发明内容
本发明的目的是提供一种离心分离检测装置,本发明离心分离检测装置具有检测速度快、高灵敏度、使用方便的特点。
本发明提供的离心分离检测装置,它包括进样部件、固相膜、离心装置和检测器;
所述离心装置包括由驱动电机驱动的离心转子和支撑底座,所述离心转子以所述支撑底座为支撑;
所述进样部件不与离心转子直接连接,设于离心转子的上方、下方或外侧;所述进样部件包括液相储存装置、进样管和进样泵;所述液相储存装置与所述进样管相连通;所述进样泵驱动所述液相储存装置中的液体进入所述进样管;
所述固相膜设于所述离心转子上,通过所述进样管直接或间接加载所述液相样本至所述固相膜的近心一侧上;
所述检测器不与离心转子直接连接,设于离心转子的上方、下方或外侧。
上述的离心分离检测装置中,所述固相膜置于固相膜固定装置中,所述固相膜固定装置选自固相膜支撑底片样部件、侧向流试纸条扣卡样部件和透明质包埋式部件中至少一种,且所述固相膜固定装置安置于所述离心转子上;所述固相膜固定装置与所述离心转子为可拆装式结构。
上述的离心分离检测装置中,所述透明质包埋式部件为所述固相膜的上下至少一侧由透明材料覆盖,所述固相膜对应侧的所述透明材料的面积大于或等于所述固相膜的面积。
上述的离心分离检测装置中,所述进样装置由一个以上排列设置;所述进样管可以进行上下左右移动。
上述的离心分离检测装置中,所述离心分离检测装置还包含有超声破碎装置;所述超声破碎装置包括超声发生器、换能器、变幅杆和超声破碎容器,设置于离心转子的上方、下方或外侧。
上述的离心分离检测装置中,所述固相膜于所述离心转子的近心端还设有与之相连通的液体吸附分散部件,所述固相膜于所述离心转子的远心端设有与之相连通的液体收集部件,所述液体吸附分散部件为所述进样管的液相加载部位。
上述的离心分离检测装置中,所述液相储存装置包括待检样品储存装置和检测相储存装置;所述待检样品储存装置和所述检测相储存装置均与所述进样管相连通,且均由所述进样泵驱动。
上述的离心分离检测装置中,所述液相储存装置还包括清洗液储存装置,所述清洗液储存装置与所述进样管相连通,且由所述进样泵驱动。
上述的离心分离检测装置中,所述离心转子采用平面型或由中心向外倾斜型;所述离心装置设有一外壳。
上述的离心分离检测装置中,在所述离心转子上设有固相膜放置装置,所述固相膜放置装置包括旋转移动式放置装置和/或槽形挤压式放置装置;所述旋转移动式放置装置为在所述离心转子上设置的柱状凸起的连接装置,所述固相膜固定器上设有与所述柱状凸起的连接装置相匹配的孔状部件。
上述的离心分离检测装置中,所述离心装置、所述进样部件、所述超声破碎装置和所述检测器均设有程序控制装置。
上述的离心分离检测装置中,所述固相膜的材料采用硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜和DEAE纤维素膜中的任一种;
所述液体吸附分散部件包括胶体金标记吸附膜、荧光标记抗体吸附膜、化学发光标记吸附膜、多聚酯纤维分散膜和玻璃纤维分散膜中的至少一种;
所述检测器包括吸光度、荧光、化学发光和图像数字处理的检测器中的任一种。
本发明所述的离心分离检测装置在免疫产品检测中的应用,具体地,所述免疫产品包括抗原、抗体、免疫细胞和化学成分中至少一种。
本发明具有以下优点:
1、本发明以离心装置驱动检测液相在固相膜上流动以及清洗步骤,提高了待检物的捕获结合能力,降低了固相膜的背景噪声干扰,提高检测灵敏度,实现现有检测试剂的高灵敏度检测。
2、本发明的以离心装置驱动检测液相在固相膜上流动,改变了现有的膜检测技术依靠自然流动且液体随着在膜上流程的延长而降低的现状,能够保持液体在膜上匀速流动,保证了待检物在膜上结合的均一性,可提高检测准确性。
3、本发明的以离心装置驱动检测液相在固相膜上流动,保持了液体在膜上匀速流动,缩短了检测时间,克服了现有膜检测技术依靠自然流动、液体在膜上的流动速度随着时间而减慢的问题,完成一项检测一般需要15分钟以上的时间的不足。
4、本发明的以离心装置驱动液体流动和进样泵进样,操作步骤简单,便于开发更为便捷的小型化检测设备,克服了现有的高灵敏度检测技术均采用多步骤、多环节驱动控制,涉及检测样本、检测相以及反应载体的换位和移动的不足。
5、本发明的以离心装置驱动液体流动和进样泵进样,以及检测器与离心装置的一体化设计,操作步骤简单,设备结构简单,易于实现自动化操作。
6、本发明在检测装置上同时安装有超声破碎装置,可以增强结合到固相膜上的检测相的检测清洗能力,提高检测效率。
因此,本发明具有高灵敏度、全定量、自动化的特点,同时又具有检测快速、使用设备简单的检测技术;不仅使用方便、减少原料的浪费,同时也显著提高工作效率,应用于检测和分析、分离的诸多领域。
实施例1、水平型离心分离检测装置的制备
