CN107525923A - 一种离心分离免疫层析检测方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了本发明提供一种离心分离免疫层析检测方法，所述方法是以在现有的免疫层析技术基础上采用离心装置驱动液相在固相检测膜中流动为特征，可用于胶体金属免疫层析检测方法、荧光免疫层析检测方法和化学发光免疫层析检测方法。本发明具有灵敏度高、检测时间短、使用便捷、稳定性高、便于储存的特点。

Description

一种离心分离免疫层析检测方法及装置
技术领域
本发明涉及一种离心分离检测方法及装置，属于免疫检测技术领域。
背景技术
免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫测定技术、化学发光检测技术、免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术等。免疫浊度技术，也称免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位，用于定量检测，但检测灵敏度低，不适合于微量检测。固相酶免疫测定技术基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，具有灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，但检测反应时间长限制了其使用。免疫化学发光检测技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、药物分析、食品和工业分析中，也是基于抗原或抗体的固相分离手段及抗原或抗体的发光试剂标记技术，但检测反应时间长、检测试剂需要冷藏保存和运输及对检测设备的要求高影响其使用。免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术也是常用的检测技术被广泛使用，但均有其相应的不足，检测反应时间长或灵敏度、准确性和稳定性欠缺是普遍存在的不足。高灵敏度、快速、便捷、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋势，但现有的都无法同时实现上述功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种离心分离免疫层析检测方法及装置。本发明具有灵敏度高、检测时间短、使用便捷、稳定性高、便于储存的特点。
本发明提供一种离心分离免疫层析检测方法，所述方法是以采用离心装置驱动液相在免疫层析固相检测膜中流动，其中所述免疫层析包括以胶体金属为指示剂的胶体金属免疫层析、以荧光素为指示剂的荧光免疫层析和化学发光物质和/或化学发光酶介导发光作为指示剂的化学发光免疫层析的至少一种。
上述的方法中，所述胶体金属为胶体金、胶体硒和胶体金磁微粒中的至少一种；所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶、别藻青蛋白和铕化合物中的至少一种；所述化学发光物质包括鲁米诺和异鲁米诺及其衍生物类、吖啶酯及吖淀酰胺类、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物和三联吡啶钌中的至少一种；所述化学发光酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和黄嘌呤氧化酶中的至少一种。
所述辣根过氧化酶的化学发光底物常用鲁米诺和异鲁米诺及其衍生物类，如异鲁米诺、4-氨基已基-N-乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等，目前常用的产品有PIERCE公司生产的West Pico化学发光检测底物、West Dura化学发光检测底物、West Femto化学发光检测底物。碱性磷酸酶的化学发光底物常用的有(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物、AMPPD、CDP-STAR、Lumi-Phos 530。黄嘌呤氧化酶的化学发光底物有黄嘌呤、杨梅酮、槲皮素。
上述的免疫层析化学发光检测方法中，还包括非酶促化学发光底物，即直接化学发光物质，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridinium ester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂（NaOH、H2O2）作用而发光，主要有吖啶酯及吖淀酰胺类、三联吡啶钌等。
上述的方法中，所述固相检测膜包括硝酸纤维素膜、PVDF膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、DEAE纤维素膜的一种或组合。
上述的方法中，所述方法是以微粒作为所述指示剂的承载载体；所述承载载体承载所述指示剂的方式采用以所述指示剂直接标记的待检物特异性直接结合物或待检物特异性间接结合物标记所述微粒或以带有所述指示剂的所述微粒直接标记待检物特异性直接结合物或待检物特异性间接结合物；所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述指示剂形成非特异性结合并维持稳定的颗粒，所述微粒的粒径选择1nm-1um，具体可为10~800 nm、20~600 nm 或43~500 nm；所述特异性结合物包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物。目前常用的微粒有胶体金微粒、胶体硒微粒、胶体金磁微粒、荧光微球、磁性微粒、金磁微粒、凝胶微粒、乳胶微粒、塑料微球、微球硅胶、琼脂糖微粒、聚苯乙烯微粒、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、羧基微球、氯甲基微球等。
上述的方法中，所述液相包括含有待检物的液相、用所述指示剂标记的检测物的液相、用所述微粒标记的检测物的液相、非标记的检测物的液相、清洗液相的一种或组合；所述检测物为待检物特异性结合物及其二级或三级特异性结合物，所述特异性结合物包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物。
上述的方法中，所述方法还含有所述固相检测膜封闭液，所述封闭液为含有牛血清白蛋白以及其它可溶性蛋白质、脱脂奶粉、聚乙二醇、酪蛋白、蔗糖、表面活性剂、明胶、血清、血浆中的至少一种的缓冲盐溶液，包括以下使用步骤：
1）采用固相检测膜包被液包被所述固相检测膜，所述固相检测膜包被液包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物的溶液；
2）采用所述清洗液清洗所述固相检测膜，所述清洗液包括水、常规缓冲液及其含有表面活性剂的缓冲溶液；
3）用所述封闭液浸沁覆盖所述固相检测膜；
4）用所述清洗液再次清洗所述固相检测膜；
5）干燥，备用。
一种离心分离检测装置包括进样部件和离心装置；所述离心装置包括由驱动电机驱动的离心转子和支撑底座，所述离心转子以所述支撑底座为支撑；所述进样部件不与离心转子直接连接，设于离心转子的上方、下方或外侧；所述进样部件包括液相储存装置、进样管和进样泵；所述液相储存装置与所述进样管相连通；所述进样泵驱动所述液相储存装置中的液体进入所述进样管；所述进样管直接或间接加载所述液相至所述固相检测膜的近心一侧上；所述固相检测膜被置于所述离心转子上离心。
