CN107543922A - 一种离心层析荧光免疫检测技术及其用途 - Google Patents
一种离心层析荧光免疫检测技术及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种荧光检测组合套装和检测方法，包含有待检物特异性结合物、微粒、固相膜、荧光物质、离心装置以及荧光检测器，其中所述的荧光物质包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料中的至少一种；所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述荧光物质形成非特异性结合并维持稳定的颗粒；所述固相膜为具有与蛋白质非特异性结合特性的膜质物质；所述离心装置为能够离心驱动液相在所述固相膜上层析流动的结构；所述待检物特异性结合物为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种。本发明具有灵敏度高、稳定性好、检测时间短的特点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种离心层析荧光免疫检测技术及其用途，属于免疫检测技术领域。
背景技术
免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫测定技术、化学发光检测技术、免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术等。免疫浊度技术，也称免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位，用于定量检测，但检测灵敏度低，不适合于微量检测。固相酶免疫测定技术基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，具有灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，但检测反应时间长限制了其使用。化学发光检测技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、药物分析、食品和工业分析中，也是基于抗原或抗体的固相分离手段及抗原或抗体的发光试剂标记技术，但检测反应时间长及对检测设备的要求高也影响其使用。免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术也是常用的检测技术被广泛使用，但均有其相应的不足，检测反应时间长或灵敏度、准确性欠缺是普遍存在的不足。高灵敏度、快速、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋势，但现有的都无法同时实现上述功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种离心层析荧光免疫检测技术装置及其用途。本发明具有灵敏度高、检测时间短、检测稳定性好、使用便捷的特点。
本发明提供的一种离心层析荧光免疫检测组合套装，特征在于，所述检测组合套装含有待检物特异性结合物、微粒、固相膜、荧光物质、离心装置以及荧光检测器，其中所述的荧光物质包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料中的至少一种；所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述荧光物质形成非特异性结合并维持稳定的颗粒；所述固相膜为具有与蛋白质非特异性结合特性的膜质物质；所述离心装置为能够离心驱动液相在所述固相膜上层析流动的结构；所述待检物特异性结合物为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种。
一种所述检测组合套装的检测方法，其特征在于：所述检测方法为如下（A）-（D）中任一种：
（A）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物和所述荧光物质同时标记所述微粒；
2）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即复合物1；
3）在所述固相膜上包被能够通过与位于复合物1上的待检物形成特异性结合的第二待检物特异性结合物；
4）用含有所述复合物1的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述第二待检物特异性结合物，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物”复合物，即复合物2，并被捕获固定在所述固相膜上；
5）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述复合物1及残留的所述荧光物质；
6）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（B）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物标记所述微粒；
2）用所述荧光物质标记所述待检物特异性结合物的特异性结合物，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物”，即荧光物质标记物；
3）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即复合物3；
4）在所述固相膜上包被所述第二待检物特异性结合物；
5）用含有所述复合物3的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述第二待检物特异性结合物，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物”复合物，即复合物4，并被捕获固定在所述固相膜上；
6）用含有所述荧光物质标记物的液相通过层析流经被捕获在所述固相膜上的复合物4，通过与所述待检物特异性结合物结合，形成“荧光物质标记物-复合物4”复合物，即复合物5，并被捕获固定在所述固相膜上；
6）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述荧光物质标记物及残留的所述荧光物质；
7）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（C）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物和所述荧光物质同时标记所述微粒；
2）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即所述复合物1；
3）用中间物质A标记所述第二待检物特异性结合物；
4）在所述固相膜上包被能够与所述中间物质A形成特异性结合的中间物质B；