如图1所示,本发明离心分离检测装置包括:进样部件1、固相膜2、离心装置(离心转子3;驱动电机5;支撑底座6)和检测器4。同时包括超声破碎装置7和外壳8。进样部件1对应的固相膜2的近心端,超声破碎装置7对应于固相膜2的检测部位,离心装置有离心转子3、驱动电机5和支撑底座6组成,驱动电机5位于支撑底座6上,离心转子3由驱动电机5驱动旋转。
如图1和图2所示,固相膜2于离心转子3的近心端设有与之相连通的液体吸附分散部件9,固相膜2于离心转子的远心端设有与之相连通的液体收集部件10,固相膜2固定放置于离心转子3的外沿,与离心转子3为可拆装式结构,液体吸附分散部件9为进样部件的液相样品加载部位。其中,固相膜2的材料采用硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜和DEAE纤维素膜中的任一种,且固相膜2的一面或两面设有背衬;液体吸附分散部件9包括胶体金标记吸附膜、荧光标记抗体吸附膜、化学发光标记吸附膜和分散膜中的至少一种;液体收集装置10采用吸水性材料,如吸水纸和/或吸水凝胶,也可用液体收集容器。
如图2、图3所示,为固定固相膜2设置的一种固相膜固定装置,如图2中支撑底片11,支撑底片11可选择PVC板、透明塑料板、有机玻璃板等。图3中固相膜固定装置为侧向流试纸条扣卡样部件12,具体包括孔状部件13、点样槽14、观察窗15和液体收集部件出口16。将固相膜结构放入侧向流试纸条扣卡样结构12后,点样槽14对应部位为液体吸附分散部件9,观察窗15的对应部位为固相膜2,液体收集部件出口16对应部位为液体收集部件10(为吸水性材料或液体收集容器)。
如图4所示,固相膜放置装置采用旋转移动式放置装置,它包括柱状凸起17,柱状凸起17与侧向流试纸条扣卡样部件12上设置的孔状部件13相匹配。柱状凸起17为设置在离心转子3上的柱状结构。使用时将位于离心转子3上的柱状凸起17插入侧向流试纸条扣卡样部件12的孔状部件13内,由进样管20的一端加载液相至点样槽14。离心转子9上应均匀分布有用于通过孔状部件13固定固相膜固定器(如侧向流试纸条扣卡样部件12)的柱状凸起17。
如图1和图5所示,进样部件1包括由液相储存装置18、进样泵19和进样管20。液相储存装置18与进样管20相连通,设于离心转子3的上方,且液相21由进样泵19驱动进入进样管20,然后加至点样槽14。为了控制离心装置的速度和进样装置的进样速度,离心装置和进样部件均与具有程序控制速度的部件相连接。
如图6所示,为固定固相膜2设置的另一种固相膜固定装置,具体包括硬质透明下盖片22、硬质透明上盖片24、前裸空夹层23和后裸空夹层或液体收集部件10。检测时液相通过离心,经前裸空夹层23,进入液体吸附分散部件9,流经固相膜2,反应后的液相从后裸空夹层或液体收集部件10排出。
如图1和图7所示,超声破碎装置7包括超声发生器25、换能器26、变幅杆27和超声破碎容器28,位于固相膜2的上方,使用时,变幅杆27下降,切割固相膜2的检测区域,推入超声破碎容器28内,超声破碎,然后经检测器检测。为了控制切割和破碎的可控性与一致性,离心装置、进样部件、超声破碎装置和检测器均与具有程序控制速度的部件相连接。
本发明的应用实验:下述实验说明本发明的检测方法及其效果,但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实验中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实验一、本发明实施例1中平面型离心分离检测装置的制备及装置的检测效果:
一、装置的制备
1、实验材料
数显低速离心机(额定输出转速4000转/分,功率250w,平面型离心转子,常州易晨仪器定制),创锐注射泵(保定创锐泵业,型号ZS100-16/CR01),超声破碎仪(上海之信仪器,型号JDY-250),纸层析检测卡(常州博闻迪公司产品),人肌红蛋白(Sigma-Aldrich产品)、胶体金定量层析分析仪(挪威Skannex产品),抗人肌红蛋白多克隆抗体(美国Genagates公司),抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国Genagates公司),辣根过氧化酶(HRP,SIGMA产品),分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司,752紫外可见分光光度计),BioFlow印膜仪(美国IMAGENE公司), Index 切条机(美国A-point公司),DBF-900封口机(温州江南包装厂),ACBO除湿机(江苏无锡奥波除湿机公司),台式离心机(美国Eppendorf 公司),牛血清白蛋白(简称BSA,SIGMA产品),硝酸纤维素膜片(MILLIPORE公司),多聚酯纤维素膜 (美国Alstrom公司产品),吸水纸膜垫(美国S&S公司产品),氯金酸(SIGMA产品),化学发光检测仪(Promega, Glomax Multi JR Detection System),West Pico发光试剂(Thermoscientific)。