上述的装置中，所述固相膜置于固相膜固定装置中，所述固相膜固定装置选自固相膜支撑底片样部件、侧向流试纸条扣卡样部件和透明质包埋式部件中至少一种，且所述固相膜固定装置安置于所述离心转子上；所述固相膜固定装置与所述离心转子为可拆装式结构。
上述的装置中，所述装置含有检测器，包括胶体金定量检测器、荧光检测器、化学发光检测器的一种或组合，所述检测器的检测指标包括吸光度、荧光值、化学发光值和图像数字信号值中的任一种或组合。
上述的装置中，所述离心装置的转速和所述进样装置的进样速度均采用程序控制方式；所述离心装置的转速为200~10000 r/min，具体可为500~5000 转/分钟、800~3000转/分钟或800~2000 转/分钟。
上述的方法或装置中任一项所述方法或所述装置在免疫检测方法产品开发中的应用。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明采用离心装置驱动检测的液相在固相检测膜上流动以及清洗，提高了待检物的捕获结合能力，降低了固相检测膜的背景噪声干扰，提高方法检测灵敏度，实现了以现有检测试剂的高灵敏度检测。
2、本发明采用离心装置驱动检测的液相在固相检测膜上流动，改变了现有的膜检测方法依靠自然流动且液体随着在膜上流程的延长而降低的现状，能够保持液体在膜上匀速流动，保证了待检物在膜上结合的均一性，可提高检测准确性。
3、现有膜检测方法依靠自然流动，液体在膜上的流动速度随着时间而减慢，完成一项检测一般需要15分钟以上的时间。而本发明采用离心装置驱动检测液相在固相检测膜上流动，保持了液体在膜上匀速流动，缩短了检测时间快速。
4、现有的高灵敏度检测方法，均采用多步骤、多环节驱动控制，涉及检测样本、检测相以及反应载体的换位和移动。而本发明采用离心装置驱动液相流动和进样泵进样，操作步骤简单。
5、直接在现有膜检测方法上采用指示剂标记检测相会产生很强的背景信号，无法进行待检物的检测。本发明封闭液封闭可以明显降低背景信号，离心清洗可以有效地去除背景上残留的游离指示剂标记物和指示剂，有效提高检测效率和准确性。
6、本发明操作步骤简单，易于实现自动化操作。本发明方法具有高灵敏度、全定量、自动化的特点，同时又具有检测快速、使用设备简单的检测方法；不仅使用方便、减少原料的浪费，同时也显著提高工作效率，应用于检测和分析、分离的诸多领域。
附图说明
图1为本发明离心分离检测装置的示意图。
图2为固相膜支撑底片样部件结构示意图。
图3为固相膜的固定器结构示意图。
图4为固相膜与进样部件位置结构示意图。
图5为固相膜固定器透明质上下包埋式部件的结构示意图。
图6为固相膜与超声破碎装置位置结构示意图。
具体实施方式
下述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1、水平型离心分离检测装置的制备
如图1所示，本发明离心分离检测装置包括：进样部件1、固相检测膜2、离心装置（离心转子3；驱动电机5；支撑底座6）和检测器4。同时包括超声破碎装置7和外壳8。进样部件1对应的固相检测膜2的近心端，超声破碎装置7对应于固相检测膜2的检测部位，离心装置有离心转子3、驱动电机5和支撑底座6组成，驱动电机5位于支撑底座6上，离心转子3由驱动电机5驱动旋转。
如图1和图2所示，固相检测膜2于离心转子3的近心端设有与之相连通的液体吸附分散部件9，固相检测膜2于离心转子的远心端设有与之相连通的液体收集部件10，固相检测膜2固定放置于离心转子3的外沿，与离心转子3为可拆装式结构，液体吸附分散部件9为进样部件的液相样品加载部位。其中，固相检测膜2的材料采用硝酸纤维素膜、PVDF膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜和DEAE纤维素膜中的任一种，且固相检测膜2的一面或两面设有背衬；液体吸附分散部件9包括胶体金标记吸附膜、荧光标记抗体吸附膜、化学发光标记吸附膜和分散膜中的至少一种；液体收集装置10采用吸水性材料，如吸水纸和/或吸水凝胶，也可用液体收集容器。
如图2、图3所示，为固定固相检测膜2设置的一种固相检测膜固定装置，如图2中支撑底片11，支撑底片11可选择PVC板、透明塑料板、有机玻璃板等。图3中固相检测膜固定装置为侧向流试纸条扣卡样部件12，具体包括孔状部件13、点样槽14、观察窗15和液体收集部件出口16。将固相检测膜结构放入侧向流试纸条扣卡样结构12后，点样槽14对应部位为液体吸附分散部件9，观察窗15的对应部位为固相检测膜2，液体收集部件出口16对应部位为液体收集部件10（为吸水性材料或液体收集容器）。
如图1和图4所示，进样部件1包括封闭相存储装置17、液相储存装置18、进样泵19和进样管20。封闭相存储装置17和液相储存装置18与进样管20相连通，设于离心转子3的上方，且液相21由进样泵19驱动进入进样管20，然后加至点样槽14。为了控制离心装置的速度和进样装置的进样速度，离心装置和进样部件均与具有程序控制速度的部件相连接。
如图5所示，为固定固相检测膜2设置的另一种固相检测膜固定装置，具体包括硬质透明下盖片22、硬质透明上盖片24、前裸空夹层23和后裸空夹层或液体收集部件10。检测时液相通过离心，经前裸空夹层23，进入液体吸附分散部件9，流经固相检测膜2，反应后的液相从后裸空夹层或液体收集部件10排出。
如图1和图6所示，超声破碎装置7包括超声发生器25、换能器26、变幅杆27和超声破碎容器28，位于固相检测膜2的上方，使用时，变幅杆27下降，切割固相检测膜2的检测区域，推入超声破碎容器28内，超声破碎，然后经检测器检测。为了控制切割和破碎的可控性与一致性，离心装置、进样部件、超声破碎装置和检测器均与具有程序控制速度的部件相连接。
本发明的实验研究：下述实验说明本发明的检测方法及其效果，但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验一、本发明与现行检测方法的检测相关性的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体（美国Genagates公司），抗人肌红蛋白单克隆抗体（美国Genagates公司），分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司，752紫外可见分光光度计），人肌红蛋白（Sigma-Aldrich产品），ＢioFlow印膜仪（美国IMAGENE公司）， Index 切条机（美国Ａ-point公司），DBF -900封口机（温州江南包装厂），ACBO除湿机（江苏无锡奥波除湿机公司），台式离心机（美国Eppendoff 公司），牛血清白蛋白（简称BSA，SIGMA产品），硝酸纤维素膜片（AE 99，由美国Genagates公司提供），多聚酯纤维素膜 (Ｒeemay 2033，美国Alstrom公司产品)，吸水纸膜垫（Grade 470，美国S&S公司产品），氯金酸（SIGMA产品），胶体金定量层析分析仪（挪威Skannex产品）。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液（1%BSA，100mM 甘氨酸，50mM PBS, 150mM NaCl，pH7.4）稀释配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