5）用含有所述复合物1的液相与所述中间物质A标记的第二待检物特异性结合物进行反应，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A”复合物，即复合物6；
6）用含有所述复合物6的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述中间物质B，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A-中间物质B”复合物，即复合物7，并被捕获固定在所述固相膜上；
7）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述复合物6及残留的所述荧光物质；
8）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（D）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物标记所述微粒；
2）用所述荧光物质标记所述待检物特异性结合物的特异性结合物，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物”，即所述荧光物质标记物；
3）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即所述复合物3；
4）用所述中间物质A标记所述第二待检物特异性结合物；
5）在所述固相膜上包被能够与所述中间物质A形成特异性结合的所述中间物质B；
6）用含有所述复合物3的液相与所述中间物质A标记的第二待检物特异性结合物反应，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A”复合物，即复合物8；
7）用含有所述复合物8的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述中间物质B，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A-中间物质B”复合物，即复合物9，并被捕获固定在所述固相膜上；
8）用含有所述荧光物质标记物的液相通过层析流经被捕获在所述固相膜上的复合物9，通过与待检物特异性结合物结合，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物-复合物9”复合物，即复合物10，并被捕获固定在所述固相膜上；
9）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述荧光物质标记物及残留的所述荧光物质；
10）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量。
上述的离心层析荧光免疫检测方法中，所述清洗所述固相膜的方法采用不加清洗液的离心层析方式的干法离心清洗。
上述的离心层析荧光免疫检测方法中，所述中间物质为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种。
上述的离心层析荧光免疫检测方法中，所述层析流经所述固相膜的反应均在离心装置上完成并采用离心层析法驱动液体在固相膜上层析流动。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装或检测方法中，所述微粒的粒径选择1nm~10um，具体可为10~3000 nm、20~2000 nm 或35~1000 nm。所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述荧光物质形成非特异性结合并维持稳定的颗粒，目前常用的微粒有胶体金微粒、胶体硒微粒、胶体金磁微粒、荧光微球、磁性微粒、金磁微粒、凝胶微粒、乳胶微粒、塑料微球、微球硅胶、琼脂糖微粒、聚苯乙烯微粒、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、羧基微球、氯甲基微球等。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装中，所述离心装置的转速采用程序控制方式；所述离心装置的转速为200~10000 转/分钟，具体可为500~5000 转/分钟、800~3000转/分钟或800~2000 转/分钟。
上述的离心层析荧光免疫检测方法中，所述离心层析法的转速采用程序控制方式；所述离心层析的转速为200~10000 转/分钟，具体可为500~5000 转/分钟、800~3000转/分钟或800~2000 转/分钟。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装或检测方法中，所述荧光物质包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料中的至少一种。荧光染料可以偶联或渗入到微球，得到荧光微球。荧光染料可以是单一化合物的荧光染料或者由几种化合物组成的复合荧光染料，但优选单一化合物荧光染料，且优选具有较强的光稳定性的荧光染料。目前常用的有机荧光染料有异硫氰酸荧光素（简称FITC）、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白（PE）、多甲藻黄素叶绿素蛋白（PerCP）、碘化丙啶（PI）、别藻青蛋白（APC），稀土元素荧光染料中常用的稀土荧光材料是以碱土金属的硫化物、鋁酸盐等为发光基质，以稀土镧系元素（铕、钐、铒等）作为激活剂和助激活剂。为了提高信号与背景的区分度，本发明中荧光染料的波长范围为300～1300nm，优选为550-800nm。此外，层析膜、底板和扣卡一般在近红外区域(600～800nm)荧光强度极弱，因此，优选波长范围为550-800nm的荧光染料以进一步提高灵敏度。为了降低对荧光染料荧光信号的影响，本发明采用弱荧光的层析膜、底板以及扣卡，其荧光噪声在大于550nm是会很弱，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。优选底板为白色，表面附有不干胶，且扣卡、层析膜、底板及不干胶均不含有荧光剂。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装或检测方法中，所述固相膜包括硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、DEAE纤维素膜。所述固相膜的一面或两面带有背衬。本发明中，所述聚偏氟乙烯膜简称PVDF膜；所述DEAE纤维素膜指的是将二乙氨乙基(DEAE)引入纤维素分子后制成的纸状薄膜，是一种弱碱型阴离子交换材料；所述检测器为荧光检测器，所述检测器设于所述固相膜的一侧或两侧。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装中，所述检测组合套装还包含有所述清洗液，所述清洗液为含有表面活性剂的常规实验用缓冲溶液。目前常用的表面活性剂有TWEEN20、TritonX-100、TritonX-405等。