上述材料对应专利申请请求内容如下,本实验数显低速离心机为平面型离心装置,创锐注射泵为进样部件中的进样泵,超声破碎仪为超声破碎装置,纸层析检测卡为固相膜固定器,胶体金定量层析分析仪为检测器(胶体金),硝酸纤维素膜为固相膜,多聚酯纤维素膜为液体吸附分散部件,吸水纸膜垫为液体收集部件,化学发光检测仪为检测器(化学发光)。
2、实验方法
1)平面型离心分离检测装置的制备:定制的数显低速离心机的离心转子为一平面结构,离心转子平面上面设有放置16个纸层析检测卡的扣卡安置槽,扣卡安置槽对应于纸层析检测卡的观察窗下的离心转子开设有上下贯通的窗口,离心转子的下方是驱动电机和支撑底座。在离心转子的上方对应固定安装16个创锐注射泵,与下方的支撑底座固定。制备超声破碎仪固定支架,将超声破碎仪固定到固定支架上,使变幅杆对应于离心转子开设有上下贯通的窗口,且变幅杆可以上下移动调整位置。在纸层析检测卡的观察窗下层开口,使观察窗为上下贯通窗口结构。将肌红蛋白检测试纸条(见下面的描述)以吸水膜垫(即液体收集部件)向外,胶体金标记吸附膜(即液体吸附分散部件)向内的方向放置在纸层析检测卡,扣上上盖固定,制成肌红蛋白检测卡,放置在离心转子上的扣卡安置槽内并固定。将化学发光检测仪安置在离心检测装置的一侧。即为平面型离心分离检测装置。
2)检测效果测试:
(1)人肌红蛋白溶液的配制:取已知浓度的人肌红蛋白溶液,用样品稀释缓冲液(1%BSA,100mM 甘氨酸,50mM PBS, 150mM NaCl,pH7.4)稀释配置0.1、1.0、10、100、500、1000ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
(2)胶体金微粒标记:取10ml纯净水,加热搅拌,待水沸腾时加入500μl 10%氯金酸溶液,加热煮沸5分钟,加入500μl 12%柠檬酸三钠溶液,保持此溶液搅拌沸腾10分钟,自然降温至室温,即得粒径50nm胶体金微粒溶液。取胶体金溶液体积10ml,用10%碳酸钾调pH至8.3,迅速加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μg,辣根过氧化酶100μg,至各10μg/ml终浓度,晃动烧杯混匀,室温放置30分钟,迅速加入10%牛血清白蛋白溶液100ul,使终浓度为1%,同时摇动烧杯,室温放置30分钟,12000rpm离心20分钟,小心吸出上清液;再加入5ml 50mM磷酸盐(PBS)缓冲液,pH7.4,将沉淀悬浮,12000rpm离心20分钟,吸出上清液,将沉淀溶于1.0ml含有1%的牛血清白蛋白和3%蔗糖的磷酸缓冲液内,4℃避光保存。
(3)胶体金微粒标记吸附膜制备:配制含有0.5%PVA(即聚乙烯醇)、50mM PBS液、0.5%BSA、0.88% NaCl,pH 7.4的多聚酯纤维素膜预处理液,置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内,室温浸泡1小时,将膜取出,置37℃干燥后密封备用,也可直接作为分散膜使用。取胶体金微粒标记抗体溶液,用胶体缓冲液(1%BSA,3%蔗糖,50mM PBS, pH7.4)稀释至OD530为30,启动印膜仪,装载抗体,开启加压氮气,取多聚酯纤维素膜,开始印膜,设定印膜条件为:喷笔移动速度30mm/秒,液体推进速度 5.0μl/cm,将印制后的膜放入干燥箱内,37℃干燥6小时,然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
(4)多克隆抗体印膜制备:取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液,用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪,装载抗体,取贴有硝酸纤维素膜的PVC片(即聚氯乙烯片),开始印膜,设定印膜条件为:喷笔移动速度30mm/秒,液体推进速度1.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内,干燥6小时,然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
(5)半成品组装方法:启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下,在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金微粒标记吸附膜。置粘贴好的检测片于切条机上,切成 3.5mm试纸条。将试纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内,在封口机上封口,加贴标签。
