CN103823065A - 一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法，属于生物技术和分析化学领域。本发明以含有活性功能基团修饰表面的微球为载体，采用化学偶联法，将检测抗原交联于微球，通过依次与霉菌毒素竞争抗霉菌毒素抗体的免疫反应和荧光标记二抗的反应，形成“微球-检测抗原-抗体-二抗”的复合物，再采用流式细胞仪分析微球上二抗的荧光强度，建立基于流式微球的霉菌毒素检测方法。本发明技术涉及生物技术和分析化学领域，主要包括微球与检测抗原的化学偶联、免疫竞争反应及其在流式细胞仪上的分析检测方法，本方法具有灵敏度高、速度快，特异性强，重复性好等优点，可用于食品和农产品中霉菌毒素的分析检测。
Description
技术领域
本发明技术涉及生物技术和分析化学领域，主要包括微球与检测抗原的化学偶联、免疫竞争反应及其在流式细胞仪上的分析检测方法，涉及一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法。
背景技术
食品、农产品、饲料发霉变质是一个全球性的严重问题。近年来的调查研究发现，许多食品和农产品中都可检测到霉菌毒素，主要原因是与玉米、大米、花生、苹果、梨等农产品或食品的霉变有关。霉菌毒素是由青霉、曲霉及其他丝状真菌产生的次级代谢产物，是一类毒性极强的化合物，具有严重肝肾毒性以及致畸、致癌和致突变作用。常见的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、单端孢霉烯族毒素和桔霉素等多种霉菌毒素。
目前，在发霉的饲料、谷物和其相关农产品均可检出霉菌毒素，而如花生、玉米和大米是被霉菌毒素污染的主要食物。霉菌毒素对人和动植物造成的严重危害，已经成为一个世界性的社会政治问题，广泛引起各国政府对动植物食品安全卫生的高度关注。
流式细胞术是一种迅速发展的快速定量分析技术，可以对一定的粒子如细胞、微生物、微球和其他粒子的理化及生物学特性进行定量、快速、多参数的同时分析。近年来，流式细胞术这种高通量的定性和定量技术已经广泛应用于细胞周期、细胞因子、免疫亚型和抗体分析等的检测技术。流式细胞仪的优点在于收集和检测通过相关反应后单个粒子、微生物或细胞上所带有的荧光信号，检测速度快、效率高，同时其数据是从大量的粒子、微生物或细胞中得到的，因此结果准确可靠、灵敏度高。
本发明首先以带有活性功能基团修饰表面的微球为载体，采用化学合成法，将检测抗原交联于微球，通过与样品中的霉菌毒素竞争抗霉菌毒素抗体，洗涤、离心后再与荧光标记二抗进行反应，最后洗涤、离心、重悬，采用流式细胞仪进行分析检测，根据已知标准曲线，计算样品中的霉菌毒素含量。本方法具有灵敏度高、速度快，特异性强，重复性好等优点，能对痕量霉菌毒素进行准确分析检测，保证农产品、食品和相关产品的安全使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于流式微球技术分析霉菌毒素的检测方法，主要包括微球与检测抗原的偶联技术、免疫竞争反应及其在流式细胞仪上的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于流式微球技术检测霉菌毒素方法，微球先与检测抗原进行化学偶联，然后偶联有检测抗原的微球与待测样品中的霉菌毒素竞争抗霉菌毒素抗体，洗涤、离心后再与带有荧光标记的二抗进行反应，最后洗涤、重悬，在流式细胞仪上进行分析检测，通过分析“微球-检测抗原-抗体-二抗”复合物上的二抗荧光强度，计算抑制率，根据标准曲线获得霉菌毒素的含量。
所采用的微球为活性功能基团修饰其表面的磁性微球或荧光微球，直径为0.1~100um，磁性微球或荧光微球表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基中一种活性功能基团，用于化学偶联，荧光微球所带的荧光激发波长为480~500nm或610~630nm，发射波长为500~700nm 。
微球采用化学合成法与检测抗原进行偶联，检测抗原为霉菌毒素与蛋白的人工抗原，抗霉菌毒素抗体为各种抗霉菌毒素多克隆抗体及抗霉菌毒素单克隆抗体。
检测的霉菌毒素包括：黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、伏马毒素、单端孢霉烯族毒素或桔霉素。
检测步骤如下：偶联有检测抗原的微球与待测样品提取液、抗霉菌毒素单克隆抗体进行免疫竞争反应，反应后离心、洗涤除去未反应抗体，再加入荧光标记二抗进行反应，反应后再次离心、洗涤完后用缓冲液进行重悬，采用流式细胞仪进行分析检测，根据已知标准曲线，计算待测样品中的霉菌毒素含量。
具体的制备方法和检测方法包括以下步骤：
1、微球与检测抗原的化学偶联：先取一定数量的微球，根据微球上所带的活性功能基团，如羟基、羧基或氨基等基团，采用相应的化学偶联方法与检测抗原上蛋白的氨基或羧基等基团进行偶联反应，制备微球-检测抗原的偶联物，反应完洗涤、离心除去反应试剂；再用含有1%蛋白的磷酸盐缓冲液封闭微球表面未反应位点，最后采用流式细胞仪计数后，4℃下保存备用；
2、取一定数量已偶联检测抗原的微球，加入待测样品提取液和抗霉菌毒素抗体，混合均匀后置于37℃避光振荡反应2小时，反应后洗涤、离心去除未反应的抗体；
3、将反应完的“微球-检测抗原-抗体”复合物，加入荧光标记二抗，混合均匀后置于37℃避光振荡反应1小时，反应后洗涤、离心除去未反应的抗体；
4、将反应完的“微球-检测抗原-抗体-二抗”复合物，加入500ul磷酸盐缓冲液进行重悬，振荡30秒，采用流式细胞仪进行分析；