上述的离心层析荧光免疫检测方法中，所述清洗液为含有表面活性剂的常规实验用缓冲溶液。
上述的离心层析荧光免疫检测组合套装中，所述检测组合套装还包含有第二待检物特异性结合物、中间物质A、中间物质B、待检物特异性结合物的特异性结合物中的至少一种。
所述的组合套装或检测方法在免疫检测产品开发中的应用。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明采用微粒作为待检物及其中间反应物质的携带载体，在固相膜上层析流动并完成反应，提高了固相膜对待检物及其中间反应物质的捕获结合能力。
2、本发明采用离心装置驱动的液相在固相膜上层析流动，可有效地降低荧光物质与固相膜的非特异性直接或间接结合，降低了固相膜的背景噪声干扰，提高检测灵敏度。
3、现有的纸层析荧光免疫检测技术，均采用侧向流控制，检测线荧光强度在一定时间范围内，不仅与待检物浓度成正比，与反应时间也呈正相关，给实际检测控制带来了很大的困难，检测误差加大。本发明采用纸层析离心技术进行荧光检测，可显著检测时间对检测结果的影响，提高了检测的准确性。
4、本发明操作步骤简单，易于实现自动化操作。本发明方法具有高灵敏度、全定量、自动化的特点，同时又具有检测快速、使用设备简单的检测技术；不仅使用方便、减少原料的浪费，同时也显著提高工作效率，应用于检测和分析、分离的诸多领域。
附图说明
图1为本发明实施例1离心层析荧光免疫检测组合套装的示意图。
图中标记如下：
1 待检物特异性结合物；2 微粒；3 固相膜；4 荧光物质；5 离心装置；6荧光检测器；7荧光激发结构；8第二待检物特异性结合物或中间物质B；9标记吸附膜垫；10吸水膜垫；支撑底片11。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1、本发明离心层析荧光免疫检测组合套装的制备：
如图1所示，本发明离心层析荧光免疫检测组合套装包括，待检物特异性结合物1、微粒2、固相膜3、荧光物质4、离心装置5、荧光检测器6、荧光激发结构7，同时还包括第二待检物特异性结合物或中间物质B 8、标记吸附膜垫9、吸水膜垫10、支撑底片11。待检物特异性结合物1和荧光物质4与微粒2结合，并印制于标记吸附膜垫9上。固相膜3上印制有第二待检物特异性结合物或中间物质B捕获检测线8。在支撑底片11上依次粘贴标记吸附膜垫9、固相膜3和吸水膜垫10，制成检测试纸条。检测时，将检测试纸条安置于离心装置5上，在标记吸附膜垫9上加载含有待检物的待检样本，此时标记有待检物特异性结合物1和荧光物质4的微粒2与待检物结合，形成待检物复合物，层析流经固相膜3，所形成的待检物复合物被包被于固相膜3上的捕获检测线8所捕获，进行层析清洗，然后经过荧光激发结构7激发，进而产生荧光，采用荧光检测器6检测位于固相膜3上的捕获检测线8所间接捕获的荧光物质4的发光量，进而获得待检物的含量，其中进样、捕获和清洗的过程在离心装置5上通过离心层析完成。
下述实验说明本发明的检测方法及其效果，但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验一、本发明离心层析荧光免疫检测实验（一）
以胶体金微粒为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体（美国Genagates公司），抗人肌红蛋白单克隆抗体（美国Genagates公司），辣根过氧化酶（HRP，SIGMA产品），分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司，752紫外可见分光光度计），人肌红蛋白（Sigma-Aldrich产品），ＢioFlow印膜仪（美国IMAGENE公司）， Index 切条机（美国Ａ-point公司），DBF-900封口机（温州江南包装厂），ACBO除湿机（江苏无锡奥波除湿机公司），台式离心机（美国Eppendoff 公司），牛血清白蛋白（简称BSA，SIGMA产品），硝酸纤维素膜片（MILLIPORE公司），多聚酯纤维素膜 (美国Alstrom公司)，吸水纸膜垫（美国S&S公司），氯金酸（SIGMA产品），荧光定量分析仪（上海巾帼生物公司，HG-98）、异硫氰酸荧光素（FITC，SIGMA产品）。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验抗人肌红蛋白多克隆抗体为第二待检物特异性结合物，抗人肌红蛋白单克隆抗体为待检物特异性结合物，异硫氰酸荧光素为荧光物质，人肌红蛋白为待检物，台式离心机为离心装置，硝酸纤维素膜片为固相膜，氯金酸为制备微粒的材料，荧光定量分析仪为荧光检测器。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液（1%BSA，100mM 甘氨酸，50mM PBS, 150mM NaCl，pH7.4）稀释配置1.0、10、100、500、1000ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
抗人肌红蛋白单克隆抗体FITC标记：采用Marsshall法，取3mg/ml抗人肌红蛋白单克隆抗体溶液，加入1/10体积的0.5M（pH9.0）碳酸盐缓冲液，电磁搅拌5分钟。用50mM磷酸盐（PBS），pH8.0缓冲液配制浓度为1mg/ml FITC溶液，以30ul/ml的量在搅拌状态下缓慢加入抗体溶液内，4℃避光搅拌12小时。将标记的抗体溶液离心（2500r/min）20分钟，除去沉淀物，装入透析袋中，置于50mM PBS缓冲液4℃透析过夜。取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25柱，分离游离FITC，收集标记的荧光抗体，即FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体，-20℃避光保存备用。
胶体金微粒标记：取10ml纯净水，加热搅拌，待水沸腾时加入500μl 10%氯金酸溶液，加热煮沸5分钟，加入500μl 12%柠檬酸三钠溶液，保持此溶液搅拌沸腾10分钟，自然降温至室温，即得粒径50nm胶体金微粒溶液。取胶体金溶液体积10ml，用10%碳酸钾调pH至8.3，迅速加入FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体100μg，至10μg/ml终浓度，晃动烧杯混匀，室温放置30分钟，迅速加入10%牛血清白蛋白溶液100ul，使终浓度为1%，同时摇动烧杯，室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟，小心吸出上清液；再加入5ml 50mM磷酸盐(PBS)缓冲液，pH7.4，将沉淀悬浮，12000rpm离心20分钟，吸出上清液，将沉淀溶于1.0ml含有1%的牛血清白蛋白和3%蔗糖的磷酸缓冲液内，4℃避光保存。