胶体金标记抗人肌红蛋白单克隆抗体的制备：取10ml纯净水，加热搅拌，待水沸腾时加入500μl 10%氯金酸溶液，加热煮沸5分钟，加入500μl 12%柠檬酸三钠溶液，保持此溶液搅拌沸腾10分钟，自然降温至室温，即胶体金溶液。取胶体金溶液体积10ml，用10%碳酸钾调pH至8.3，迅速加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μg，至10μg/ml终浓度，晃动烧杯混匀，室温放置30分钟，迅速加入10%牛血清白蛋白溶液100ul，使终浓度为1%，同时摇动烧杯，室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟，小心吸出上清液；再加入5ml 50mM磷酸盐(PBS)缓冲液，pH7.4，将沉淀悬浮，12000rpm离心20分钟，吸出上清液，将沉淀溶于1.0ml含有1%的牛血清白蛋白和3%蔗糖的磷酸缓冲液内，4℃避光保存。
胶体金标记吸附膜制备：配制含有0.5%PVA（即聚乙烯醇）、50mM PBS液、0.5%BSA、0.88% NaCl，pH 7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内，室温浸泡１小时，将膜取出，置37℃干燥后密封备用，也可直接作为分散膜使用。取胶体金标记抗体溶液，用胶体缓冲液（1%BSA，3%蔗糖，50mM PBS, pH7.4）稀释至OD530为30，启动印膜仪，装载抗体，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 3.0μl／cm，将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的PVC片（即聚氯乙烯片），开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度0.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥６小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金标记吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成 3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以胶体金标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子（外向倾斜型）内，向胶体金标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置1-15分钟，2000转/分离心1分钟，再向胶体金标记吸附膜上滴加pH7.4的50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，放置于胶体金定量层析分析仪（即检测器）上读取多克隆抗体印迹条带的数字图像，进行图像处理获得相应的色度数值。对照试纸条不做离心处理，在设定的上述相同的静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取相应的色度数值。
实验重复三次，结果取平均值。统计学计算不同预静置时间试纸条的检测值。
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的检测方法测定结果显示本发明技术检测的相关系数r2平均值为0.962，现有技术检测（不做离心处理）的相关系数r2为0.936，P＜0.05，显著优于现有技术的检测结果，说明本发明技术提高了现有技术检测的准确性。实验结果如表1所示。
表1 本发明以胶体金为指示剂的检测结果准确性分析（单位：图像色度值）
时间（分） 技术 3.125 6.25 12.5 25 50 100 r2
1 现行技术 19.8 19.7 23.0 28.8 31.4 43.7 0.928
本发明 8.7 7.4 12.3 16.8 24.8 37.9 0.926
2 现行技术 20.3 21.2 23.3 27.6 38.6 44.0 0.932
本发明 16.5 19.4 26.3 31.8 35.3 39.3 0.965
5 现行技术 34.1 32.1 38.0 42.3 49.1 62.6 0.902
本发明 23.0 24.3 29.0 38.9 54.8 65.3 0.962
10 现行技术 32.3 31.4 40.1 45.9 61.7 73.8 0.947
本发明 24.9 29.3 42.3 48.2 61.4 73.1 0.985
15 现行技术 33.2 33.5 43.1 54.3 64.7 76.7 0.972
本发明 26.1 35.3 45.2 58.1 65.3 74.7 0.971
实验二、本发明与现行检测方法的最低检出量的比较
一、实验材料
同实验一
二、实验方法
同实验一
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的测定结果，分析采用相关产品开发常用的相关系数r值大于0.98的要求对数据进行了统计处理，以r值大于0.98时的最小值定为最低检出量。结果同样的实验条件下，预静置时间2-10分钟，采用现有技术的最低检出量为6.25ng/ml，采用本发明的最低检出量均为3.125ng/ml，检测灵敏度显著高于现有技术，说明本发明技术提高了现有技术检测的检测灵敏度。实验结果如表2所示。
表2 本发明以胶体金为指示剂的检测灵敏度分析（单位：图像色度值）
时间（分） 技术 3.125 6.25 12.5 25 50 100 r2 最低检出量
1 现行技术 19.7 23.0 28.8 31.4 43.7 0.970 6.25
本发明 7.4 12.3 16.8 24.8 37.9 0.995 6.25
2 现行技术 21.2 23.3 27.6 38.6 44.0 0.963 6.25
本发明 16.5 19.4 26.3 31.8 35.3 39.3 0.966 3.125
5 现行技术 32.1 38.0 42.3 49.1 62.6 0.981 6.25
本发明 23.0 24.3 29.0 38.9 54.8 65.3 0.962 3.125
10 现行技术 31.4 40.1 45.9 61.7 73.8 0.991 6.25
本发明 24.9 29.3 42.3 48.2 61.4 73.1 0.986 3.125
15 现行技术 33.2 33.5 43.1 54.3 64.7 76.7 0.972 3.125
本发明 26.1 35.3 45.2 58.1 65.3 74.7 0.971 3.125
实验三、本发明对检测特异性的影响
一、实验材料
同实验一
二、实验方法
同实验一，配制人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml，同样的实验条件下，预静置时间5分钟。
制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，分别采用本发明和现行检测方法检测并绘制标准曲线。
特异性检测所用样品为A：50ng/ml肌红蛋白、B：10ng/ml肌钙蛋白I、C：30ng/ml肌酸激酶同工酶、D：80mg/ml 人血清白蛋白、E：20mg/ml 胆固醇。用样品稀释缓冲液配制。
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的检测上述特异性检测样品，实验结果如表3所示，现行技术和本发明技术对肌红蛋白样品重复检测平均值分别为51和49ng/ml，其它不含有肌红蛋白的样品的检测值在检测方法的检测灵敏度下限以下，均为阴性，且无明显的显色反应。说明本发明不影响检测特异性。
表3 本发明与现行技术检测肌红蛋白特异性的结果比较（单位：ng/ml）
