CN104677889A - 一种基于鲁米诺功能化的磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于鲁米诺功能化的磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法，属于纳米功能材料、生物传感技术和电化学技术领域。磁性微球比表面积大、导电能力强，且分离方便。制备鲁米诺功能化的磁性微球，利用其标记甲胎蛋白二抗，从而制得鲁米诺功能化的磁性免疫探针。在金电极表面构建“甲胎蛋白一抗/甲胎蛋白抗原/鲁米诺功能化的磁性免疫探针”式复合结构，通过检测电致化学发光信号实现对甲胎蛋白抗原的灵敏、特异性检测。目前常采用的酶标记抗体法，其探针制备操作复杂且易降低酶的活性。与之比较，本发明中鲁米诺功能化的磁性免疫探针标记抗体制备简单方便、且易于保存，可用于检测甲胎蛋白抗原。

Description

一种基于鲁米诺功能化的磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法

技术领域

本发明涉及鲁米诺键合的磁性免疫探针的制备。传统的酶标记法制备探针，分离步骤复杂且易降低酶的活性。本方法便于分离，操作简单，易于保存，并实现了电致化学发光检测甲胎蛋白。

背景技术

将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原、抗体、细胞等，包裹或吸附于某些高分子材料、生物高分子或无机材料上制备成感应器，这些称为生物功能物质的固定化。生物分子固定化方法是研制免疫传感技术的关键，成为改善免疫分析方法的稳定性、灵敏度、选择性等性能的最有效途径之一，并代表当前免疫分子固定化技术的发展方向。通常要求采用的固定化程序既使所固定的生物分子具有较高的固定量，又能使其免疫活性得以完好保持，还应能减少背景非特异性吸附以及易于传感器件的反复再生等。然而传感器表面构造不一，它们与抗原/抗体的结合特性都不同，这就需要不同的固定方法使固定的抗原/抗体在反应中不会脱落。固定方法决定着技术的稳定性、灵敏度、选择性等性能。记产物不仅稳定性要好，而且不能降低抗原或抗体的免疫反应活性以及标记基团的发光效率。随着免疫分析新酶及标记试剂的引入，涌现出了新的标记技术，并展现出了良好的应用前景。免疫分析研究表明，第二抗体上标记分子数目的增加能够大大提高免疫反应的灵敏度，但过多的标记分子存在又会降低抗体的生物活性。为了研制廉价、灵敏度高、选择性好的免疫分析方法，固定化技术已成为研究和探索的目标。

在免疫分析中，通常固定抗体或抗原的载体是塑料板、塑料球、管及尼龙等。使用这些固相载体时，抗体-抗原免疫复合物的分离往往比较烦琐费时，常常是分析误差的主要来源。由于抗体或抗原在固相上固定的不均匀性，成本高，大多抗体或抗原的 10 %能够吸附在固相上进行抗体-抗原免疫复合物的形成，导致包被固相条件不易被控制。磁性微球作为免疫固相的发展，克服了这些缺点，目前已受到了广泛的关注。磁性微球可以提供一种类均相的免疫反应历程，不仅便于抗体-抗原复合物从分离介质中分离，还可以大大提高分析方法的灵敏度。

磁性微球具有一个由磁性金属或金属氧化物组成的磁性内核，内核表面通常包裹有核壳，核壳可以为生物分子的结合提供活性功能基团（如氨基、羧基、醛基等），这些活性基团通过戊二醛或碳二亚胺等双功能偶联剂将生物靶向分子和信号分子等结合到磁性微珠的表面，形成免疫磁性探针，从而具有了靶向结合目标分子的能力。制备过程中，可借助磁场与其他物质快速分离。与磁性微球结合后的免疫活性分子仍具有抗原-抗体识别反应的高度专一性。该免疫磁性探针与相应配体结合后，形成的免疫复合物可以在磁场下与其他物质快速分离，从而达到快速特异性分离纯化靶向分子的作用，可用作微量样品分离、富集、提纯和检测的手段。常使用的免疫磁性微球大约是直径几个微米左右，磁性颗粒很小，易于稳定地悬浮在溶液中，提高了生物分子之间的反应效率。另外，这种免疫磁性微球具有顺磁性，当外加磁场时，可以迅速地从溶液中分离出来，提高了分离效率和速度。免疫磁性微球，是近年来国内外研究比较热门的一种新的免疫学技术，它以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域，其应用日趋广泛，尤其在免疫学检测、细胞分离、蛋白质纯化等方面取得巨大的进展。免疫磁性探针技术作为一项新的检测技术，在抗原抗体检测方面有着很大的发展潜力。