胶体金微粒标记吸附膜制备：配制含有0.5%PVA（即聚乙烯醇）、50mM PBS液、0.5%BSA、0.88% NaCl，pH 7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内，室温浸泡１小时，将膜取出，置37℃干燥后密封备用，也可直接作为分散膜使用。取胶体金微粒标记抗体溶液，用胶体缓冲液（1%BSA，3%蔗糖，50mM PBS, pH7.4）稀释至OD530为30，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm，将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的PVC片（即聚氯乙烯片），开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度1.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥６小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金微粒标记吸附膜。置粘贴好的检测片于切条机上，切成 3.5mm试纸条。将试纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
实验组：取上述制备的试纸条，以胶体金微粒标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待胶体金微粒标记吸附膜上的红色胶体金微粒标记物全部层析流入硝酸纤维素膜，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，取下试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本发明以胶体金微粒为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为3.5分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为38分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.989，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为7.31，而对照组仅为1.50，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表1所示。
表1 本发明离心层析荧光免疫检测方法A实验结果（单位：发光值）
实验二、本发明离心层析荧光免疫检测实验（二）
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
荧光微球（上海杰一生物），海藻糖（SIGMA），硝酸纤维素膜（Millipore 公司），EDC（PIERCE公司），NHS（PIERCE公司），其它同实验一。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验荧光微球为微粒，同时也是荧光物质，其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
荧光微球标记：取0.5ml微球，使用pH7.2的0.1M 磷酸缓冲液离心清洗4次，13000rpm离心，用pH7.2的0.1M 磷酸缓冲液复溶至1ml，加入200μg抗人肌红蛋白单克隆抗体，混匀，加入250ul的40mg/ml的EDC溶液，加入250ul 40mg/ml的NHS溶液，混匀，室温反应60分钟，加入20mg的牛血清白蛋白，混匀，室温反应60分钟。离心吸弃上清，使用0.05M TrispH7.6离心清洗4次后，用0.5%海藻糖、1%BSA、 0.05M Tris pH7.6复溶至10ml，4℃避光保存待用。
荧光微球标记吸附膜制备：取荧光微球标记抗体溶液，用pH7.2的0.1M 磷酸缓冲液稀释2倍，其它同实验一。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：样品和清洗液滴加至荧光微球标记吸附膜上，其它同实验一。
对照组：样品和清洗液滴加至荧光微球标记吸附膜上，其它同实验一。
三、实验结果
本发明以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为3.6分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为37分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.984，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为14.2，而对照组仅为2.50，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表2所示。
表2 本发明离心层析荧光免疫检测方法A实验结果（单位：发光值）
实验三、本发明离心层析荧光免疫检测实验（三）
以磁微粒为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
磁微粒（MP-COOH-20020，郑州英诺生物）、MES（上海生工），其它同实验一。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验磁微粒为微粒，其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
抗人肌红蛋白单克隆抗体FITC标记：同实验一。
磁微粒标记：取2ml 0.1M MES，pH5.0溶液、FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体2mg、0.2ml 的5% w/v磁微粒和10mg EDC，混匀，加入10mg NHS，室温下在旋转混合器振荡器上放置2小时，3000g离心15分钟，弃上清， 加2ml 20mM PBS、1%BSA、2%PC-300的封闭缓冲液室温封闭1小时，加4ml 50mM PBS，pH7.4缓冲液混悬，重复清洗一次，加入2ml 50mM PBS缓冲液，4℃保存备用。
磁微粒标记吸附膜制备：采用磁微粒标记抗体溶液代替胶体金微粒标记抗体溶液，其它同实验一。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：采用磁微粒标记抗体溶液代替胶体金微粒标记抗体溶液，其它同实验一。
对照组：采用磁微粒标记抗体溶液代替胶体金微粒标记抗体溶液，其它同实验一。
三、实验结果