5、在流式细胞仪上分析检测“微球-检测抗原-抗体-二抗”复合物上二抗的荧光强度，根据已建立的标准曲线，计算获得样品中的霉菌毒素含量。
本发明的优点在于：流式细胞仪具有高灵敏度、高分辨率、双激光、多参数分析等优点，检测的数据收集和分析是通过荧光微球上所携带的信号来完成的，检测时间短、可靠性强、灵敏度高。同时，本发明采用的是抗原-抗体的免疫竞争反应，具有特异性强、交叉反应少等优点。因此，与液相色谱法和酶联免疫法相比，本发明具有灵敏度高、速度快，特异性强，重复性好等优点，能对痕量霉菌毒素进行准确分析检测，从而保证农产品、食品和相关产品的安全使用。
具体实施方式
实施例1：应用流式微球分析检测赭曲霉毒素A的含量
1、羧基荧光微球(粒径5.5 μm，激发波长480 nm，发射波长685 nm)与检测抗原(赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白，OTA-BSA)的偶联：取100 μL 带有羧基荧光微球(内含5×105个)置于1.5 mL离心管中，用KH 
PO4-Na
HPO4缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4，PBS)洗涤离心后，加入80 μL的NaH
PO4缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.2)，振荡30 s。加入10 μL碳化二亚胺(50 mg/mL) 和10 μL N-羟基丁二酰亚胺(50 mg/mL)，室温下避光振荡反应30 min。反应后10000 g离心5 min，小心吸去上清。用500 μL的PBS缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)洗涤离心3次，小心吸去上清。加入100 μL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 5.0)，剧烈振荡30 s。加入100 μL OTA-BSA (0.5 mg/mL)检测抗原，振荡30 s后，室温下避光振荡反应2 h。反应后，离心吸去上清，重复洗涤3次。加入500 μL含有1%BSA的PBS缓冲液进行封闭微球表面未反应位点，室温下避光振荡反应2 h。反应结束后，用500 μL PBS缓冲液重复洗涤离心3次，小心吸去上清，加入1.0 mL PBS缓冲液重悬，采用流式细胞仪计数后，4℃下保存备用。
2、标准曲线的制定：分别取已偶联OTA-BSA的微球20 μL置于1.5 mL离心管中，即1×104个微球，分别加入100 μL不同浓度的赭曲霉毒素A标准品(0、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL 、1.0 ng/mL和10.0 ng/mL)，振荡30 s后，加入100 μL抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，37℃避光振荡反应2 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入100 μL 羊抗小鼠IgG/FITC二抗(激发波长480 nm，发射波长525 nm)，37℃避光振荡反应1 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入500 μL PBS缓冲液重悬，振荡30 s，采用流式细胞仪进行分析，收集微球上二抗荧光强度(525 nm)，荧光强度与赭曲霉毒素A标准品浓度呈负相关，计算抑制率，通过抑制率与赭曲霉毒素A标准品浓度制作标准曲线。本发明建立的流式微球技术检测赭曲霉毒素A的标准曲线，赭曲霉毒素A浓度在0.01 ng/mL~10.0 ng/mL有较好的线性，检测灵敏度可达0.01 ng/mL。
3、待测样品中赭曲霉毒素A含量的分析检测
取待检测的玉米样品，采用粉碎机高度粉碎后，准确称取1.000g，加入5.0 mL 70%甲醇，涡旋振荡5 min，再用超声波提取5 min后定性滤纸过滤、定容，提取液经稀释后备用。取已偶联OTA-BSA的微球20 μL置于1.5 mL离心管中，即1×104个微球，加入100 μL的样品提取液和100 μL抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，37℃避光振荡反应2 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入100 μL羊抗小鼠IgG/FITC二抗，37℃避光振荡反应1 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入500 μL PBS缓冲液重悬，振荡30 s，采用流式细胞仪进行分析，计算抑制率，根据标准曲线计算获得样品中赭曲霉毒素A的含量，样品中的赭曲霉毒素A的含量为60.36±5.28 μg/kg。
实施例2：应用流式微球检测黄曲霉毒素B1的含量
1、羧基荧光微球(粒径5.5 μm，激发波长480 nm，发射波长685 nm)与检测抗原(黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白，AFB1-BSA)的偶联：取100 μL 羧基荧光微球(内含5×105个)置于1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤离心后，加入80 μL的NaH