发明内容

本发明以磁性微球作为固相载体，利用共价结合作用将鲁米诺和甲胎蛋白二抗体同时固定在其表面，构建了鲁米诺功能化磁性免疫探针。结合磁性分离技术，建立了一种简便的固定方法。以甲胎蛋白未检测对象，利用抗原抗体特异性识别的作用，采用双抗体夹心法，采用电致发光的检测方法建立了甲胎蛋白免疫传感分析方法。

在磁性微球悬浮液在加入活化剂以活化磁性微球表面的基团，加入鲁米诺和甲胎蛋白二抗体，通过偶联剂的作用，将鲁米诺和甲胎蛋白二抗体固定在磁性微球表面。磁性分离、洗涤后得到鲁米诺功能化磁性免疫探针。通过金-硫共价键作用，在金电极表面修饰一层巯基乙酸分子。通过偶联剂的作用将甲胎蛋白一抗体与金电极表面巯基乙酸结合，用牛血清白蛋白封闭未结合位点，得到甲胎蛋白一抗体修饰的金电极。将甲胎蛋白一抗体修饰的金电极浸入到待检测的溶液中，孵育后，甲胎蛋白一抗体与甲胎蛋白抗原结合，接下来与鲁米诺功能化磁性免疫探针反应，从而得到一抗/抗原/二抗/鲁米诺夹心式结构。通过检测其电致化学发光信号对甲胎蛋白抗原进行定量分析。并将本方法用于检测人血清样品，与酶标记法相比，得到了很好的相关性。本发明中，对鲁米诺功能化磁性免疫探针的改进克服了传统酶标记法降低酶活性的缺点，该探针具有合成步骤简单，易分离，易保存等优点。

本方法所用仪器装置为：CHI 832B电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司）；MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）；三电极系统：金电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极；可调式移液器（热电上海仪器有限公司）；电子天平（上海天普分析仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；石英自动双重纯水蒸馏器（江苏省金坛市白塔石英玻璃仪器厂）；pHS-3D型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；数值式水浴温度控制仪（北京长安科学仪器厂）。玻璃仪器均用铬酸洗液浸泡过夜后用去离子水清洗烘干

所用试剂为：鲁米诺（ABCR GMbH & Co）；30%过氧化氢溶液（莱阳市双双化工有限公司）；甲胎蛋白单克隆抗体、甲胎蛋白抗原（郑州博赛生物技术有限公司），顺磁性微球（天津倍思乐色谱技术开发中心）；吐温-20（天津市光复精细化工研究所）； 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和牛血清白蛋白均购自（Sigma公司）。其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

附图说明

附图1为鲁米诺功能化磁性免疫探针的制备示意图。

附图2为基于鲁米诺功能化磁性免疫探针检测甲胎蛋白的原理示意图。

附图3检测一系列浓度甲胎蛋白抗原标准品得到的工作曲线。线性方程为：I=62.9C+25.1，其中I为相对电致化学发光强度，C为甲胎蛋白抗原浓度（ng/mL）。

附图4本方法与酶联免疫法的相关性，相关系数为0.999。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

鲁米诺功能化磁性免疫探针的制备（见图1）

(1)采用羧基修饰的磁性微球，制备鲁米诺功能化磁性免疫探针。

(a)用0.1M pH 7.0的咪唑-盐酸缓冲溶液洗涤100 μL 10mg/mL羧基修饰的磁性微球，加入0.1 M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.1 M的 N-羟基琥珀酰亚胺，37 °C孵育5小时后0.01M  pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤、磁性分离得到活化了的磁性微球。

(b)200 μL 1.0 ×10^-4 M鲁米诺和200 μL 0.02 mg/mL甲胎蛋白二抗加入到活化了的磁性微球中，置于恒温箱中37 °C温育12小时，经0.01M  pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后，加入200 μL 0.1% 牛血清白蛋白溶液37 °C温育2小时，经0.01M  pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤、磁性分离后得到鲁米诺功能化的磁性免疫探针。

鲁米诺溶液：用0.05 M碳酸盐缓冲溶液（pH 10.3）配制0.1M 溶液，放置三天，再用0.1 M NaHCO3-NaOH缓冲溶液（pH  10.0）稀释为0.01M 储备液，使用时用0.01 M pH 7.4磷酸缓冲溶液逐级稀释至所需浓度。

0.01M pH 7.4磷酸缓冲溶液：称取8.20 g NaCl、0.20 g KCl、3.64g Na₂HPO₄·12H₂O、0.24 g KH₂PO₄，蒸馏水溶解、调pH=7.4，定容至1.0 L。