本发明以磁微粒为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为3.6分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为39分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.986，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为12.4，而对照组仅为1.7，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表3所示。
表3 本发明离心层析荧光免疫检测方法A实验结果（单位：发光值）
实验四、本发明离心层析荧光免疫检测实验（四）
以胶体金微粒为液相反应运载载体，采用所述方法B进行实验。
一、实验材料
FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体（上海一研生物），其它同实验一。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验FTIC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体为荧光素标记的待检物特异性结合物的特异性结合物，即荧光物质标记物，其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
胶体金微粒标记：取胶体金溶液体积10ml，用10%碳酸钾调pH至8.3，迅速加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μg，至10μg/ml终浓度，晃动烧杯混匀。其它同实验一。
胶体金微粒标记吸附膜制备：同实验一。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以胶体金微粒标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待胶体金微粒标记吸附膜上的红色胶体金微粒标记物全部层析流入硝酸纤维素膜，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，取下试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本发明以胶体金微粒为液相反应运载载体，采用所述方法B进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为6.8分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为51分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.989，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为9.1，而对照组仅为1.5，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表4所示。
表4 本发明离心层析荧光免疫检测方法B实验结果（单位：发光值）
实验五、本发明离心层析荧光免疫检测实验（五）
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法C进行实验。
一、实验材料
NHS活化生物素（SIGMA）、亲和素（SIGMA），其它同实验二。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验生物素为中间物质A、亲和素为中间物质B，其它同实验二。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
抗人肌红蛋白多克隆抗体生物素标记：取抗人肌红蛋白多克隆抗体在0.1M pH9.5碳酸钠缓冲液中透析过夜，调终浓度为2mg/ml。取NHS活化生物素20mg溶解于1ml二甲基甲酰胺，取50ul，加入到上述溶液中，室温反应4小时。将反应液于PBS缓冲液过夜透析，-20℃保存。
荧光微球标记：同实验二。
荧光微球标记吸附膜制备：取荧光微球标记抗体溶液，用胶体缓冲液（1%BSA，3%蔗糖，50mM PBS, pH7.4）稀释至OD530为30，加入生物素标记抗人肌红蛋白多克隆抗体10μg/ml，混匀。其它同实验一。
亲和素印膜制备：取亲和素溶液，用50mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载亲和素溶液，其它同实验一。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在亲和素印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金微粒标记吸附膜，其它同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以荧光微球标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待荧光微球标记吸附膜上的液体全部层析流入硝酸纤维素膜，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，取下试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本实验以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法C进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为3.8分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为37分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.989，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为5.0，而对照组仅为2.4，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表5所示。
表5 本发明离心层析荧光免疫检测方法C实验结果（单位：发光值）
实验六、本发明离心层析荧光免疫检测实验（六）
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法D进行实验。
一、实验材料