样品 技术 重复1 重复2 重复3 平均值
A 现行技术 58 52 43 51
本发明 55 48 44 49
B 现行技术 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25
本发明 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125
C 现行技术 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25
本发明 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125
D 现行技术 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25
本发明 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125
E 现行技术 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25 ＜6.25
本发明 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125 ＜3.125
实验四、本发明与现行化学发光检测方法的检测性能的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体（Genagates公司）、辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体（美国Genagates公司）、磁微粒（MP-COOH-20020，郑州英诺生物科技有限公司）、pico发光试剂（Thermo scientific）、化学发光检测仪（Promega, Glomax Multi JR DetectionSystem）、人肌红蛋白（Sigma-Aldrich产品）、ＢioFlow印膜仪（美国IMAGENE公司）， Index切条机（美国Ａ－point公司），ＤＢＦ－900封口机（温州江南包装厂），ACBO除湿机（江苏无锡奥波除湿机公司），台式离心机（美国Eppendoff 公司），牛血清白蛋白（SIGMA产品），硝酸纤维素膜片（AE 99，由美国Genagates公司提供）,多聚酯纤维素膜 (Ｒeemay 2033，美国Alstrom公司产品)，吸水纸膜垫（Grade 470，美国Ｓ&Ｓ公司产品）。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
1、现行化学发光检测方法组
磁微粒的标记，采用常规标记方法，用1mg/ml抗人肌红蛋白多克隆抗体对磁微粒进行标记，抗人肌红蛋白多克隆抗体和磁微粒的用量比（w/w）为3:1。各浓度检测取三个平行管，每管加入用抗人肌红蛋白多克隆抗体标记的磁微粒100μl，再分别加入浓度为对应浓度的人肌红蛋白溶液各100μl，结合反应在37℃震摇温育60分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS 200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体200μl，结合反应在37℃震摇温育60分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS 200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，转移磁微粒至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
2、本发明组
多聚酯纤维素膜预处理同实验一，置37℃干燥后密封备用。
本发明未封闭组多克隆抗体印膜同实验一，置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
本发明封闭组多克隆抗体印膜进行同实验一的处理，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥1小时。配制封闭液（5%脱脂奶粉、3％BSA、0.05% tween20、0.8%NaCl、0.02% KCL，pH7.4），将处理后的多克隆抗体印膜置于封闭液内，室温静置30分钟，取出放入37℃干燥箱内，干燥6小时。
化学发光标记吸附膜的制备：取预处理的多聚酯纤维素膜，用50mM PBS缓冲液(pH 7.4)稀释辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体0.15mg/ml，启动印膜仪，装载抗体，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 3.0μl／cm，将印制后的膜冷冻干燥，置4℃密封保存备用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及化学发光标记吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以化学发光标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向化学发光标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置3分钟，2000转/分离心1分钟，再向化学发光标记吸附膜上滴加pH7.4的含有1%吐温20的PBS缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，重复清洗2次，取出试纸条，切取多克隆抗体印膜检测线，放置于透明试管内，加入PBS缓冲液200ul，超声破碎3秒。取10ul，加入Pico发光试剂，置于化学发光检测仪上，反应进行2分钟时记取发光量， 发光量积分时间为6秒，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
采用本发明以化学发光检测方法和现行化学发光检测方法对人肌红蛋白溶液进行检测，实验结果如表4所示，由表4可知，两者均呈现良好的浓度线性关系，相关系数r2值分别为0.974和0.901，但未封闭组的相关系数r2值为0.75。说明本发明封闭组具有与现行化学发光技术相似的检测效果，但显著缩短了检测时间，未封闭组的本底信号较高，影响检测。
表4 本发明与现行化学发光检测方法的检测性能的比较（单位：发光值）
浓度（ng/ml） 本发明封闭 现有技术 本发明未封闭
3.125 95380 661292 1161292
6.25 112336 783025 1283025
12.5 329378 821436 1121436
25 956238 1123185 1323185
50 1608326 2234590 2420395
100 3082607 3411312 3518320
r2值 0.974 0.901 0.750
实验五、本发明微球介导的化学发光检测实验
以荧光微球为检测反应运载载体。
一、实验材料
