发光标记物的羧基修饰的聚苯乙烯微球，其发光标记物质为含有稀土元素铕的化合物。例如可以是铕螯合的荧光微粒如赛默飞世尔公司销售的羧基修饰的荧光微球。

生物芯片包括生物芯片构架及依次设置于构架上的样品槽、毛细管和吸水纸，所述毛细管的两端分别连接样品槽和吸水纸。可选择的，所述生物芯片上可以集成多个并行的样品槽和毛细管，使一个芯片可能同时检测多个参数。

定位磁场可以是外置于生物芯片一侧或下方的磁铁，也可以是满足本发明被测物检测目的的磁场、激发光设备和光检测设备一体化检测设备，如上海纽克生物科技有限公司生产的NT9700便携式时间分辨荧光检测仪。光检测元件用来将反应过程中的光信号转换成数字信息。光信号可以是荧光信号或可见光信号，激发光波长可以是200‐800nm任何波长。

如本领域一般技术人员能理解的，测试时，将液体样品滴加到样品槽中，在磁场和毛细管表面张力双重作用下向吸水垫方向移动，而样品混合液中的磁珠浓集固定在定位磁场的检测区域，需要时滴加缓冲液清洗，以待检测。检测器用来读取并转化反应信号，检测器的激发波长和检测波长，根据发光标记微粒光学性质确定。

本发明可用于系列体外诊断试剂盒包括心肌梗死标志物系列试剂盒、心力衰竭系列试剂盒和炎症因子生物标志物系列等试剂盒。

本发明克服了侧向流免疫层析的不足。反应在样品处理液中完成，属于均相反应，因此反应完全；中间形成的磁珠、被测物和发光标记微粒的复合物被磁场捕获，因此收集的信息更加完全，与纸层析相比，本反应在毛细管中进行，所以无残留，而且还可以进行洗涤，反应的背景信号更低。综上所述，整个产品在准确度和精密度上得到了显著提升。

具体实施方式

实施例1

为了能够更清楚的描述本发明内容，下面以C‐反应蛋白（CRP）为实施例来进行进一步的描述。采用双抗体夹心法，1000nm羧基修饰磁珠，铕螯合的荧光微粒，抗CRP的抗体1和2。抗体1和抗体2分别使用杭州启泰生物科技的鼠抗人MC01抗体和MC02抗体。

CRP抗体1与磁珠的结合可通过以下方法制备得到：

（1）磁珠洗涤分散：用50mmol/l MES缓冲液清洗，并分散于MES缓冲液中。

（2）磁珠的活化：称取活化剂EDC和NHS溶于（1）磁珠溶液中，活化剂浓度为100mg/ml，反应10分钟。MES缓冲液清洗并分散，活化后的磁珠浓度为10mg/ml。

（3）磁珠与抗体连接：磁珠抗体比例以5:1，向磁珠溶液中加入抗体，混匀后，室温下静置10小时。

（4）磁珠的清洗及封闭：MES缓冲液清洗与抗体反应后的磁珠，并溶于pH7.8的100mmol/l的Tris‐HCl缓冲液中，用3%BSA封闭1小时。清洗并溶于pH7.8的100mmol/l的Tris‐HCl缓冲液中，4℃保存。

CRP抗体2标记的荧光微粒可通过以下方法制备得到：

（1）荧光微粒的清洗：用50mmol/l MES缓冲液清洗，并溶于MES缓冲液中。

（2）荧光微粒的活化：称取活化剂EDC和NHS溶于（1）发光微粒溶液中，活化剂浓度为10mg/ml，反应30分钟。MES缓冲液清洗并分散，活化后的发光微粒浓度为100mg/ml

（3）发光微粒与抗体连接：发光微粒抗体比例以5:1，向发光微粒溶液中加入抗体，室温，震荡反应4小时。

（4）发光微粒的清洗及封闭：HEPES缓冲液清洗与抗体反应后的发光微粒，并溶于HEPES缓冲液中，用1%BSA封闭1小时。清洗并溶于HEPES缓冲液中，4℃保存。

CRP体外诊断试剂盒中样品处理液组成：Tris‐HCl50mmol/l）、Casein（0.5%）、Tween‐20（1%），与CRP抗体1结合的磁珠，与CRP抗体2结合的荧光微粒。

分析过程如下，在50ul样品处理液中加入1ul样品，然后混匀1分钟，取1滴（约30ul），加入样品槽，2分钟后测试，用上海纽克生物科技有限公司生产的NT9700便携式时间分辨荧光检测仪读取数据。