PO4缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.2)，振荡30 s。加入10 μL碳化二亚胺(50 mg/mL) 和10 μL N-羟基丁二酰亚胺(50 mg/mL)，室温下避光振荡反应30 min。反应后10000 g离心5 min，小心吸去上清。用500 μL的PBS缓冲液洗涤离心3次，小心吸去上清。加入100 μL的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 5.0)，剧烈振荡30 s。加入100 μL AFB1-BSA (0.5 mg/mL)检测抗原，振荡30 s后，室温下避光振荡反应2 h。反应后，离心吸去上清，重复洗涤3次。加入500 μL含有1%BSA的PBS缓冲液进行封闭微球表面未反应位点，室温下避光振荡反应2 h。反应结束后，用500 μL的缓冲液重复洗涤离心3次，小心吸去上清，加入1.0 mL PBS缓冲液重悬，采用流式细胞仪计数后，4℃下保存备用。
2、标准曲线的制定：分别取已偶联AFB1-BSA的微球20 μL置于1.5 mL离心管中，即1×104个微球，分别加入100 μL不同浓度的AFB1标准品(0、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL 、和1.0 ng/mL)，振荡30 s后，加入100 μL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，37℃避光振荡反应2 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入100 μL羊抗小鼠IgG/FITC二抗，37℃避光振荡反应1 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入500 μL PBS缓冲液重悬，振荡30 s，采用流式细胞仪进行分析，收集微球上的二抗荧光强度(525 nm)，荧光强度与黄曲霉毒素B1标准品浓度呈负相关，计算抑制率，通过抑制率与黄曲霉毒素B1浓度制作标准曲线。本发明建立的流式微球技术检测黄曲霉毒素B1的标准曲线，黄曲霉毒素B1浓度在0.05 ng/mL~1.0ng/mL有较好的线性，最低检测浓度为0.03 ng/mL。
3、待测样品中的黄曲霉毒素B1含量的分析检测
取待检测的玉米样品，采用粉碎机高度粉碎后，准确称取1.000g，加入5.0 mL 70%甲醇，涡旋振荡5 min，再用超声波提取5 min后定性滤纸过滤、定容，提取液经稀释后备用。取已偶联AFB1-BSA的微球20 μL置于1.5 mL离心管中，即1×104个微球，加入100 μL的样品提取液和100 μL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，37℃避光振荡反应2 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入100 μL 羊抗小鼠IgG/FITC二抗，37℃避光振荡反应1 h；反应后，离心洗涤3次，吸去上清；加入500 μL PBS缓冲液重悬，振荡30 s，采用流式细胞仪进行分析，计算抑制率，根据标准曲线计算获得样品中黄曲霉毒素B1的含量，测得的样品中黄曲霉毒素B1的含量为0.35±0.03 mg/kg。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种基于流式微球技术检测霉菌毒素方法，其特征在于：微球先与检测抗原进行化学偶联，然后偶联有检测抗原的微球与待测样品中的霉菌毒素竞争抗霉菌毒素抗体，洗涤、离心后再与带有荧光标记的二抗进行反应，最后洗涤、重悬，在流式细胞仪上进行分析检测，通过分析“微球-检测抗原-抗体-二抗”复合物上的二抗荧光强度，计算抑制率，根据标准曲线获得霉菌毒素的含量。
2.根据权利要求1所述一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法，其特征在于：所采用的微球为活性功能基团修饰其表面的磁性微球或荧光微球，直径为0.1~100um，磁性微球或荧光微球表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基中一种活性功能基团，用于化学偶联，荧光微球所带的荧光激发波长为480~500nm或610~630nm，发射波长为500~700nm。
3.根据权利要求1所述一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法，其特征在于：微球采用化学合成法与检测抗原进行偶联，检测抗原为霉菌毒素与蛋白的人工抗原，抗霉菌毒素抗体为各种抗霉菌毒素多克隆抗体及抗霉菌毒素单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法，其特征在于：检测的霉菌毒素包括：黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、伏马毒素、单端孢霉烯族毒素或桔霉素。
5.根据权利要求1所述一种基于流式微球技术检测霉菌毒素的方法，其特征在于：检测步骤如下：偶联有检测抗原的微球与待测样品提取液、抗霉菌毒素单克隆抗体进行免疫竞争反应，反应后离心、洗涤除去未反应抗体，再加入荧光标记二抗进行反应，反应后再次离心、洗涤完后用缓冲液进行重悬，采用流式细胞仪进行分析检测，根据已知标准曲线，计算待测样品中的霉菌毒素含量。
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