荧光微球（上海杰一生物），海藻糖（SIGMA），硝酸纤维素膜（Millipore 公司），EDC（PIERCE公司），NHS（PIERCE公司），辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体（美国Genagates公司），抗人肌红蛋白多克隆抗体（美国Genagates公司），分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司，752紫外可见分光光度计），人肌红蛋白（Sigma-Aldrich产品），ＢioFlow印膜仪（美国IMAGENE公司）， Index 切条机（美国Ａ-point公司），DBF-900封口机（温州江南包装厂），ACBO除湿机（江苏无锡奥波除湿机公司），台式离心机（美国Eppendoff公司），牛血清白蛋白（简称BSA，SIGMA产品），硝酸纤维素膜片（AE 99，由美国Genagates公司提供），多聚酯纤维素膜 (Ｒeemay 2033，美国Alstrom公司产品)，吸水纸膜垫（Grade470，美国S&S公司产品），化学发光检测仪（Promega, Glomax Multi JR DetectionSystem），West Pico发光试剂（Thermo scientific）。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
荧光微球标记：取0.5ml微球，使用pH6.2的0.1M 磷酸缓冲液离心清洗4次，13000rpm离心，用pH6.2的0.1M 磷酸缓冲液复溶至1ml，加入2mg辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体，混匀，加入250ul的40mg/ml的EDC溶液，加入250ul 40mg/ml的NHS溶液，混匀，室温反应60分钟，加入20mg的牛血清白蛋白，混匀，室温反应60分钟。离心吸弃上清，使用0.05M Tris pH7.6离心清洗4次后，用0.5%海藻糖、1%BSA、0.05M Tris pH7.6复溶至10ml，4℃避光保存待用。
荧光微球标记吸附膜制备：取荧光微球标记抗体溶液，用复溶液稀释3倍，其它同实验一胶体金标记吸附膜制备中的印膜方法。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以荧光微球标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置3分钟，以1000转/分离心1分钟，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，清洗两次，取出试纸条，切取多克隆抗体印膜检测线，放置于透明试管内，加入PBS缓冲液200ul，超声破碎3秒。取10ul，加入Pico发光试剂，置于化学发光检测仪上，反应进行2分钟时记取发光量， 发光量积分时间为6秒，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向荧光微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待荧光微球标记吸附膜上的液体全部层析流入硝酸纤维素膜，再向荧光微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，清洗两次，取下试纸条，切取多克隆抗体印膜检测线，放置于透明试管内，加入PBS缓冲液200ul，超声破碎3秒。取10ul，加入Pico发光试剂，置于化学发光检测仪上，反应进行2分钟时记取发光量， 发光量积分时间为6秒，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本实验以荧光微球为液相反应运载载体进行检测，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为4.6分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为49分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r2为0.987，对照组检测数据在50ng/ml以下，基本没有浓度-发光值的相关性，主要由于化学发光物质在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗，导致本底过高有关，相关系数r2为0.711，P＜0.05，本发明结果显著优于不做离心处理的检测结果，说明本发明技术提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表5所示。
表5 本发明免疫层析化学发光检测实验结果（单位：发光值）
技术 3.125 6.25 12.5 25 50 100 r2
实验组 80235 182278 387126 1232961 1782785 3672463 0.987
对照组 1261453 1288604 1322169 1297865 2321226 4120437 0.711
实验六、本发明与现行化学发光检测方法检测结果的比较
一、实验材料
同实验五。
二、实验方法
制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，采用本发明化学发光检测方法检测并绘制标准曲线。以已知浓度的人肌红蛋白30ng/ml作为待检样本。其它方法同实验五实验组。
三、实验结果
三次重复实验的具体结果如表6所示。本发明离心技术测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为30.95ng/ml，具有良好的重复性和准确性。
表6 本发明化学发光检测方法检测性能实验（单位：ng/ml）
重复1 重复2 重复3 平均值
离心 28.76 29.55 34.55 30.95
实验七、本发明与现行荧光免疫检测方法检测性能的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体（Genagates公司）、抗人肌红蛋白单克隆抗体（美国Genagates公司）、荧光微球（所用荧光素为铕化合物，上海杰一生物公司）、EDC （Pierce产品）、NHS（Pierce产品）、人肌红蛋白（Sigma-Aldrich产品）、荧光定量分析仪（上海巾帼生物公司，HG-98）、ＢioFlow印膜仪（美国IMAGENE公司），Index 切条机（美国Ａ－point公司），ＤＢＦ－900封口机（温州江南包装厂），ACBO除湿机（江苏无锡奥波除湿机公司），台式离心机（美国Eppendoff 公司），牛血清白蛋白（SIGMA产品），硝酸纤维素膜片（AE 99，由美国Genagates公司提供），多聚酯纤维素膜 (Ｒeemay 2033，美国Alstrom公司产品)，吸水纸膜垫（Grade 470，美国Ｓ&Ｓ公司产品）。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
荧光微球标记：取0.5ml荧光微球，使用PH6.2的0.1M PB离心清洗4次，13000rpm离心，用pH6.2的0.1M PB复溶至1ml，加入150ug抗人肌红蛋白单克隆抗体，混匀，加入pH6.2的0.1M PB 至1.5ml，加入250ul的40mg/ml的EDC水溶液，加入250ul 40mg/ml的NHS水溶液，混匀，室温反应60分钟。加入20mg的BSA，混匀，室温反应60分钟。离心吸弃上清，使用0.05MTris pH7.6离心清洗4次后，用1%BSA 、0.05M Tris pH7.6复溶至10ml待用，4℃保存。