(6)实验组:取上述制备的试纸条,放入观察窗下层开口的纸层析检测卡内固定,以胶体金微粒标记吸附膜的一侧为近心端,置于离心机转子内,启动创锐注射泵,向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul,静置2分钟,以1000转/分离心1分钟,再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul,2000转/分离心30秒清洗,清洗两次。移动超声破碎仪变幅杆,检测卡下方放置含有West Pico化学发光检测底物液的透明的超声破碎容器,挤压切割含有检测线的硝酸纤维素膜,推入超声破碎容器内,超声破碎3秒(60W),静置5分钟,在化学发光检测仪上读取6秒发光量,实验重复三次,结果取平均值,然后绘制浓度-发光曲线,并计算相关系数。
对照组:检测卡不进行离心,置于桌面操作,手工加样,每次加样后静置至液体全部流入硝酸纤维素膜,其它同实验组。
3、实验结果
用本发明离心分离检测装置和现有的常规方法作比较,观察本发明技术和现有技术对检测结果的影响。结果,本发明实验组试纸条单次检测处理时间平均为4.5分钟,对照检测组(不做离心处理)试纸条单次检测处理时间平均为47分钟;本发明实验组检测数据呈良好的浓度-发光值的相关关系,相关系数r为0.976,对照组检测数据在100ng/ml以下,基本没有浓度-发光值的相关性,主要由于化学发光酶在固相膜上的非特异性结合不能被有效地清洗,导致本底过高有关,相关系数r为0.821,P<0.05,本发明结果显著优于不做离心处理的检测结果,说明本发明技术装置提高了现有技术检测的线性和准确性。实验结果如表1所示。
表1 本发明技术装置纸层析化学发光检测实验结果(单位:发光值)
实验二、本发明中心向外倾斜型离心分离检测装置的效果检测
1、实验材料
小型台式离心机(Eppendorf, Minispin,角转子,输出转速1000-10000转/分),创锐注射泵(保定创锐泵业,型号ZS100-16/CR01),超声破碎仪(上海之信仪器,型号JDY-250),胶体金定量层析分析仪(挪威Skannex产品),肌红蛋白胶体金检测卡(常州博闻迪公司产品),人肌红蛋白(Sigma-Aldrich产品,产品目录号为F3879-1G)、胶体金定量层析分析仪(挪威Skannex产品)。
上述材料对应专利申请请求内容如下,本实验数显小型台式离心机为中心向外倾斜型离心装置,创锐注射泵为进样部件中的进样泵,超声破碎仪为超声破碎装置,胶体金定量层析分析仪为检测器(胶体金),肌红蛋白胶体金检测卡为固相膜检测试纸条和固相膜固定器的一体结构,化学发光检测仪为检测器(化学发光)。
2、实验方法
1)平面型离心分离检测装置的制备:采用小型台式离心机代替数显低速离心机,其它同实验一。
2)检测效果测试:
(1)人肌红蛋白溶液的配制:取已知浓度的人肌红蛋白溶液,用样品稀释缓冲液(1%BSA,100mM 甘氨酸,50mM PBS, 150mM NaCl,pH7.4)稀释配置25、50、100、300、500ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
(2)实验组:取肌红蛋白胶体金检测卡,以胶体金标记吸附膜(即液体吸附分散部件)的一侧作为近心端放置在角转子离心孔内,启动创锐注射泵,向胶体金微粒标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul,静置2分钟,以1000转/分离心1分钟,再向胶体金微粒标记吸附膜上滴加pH7.4的0.05%吐温-20、50mM PBS缓冲液80ul,2000转/分离心30秒清洗。移动肌红蛋白胶体金检测卡至胶体金定量层析分析仪上,读取结果。依次对浓度为25、50、100、300、500ng/ml的系列人肌红蛋白溶液进行检测。实验重复三次,结果取平均值。
(3)对照组:取肌红蛋白胶体金检测卡,按照说明书每个卡滴加80ul已知浓度的系列人肌红蛋白溶液,静置20分钟,将检测卡放置于胶体金定量层析分析仪上读取结果。实验重复三次,结果取平均值。
3、实验结果
采用现有的胶体金固相膜检测产品,用本发明外斜型离心分离检测装置和现有的常规方法作比较,观察本发明技术和现有技术检测的相关性。结果显示本发明技术检测的相关系数r为0.982,现有技术检测的相关系数r为0.967,P<0.05,显著优于现有技术的检测结果,同时,现有技术检测的检测时间为20分钟,本发明技术为3.6分钟,说明本发明技术不仅提高了现有技术检测的准确性,同时还缩短了检测时间。实验结果如表2所示。
表2 本发明中心向外倾斜型离心分离检测装置的比对实验(单位:色度值)