实施例2

为了能够更清楚的描述本发明内容，下面以N端脑钠肽前体（NT‐proBNP）检测项目为实施例来进行进一步的描述。采用双抗体夹心法，200nm羧基修饰磁珠，铕螯合的荧光微粒（激发光为300nm左右，发射光600nm左右），抗体1使用Hytest公司生产的批号为：13/01-8NT2的NT‐proBNP的抗体；抗体2使用Hytest公司生产的批号为：13/02-NT1-G12抗抗体。

NT‐proBNP抗体1与磁珠的结合与实例1相同：

NT‐proBNP抗体2与荧光微粒结合与实例1相同。

NT‐proBNP体外诊断试剂盒中样品处理液组成：Tris‐HCl50mmol/l）、Casein（0.5%）、Tween‐20（1%），与NT‐proBNP抗体1结合的磁珠，与NT‐proBNP抗体2结合的荧光微粒。

分析过程如下，在20ul样品处理液中加入20ul样品，然后混匀1分钟，取1滴（约30ul），加入样品槽，2分钟后测试，用上海纽克生物科技有限公司生产的NT9700便携式时间分辨荧光检测仪读取数据。

实施例3

为了能够更清楚的描述本发明内容，下面以降钙素原（PCT）检测项目为实施例来进行进一步的描述。采用双抗体夹心法，200nm羧基修饰磁珠，采用赛默飞世尔的AMCA荧光微粒（激发光为340nm左右，发射光440nm左右），抗体使用杭州启泰生物科技的鼠抗人MJG03抗体和MJG05抗体。

PCT抗体1与磁珠的结合与实例1相同：

PCT抗体2与荧光微粒结合与实例1相同。

PCT体外诊断试剂盒中样品处理液组成：Tris‐HCl50mmol/l）、Casein（0.5%）、Tween‐20（1%），与PCT抗体1结合的磁珠，与PCT抗体2结合的荧光微粒。

分析过程如下，在10ul样品处理液中加入90ul样品，然后混匀1分钟，取1滴（约30ul），加入样品槽，2分钟后测试，用上海纽克生物科技有限公司生产的NT9700便携式时间分辨荧光检测仪读取数据。

Claims

1.一种生物样品快速检测方法，其特征在于，将检测样品用样品处理液处理，使被测物形成磁珠、被测物和发光标记微粒的复合物；将处理后的检测样品滴加在生物芯片上，检测样品沿芯片上的毛细管向另一侧流动，复合物在定位磁场的作用下，聚集在毛细管检测区域；激发光设备产生激发光照射到毛细管上的检测区域后，复合物上的发光标记微粒受到激发，产生发射光，光检测设备将发射光的强度转换成数字信号，形成检测结果。

2.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述被测物带有至少两个能够与其他生物片段结合的特定位点；所述样品处理液为包含磁珠、发光标记微粒的缓冲液；所述磁珠连接了能够与被测物特定位点1相结合的生物片段，所述发光标记微粒连接了能够与被测物特定位点2结合的生物片段。

3.如权利要求2所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，被测物是抗原，所述磁珠连接了能够与被测抗原位点1相结合的抗体1，所述发光标记微粒连接了能够与被测物抗原位点2结合的抗体2。

4.如权利要求2所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，被测物是抗体，所述磁珠连接了能够与被测抗体位点1相结合的抗原1，所述发光标记微粒连接了能够与被测物抗体位点2结合的抗原2。

5.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述磁珠为内核为含有四氧化三铁的高分子微球，在其表面覆盖聚苯乙烯材料，并有羧基修饰，其直径可以是30nm-1000nm。

6.如权利要求5所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述磁珠直径为200nm–400nm。

7.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述发光标记微粒为含有发光标记物的羧基修饰的聚苯乙烯微球，其发光标记物质为含有稀土元素铕的化合物。

8.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述生物芯片包括生物芯片构架及依次设置于构架上的样品槽、毛细管和吸水纸，所述毛细管的两端分别连接样品槽和吸水纸。

9.如权利要求8所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述生物芯片上可以集成多个并行的样品槽和毛细管，使一个芯片可能同时检测多个参数。

10.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述的定位磁场可以是外置于生物芯片一侧或下方的磁铁。

11.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述激发光波长为200‐800nm。

12.如权利要求1所述的生物样品快速检测方法，其特征在于，所述的定位磁场、激发光设备和光检测设备为一体化的检测设备。