荧光标记抗体吸附膜的制备：配制含有0.5%PVA、50mM PBS液、0.5%BSA、0.88%NaCl，pH 7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内，室温浸泡１小时，将膜取出，置37℃干燥后密封备用。取荧光微球标记抗体溶液，用1%BSA 、0.05MTris pH7.6缓冲液稀释3倍，启动印膜仪，装载抗体，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm，将印制后的膜，放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的PVC片，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥６小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及荧光标记抗体吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成 3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置3分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加pH7.4的PBS缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印迹条带的荧光值。
现行技术对照试纸条不做离心处理，在设定的3分钟静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取荧光值。
实验重复三次，结果取平均值。
三、实验结果
具体结果如表7所示。本发明技术经如上操作，线性反应良好，相关系数r2值为0.994。采用现有技术测定，点样后静置3分，再静置2.5分，线性不佳，12.5ng/ml以下的样品，其发光量接近本底水平，相关系数r2值为0.900。
表7 本发明与现行免疫荧光检测方法的检测性能的比较（单位：发光值）
浓度（ng/ml） 本发明 现有技术
3.125 18820 84125
6.25 45323 87873
12.5 97832 92451
25 152371 186782
50 324569 317653
100 632872 587749
r2 0.994 0.900
实验八、本发明与现行免疫荧光检测方法检测结果的比较
一、实验材料
羊抗鼠IgG多克隆抗体（美国Genagates 公司提供），其它同实验七。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。配制20ng/ml已知浓度的人肌红蛋白待检样品。
制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，分别采用本发明和现行技术检测并绘制标准曲线。
荧光微球标记：同实验七。
荧光微球膜的印制：同实验七。
荧光标记抗体吸附膜的制备：同实验七。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。取羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液，用50mM磷酸缓冲液 (pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的PVC片，开始印膜，同一硝酸纤维素膜上印制抗人肌红蛋白多克隆抗体作为检测线T、羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线C，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥６小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：同实验七。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置3分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加pH7.4的PBS缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印制膜上检测线T和质控线C的荧光值，并计算T/C比值，绘制标准曲线，计算待检样品肌红蛋白浓度。
现行技术对照试纸条不做离心处理，在设定的静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取荧光值，并计算T/C比值，绘制标准曲线，计算待检样品肌红蛋白浓度。
实验重复三次，结果取平均值。
三、实验结果
本发明技术经如上操作，标准曲线线性良好，相关系数r2值为0.995，随即进行了样品测定，三次实验平均19.12 ng/ml，符合要求。采用现有技术测定，点样后静置3分，再静置2.5分，检测标准曲线线性不佳，相关系数r2值为0.937。随后将总的点样后静置时间延长至现行产品检测的15分钟，标准曲线线性良好，相关系数r2值为0.961，随即按照15分钟的条件进行了样品测定，三次平均值为20.84ng/ml，符合要求。三次重复实验的具体结果如表8所示。与现有技术比较，本发明显著缩短了检测时间。
表8 本发明以免疫荧光检测方法的检测结果分析（单位：ng/ml）
重复1 重复2 重复3 平均值
本发明 16.98 21.22 19.17 19.12
现有技术 22.35 21.21 18.97 20.84
实验九、本发明荧光检测与现行酶联免疫检测方法检测结果的比较
一、实验材料
酶联免疫检测仪（Bio-Rad, Model 550）、健康人血清（健康自愿者捐赠），其它同实验七。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
以已知浓度的16.1ng/ml人肌红蛋白健康人血清作为待检样品。
制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，分别采用本发明荧光检测与现行酶联免疫检测方法检测人肌红蛋白溶液并绘制标准曲线，然后取待检样品测定，用标准曲线计算待检样品中肌红蛋白的浓度。每个样品做3个平行管。
1、现行酶联免疫检测方法组
采用96孔酶联板，每管加入抗人肌红蛋白多克隆抗体100μl，4℃过夜包被，清洗三次，再分别加入人肌红蛋白溶液或待检样品100μl，结合反应在37℃温育120分钟，清洗三次，加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μl，结合反应在37℃温育60分钟，清洗三次，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG多克隆抗体100μl，结合反应在37℃温育60分钟，清洗三次，弃上清，加入100μl显色液（配方：0.1M柠檬酸2.43ml，0.2M磷酸氢二钠2.57ml，邻苯二胺5mg，过氧化氢5μl），避光5分钟，加入2M硫酸终止反应。置酶联免疫检测仪上读取OD490吸光值，绘制标准曲线，r2=0.991，计算待检样品中人肌红蛋白含量。
2、本发明组
荧光微球标记：同实验七。
荧光微球膜的印制：同实验七。
荧光标记抗体吸附膜的制备：同实验七。
多克隆抗体印膜制备：同实验八。
半成品组装方法：同实验七。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置3分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加pH7.4的PBS缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印印制膜上检测线T和质控线C的荧光值，并计算T/C比值，绘制标准曲线，r2=0.987，计算待检样品肌红蛋白浓度。