NHS活化生物素（SIGMA）、亲和素（SIGMA）、FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体（上海一研生物），其它同实验二。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验生物素为中间物质A、亲和素为中间物质B，FTIC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体为荧光素标记的待检物特异性结合物的特异性结合物，即荧光物质标记物，其它同实验二。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
抗人肌红蛋白多克隆抗体生物素标记：同实验四。
荧光微球标记：同实验二。
荧光微球标记吸附膜制备：取胶体金微粒标记抗体溶液，用胶体缓冲液（1%BSA，3%蔗糖，50mM PBS, pH7.4）稀释至OD530为30，加入生物素标记抗人肌红蛋白多克隆抗体10μg/ml，混匀。其它同实验二。
亲和素印膜制备：取亲和素溶液，用50mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载亲和素溶液，其它同实验二。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在亲和素印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及荧光微球标记吸附膜，其它同实验二。
实验组：取上述制备的试纸条，以荧光微球标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，向荧光微球标记吸附膜上滴加FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待荧光微球标记吸附膜上的液体全部层析流入硝酸纤维素膜，向荧光微球标记吸附膜上滴加FITC标记羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mMPBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，取下试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本实验以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法D进行实验，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为7.1分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为52分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r为0.978，对照组检测数据在10ng/ml以下的相关性不佳。本发明实验组10ng/ml与1ng/ml检测数据的比值为14.3，而对照组仅为1.8，主要由于荧光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表6所示。
表6 本发明离心层析荧光免疫检测方法D实验结果（单位：发光值）
实验七、本发明离心速度对检测结果的影响
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
同实验二。
二、实验方法
不设对照组，实验组人肌红蛋白溶液进样采用500、1000、2000、3000、4000、5000转/分离心，清洗用2000转/分离心，点样后直接离心，静置1分钟，其它同实验二。
三、实验结果
本实验以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，观察不同离心速度对检测结果的影响。实验检测了不同浓度的人肌红蛋白样品，实验结果如表7所示。由表7可知，检测准确性与离心速度有关，500、1000、2000转/分的离心速度获得符合要求的检测结果。3000、4000、5000转/分的离心速度获得的检测结果，莹光值有明显的下降，影响检测灵敏度和准确性。说明本发明进行肌红蛋白检测的最佳离心速度应在2000转/分以下。
表7 离心速度对检测结果的影响（单位：发光值）
实验八、本发明微粒粒径对检测结果的影响
以聚苯乙烯微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
聚苯乙烯微球（粒径35、130、376、600、1000nm，羧基化，上海涛宇国际），其它同实验一。
上述材料对应专利申请请求内容如下，本实验聚苯乙烯微球为微粒，其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
抗人肌红蛋白单克隆抗体FITC标记：同实验一。
聚苯乙烯微球标记：取2ml 0.1M MES，pH5.0溶液、FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体2mg、0.2ml 的5% w/v微球和20mg EDC，混匀，加入10mg NHS，室温下在旋转混合器振荡器上放置2小时，3000g离心15分钟，弃上清，加2ml 20mM PBS、1%BSA的封闭缓冲液室温封闭1小时，加4ml 50mM PBS，pH7.4缓冲液混悬，重复清洗一次，加入2ml 50mM PBS缓冲液，4℃保存备用。
聚苯乙烯微球标记吸附膜制备：取聚苯乙烯微球标记抗体溶液，用50mM PBS，pH7.4缓冲液稀释至1% w/v微球，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm，将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以聚苯乙烯微球标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向聚苯乙烯微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，以1000转/分离心1分钟，再向聚苯乙烯微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本发明以聚苯乙烯微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，观察不同粒径对实验结果的影响。结果，本发明粒径为35、130、376、600、1000nm的检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r均大于0.98，说明不同粒径的微粒适用于本发明技术。实验结果如表8所示。
表8 本发明微粒粒径对检测结果的影响（单位：发光值）
实验九、本发明时间相关检测稳定性与现行检测技术的比较实验
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