(2)制备甲胎蛋白一抗修饰的金电极。

(a)金电极依次使用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的α-Al₂O₃抛光粉抛光，用二次蒸馏水洗涤干净。

(b)将抛光的电极浸到200 μL 1.0 ×10^-4 M巯基乙酸37 °C温育24小时，经0.01M  pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入200 μL 0.1 M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.1 M的 N-羟基琥珀酰亚胺溶液37 °C孵育5小时，经0.01 M pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤得到活化了羧基修饰金电极。

(c)将活化了的金电极浸入200 μL 0.02 mg/mL甲胎蛋白一抗溶液中，37 °C温育12小时，经0.01 M pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤，浸入200 μL 0.1% 牛血清白蛋白溶液37 °C温育2小时，经0.01M  pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后得到甲胎蛋白一抗修饰的金电极。

实施例2

电致化学发光检测甲胎蛋白（见图2）

(1)按照实施例1制备鲁米诺功能化的磁性免疫探针。

(2)按照实施例1制备甲胎蛋白一抗修饰的金电极。

(3)在甲胎蛋白一抗修饰的金电极表面滴加8 μL待测样品或标准品，37 °C温育2小时，经0.01 M pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤，滴加鲁米诺功能化的磁性免疫探针溶液，37 °C温育2小时，在金电极表面形成一抗/抗原/二抗/鲁米诺夹心式结构。

(4)电致化学发光检测。将制备好的金电极浸入到2.0 mL电致化学发光反应试剂中，以铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测定其发光强度。利用所构建的方法检测一系列浓度甲胎蛋白标准品，其工作曲线如图3所示。

实施例3

按照实施例1和实施例，利用本方法制备的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，对5份人血清样品中的甲胎蛋白进行检测，结果与传统的酶联免疫法对照，绘制相关曲线。结果表明二者具有很好的相关性（见图4）。

Claims (12)

1.在一种鲁米诺功能化的磁性免疫探针，由羧基修饰的磁性微球与鲁米诺、甲胎蛋白二抗链接而成。

2.根据权利要求1所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，其特征在于：所述鲁米诺、甲胎蛋白二抗分别通过氨基和羧基反应共价链接在所述的磁性微球表面。

3.根据权利要求1所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，其特征在于：所述鲁米诺功能化的磁性免疫探针具有电致化学发光特性。

4.权利要求1至3中任一所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）将洗涤干净的磁性微球加到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，搅拌状态下得到活化的磁性微球；                   

（2）将步骤（1）得到的活化的磁性微球洗涤干净，加到鲁米诺和甲胎蛋白二抗的混合溶液中，混合均匀后孵育，洗涤干净，并用牛血清白蛋白封闭得到鲁米诺功能化的磁性微球免疫探针。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述磁性微球浓度为；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.1 M；N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1 M；鲁米诺浓度为1.0 ×10-4 M；甲胎蛋白二抗浓度为0.02 mg/mL。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述磁性微球通过磁性分离洗涤的步骤。

7.根据权利要求4（1）和6所述的磁性微球，其特征在于：用0.1M咪唑-盐酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤三遍。

8.根据权利要求4（2）和6所述的磁性微球，其特征在于：用0.01M磷酸缓冲溶液（pH=7.4）洗涤三遍。

9.一种基于鲁米诺功能化磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法，步骤包括：

（1）利用Au-S化学键，在金电极表面修饰巯基乙酸；

（2）在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下，将巯基乙酸修饰的金电极与甲胎蛋白一抗反应，并用封闭液封闭，制备甲胎蛋白一抗包被的金电极；

（3）将步骤9（2）中制备的甲胎蛋白一抗包被的金电极依次与甲胎蛋白抗原标准品或标本、鲁米诺功能化的磁性微球免疫探针；

（4）在检测池中加入电致化学发光反应试剂；

（5）将步骤9（3）制备的金电极插入到检测池中，电致化学发光仪测定电致化学发光强度。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于：步骤9（1）中金电极为4 mm金盘电极，巯基乙酸浓度为1.0 ×10^-4 M。

11.根据权利要求9所述方法，其特征在于：步骤9（2）中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.1 M，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1 M，甲胎蛋白一抗浓度为0.01 mg/mL，封闭液为0.1%（m/v）牛血清白蛋白溶液。

12.根据权利要求9所述方法，其特征在于：步骤9（4）中电致化学发光反应试剂中过氧化氢浓度为：1.0 ×10^-3 M。