三、实验结果
具体结果如表9所示。现行酶联免疫检测方法测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为16.54ng/ml，本发明测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为16.91ng/ml，两种实验方法所得结果基本一致，无统计学差异（P>0.05），但本发明的完成实验时间明显短于现行技术。
表9 本发明荧光检测与现行酶联免疫检测方法检测结果的比较（单位：ng/ml）
重复1 重复2 重复3 平均值
现行技术 18.72 17.28 13.63 16.54
本发明 15.44 18.91 16.37 16.91
实验十、本发明离心速度对检测结果的影响
一、实验材料
同实验1
二、实验方法
同实验1，预静置3分钟。
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂，采用不同离心速度，检测了不同浓度的人肌红蛋白样品，实验结果如表10所示。由表10可知，检测准确性与离心速度有关，500、1000、2000、3000、4000转/分的离心速度获得符合要求的检测结果，相关系数r值均大于0.98。4000、5000转/分的离心速度获得的检测结果，其相关系数r值均低于0.98，没有达到相关检测要求。说明本发明进行肌红蛋白检测的最佳离心速度应在3000转/分以下。
表10 离心速度对检测结果的影响
离心速度 3.125 6.25 12.5 25 50 100 r2
500r/min 30.2 34.7 40.7 49.2 63.8 78.5 0.988
1000r/min 29.7 32.0 38.9 50.6 61.8 79.8 0.980
2000r/min 28.8 33.5 38.0 46.8 56.4 82.4 0.962
3000r/min 28.1 33.2 37.7 49.2 56.4 74.3 0.987
4000r/min 19.2 24.8 26.6 28.4 34.7 66.9 0.835
5000r/min 19.8 21.5 26.4 28.1 34.2 62.0 0.864
实验十一、本发明微粒粒径对检测结果的影响
以聚苯乙烯微球为液相反应运载载体。
一、实验材料
聚苯乙烯微球（粒径35、130、376、600、1000nm，羧基化，上海涛宇国际），其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一。
抗人肌红蛋白单克隆抗体FITC标记：采用Marsshall法，取3mg/ml抗人肌红蛋白单克隆抗体溶液，加入1/10体积的0.5M（pH9.0）碳酸盐缓冲液，电磁搅拌5分钟。用50mM磷酸盐（PBS），pH8.0缓冲液配制浓度为1mg/ml FITC溶液，以30ul/ml的量在搅拌状态下缓慢加入抗体溶液内，4℃避光搅拌12小时。将标记的抗体溶液离心（2500r/min）20分钟，除去沉淀物，装入透析袋中，置于50mM PBS缓冲液4℃透析过夜。取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25柱，分离游离FITC，收集标记的荧光抗体，即FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体，-20℃避光保存备用。
聚苯乙烯微球标记：取2ml 0.1M MES，pH5.0溶液、FITC标记抗人肌红蛋白单克隆抗体2mg、0.2ml 的5% w/v微球和20mg EDC，混匀，加入10mg NHS，室温下在旋转混合器振荡器上放置2小时，12000rpm离心15分钟，弃上清，加2ml 20mM PBS、1%BSA的封闭缓冲液室温封闭1小时，加4ml 50mM PBS，pH7.4缓冲液混悬，重复清洗一次，加入2ml 50mM PBS缓冲液，4℃保存备用。
聚苯乙烯微球标记吸附膜制备：取聚苯乙烯微球标记抗体溶液，用50mM PBS，pH7.4缓冲液稀释至1% w/v微球，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm，将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：同实验一。
半成品组装方法：同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以聚苯乙烯微球标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向聚苯乙烯微球标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置3分钟，以1000转/分离心1分钟，再向聚苯乙烯微球标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于荧光检测仪上读取荧光值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-发光曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本发明以聚苯乙烯微球为液相反应运载载体，观察不同粒径对实验结果的影响。结果，本发明粒径为35、130、376、600、1000nm的检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系，相关系数r均大于0.98，说明不同粒径的微粒适用于本发明技术。实验结果如表11所示。
表11 本发明微粒粒径对检测结果的影响（单位：发光值）
粒径（nm) 3.125 6.25 12.5 25 50 100 r2
35 83160 113520 225362 285321 391786 450012 0.955
130 95461 168213 213382 242914 322769 394864 0.950
376 109234 156378 223451 267869 297712 403524 0.967
600 94532 134568 212219 278763 318826 398772 0.964
1000 95674 112367 198756 287964 312278 412344 0.956
实验十二、本发明清洗步骤对检测结果的影响
一、实验材料
同实验一。
二、实验方法
对照实验清洗步骤静置，不清洗。其它同实验一。
三、实验结果
实验结果如表12所示。两实验组结果比较，清洗的检测结果优于不清洗，相关系数r2值分别为0.968含0.943。说明实验进样后伴有清洗的步骤是必要的。
表12 本发明清洗步骤对检测结果的影响（单位：图像色度值）
浓度（ng/ml） 清洗 非清洗
3.125 20.3 29.6
6.25 22.2 28.7
12.5 24.3 33.5
25 31.1 37.1
50 38.6 41.4
100 47.7 48.6
r2 0.968 0.943
实验十三、亲和素生物素放大系统对本发明检测性能的影响
以胶体金微粒为液相反应运载载体。
一、实验材料
NHS活化生物素（SIGMA）、亲和素（SIGMA），其它同实验一。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：同实验一，浓度为0.1、1、3.13、6.25、12.5、25、50、100ng/ml。