同实验二。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液（1%BSA，100mM 甘氨酸，50mM PBS, 150mM NaCl，pH7.4）稀释配置100ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
试纸条实验处理过程同实验二，完成清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，每隔两分钟读取一次，连续读取五次，实验重复三次，结果取平均值。
三、实验结果
本实验以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验，观察完成清洗后荧光检测值随放置时间延长的稳定性，实验结果如表9所示。本发明实验组检测数据在之后的8分钟连续观察期内，其结果基本稳定，而现行技术对照组检测数据在之后的8分钟连续观察期内，其结果随着时间延长而增加。说明本发明技术可提高实验检测的稳定性。
表9本发明时间相关检测稳定性与现行检测技术的比较实验（单位：发光值）
实验十、本发明与现行免疫荧光检测技术检测结果的比较
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
同实验二。
二、实验方法
1、制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，分别采用本发明和现行荧光免疫检测技术检测并绘制标准曲线。以已知浓度的人肌红蛋白100ng/ml作为待检样本。
2、现行荧光免疫检测技术组：
荧光微球标记：同实验二。
荧光微球标记吸附膜制备：同实验二。
多克隆抗体印膜制备：按照实验一的抗体印膜方法在固相膜的远心端印制羊抗鼠IgG多克隆抗体，作为质控线（C线），在固相膜的近心端印制抗人肌红蛋白多克隆抗体，作为检测线（T线），其它同实验一。
半成品组装方法：荧光标记抗体吸附膜粘贴于T线侧，吸水膜垫粘贴于C线侧，其它同实验一。
取上述制备的试纸条，置于桌面，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置20分钟，放置在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印制膜上检测线T和质控线C的荧光值，并计算T/C比值，对照标准曲线计算待检样本肌红蛋白浓度。
3、本发明检测技术组：材料和方法同上述实验二 。取上述制备的试纸条，以荧光微球标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光微球标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置2分钟，1000转/分离心1分钟，再向荧光微球标记抗体吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，对照标准曲线计算待检样本肌红蛋白浓度。
三、实验结果
本发明技术经如上操作，标准曲线线性良好，相关系数r值为0.995，随即进行了样品测定，三次实验平均104 ng/ml，检测误差在10%以内。采用现有技术测定，点样后静置现行产品检测的20分钟，标准曲线线性良好，相关系数r值为0.989，随即按照20分钟的条件进行了样品测定，三次平均值为111ng/ml，检测误差在15%以内。三次重复实验的具体结果如表11所示。与现有技术比较，本发明显著缩短了检测时间。
表11 本发明与免疫荧光检测技术的检测结果分析（单位：ng/ml）
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 | |
| 本发明 | 97 | 107 | 109 | 104 |
| 现有技术 | 108 | 115 | 110 | 111 |
实验十一、本发明清洗步骤对检测结果的影响
以荧光微球为液相反应运载载体，采用所述方法A进行实验。
一、实验材料
同实验二。
二、实验方法
以不含有人肌红蛋白的样品作为待检样本，对照不清洗，静置层析；实验采用40、80、120、160ul清洗，其它同实验二。
三、实验结果
实验结果如表11所示。两实验组结果比较，清洗可降低荧光物质在固相膜上的非特异性结合，而离心层析清洗的作用尤为显著。不加清洗液不做离心处理的本底荧光值为35231，离心处理的本底荧光值为5568，单用离心处理就可使本底降低6.3倍。80ul清洗使固相膜本底降低了13.5倍，获得了良好的本底实验结果。说明实验进样后伴有清洗的步骤是重要的，而离心清洗是必要的。
表11 本发明清洗步骤对检测结果的影响（单位：发光值）
| 清洗液 | 离心 | 不离心 |
| 0 | 5568 | 35231 |
| 40 | 3123 | 29871 |
| 80 | 1935 | 26152 |
| 120 | 1911 | 20123 |
| 160 | 1875 | 19886 |
Claims (13)
1.一种离心层析荧光免疫检测组合套装，特征在于，所述检测组合套装含有待检物特异性结合物、微粒、固相膜、荧光物质、离心装置以及荧光检测器，其中所述的荧光物质包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料中的至少一种；所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述荧光物质形成非特异性结合并维持稳定的颗粒；所述固相膜为具有与蛋白质非特异性结合特性的膜质物质；所述离心装置为能够离心驱动液相在所述固相膜上层析流动的结构；所述待检物特异性结合物为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种。
2.一种权利要求1所述检测组合套装的检测方法，其特征在于：所述检测方法为如下（A）-（D）中任一种：
（A）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物和所述荧光物质同时标记所述微粒；
2）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即复合物1；
3）在所述固相膜上包被能够通过与位于复合物1上的待检物形成特异性结合的第二待检物特异性结合物；
4）用含有所述复合物1的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述第二待检物特异性结合物，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物”复合物，即复合物2，并被捕获固定在所述固相膜上；
5）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述复合物1及残留的所述荧光物质；
6）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（B）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物标记所述微粒；