抗人肌红蛋白多克隆抗体生物素标记：取抗人肌红蛋白多克隆抗体在0.1M pH9.5碳酸钠缓冲液中透析过夜，调终浓度为2mg/ml。取NHS活化生物素20mg溶解于1ml二甲基甲酰胺，取50ul，加入到上述溶液中，室温反应4小时。将反应液于PBS缓冲液过夜透析，-20℃保存。
胶体金微粒标记：同实验一。
胶体金微粒标记吸附膜制备：取胶体金微粒标记抗体溶液，用胶体缓冲液（1%BSA，3%蔗糖，50mM PBS, pH7.4）稀释至OD530为30，加入生物素标记抗人肌红蛋白多克隆抗体10μg/ml，混匀。其它同实验一。
亲和素印膜制备：取亲和素溶液，用50mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载亲和素溶液，其它同实验一。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，在亲和素印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金微粒标记吸附膜，其它同实验一。
实验组：取上述制备的试纸条，以胶体金微粒标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置3分钟，以1000转/分离心1分钟，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，2000转/分离心30秒清洗，取出试纸条，放置于胶体金定量层析分析仪上读取色度值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-色度值曲线，并计算相关系数。
对照组：取上述制备的试纸条，置于桌面，向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置，待胶体金微粒标记吸附膜上的红色胶体金微粒标记物全部层析流入硝酸纤维素膜，再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul，静置，液体全部流入硝酸纤维素膜，取下试纸条，放置于胶体金定量层析分析仪上读取色度值，实验重复三次，结果取平均值，然后绘制浓度-色度值曲线，并计算相关系数。
三、实验结果
本发明以胶体金微粒为液相反应运载载体，结果，本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为3.7分钟，对照检测组（不做离心处理）试纸条单次检测处理时间平均为38分钟；本发明实验组检测数据呈良好的浓度-色度值的相关关系，相关系数r2为0.973，线性检测范围为0.1-100 ng/ml；对照组检测的相关性r2为0.902，未达到r大于0.98的检测要求，但当将线性检测范围调整为3.125-100 ng/ml时，相关系数r2为0.973，达到了r大于0.98的检测要求。实验结果说明，本发明技术不仅缩短了检测时间，同时提高了现有技术检测的灵敏度和准确性。实验结果如表13所示。
表13亲和素生物素放大系统对本发明检测性能的影响（单位：色度值）
浓度（ng/ml） 放大 不放大
0.1 10.2 12.6
1 16.4 13.8
3.125 18.6 16.8
6.25 22.8 24.5
12.5 24.5 35.0
25 29.7 38.6
50 40.2 48.2
100 46.8 56.4
r2 0.973 0.902

Claims (10)

1.一种离心分离检测方法，所述方法是以采用离心装置驱动液相在免疫层析固相检测膜中流动，其中所述免疫层析包括以胶体金属为指示剂的胶体金属免疫层析、以荧光素为指示剂的荧光免疫层析和化学发光物质和/或化学发光酶介导发光作为指示剂的化学发光免疫层析的至少一种。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述胶体金属为胶体金、胶体硒和胶体金磁微粒中的至少一种；所述荧光素包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶、别藻青蛋白和铕化合物中的至少一种；所述化学发光物质包括鲁米诺和异鲁米诺及其衍生物类、吖啶酯及吖淀酰胺类、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物和三联吡啶钌中的至少一种；所述化学发光酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和黄嘌呤氧化酶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述固相检测膜包括硝酸纤维素膜、PVDF膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、DEAE纤维素膜的一种或组合。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述方法是以微粒作为所述指示剂的承载载体；所述承载载体承载所述指示剂的方式采用以所述指示剂直接标记的待检物特异性直接结合物或待检物特异性间接结合物标记所述微粒或以带有所述指示剂的所述微粒直接标记待检物特异性直接结合物或待检物特异性间接结合物；所述微粒为能够直接和/或通过化学交联方式与蛋白质和/或所述指示剂形成非特异性结合并维持稳定的颗粒，所述微粒的粒径选择1nm-1um；所述特异性结合物包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述液相包括含有待检物的液相、用所述指示剂标记的检测物的液相、用所述微粒标记的检测物的液相、非标记的检测物的液相、清洗液相的一种或组合；所述检测物为待检物特异性结合物及其二级或三级特异性结合物，所述特异性结合物包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述方法还含有所述固相检测膜封闭液，所述封闭液为含有牛血清白蛋白以及其它可溶性蛋白质、脱脂奶粉、聚乙二醇、酪蛋白、蔗糖、表面活性剂、明胶、血清、血浆中的至少一种的缓冲盐溶液，包括以下使用步骤：
1）采用固相检测膜包被液包被所述固相检测膜，所述固相检测膜包被液包括抗原、抗体、亲和素、生物素及其衍生物的溶液；
2）采用所述清洗液清洗所述固相检测膜，所述清洗液包括水、常规缓冲液及其含有表面活性剂的缓冲溶液；
3）用所述封闭液浸沁覆盖所述固相检测膜；
4）用所述清洗液再次清洗所述固相检测膜；
5）干燥，备用。
7.一种离心分离检测装置包括进样部件和离心装置；所述离心装置包括由驱动电机驱动的离心转子和支撑底座，所述离心转子以所述支撑底座为支撑；所述进样部件不与离心转子直接连接，设于离心转子的上方、下方或外侧；所述进样部件包括液相储存装置、进样管和进样泵；所述液相储存装置与所述进样管相连通；所述进样泵驱动所述液相储存装置中的液体进入所述进样管；所述进样管直接或间接加载所述液相至所述固相检测膜的近心一侧上；所述固相检测膜被置于所述离心转子上离心。
8.根据权利要求7所述装置，其特征在于：所述装置含有检测器，包括胶体金定量检测器、荧光检测器、化学发光检测器的一种或组合，所述检测器的检测指标包括吸光度、荧光值、化学发光值和图像数字信号值中的任一种或组合。
9.根据权利要求7或8所述装置，其特征在于：所述离心装置的转速和所述进样装置的进样速度均采用程序控制方式；所述离心装置的转速为200~10000 r/min。
10.权利要求1-9中任一项所述方法或所述装置在免疫检测技术产品开发中的应用。
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