2）用所述荧光物质标记所述待检物特异性结合物的特异性结合物，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物”，即荧光物质标记物；
3）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即复合物3；
4）在所述固相膜上包被所述第二待检物特异性结合物；
5）用含有所述复合物3的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述第二待检物特异性结合物，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物”复合物，即复合物4，并被捕获固定在所述固相膜上；
6）用含有所述荧光物质标记物的液相通过层析流经被捕获在所述固相膜上的复合物4，通过与所述待检物特异性结合物结合，形成“荧光物质标记物-复合物4”复合物，即复合物5，并被捕获固定在所述固相膜上；
6）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述荧光物质标记物及残留的所述荧光物质；
7）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（C）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物和所述荧光物质同时标记所述微粒；
2）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，所述待检物通过与所述待检物特异性结合物结合，进而形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即所述复合物1；
3）用中间物质A标记所述第二待检物特异性结合物；
4）在所述固相膜上包被能够与所述中间物质A形成特异性结合的中间物质B；
5）用含有所述复合物1的液相与所述中间物质A标记的第二待检物特异性结合物进行反应，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A”复合物，即复合物6；
6）用含有所述复合物6的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述中间物质B，形成“荧光物质-微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A-中间物质B”复合物，即复合物7，并被捕获固定在所述固相膜上；
7）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述复合物6及残留的所述荧光物质；
8）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量；
（D）包括如下步骤：
1）用所述待检物特异性结合物标记所述微粒；
2）用所述荧光物质标记所述待检物特异性结合物的特异性结合物，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物”，即所述荧光物质标记物；
3）用含有待检物的样本与所述标记后的微粒反应，所述待检物通过与位于所述标记后的微粒上的所述待检物特异性结合物结合，进而形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物”复合物，即所述复合物3；
4）用所述中间物质A标记所述第二待检物特异性结合物；
5）在所述固相膜上包被能够与所述中间物质A形成特异性结合的所述中间物质B；
6）用含有所述复合物3的液相与所述中间物质A标记的第二待检物特异性结合物反应，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A”复合物，即复合物8；
7）用含有所述复合物8的液相通过层析流经所述固相膜上包被的所述中间物质B，形成“微粒-待检物特异性结合物-待检物-第二待检物特异性结合物-中间物质A-中间物质B”复合物，即复合物9，并被捕获固定在所述固相膜上；
8）用含有所述荧光物质标记物的液相通过层析流经被捕获在所述固相膜上的复合物9，通过与待检物特异性结合物结合，形成“荧光物质-待检物特异性结合物的特异性结合物-复合物9”复合物，即复合物10，并被捕获固定在所述固相膜上；
9）采用离心层析法用清洗液清洗所述固相膜上未结合的所述荧光物质标记物及残留的所述荧光物质；
10）将清洗后的所述固相膜用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的所述荧光物质通过激发光激发产生荧光的发光值，以检测所述待检物的含量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述清洗所述固相膜的方法采用不加清洗液的离心层析方式的干法离心清洗。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述中间物质为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述层析流经所述固相膜的反应均在离心装置上完成并采用离心层析法驱动液体在固相膜上层析流动。
6.根据权利要求1所述的组合套装或权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述微粒的粒径选择1nm-10um。
7.根据权利要求1所述的检测组合套装，其特征在于：所述离心装置的转速采用程序控制方式；所述离心装置的转速为200~10000 转/分钟。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述离心层析法的转速采用程序控制方式；所述离心层析的转速为200~10000 转/分钟。
9.根据权利要求1所述的组合套装或权利要求2或4所述的检测方法，其特征在于：所述固相膜包括硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、DEAE纤维素膜；所述检测器为荧光检测器。
10.根据权利要求1所述的检测组合套装，其特征在于：所述检测组合套装还包含有所述清洗液，所述清洗液为含有表面活性剂的常规实验用缓冲溶液。
11.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述清洗液为含有表面活性剂的常规实验用缓冲溶液。
12.根据权利要求1所述的检测组合套装，其特征在于：所述检测组合套装还包含有第二待检物特异性结合物、中间物质A、中间物质B、待检物特异性结合物的特异性结合物中的至少一种。
13.权利要求1-12中任一项所述的组合套装或检测方法在免疫检测产品开发中的应用。
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